Objetivos:

• Reconocer las proteínas de la leche.

• Con la proteína obtenida realizar las diferentes reacciones, para determinar la presencia de los distintos aminoácidos presentes en ella.

Marco teórico:

Generalidades:

Las células de los animales y de los vegetales contienen tres tipos de importantes de compuestos: lípidos o grasas, glúcidos y proteínas.

Las proteínas son, sin duda, las más importantes desde el punto de vista fisiológico y las más complejas desde el punto de visa químico.

Su importancia radica en que son indispensables para la vida animal. Los animales, incluido el hombre, pueden vivir durante largos períodos sin que en su dieta intervengan lípidos o glúcidos, pero no pueden prescindir de las proteínas.

El nombre “proteína” deriva de la palabra griega “proteios”,

Que significa “lo primero”, lo cual nos está indicando lo indispensable para la estructura de las células vivientes.

El conocimiento actual de la estructura de las proteínas ha sido obtenido realizando su hidrólisis ácida o enzimática.

Son macromoléculas, polímeros muy grandes, y los monómeros que las originan son los α aminocarboxílicos, a lo cual se llegó estudiando las distintas etapas de su hidrólisis, que son:

Proteínas --> proteasas --> peptonas --> polipéptidos --> péptidos --> α aminoácidos.

Ya que dichos ácidos α aminocarboxílicos son considerados como las unidades que forman la molécula de las proteínas, nuestro estudio de ellas comenzará con el de los aminoácidos.

Aminoácidos:

Frecuentemente, se indican los aminoácidos como compuestos caracterizados por presentar dos funciones químicas: ácida y amino.

Sus componentes fundamentales son: C, H, O y N, aunque algunos de ellos contienen además, azufre o iodo.

Por lo tanto, una estructura simplificada sería:

COOH

|

CHNH2

|

R

Clasificación.

Los aminoácidos se pueden clasificar o agrupar según diferentes criterios:

Según la posición relativa de ambos grupos funcionales:

• α aminoácidos: cuando ambos grupos funcionales están en carbonos contiguos.

• Β aminoácidos: cuando dichos grupos están separados por un carbono

• γ aminoácidos: cuando están separados por dos carbonos… etc.

Según el nímero de grupos amino y carboxilos que presentan:

• Neutros: son la mayoría y poseen un grupo carboxilo y un grupo amino, por ello se los denomina monoamino-monoácidos.

• Ácidos: poseen dos grupos carboxilo y uno amino, son monoamino- diácidos.

• Básicos: cuando contienen un grupo carboxilo y dos amino, son diamino-monoácidos.

Según sean o no imprescindibles para la vida:

Los esenciales para la vida son 21, cada vez que aparezca uno de ellos y el criterio de clasificación.

Aminoácidos neutros:

• Glicina o glicocola (Gly), ácido aminoetanoico o aminoacético:

Carece de actividad óptica, por no presentar quiralidad. Es esencial.

• Alanina (+) (Ala) o ácido 2 amino propanoico o α amino propanoico.

• Fenilanlanina (Phe) o α amino β fenil propanoico. Esencial. De uso comun como edulcorante.

• Tirosina (-) (Tyr)

• Tripofano: (-) (try) o ácido α amino β (3) indonil- propanoíco. Esencial.

Aminoácidos Básicos:

• Histidina: (-) (His) o ácido α amino β (4) imidozolil-propanóico. Esencial.

• Lisina: (+) (Lys). Esencial

Aminoácidos ácidos:

• Ácido glutámico (-) (Glu)

• Ácido aspártico: (+) (Asp) o ácido amino succínico. Se utiliza como edulcorante, tanto él como un ester derivado.

Aminoácidos que contienen azufre:

• Cisteína: (-) (Cys)

• Cistina: (-) (Cys-Cys)

Aminoácidos con iodo:

• Tiroxina: (+)

Los símbolos (+) o (-), que hemos indicado, en cada aminoácido estudiado, se refieren al poder rotatorio, ya que, a excepción de la glicina todos poseen quiralidad, siendo ópticamente activos.

Propiedades Físicas.

Como hemos indicado, los aminoácidos se consideran constituidos por una doble función química: amino y ácido, es decir poseen dos grupos funcionales diferentes. Amino NH2 y carboxilo COOH.

Sin embargo, ciertas propiedades que poseen no concuerdan con tal estructura:

• los aminoácidos son sólidos cristalinos no volátiles, que funden con descomposición a temperaturas relativamente altas, propiedad ésta que no la presenta ni las aminas ni los ácidos.

• son insolubles en solventes no polares, tales como éter, benceno, etc.

Mientras que son apreciablemente solubles en agua.

• sus soluciones acuosas se compartan tal como las sustancia de elevado momento bipolar.

• las constantes de acidez y basicidad son excesivamente pequeñas comparadas con las correspondientes a los grupos amino y carboxilo.

Este conjunto de propiedades indican que loa Aá presentan un carácter salino, lo cual concuerda con una estructura de Ion bipolar en solución acuosa.

Péptidos.

Las moléculas polifuncionales, como las de los Aá, poseen frecuentemente la capacidad de formar dímeros, trímeros, tetrámeros y finalmente polímeros.

Los Aá pueden perder los elementos del agua entre dos o más moléculas, para formar poliamidas, que se denominan respectivamente: dipéptidos, tripéptidos, polipéptidos. La pérdida de agua deja residuos de aminoácido encadenados.

El agua se forma entre el grupo carboxilo de una molécula de Aá y un hidrógeno del grupo amino de la otra molécula.

Los aminoácidos individuales pueden encadenarse formando enlaces covalentes.

El enlace así formado se llama:

• Enlace peptídico.

El enlace carbono—nitrógeno que se forma cuando se unen dos aminoácidos con un enlace peptídico suele escribirse como enlace sencillo, con un par de electrones compartido entre los dos átomos. Con un simple desplazamiento en la posición de un par de electrones, es muy posible escribir este enlace como doble enlace. Tal desplazamiento de electrones es muy conocido en química orgánica y da pie a estructuras de resonancia que difieren entre sí únicamente en la ubicación de algunos electrones.

Proteínas.

Las proteínas son macromoléculas, polímeros lineales en los que las unidades monoméricas son los aminoácidos. En ellas los Aá están unidos por enlaces peptídicos, formando una o más cadenas polipeptídicas muy largas, que se pliegan en una notable diversidad de formas tridimensionales estabilizadas por otros enlaces como los puentes de hidrógeno, que les proporcionan una correspondiente variedad de funciones.

Son componentes esenciales de todas las células vivas.

Se pueden clasificar entre otros, con el criterio de acuerdo de su comportamiento frente a la hidrólisis.

• Proteínas simples

Son aquellas que por hidrólisis dan solamente α Aá. Como ejemplo ovoalbúmina (proteína de la clara de huevo), la queratina del cabello.

A su vez pueden dividirse según, según su comportamiento ante la solubilidad en:

• Solubles o globulares.

Se caracterizan por ser solubles en agua o en soluciones acuosas de ácidos, bases y sales.

• Insolubles o fibrosas.

Son aquellas que son insolubles en los disolventes comunes, pero son solubles en ácidos y bases fuertes.

• Proteínas conjugadas

Son aquellas que por hidrólisis dan α Aá y uno o más grupos de naturaleza no proteica. A esos grupos se les llama “grupos prostéticos”.

Ejemplo: fosfoproteínas, cromoproteínas, núcleo-proteínas, glicoproteínas o lipo-proteínas.

Estructuras de las proteínas.

• estructura primaria: se refiere a la ordenación o secuencia de los residuos de aminoácidos que la constituyen. Esta secuencia o arreglo da a la proteína su identidad única o exclusiva. Un cambio en uno solo de los muchísimos aminoácidos que la constituyen, altera las características bioquímicos de la proteína.

