Resumen

Durante la última década ha habido una creciente presión social, ambiental (legislaciones ambientales) y empresarial (menor costo) para desarrollar métodos alternativos a la síntesis química que produce la gran mayoría de compuestos orgánicos del mundo. Aquí describimos el desarrollo de alternativas biotecnológicas para la síntesis de ácido ascórbico, ácido glutámico, ácido cítrico y salicílico por microorganismos y procesos químicos de forma industrial.

Como la ruta biosintética para la obtención del ácido glutámico es muy conocida, generalmente, se utilizan cepas comerciales mutantes en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, con un bloqueo en la α-cetoglutarato deshidrogenasa, lo cual permite la acumulación de ácido glutámico. La producción y excreción del exceso del ácido glutámico depende de la permeabilidad de la célula, por ello las cepas de uso comercial son bacterias seleccionadas.

La síntesis química del ácido L-ascórbico (L-AA) es un procedimiento caro y complicado que conlleva muchos pasos químicos que parten de la D-glucosa, y un único paso enzimático que implica a la enzima sorbitol-deshidrogenasa. Gracias a la tecnología de ADN recombinante, ha sido posible aislar el gen de la 2,5-DKG-reductasa en la especie Corynebacterium y expresarlo en Erwinia berbicola. Las células de Erwinia transformadas son capaces de convertir directamente la glucosa en ácido 2-KLG. En el caso de las microalgas, se da la fermentación en una etapa utilizando Chlorella pyrenoidosa. Pero utilizando la microalga Prototheca moriformis se consiguió la acumulación de L-AA en el medio de fermentación.

El proceso general de obtención de ácido cítrico mediante fermentaciones es llevado a cabo por Aspergillus niger. Actualmente se utiliza ampliamente el cultivo en superficie, lo que exige un control extremado de la concentración de iones Mn2+ y una alta concentración de oxigeno disuelto y también, es esencial mantener el pH por debajo de 2.0. También se comercializó un proceso de cultivo sumergido con levaduras del genero Candida y más adelante se estudiaron otros métodos más eficientes de producción con la cepa Yarrowia, que es capaz de utilizar las n-parafinas y los ácidos grasos como fuentes de carbono.

El ácido salicílico se emplea en varios tratamientos médicos siendo su principal uso la producción de Aspirina®. La producción industrial de ácido acetilsalicílico se lleva a cabo mediante síntesis química empleando compuestos como el fenol. El modo de operación es principalmente discontinuo, alcanzando el rendimiento de la reacción valores del 90% aproximadamente.

Introducción

La producción microbiana de ácidos orgánicos es un método prometedor para la obtención de sustancias de interés comercial que está desplazando paulatinamente los métodos de síntesis química. Aún así, hay algunos procesos químicos de producción de ácidos orgánicos que continúan utilizándose en la industria, como el caso del ácido salicílico y ácido acetilsalicílico.

La ventaja de usar microorganismos para la producción industrial o combinar su uso con procesos químicos de síntesis, es principalmente la habilidad de sintetizar enantiómeros específicos, por su crecimiento a gran escala y la separación fácil de productos y substratos, además, la gran diversidad metabólica permite su aplicación como productores de metabolitos primarios y secundarios.

El hecho de conocer en profundidad los procesos biológicos y fisiológicos de la producción microbiana ha hecho viable la producción a gran escala de ácidos orgánicos.Se ha conseguido aumentar los rendimientos de los microorganismos aplicados en la industria mediante la obtención de mutantes (técnicas de mutagénesis, recombinación genética, fusión de protoplastos), el empleo de tecnología de DNA recombinante (introducción de enzimas claves para la utilización de nuevos sustratos, etc), el diseño y selección de medios de cultivo y fermentadores que maximicen la producción, disminuyan los costes o faciliten la recuperación de productos, el diseño y selección de las condiciones y sistemas de cultivo mas convenientes.

Producción de ácido glutámico

• El ácido glutámico

El ácido glutámico es uno de los aminoácidos más importantes, tanto por su abundancia en la composición de las proteínas (6.3%), como por su papel en el intercambio de energía entre los tejidos y el crecimiento celular (Alberts B. et al. 2002). Aislado del gluten de trigo por H. Ritthausen en 1866, este aminoácido, o su forma ionizada, el glutamato (abreviado Glu o E), pertenece al grupo de los llamados aminoácidos ácidos, o con carga negativa a pH fisiológico, debido a que presenta un segundo grupo carboxilo en su cadena lateral (como se observa en la ilustración) (Anfinsen, C.B. 1992).

Imagen 1. Estructura del ácido glutámico, conformación plana y tridimensional.

En 1908 Ikeda descubrió que este compuesto era el responsable de la potenciación del sabor en sopas y alimentos derivados del alga Laminaria japonica, utilizada en la cocina Japonesa. Es por ello, que hoy día se conoce su propiedad de proporcionar un sabor peculiar denominado “umami”, considerado como “el quinto sabor”. En la industria alimentaria, el ácido glutámico se utiliza como potenciador del sabor en sazones y condimentos en forma de glutamato monosódico (MGS o E621) (Kirimura J. et al. 1969).

Además de intervenir en reacciones de transaminación y en la síntesis de diferentes aminoácidos como la prolina, hidroxiprolina, ornitina y arginina, el ácido glutámico es el neurotransmisor excitatorio por excelencia de la corteza cerebral humana. Normalmente, funciona como mensajero químico en la sinapsis neuronal, pero por encima de unos niveles críticos, el glutamato puede convertirse en un tóxico para el sistema nervioso, provocando su degeneración y muerte, por lo que se le clasifica como excitotoxina (Palucha A. et al. 2005).

En los últimos 30 años, el uso de esta excitotoxina en la alimentación ha suscitado mucha controversia a raíz de diversos artículos científicos sobre el papel de esta sustancia en la patogénesis y la patología de muchas enfermedades del sistema nervioso central (SNC) y otras enfermedades agudas y crónicas. En 1968, se describieron las reacciones agudas que pueden darse poco después de ingerir alimentos que contengan glutamato (dolores de cabeza, debilidad, entumecimiento, palpitaciones, asma, problemas de sueño, dolores abdominales, calambres, hormigueo, opresión en el pecho, etc.), es decir, lo que se denominó el “síndrome de restaurante chino” (Rejane G. et al. 2002).

A pesar de los numerosos estudios que han demostrado la toxicidad del glutamato, la legislación española permite hasta 10g/Kg de E-621 (glutamato sódico) solo o en combinación con otros aditivos como el E-620 o del E-622 al E625, en su función de aditivo alimentario general (salvo en alimentos para lactantes y niños de corta edad), mientras que en los condimentos y aderezos se permite la dosis máxima de quantum satis, es decir, un nivel máximo no especificado (BOE, 22/01/1986).

• Ruta biosintética del ácido glutámico

Los aminoácidos podemos clasificarlos en esenciales, que son aquellos que no somos capaces de sintetizar metabolitamente y que tenemos que incorporarlos en nuestra dieta, y los no esenciales, que son aquellos que sí podemos sintetizar. Los aminoácidos no esenciales se sintetizan a partir de precursores que derivan de distintas rutas metabólicas, entre las que destacan:

El ácido glutámico, o glutamato, es un aminoácido no esencial, que deriva directamente de un intermediario del ciclo de Krebs, concretamente el α-cetoglutarato. Esta conversión es posible principalmente gracias a la acción de enzimas como la Glutamato deshidrogenasa, capaz de catalizar la reacción:

α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH + H+ glutamato + NADP+

Y en menor medida por otras enzimas como la Glutamato sintasa, que usa la glutamina como donadora del grupo amonio:

α-cetoglutarato + glutamina + NADPH + H+ 2 glutamato + NADP+

O la Carbamilfosfato sintetasa, que lo sintetiza de forma indirecta:

HCO3- + glutamina + 2 ATP carbamil fosfato + glutamato + 2 ADP + Pi

Gracias a estas tres enzimas, podemos obtener anabólicamente el ácido glutámico o su forma ionizada, el glutamato (Stryer, 2003).

En condiciones óptimas para la producción de glutamato a partir de glucosa, predomina la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas o Glucólisis que dirige los precursores del carbono hacia el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs. El NADPH + H+ formado en la descarboxilación oxidativa del isocitrato a α-cetoglutarato suministra el cofactor reducido, que, junto con el NH3, se necesita para la conversión de α-cetoglutarato a glutamato por la acción de la glutamato deshidrogenasa (Lehninger, 2005).

