MICROSCOPÍA ÓPTICA

EL MICROSCOPIO: El microscopio es un instrumento óptico de precisión, que nos permite observar objetos no perceptibles a simple vista.

DESCRIPCION DEL MICROSCOPIO.

Para su estudio al microscopio se lo divide en tres sistemas que son:

1.- SISTEMA MECÁNICO.

Este sistema comprende todas aquellas partes que sirven de apoyo y superficie de observación móvil:

1. PIE. Llamado también base. Es una pieza maciza y pesada que asegura la estabilidad del microscopio.

En los modelos antiguos tiene la forma de U, Y o V, que aloja en ella al espejo. En los modelos actuales son de forma rectangular que contiene en su interior a la bombilla eléctrica.

2. COLUMNA.

O brazo. Está en posición vertical. El extremo inferior se une con el pie, en los microscopios antiguos se articula por medio de la charnela, en cambio en los modelos actuales ya no existe dicha articulación. El extremo superior se une al tubo óptico en los modelos antiguos y a la caja de prismas en los modelos actuales. En la parte media y anterior se encuentra implantada la platina de observación.

3. TUBO ÓPTICO.

Es un tubo cilíndrico hueco y largo, pintado interiormente de color negro mate para evitar la reflexión de la luz. Es propio de los modelos antiguos y mide aproximadamente 160 mm y sirve para calcular la amplificación del objeto.

4. CAJA DE PRISMAS DEL SISTEMA BINOCULAR.

Formado por un sistema de prismas, los cuales reflejan en ángulo adecuado la luz que proviene de los objetivos y enviarlos a los oculares con la misma intensidad. Es propio de los modelos actuales.

5. PLANTA MÓVIL.

Es una pieza metálica plana, dispuesta en forma horizontal, tiene la forma redonda o cuadrada y es el lugar donde se coloca las preparaciones, tiene en su parte central una abertura circular por donde atraviesan los rayos luminosos. La preparación a ser examinada es sujetada a la platina por medio de pinzas que permite movimientos anteroposteriores y de izquierda a derecha, gracias a un sistema de tornillos.

6. TORNILLOS MACRO-MICROMETRICOS.

Son tornillos que permiten movimientos de ascenso y descenso del tubo óptico en los modelos antiguos o de la platina en los actuales.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES: Es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad, mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya en diferentes rutas a través de las distintas partes de una célula. El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 – 0,0003 nm (nanómetros), muy corta comprada con la de la luz visible (426 – 750 nm; violeta – rojo). Es posible con el microscopio electrónico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 um, (micrómetro o micra) comparado con los 0,25 um de uno óptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un millón de veces.

A causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos.

Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Después de la deshidratación, la muestra se incluye en una resina y es aquí donde se realizan cortes finos con un ultramicrotómo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. El rayo de electrones es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observación produciendo una imagen.

A la primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y a la segunda Microscopia Electrónica de Barrido (MEB).

La Microscopía Electrónica de Barrido es una de las técnicas más versátiles para la visualización y el análisis de las características micro estructurales de muestras sólidas, debido, principalmente, a su elevada resolución (alrededor de 2nm) y a su gran profundidad de campo, lo que permite una visualización tridimensional.

TECNICAS HISTOLÓGICAS

Para poder realizar un estudio microscópico de los diversos, tejidos de nuestro organismo, estas deberán ser preparadas adecuadamente sometiéndolas a una serie de procesos.

Histotécnia es el conjunto de métodos y artes necesarios para el correcto manejo y procesamiento de los tejidos y células, de modo que sea posible su observación microscópica. Comprende los siguientes pasos:

1. OBTENCION DE LA MUESTRA.

Existen varias formas de obtener una muestra, que puede ser de humanos o como también de animales de laboratorio.

• Biopsia.- consiste en la obtención de un fragmento de tejido de un ser vivo, con fines de diagnóstico.
• Autopsia.- son piezas tomadas de cadáver, los cuales deben ser extraídos lo más rápidamente posible después de la muerte, esto con el fin de evitar la deformación de los tejidos.

La muestra debe ser obtenida (cortada) con instrumentos bien afilados, además el espesor de la muestra no deberá ser más de 1 cm de largo y ancho, esto para poder realizar una buena fijación.

• Disociación.- Consiste en separar todos los componentes de un tejido, se realiza más en tejido muscular, a la que se hace macerar en ácido nítrico y luego se separan cuidadosamente las fibras musculares con agujas histológicas de punta roma.
• Brochaje.- Método utilizado en órganos linfáticos (amígdalas palatinas) y en tejidos de alto índice de descamación. Para lo cual se utiliza una brocha especial, con la que se recoge la muestra.
• Frotis.- Este método de obtención se utiliza en muestras líquidas, como por ejemplo: sangre, líquido sinovial, linfa, líquido cefalorraquídeo, etc. Se toma una gota de la muestra, la cual se coloca en un extremo y sobre el portaobjeto, utilizando otro portaobjeto que esté con un ángulo de 45º en relación al anterior se desliza la muestra en toda la superficie.
• Desgaste.- Se utiliza en tejidos o muestras duras (calcificadas) como por ejemplo hueso, diente, ateroma, etc. Primeramente se obtienen una muestra lo más delgado posible, la cual se deberá raspar o desgastar hasta convertirla en una lámina sumamente delgada y translúcida.
• Descalcificación.- Consiste en quitarle los iones de calcio y fosfato al hueso u otros tejidos calcificados, utilizando sustancias químicas; como EDTA (ácido etilendiamino tetra acético) de modo que solamente quede tejido orgánico blando, fácil de cortar.