• estructura secundaria: las cadenas de aminoácidos se estiran o enrollan en formas espaciales, siendo uno de los arreglos más importantes y comunes la disposición en α hélice, propuesta por Pauling y Corey, en 1950. Para su propuesta. Interpretaron los datos de rayos X de la fibra proteica de a-queratina según una estructura espiral que mantiene la conformación helicoidal mediante enlaces de hidrógeno intramoleculares.

En esta conformación particular, cada grupo > C=0 y >N - H de una cadena de péptido se une intramolecularmente por enlaces de hidrógeno, formándose los enlaces de hidrógeno entre dichos grupos de aminoácidos de cuatro restos más allá de la cadena.

Ciertas características estructurales interfieren en la estructura helicoidal y son:

• grupos R muy voluminosos

• existencia de aminoácidos D y L en el mismo péptido

• contener prolina o hidroxiprolina.

Las estructuras helicoidales no son el único tipo de estructura secundaria, otro es la "hoja plegada", llamada β hoja plegada. El tipo de hoja plegada es una disposición en la cual las moléculas de proteína se colocan lado a lado y se mantienen unidas por puentes de hidrógeno entre las cadenas.

Estructura terciaria: en algunas proteínas, por ejemplo las globulares, la estructura helicoidal genera otras disposiciones, enrollándose de varias maneras, y existiendo zonas de conformación al azar.

Proteínas de la leche:

El grupo más importante de proteínas de la leche es la caseína que se encuentra en mayor proporción. Proveen más de las tres cuartas partes del nitrógeno de la leche.

Se encuentra en la leche en forma de partículas coloidales con un diámetro de 1200 A en promedio. Es una proteína conjugada que contiene ácido fosfórico, calcio y carbohidratos. Puede ser fácilmente aislada por precipitación isoeléctrica.

Materiales:

Sustancias

• Ác. Acético 2 M

• Leche (aprox. 50 ml.)

• Etanol

• Reactivo de millón

• Ác. etanoico 2 M

• Sulfato de cobre 0,01 M

• Hidróxido de sodio 2 M

• Ácido nitrico

• Acetato de plomo

Material técnico

• Papel de filtro

• Cuenta gotas

• Embudo

• Soporte para embudo

• Pinza

• tubo de ensayo

• varilla de vidrio

• encendedor

• Mechero

Procedimientos:

Técnica: Obtención de caseína

Colocar 50ml de leche en un vaso de bohemia.

Se agrega gota a gota y agitando ácido acético 2,0M hasta precipitación máxima (unos 7ml de ácidos)

Dejar sedimentar y filtrar.

Lavar precipitado con 20ml de Etanol en el mismo filtro.

Desecar entre varias hojas de papel.

Reacción de Biuret

Colocar un trozo de caseína en un tubo de ensayo

Añadir CuSO4 0,01M e NaOH 2,0M

Agitar y observar.

Reacción Xantoprotéica

Colocar un trozo de caseína en un tubo de ensayo

Agregar ácido nítrico concentrado

Observar y anotar.

Reacción de Millon

Colocar un trozo de caseína en un tubo de ensayo

Agregar reactivo de Millón

Calentar

Observar y anotar

Acetato de Plomo , en medio Básico

Colocar un trozo de caseína en un tubo de ensayo

agregar solución de acetato de plomo con NaOH

Calentar

Observar y anotar

Observaciones:

Obtención de la proteína de la leche:

• Al agregar ácido etanoico a la leche y comenzar a calentar se observa un precipitada en las paredes del vaso de bohemia. Este precipitado se torna un sólido blando de color blanco manteca. (Ver fig. 1 y 2)

Reacción de Biuret:

• Al añadir sulfato cobre sobre el trozo del sólido obtenido en el tubo de ensayo, empieza a verse una coloración turquesa y debajo un tono blanco, que luego al agregar hidróxido de sodio pasa a un color amatista. (Ver fig. 3 y 9-A)

Reacción xanoprtoeíca:

• Al agregar ácido nítrico al sólido obtenido en el tubo de ensayo, se aprecia un color amarillo. (Ver fig. 4 y 9-B)

Reactivo de Millon:

• Cuando colocamos el reactivo de millon en el sólido presente en el tubo de ensayo, logramos identificar un tono rosa carne. (Ver fig. 5, 6 y 9-C)

Acetato en un medio básico:

• Al suministrar acetato de plomo al sólido presente en tubo de ensayo, se observa una coloración blanca, que posteriormente al añadir hidróxido de sodio se tornará de un color verde mate hasta alcanzar el tono marrón. (Ver fig. 8 y 9-D)

Emulsión directamente sobre la leche:

• Al suministrar directamente acetato de plomo sobre la leche percibimos la precitipitación y la coagulación porque es un metal pesado, se mantiene la coloración blanca de la leche. (Ver fig. 7 y 9-E)

Interpretación de datos:

• Obtención de la caseína:

El sólido obtenido se denomina caseína, proteína conjugada relacionada con el ácido fosfórico, calcio, carbohidratos (azúcares).

Tiene un PI caseína=4,7

Le da un color blanco a la leche, coagula por ácidos y no por la acción de calor, porque no se destruye la capa de molécula de agua que rodea la proteína, ni las micelas coloidales.

Esta compuesta por una cadena de alrededor de 200 aminoácidos.

Para obtenerla se agrega ácido etanoico ya que con él alcanza su punto isoeléctrico, provoca que se precipite la caseína y alcance su solubilidad minima.

Reacciones de reconocimientos:

• Reacción de Biuret:

Las sustancias que contienen dos o m[as enlaces peptídicos producen un color violeta amatista al ser tratadas con sulfato de cobre ΙΙ, (CuSO 4) diluido y bases fuertes (NaOH que fue introducido por las paredes).

En conclusión esta reacción reconoce enlaces peptídicos.

El color amatista es debido a la formación de un complejo entre el Ion cobre ΙΙ y varios de los enlaces peptídico de la proteína.

• Reacción xanoproteíca:

Cuando se calientan proteínas con ácido nítrico concentrado se vuelven amarillas si poseen grupos aromáticos, ya que estos se nitran.

Los nitrocompuestos amarillos formados se convierten en sales de color anaranjado por la acción de una base fuerte (NaOH).

Reconoce la reacción triptófano, tirosina, etc.

• Reacción de millón:

Este reactivo es el nitrato de mercurio II, Hg(NO3)2 en solución nitroso-nítrica.

Si al tratar una solución de proteína con este reactivo se produce un coágulo blanco que por el calentamiento pasa a rojo carne, es por que contiene restos de tirosina.

• Reactivo con acetato de plomo:

Se reconoce el aminoácido que contiene azufre (S), al ser un metal pesado, las sales de estos hacen precipitar a la proteína formando sales insolubles.

Como por ejemplo la metionina.

Leche + (CH3COO)2 Pb + PP

Pb metal pesado, produce pp y coagulación.

Caseína + + (CH3COO)2 Pb + Pbs (sulfuro de plomo)

Conclusiones:

• Pudimos obtener la proteína de la leche (caseína) mediante un precipitado dado

por el acido etanoico.

• Reconocimos algunas propiedades de las proteínas.

• Reconocimos algunos aminoácidos y enlaces peptídicos.

Bibliografía:

• Vila -Romano / Principios de Química general / Ed. Monteverde

• Campbell -Farrell / Bioquímica 5ta edición.

• Garrido Pertierra - Tejión Rivera / Principios de Química estructural / Ed. Tebar

• Brown - Lemay - Bursten - Murphy / Química, la ciencia central / Ed. Pearson

3

Santiago Martínez - Macarena Gallo - Camila Mespolet / San Antonio, canelones

Ejemplo 1.

Ejemplo 2.

Fig. 2

Fig. 1

Fig. 4

Fig. 3

Fig. 6

Fig. 5

E

D

C

B

A

Fig. 9

Fig. 7

Fig. 8