Imagen 2. Desvío de los productos de la glucólisis al ciclo de Krebs.

Las cepas productoras de ácido glutámico comercial carecen del enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa del ciclo del ácido cítrico y por consiguiente, en ausencia de iones NH4+ aunque con suficiente oxígeno, el ácido α-cetoglutárico se acumula (Lehninger, 2005).

Los compuestos intermedios del ciclo de Krebs, necesarios para el aprovisionamiento del oxalacetato que interviene en la reacción de condensación de las citrato sintetasa y otras reacciones celulares, provienen de reacciones anapleróticas, como el paso de fosfoenolpiruvato con la adicción de CO2 a oxalacetato. Por otra parte, los compuestos intermedios del ciclo de Krebs pueden provenir del ciclo del glioxilato. Estequiométricamente a partir de 1.4 moles de glucosa se obtiene 1 mol de glutamato mediante el ciclo del glioxilato, mientras que la ruta que implica la fijación del dióxido de carbono bajo la acción de la fosfoenolpiruvato carboxilasa es más eficaz y produce 2 moles de glutamato por 1 mol de glucosa (Lehninger, 2005).

Es por ello, que con el objeto de incrementar la eficacia de la conversión se han introducido en la producción algunos mutantes que tienen niveles bajos del enzima isocitrato liasa del ciclo del glioxilato. En el esquema adjunto se muestra la vía metabólica seguida para la producción de glutamato a partir de glucosa, destacando las enzimas clave en el proceso (Lehninger, 2005).

• Producción Industrial del ácido glutámico

En 1909, Saburosuke Suzuki and Ikeda llevaron a cabo por primera vez la producción industrial de L-glutamato monosódico (MSG). El primer proceso de producción industrial consistió en la extracción de glutamato a partir de proteínas vegetales, las cuales eran tratadas con ácido hidroclorídrico para romper los enlaces peptídicos. El ácido L-glutamico era entonces aislado desde este material y purificado como MSG. Esta producción inicial de MSG estaba limitada debido a los problemas técnicos que presentaba el método para ser desarrollado a gran escala (Sano C., 2009).

Extracción de tejidos vegetales

La proteína vegetal hidrolizada (PVH) es fuente de glutamato procesado en la que hay concentraciones altas de dicho compuesto. Las proteínas hidrolizadas que se utilizan para realzar el sabor se preparan utilizando ácidos o enzimas que permiten digerir químicamente la harina de soja, el gluten de trigo, las cepas comestibles de levadura, etc. Este proceso, que consiste en hervir productos vegetales en un recipiente lleno de ácido sulfúrico durante varias horas, para luego neutralizar el ácido con sosa cáustica, descompone las proteínas en sus aminoácidos constituyentes. Así se obtiene un fango de color marrón que se recoge y se deja secar. El producto final es un polvo marrón con altas concentraciones de glutamato. Además, igual que el glutamato obtenido por fermentación, la PVH contiene las mismas sustancias cancerígenas que este tipo de glutamato, así como las formas D y L de esta sustancia (Sano C., 2009).

Mejoras en la producción del ácido glutámico no aparecieron hasta los años 50s. Una de estas mejoras consistía en la síntesis química directa, que fue utilizada para la producción de MSG desde 1962 hasta 1973 (Sano C., 2009).

Síntesis química

El acrilonitrilo se forma catalíticamente con CO/H2 y en presencia de [Co(CO)4]2, para dar un aldehído que mediante la reacción de Strecker, en presencia de ácido cianhídrico y amoniaco, se transforma en el dinitrilo del ácido glutámico. En medio básico se obtiene la mezcla racémica del ácido glutámico, que contiene los isómeros D y L:

H2C=CH-CN OHC-CH2-CH2-CN NC-CH(NH2)-CH2-CH2-CN ácido D,L-Glutámico

La separación de la mezcla racémica se consigue favoreciendo la cristalización de ácido L-glutámico a partir de la disolución sobresaturada de la mezcla de isómeros mediante siembra con el derivado L (Sano C., 2009).