2. FIJACIÓN.

Es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las células y por tanto de los tejidos, son fijadas en cuanto a su estado físico y parcialmente en su estado químico, de manera que pueda resistirá los diversos reactivos sin distorsionarse o descomponerse. En condiciones ideales, un fijador debe penetrar rápidamente al tejido y su acción debe ser rápida.

La cantidad de fijador que se debe usar es de 15-20 veces más que el volumen de la muestra.

El tejido debe permanecer en el fijador por lo menos 1 a 2 días hasta que el tejido tenga una apariencia blanquecina a la observación macroscópica.

ACCION DE LOS FIJADORES.

La mayoría de los fijadores actúan:

1. Coagulando las proteínas de las células.
2. Produce cierto endurecimiento tisular.
3. Desnaturaliza y precipita a las proteínas.
4. Evita que las enzimas hidrolíticas degraden los componentes histicos.
5. Es un potente antiséptico (destruye, microorganismos).
6. Como un excelente mordiente para los colorantes.
7. Aumenta la diferenciación óptica de las estructuras celulares y tisulares.

Existen varios tipos de fijadores, pero en nuestro medio el más utilizado es el formol al 10-20%, los demás fijadores son usados en otras especialidades.

3.- HIDRATACIÓN

Es el proceso mediante el cual se remplaza o eliminan las grandes cantidades de agua intra y extracelular que contienen los tejidos. Es indudable que el mejor deshidratante es el alcohol, la que se utiliza en diferentes concentraciones ascendentes (frascos de alcohol al 60%, 70%, 80%, 90%), en cada uno de estos frascos la muestra debe, permanecer una hora, finalmente la muestra se sumerge en un frasco que contenga alcohol en una concentración de 99% (alcohol absoluto o etanol), en la que debe permanecer un tiempo de 10 a 12 horas.

Cuando se trabaja con muestras delicadas, tejido embrionario, pulmón, etc. La deshidratación se debe iniciar de concentraciones mucho más bajas de alcohol (30%).

4.- ACLARAMIENTO.

Método mediante el cual se remplaza (saca) el alcohol que se encuentre en los espacios intra y extracelulares por otra sustancia. El más utilizado es el Xilol que además de ser un buen aclarante de los tejidos, es un líquido soluble con la parafina, sustancia que utilizará más tarde para que ocupe los espacios anteriormente mencionados. El aclaramiento se logra sumergiendo la muestra en tres baños de Xilol, durante una hora en cada recipiente. Un buen aclarante elimina rápidamente el alcohol y aclara de inmediato sin endurecer el tejido, ni evaporarse demasiado rápido en los baños de parafina.

5.- INFILTRACIÓN EN PARAFINA.

Consiste en la impregnación de los tejidos con sustancias que llenen todas las cavidades naturales, espacios tisulares y también los espacios intracelulares. Para ello la muestra debe ser en tres baños, sucesivos de parafina derretida (57ºC) dentro de una estufa, permaneciendo una hora en cada recipiente en nuestras muy porosas y blandas (pulmón), se realiza inclusión al vacío por medio de una bomba de succión; adaptada al baño de parafina.

6. INCLUSIÓN.

Con el propósito de proporcionar una consistencia a los tejidos, la muestra se incluye dentro de un bloque de parafina. Para lo cual se utilizan moldes de Leuckart, que tiene la forma de “L” unimos dos moldes de Leuckart, formando un pequeño recipiente que tiene la forma de un cubo, en donde se vacía parafina líquida (fundida), luego se sumerge el tejido, esperar unos minutos hasta que la parafina se solidifique a temperatura ambiente, posteriormente separar los dos moldes “L”, de modo que se formó el bloque de raima con un tejido incluido dentro de ella. Este bloque de parafina debe ser unido a u taco de madera, con la ayuda de una espátula caliente.

7. CORTES DE LOS TEJIDOS.

Consiste en obtener láminas muy delgadas de parafina y tejido, normalmente tiene un espesor de 4 a 8 um. El instrumento que se utiliza para realizar los cortes, es el micrótomo, que son de varios tipos (los más utilizados son el de rotatorio y el de deslizamiento). Para realizar los cortes primeramente se verifica que el espesor del corte este graduado adecuadamente (4-8 um), se ajusta el taco de madera en la pinza del micrótomo teniendo en cuenta que la parte más blanda este dirigido hacia la cuchilla. Seguidamente apoyar el bloque de parafina sobre la cuchilla y comenzar el corte con impulsos regulares. Para poder realizar un buen corte es importante que la consistencia y dureza del tejido sean semejantes al de la parafina.

8. TINCIÓN DE LOS TEJIDOS.

Después de realizado el corte se levanta la lámina de parafina que se encuentra en la cuchilla con un palillo de madera húmedo y transportado a un recipiente con agua tibia (45 grados centígrados), donde llotan para eliminar los pliegues que se pudieran haber producido en el momento del, corte, luego, se recoge la muestra en un portaobjeto, la que previamente ha sido pasado con albúmina glicerinada (agente adherente) y se lleva a la estufa graduada a 57 grados centígrados donde se elimina la mayor parte de la parafina y al mismo tiempo se fija la muestra al portaobjeto. Dentro de la estufa deberá permanecer un tiempo de 10 minutos aproximadamente. Posteriormente se realiza la tinción, que generalmente la que más se utiliza es la tinción universal o de rutina (hematoxilina y eosina) que consiste en sumergir al porta objeto con la muestra a una serie de soluciones que al final le darán la coloración al tejido.

1. Desparafinar: Xilol – Xilol 5 minutos en cada uno.
2. Hidratación: alcohol 96% - 80% - 70% - 60% 5 minutos en cada uno.
3. