TEMA 19 PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACION DE MICROTOMÍA Y CONTRASTE EN M.E.T.

La preparación de los tejidos comprende 5 tiempos:

Esta preparación puede efectuarse sin grandes dificultades fuera de un centro de M.E. y conducir a una inclusión definitiva que puede conservarse casi indefinidamente.

Posteriormente se realiza el transporte a un centro de M.E. sin que ello suponga ningún riesgo.

Interesa que la fijación sea inmediata dentro del minuto que sigue a la extracción del tejido vivo; es posible un a fijación más tardía pero los resultados serán menos satisfactorios.

La fijación se hace frecuentemente con un fijador ósmico cuyo pH y osmolaridad deben estar bien determinados, se puede utilizar también el permanganato potásico, glutaraldehido y el fijador de Dalton.

• Ventajas que explican la generalización de su empleo:

• Por una parte su acción sobre los componentes de los tejidos es muy rápida, lo cual limita al máximo los peligros de autolisis intracelular.

• Por otra parte, la presencia de osmio va a permitir un aumento apreciable del contraste de la imagen (porque es un material pesado).

• Inconvenientes:

• Penetra con dificultad en los tejidos.

• Otro pequeño inconveniente es que la concentración de osmio disminuye progresivamente en el curso de la penetración a causa de su absorción por las capas superficiales, esta lentitud de penetración explica lo poco que se utiliza en histología clásica.

El tetróxido de osmio actúa por gelificación de las proteínas, es decir, transforma las soluciones acuosas de estas macromoléculas en un estado que se aproxima al estado sólido.

El ácido ósmico se presenta en ampollas que contienen cada una 0´5 g. de tetróxido de osmio cristalizado. En el laboratorio se efectuarán las operaciones necesarias para su preparación para poder ser utilizado como fijador.

El líquido fijador de tetróxido de osmio tiene que tener un pH 7´38, una vez preparado se guarda en el frigo, en un recipiente oscuro y herméticamente cerrado, debe permanecer incoloro o ligeramente amarillo. Su alteración se manifiesta por un viraje al rosa que aparece generalmente después de algunas semanas. No debe usarse nunca el fijador color rosa.

Técnica de fijación con tetróxido de osmio:

El fijador debe ser transparente hasta el lugar de la extracción, dentro de pequeños tubos de cristal, los cuales deberán ser siempre cuidadosamente lavados, pasados por la mezcla sulfocrómica y secados en la estufa. Estos frascos serán colocados en un recipiente isotérmico relleno de hielo. En el momento de la extracción se deposita sobre un “cartón” llamado bristol con unas gotas de fijador y lo antes posible se deposita el fragmento de tejido obtenido.

El tejido se habrá cortado en forma de pequeños cubos regulares cuyas dimensiones debe ser del orden de 1mm3.

Esta manipulación se efectúa aproximadamente en 1 minuto, el tiempo de fijación puede variar entre 1 - 2 horas.

Este fijador tiene la propiedad de fijarse sobre las membranas celulares y tiene el inconveniente de impregnar poco las demás estructuras. Debe prepararse en el momento del uso.

Se emplea a una concentración de 2´5 % y se puede emplear solo o formando mezclas.

Este fijador también contiene osmio y está particularmente indicado para la fijación de células sanguíneas. Este fijador se puede realizar a tª ambiente y dura entre 1 - 2 horas.

Después de la fijación los tejidos serán deshidratados.

Se realiza por pasos sucesivos en los alcoholes siguientes:

• Etanol 50º………… 15 min.

• “ “70º…………. “ “

• “ “95º…………. “ “

• “ “100º………… “ “

• “ “100º…………bidestilado y rectificado 30 min. 2 veces.

En caso de inclusión en araldita o Epon es posible limitarse a un solo pase en etanol rectificado.

En caso de inclusión en metacrilato es extremadamente importante en los últimos tiempos utilizar un alcohol recientemente rectificado y perfectamente puro.

La fijación también puede realizarse con acetona.

La técnica de inclusión clásica en parafina no es adecuada en M.E. ya que esta es demasiado blanda para obtener cortes muy finos. Se utilizan materias plásticas sintéticas, estas deben reunir varias condiciones: como tener unas determinadas características físicas de dureza, plasticidad y elasticidad, para responder a las exigencias de la microtomía ultra fina.

Su penetración en los tejidos debe ser satisfactoria y no deben ocasionar alas células más que un mínimo de alteración.

La muestra tiene que ser extremadamente fina para que permita el paso de los electrones. También tiene que presentar una estructura celular y subcelular idóneas para el estudio con microscopia electrónica por ello las características físico-químicas del medio de inclusión condicionan toda la cadena de reactivos previos al encastramiento, corte y tinción.

Como líquidos intermediarios se pueden usar el etanol y la acetona siempre que sean miscibles con el agente de inclusión. Normalmente es posible el paso directo del tejido al liquido intermediario pero algunas veces es aconsejable utilizar un agente de transición que facilite la penetración del medio de infiltración, por ejemplo el 1,2-epoxipropano u oxido de propileno.

4.1. INCLUSION EN METACRILATO

Tiene 2 grandes ventajas:

• La 1ª se refiere a sus propiedades físicas de elasticidad y dureza que pueden hacer variar a voluntad y que permiten efectuar cortes ultra finos.

• La 2ª es que da cortes en los que las imágenes aparecen fuertemente contrastadas.

El metacrilato tiene la propiedad de sublimarse bajo el haz electrónico, lo cual tiende a adelgazar el corte en los sitios en los que las estructuras están ausentes y por tanto a aumentar el contraste de las mismas.

En cambio tiene el grave inconveniente de provocar alteraciones celulares en el momento de la polimerización y la conservación de las estructuras finas es generalmente menos buena que con las otras materias de inclusión como la araldita y Epon. El uso del metacrilato ha decaído debido a sus inconvenientes.

Se utiliza metacrilato de butilo adicionado de una pequeña cantidad de metacrilato de metilo, la dureza del polímero está en función de su contenido en metacrilato de metilo que puede variar a voluntad.

El polímero de metacrilato de metilo está comercializado bajo el nombre de Plexiglas. El monómero es muy soluble en alcohol y muy fluido y penetra bien en las células tras su deshidratación total. En cambio es completamente insoluble en el agua, esto explica la atención que se debe poner a la rectificación del alcohol absoluto. La polimerización del metacrilato se obtiene añadiendo un iniciador químico y bajo la acción del calor.

El metacrilato monómero que se expende en el comercio está mezclado con hidroquinona que impide su polimerización a esto se le llama desestabilización y se realiza con una solución de sosa al 40 x 1000.

4.2.INCLUSIÓN EN EPOXIRRESINAS.

Estas sustancias están formadas por un amplio conjunto de polímeros plásticos entre los que se encuentran el araldite, la resina epon y la spurr. Por retraerse escasamente suelen proporcionar una buena conservación de la estructura subcelular y mayor preservación del corte que el metacrilato.

Sus inconvenientes mas graves son:

• Su elevada viscosidad, que enlentece la penetración.

• La toxicidad de sus moléculas, principalmente del componente denominado dióxido de vinilciclohexano (VCD).

El fundamento general de la inclusión en epoxirresinas radica en la utilización de una resina monomérica líquida que se transforma en un polímero sólido de gran dureza en presencia de calor, un endurecedor, un acelerador de la reacción y opcionalmente un agente plastificante que disminuye su fragilidad.

a) INCLUSION EN ARALDITA.

Su principal ventaja sobre el metacrilato consiste en permitir una mejor conservación de las estructuras histológicas finas con una notable constancia en los resultados.

La presencia de agua no influye en la polimerización de la araldita, esto es una ventaja porque no es necesario extremar la deshidratación.

Otra ventaja es la de poseer un punto de fusión más alto que el del metacrilato, además su conductibilidad térmica es mejor, de ello resulta que los cortes ultra finos de araldita se calientan mucho menos bajo el haz electrónico que los cortes de metacrilato. Su resistencia y estabilidad son mejores.

La araldita tiene en cambio 2 inconvenientes importantes:

• La obtención de los cortes ultra finos es más difícil que con el metacrilato.

• El contraste de los cortes es siempre bastante débil, de aquí la necesidad de recurrir a artificios suplementarios para aumentarlo.

b) INCLUSIÓN EN EPON.

Esta es otra variedad de resina cuyas ventajas e inconvenientes son los mismos que los de la araldita.

c) INCLUSIÓN EN SPURR

Es una resina de muy baja viscosidad cuyo uso está ampliamente extendido pese a los inconvenientes descritos para las epoxirresinas.

Antes de la ultramicrotomía el tejido incluido se tiene q encastrar en un molde. Suele realizarse en moldes plásticos o de silicona que se desechan tras la polimerización seccionándolo con una cuchilla longitudinalmente, también se utilizan cápsulas de gelatina que se eliminan por disolución en agua a 70ºC.

La observación de cortes histológicos al M.E. exige que estos sean extremadamente delgados, un grosor del orden de unas centenas de anstrong. Un corte de 0´5 micras de grosor aparece completamente opaco.

Es prácticamente imposible obtener un poder de resolución superior a la décima parte del grosor del corte, así pues un corte de 200 A tendrá un poder de resolución de 20 A, este valor está lejos del límite de resolución de los mejores aparatos actuales (del orden de 5 A), por tanto se procurará hacer los cortes lo más finos posible. La finura de los cortes depende de 3 factores:

5.1. MICROTOMOS.

Actualmente se disponen de varios instrumentos que permiten con facilidad la obtención de cortes ultra finos.

Todos ellos tienen en común el hecho de que la cuchilla está fija mientras que la preparación es móvil, el avance de la preparación es regulable a voluntad de uno y permite la obtención de cortes cuyo espesor puede variar desde algunas micras hasta 0´01 micra.

Se pueden distinguir micrótomos de mano manual y automáticos:

• Los manuales, el desplazamiento de la preparación se efectúa mediante un volante que tiene una cierta inercia, a cada vuelta del volante corresponde un corte.

• En los automáticos el desplazamiento se efectúa por medio de un motor eléctrico o de un sistema electromagnético.

5.2. CUCHILLAS.

La perfección de un corte depende tanto de las cualidades de la cuchilla como de las del micrótomo.

Las cuchillas de acero no sirven en este caso; actualmente la solución está entre las cuchillas de vidrio y las de diamante, más utilizadas las de vidrio por su bajo precio.

Las cuchillas de diamante presentan la ventaja de su mayor dureza por lo que es preferible utilizarlas cuando se va a cortar un material duro como el hueso, otra ventaja es que duran más, como inconveniente que son más caras y no permiten obtener cortes de más calidad que las de vidrio.

5.3. PRÁCTICA DE LA ULTRAMICROTOMÍA.

Sin ser extremadamente difícil la práctica de la ultramicrotomía necesita gran cuidado, no cabe duda que el valor de los cortes y la constancia de los resultados dependerán esencialmente de la habilidad y de la paciencia del operador.

El micrótomo debe estar situado sobre un soporte estable y no sobre un entarimado, el suelo sobre el cual descansará el micrótomo debe estar exento de vibraciones mecánicas, también es importante que este en sitio donde la temperatura sea constante y exento de corrientes de aire. Una simple corriente de aire puede enfriar la muestra y provocar una contracción de la misma originando una irregularidad en el grosor de los cortes.

Preparación del bloque:

La inclusión definitiva se presenta bajo la forma de un pequeño fragmento de 1mm3 de tejido envuelto en la materia plástica contenida en una cápsula de gelatina (en el caso de metacrilato hay que quitar antes esta cápsula), pero cuando las inclusiones están echas con epon o araldita es inútil intentar quitarla ya que está estrechamente adherida al bloque polimerizado.

Cortar la extremidad del bloque bajo la forma de una pirámide cuadrangular, esta pirámide contiene el fragmento de tejido. Se cortará de manera que la superficie de sección sea un poco inferior a 1 mm2.

Hay que preparar la cuchilla para facilitar la recogida y montaje del tejido cortado. Los cortes ultra finos no pueden ser recogidos ni sobre una superficie sólida ni manipularlos, en cambio será posible recogerlos sobre una superficie líquida.

Para esto se adoptará a la cuchilla una pequeña cubeta destinada a ser llenada de agua cuya superficie horizontal debe estar exactamente en el mismo nivel que la arista de la cuchilla. Se usan generalmente cubetas de cobre o aluminio y se asegurará su cierre hermético con un fragmento de cera o parafina, la arista de la cuchilla estará exactamente en el mismo plano que las extremidades de la cubeta, también se puede formar la pequeña cubeta por medio de una tira adhesiva impermeable que se fijará de la forma indicada.

La cuchilla unida a su cubeta será fijada solidamente al micrótomo, habiendo llenado previamente la cubeta con agua destilada (para el metacrilato) o con agua acetonaza al 10 % (para araldita o epon) se hará al principio algunos cortes semifinos para obtener una superficie se corte cien regular. Una vez seccionados, estos cortes flotan en la superficie de la cubeta.

Observados al contraste de fases sin impregnación permitirán observar inmediatamente si la estructura histológica corresponde a la investigada. Los cortes serán extraídos de la superficie del agua con un palillo tipo manicura (los cortes semifinos) y depositados sobre una gota de agua albuminosa situada sobre un portaobjetos. La gota de agua albuminosa es luego absorbida por el borde de un papel de filtro lo cual permite la extensión regular e inmediata de los cortes sobre el portaobjetos.

Posteriormente se harán los cortes ultra finos, la sucesión de los cortes debe formar una tira bien regular siendo preferible no extraer más que las tiras cuyos cortes sean todos del mismo color, es decir, del mismo grosor; aunque generalmente es necesario antes de la extracción extender los cortes.

Extensión de los cortes:

En el momento de la sección el corte está generalmente contraído, es decir, que su superficie es inferior a la del bloque de la cual procede, esto se traduce por un plisado.

Es necesario desarrugar estos cortes, lo cual se consigue con dificultades variables según la dificultad de la inclusión (por ejemplo añadiendo unas gotas de una sustancia volátil al agua de la cubeta).

Montaje de los cortes sobre su soporte:

Es imposible manipular con un instrumento estos cortes, ya que son muy frágiles y ultra finos. La tira formada por la sucesión de varios cortes será extendida sobre su soporte definitivo que generalmente es una rejilla de cobre muy fina, recubierta o no por una membrana. La rejilla sostenida con el extremo de una pinza fina se sumerge en la cubeta y se desplaza horizontalmente debajo de la tira que se quiere extraer y luego se retira de la cubeta al mismo tiempo que la tira, al cual queda depositada sobre la membrana que recubre la cara superior de la rejilla.

5.4. IMPREGNACIÓN DE LOS CORTES ULTRAFINOS.

El contraste de la imagen de un corte ultra fino es con frecuencia insuficiente por lo que es necesario aumentarlo mediante los reforzadores de contraste comúnmente llamados “colorantes electrónicos”. Se utilizan para este fin sales de metales pesados susceptibles de fijarse sobre ciertos elementos celulares, generalmente las membranas.

Se utiliza en la mayoría de los casos una técnica de impregnación sencilla que consiste en hacer flotar durante un cierto tiempo la cuadrícula previamente invertida, es decir, con los cortes hacia abajo, sobre la superficie de la solución de una sal de metal pesado, por ejemplo acetato de uranilo y citrato de plomo.

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