Tema 8: Micrótomo

Es un instrumento mecánico con el que se realizan secciones titulares de espesor micrométrico y por lo tanto lo suficientemente delgados para su posterior observación microscópico. A menor grosor mejor estudio.

Existen 6 tipos básicos de micrótomos pro todas tienen un principio básico de funcionamiento. Tiene un portabloques en el que se va a apoyar el material que se va a cortar que avanza sobre una cuchilla gracias a un sistema de cremallera de forma periódica se hace incidir el bloque con la cuchilla o viceversa que va sobre el portacuchillas con lo que obtendremos secciones titulares de espesor equivalente al seleccionado por el tornillo que controla el mecanismo de avance. El mecanismo de avance puede ser manual o digitalizado. Nuestro bloque está formado por parafina. Antiguamente la fijación del bloque era con parafinas fundida. Actualmente se realiza por medio de una pinza y es encima de éste portabloques donde existen unos tornillos que los permiten orientar el bloque de manera que queda paralela a la cuchilla.

Portacuchillas consta de dos palancas que nos permiten fijar la cuchilla al micrótomo. Estos impiden que la cuchilla quede suelta y hay una palanca que controla la inclinación de la cuchilla para cortar de forma homogénea el bloque. El sistema de avance mecánico del portabloques sobre la cuchilla proporcionará cortes sucesivos de tejido a partir del bloque.

Posee un sistema de avance de tornillo y las secciones se obtienen por un sistema oscilatorio de planaza que realiza l portabloque sobre la cuchilla al vascular sobre ella.

Ventajas: simplicidad y bajo coste

Desventajas: no permite obtener secciones seriadas.

Ha sido el más empleado en anatomía patológica. El portabloque colocado en posición vertical se mueve de arriba abajo. Delante del filo de la cuchilla El portabloques avanza de manera automática y constante, en cada vuelta del mango.

Ventajas:

Desventajas:

1. El elevado precio debido a la complejidad del mecanismo de avance, que además dificulta y encarece las reparaciones.

2. La imposibilidad de cortar con él tejidos incluidos en celoidina, en gelatina y en propilén glicol.

El micrótomo del aula es Minot

Existen principalmente dos tipos según se movilice el portabloques, sobre la cuchilla permaneciendo esta fija, o viceversa, en ambos casos.

El movimiento que produce el corte es el avance y retroceso de la porción móvil sobre unas guías metálicas.

1º modelo: deslizantes o de tipo Leizls es más estable y proporciona mejor calidad de corte ya que la vibración de la cuchilla se elimina al permanecer fija.

2º modelo: es el que tiene una cuchilla móvil también llamado Rehicher-Jung, este modelo está en desuso

3º modelo: este existía es el tipo tetrander que se utiliza para realizar secciones macro-microscópicas de órganos completos. La cuchilla está fija y lo que se desliza es el objeto. Se monta sobre una mesa especial.

Ventajas:

Inconvenientes:

Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y por tanto no deshidratado. La congelación se consigue haciendo circular CO2 por el interior del portabloques procedente de una bombona y de esta forma el gas cuando se expande provoca el enfriamiento del tejido. Una vez congelada las secciones de trabajan con una cuchilla que se encuentra sobre un eje fijo de manera que el avance lo realiza el portabloques por un mecanismo directo del tornillo.

Inconvenientes:

El microtomo de congelación ha sido desplazado por el criostato, solo se utiliza para el sistema nervioso, para estudios arquitecturales e histoquímicas.

Colocado en un mueble frigorífico con una tapadera en la parte superior y tiene una manivela que se mueve desde fuera consta de un micrótomo de tipo Minot. Semejante al convencional de parafina que está incluido en una cámara de congelación permite obtener cortes de material sin fijar a -20ºC o incluso a -60.

La manivela que controla la realización del corte está fuera mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance está dentro de la cámara fría. La obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema antienrrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla, en los mas modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra, a menos 60ºC por medio de isopentano o nitrógeno líquido.

Ventajas:

1. Con el se obtienen cortes mas delgados que con el micrótomo de congelación de 4 micras o incluso 2 que se utiliza no solo para intras en estudios histoenzimáticos o inmunohistoquímicos o en grasas. Se realiza primero 1 debastado de 10-20 micras se corta generalmente a 5. En éste caso la pieza saldrá al revés que con el microtomo de rotación, o de tipo Minot.

Prácticamente es un derivado del de tipo Minot pero con mejorar técnicas que permiten efectuar secciones de manómetros de espesor incluso en plásticos. Se obtiene en microscopia electrónica.

Tiene un sistema de iluminación múltiple con una luz incidente sobre el bloque posterior

Tiene un alcance técnico por dilatación de una varilla, metálica que se controla por n microordenador que permite el ajuste digital en pasos de un manómetro.

Tiene una platina, portacuchillas regulable apta para cuchillas de vidrio o diamante, El sistema óptico tiene un microscopio o una lupa binocular incorporado mediante un motor se regula el brazo de avance tiene una unidad de control independiente con selectores para avance macro y micrométrico regulable en amplitud y velocidad. El portabloques es una pinza redondeada como la de los taladros (como la de las brocas).

Eran piezas de acero grandes que había que mantener en buen estado lo hacia el técnico y eran personales. Actualmente las cuchillas son desechables, se tiran cuando tienen mellas y existen cuchillas de distintos materiales como acero inox., vidrio, carburo, diamante dependiendo de lo que se va a seccionar y del medio de inclusión. Se suele utilizar de acero inox. y para incluir en parafina y de carburo de tolueno.

El largo de las cuchillas variará según el portacuchillas. Existen 4 tipos:

1. Bicóncava por ambas caras: se utiliza para cortar bloques de parafina blanda en el microtomo de balanceo o de rotación.

Inconvenientes:

1. Vibra en exceso, pero si el tejido es suficientemente blando produce excelentes secciones, se utiliza también para celoidina blanda.

2. Plano-cóncavas: También se llaman de tipo A y B según sea mayor o menor el frado de concavidad de la cara no aplanada. Lo de tipo A se usa para bloques de parafina en el microtomo de deslizamiento y la de tipo B se utiliza para bloques en celoidina.

3. Cuchilla biplana en cuña: o de tipo C que se utiliza indistintamente para cortes criostáticos en congelación de parafina de tipo Minot. Este tipo se ha impuesto por su fácil mantenimiento y su mayor rapidez cuando la dureza de los tejidos oscila notablemente.

4. Biplana: O de tipo D. Se utiliza para cortar material congelado con el microtomo de gas carbónico o cuando el tejido es muy duro.

En anatomía patológica es una de las funciones mas importantes, la exactitud en el diagnóstico de la calidad y el espesor de los cortes, para ello necesitamos un microtomo moderno con adecuad mantenimiento cuchillas adecuadas y formación y experiencia suficiente. La confección de los cortes consta de 6 pasos.

• Si no trabajamos el freno ha de estar puesto

• No se coge la cuchilla con las manos, cuando no se utiliza la cuchilla se pone una pieza que se llama guardas.

• Antes de empezar a cortar hay que tener preparado el material. Hay que preparar placas de parafina frías con hielo para mantener fríos los bloques, prepararemos portas, lápices de grafito, agujas histológicas…

• Se enchufara el baño de flotación programando la temperatura entre 45-50 grados. Se debe comprobar periódicamente esta temperatura, con el termómetro.

• Se añadirá al baño una pequeña cantidad de gelatina en polvo, o bien que los cortes se adhieran al portaobjetos.

Retallar un bloque es eliminar el exceso de medio de inclusión que existe en su periferia para disminuir la superficie total en contacto con la cuchilla. Esto se realiza con la parte de atrás de la hoja de bisturí se consigue que el bloque oponga solo la resistencia al corte propia del tejido. Después el bloque debe enfriarse para conseguir una consistencia óptima de la parafina. S e debe colocar a 4ºC si se colocara a menos de 0 la parafina tiende a cristalizar y se resquebrajaría los bloques apareciendo artefactos en los tejidos. Esto no siempre se hace.

Existen sistemas comerciales que se adoptan a la pinza del micrótomo sino fuera así se podría hacer con parafina líquida.

Hay que saber que existen 4 ángulos de control de la incidencia del bloque sobre la cuchilla:

1º es el ángulo de inclinación, se representa por I, debe ser de 10-15 grados

2º es el ángulo de arrastre, se representa por A, debe ser entre 5 y 8 grados

3º es el ángulo de corte, se representa por C, debe ser de 60 grados

4º es el de ángulo libre, es el complementario al ángulo de corte.

Colocar el boque retallado sobre el portabloques y orientarlo de manera que quede paralelo al filo de la cuchilla, para orientarlo había 2 tornillos. Se quita el freno y se hace descender el brazo hasta que la superficie del bloque entre en contacto con la cara interna de la cuchilla de debastado. Se comprueba que queden paralelos y sino se restablece mediante la manipulación de los tornillos.

Para tejidos incluidos en parafina, lo 1º que hay que hacer es debastar para eso se ponen 20 micras y se elimina la 1º capa de parafina. Cuando vemos que empieza a salir tejidos se cambia el selector de micras y se pone a la que nos convenga.

El espesor final será de 2 a 5 micras, se utiliza el corte de 10 para tejido nervioso que tiene baja celularidad, los cortes mas delgados son difíciles de obtener, son útiles en patología renal, hematopoyéticas y linfoide.

Realizaremos con una cuchilla que tengamos para debastar siempre con una parte de la cuchilla y una ve que sale el tejido, se cambia o se mueve la cuchilla y con un movimiento rítmico del volante, se generará una cinta continua de cortes que es conveniente retirarla por medio de un pincel o aguja histológica y colocarla en el baño de flotación que tendremos al lado. Si el tejido se resquebraja es útil añadir vaho sobre el bloque, en todo momento tendremos un cubito de hielo par frotar sobre el bloque. Los cortes tienen 2 caras. La superior mate y la detrás mate ¿?

Se coloca el corte en el baño de flotación de manera que la cara brillante o inferior quede en contacto con el H2O al estar en H2O entre 45-50 grados el corte se estira debido a la tensión superficial y flota, si existen pliegues se suelen estirar al ponerlas en el baño, a veces en la tira de cortes, según sale, se puede coger con un porta objetos humedecido en alcohol de 50 o 70 y con este porta se deja reflotar en el baño.

Después procederemos a la captura de los cortes con nuestro porta enumerado, si nos sale mal podremos volver a reflotar y coger. Después de montar las preparaciones y los portas hay que eliminar del H2O cualquier resto para evitar contaminaciones accidentales. Esto consigue pasando sobre la superficie del H2O un papel de filtro.

Antes de iniciar el proceso de coloración hay que secarlos para evitar los desprendimientos. La desecación e puede realizar de distintas formas. La desecación puede hacerse de esta forma rápida introduciéndose los portas en un cestillo y este en una estufa que se encuentra previamente a 60 grados durante 30-35 minutos.

También se puede dejar hasta 37 grados hasta el día siguiente.

(FOTOCOPIAS)

El porta debe estar bien desengrasado, para ello después de lavarlo con agua y jabón y enjuagarlo con agua destilada se pueden dejar en una solución de alcohol clorhídrico formado por 1 mL de HCl en 1000 mL de alcohol etílico de 96 o bien dejarlo en alcohol éter a partes iguales durante un día. Se deja secar y se coge por los bordes (Se deja secar inclinados). Para los procedimientos más rutinarios o procedimientos más habituales, la adhesión del tejidos al porta queda garantizada con un desengrasado meticuloso. Para técnicas histoquímicas inmunológicas o de biología molecular se necesita impregnar los portas con sustancias adhesivas que eviten que se desprendan los cortes, para ello se utilizan sustancias naturales como la albúmina de huevo o gelatina o bien sistemas comerciales formados por resinas y compuestos del tipo poli - L - lisina que son mas caros pero proporcionan mayor adhesividad.

Albúmina glicerinada de Mayer: Los reactivos son:

• Clara de huevo recién extraído ------------------------------------------50 mL

• Glicerol o glicerina ------------------------------------------------------- 50 mL

• Salicilato sódico o fenol o timol una gota o --------------------------- 1gr.

Se mide la clara y se bate a punto de nieve se le añade la misma cantidad de glicerina, se mezcla se agita y se filtra y se le pone un antibacteriano que puede ser salicilato sódico, fenol o timol.

Del filtrado se impregna cada parte con una película y se deja secar el aire. Posteriormente, durante el desparafinado se van a coagular la albúmina y se aumenta la adhesión al porta.

Gelatina: se hace a una concentración al 5%, se disuelve en agua destilada y se puede disolver primero en agua caliente sin que llegue a hervir porque perdería sus propiedades de cohesión, cuando esté a temperatura ambiente se añade el fenol (antibacteriano) del preparado anterior se añade 3 o 4 cucharaditas por litro de agua al baño de flotación. En otros sitios añaden directamente una cucharada de gelatina en polvo al baño para técnicas de enzimología o de inmunohistoquímica (ihq) no podemos usar proteínas animales ya que pueden producirse reacciones cruzadas.

Resinas: son sustancias de alto peso molecular derivadas del fenol y son el sistema que proporciona mayor adhesión, habitualmente se utiliza una solución de resina en acetona en proporción 1:10 antes de su uso.

-Técnica de corte en el criostato: por las especiales características de este instrumento, es un microtomo minot o de rotación, situado en el interior de una cámara congeladora, es posible conseguir secciones de hasta 2 micras.

-Congelación del material: para la realización de técnicas histoenzimáticas o inmunoquímicas es imprescindible que el tejido no haya sido fijado y que la congelación, no se haya realizado lentamente en la cámara fría del criostato, debido a la formación de cristales intratisulares de hielo que esto provoca. Si el criostato dispone de un sistema de congelación ultrarrápido a -50ºC con isopentano se empleara también isopentano enfriado en nitrógeno líquido, con ello se consigue que el tejido esté suficientemente congelado cuando se coloque en la cámara de corte del criotomo incluso puede ser necesario esperar algún tiempo hasta que se alcance la temperatura idónea para el corte. La realización de los cortes se facilita antes de ser congelado, el tejido se coloca dentro de una gota de medio sintético de OCT de esta forma se provoca la inhibición del tejido en el medio, además se favorece la fijación al portabloques del criostato.

Con ella conseguimos hidratar nuestros cortes para ellos e pasara por una batería de alcoholes con concentración decreciente se puede hacer de diversas maneras.

-1º forma: Con 2 cubetas de alcohol absoluto. Una cubeta de 96 y otra de agua. Se hacen pases rápidos en cada una de ellas.

-2º forma: Cubetas de 100, 2 de 96 y 1 de 80. Después de esta hidratación hay que colorear.

Siempre acaba en agua. Y según la técnica, después de colorear habrá que deshidratar aclarar y montar.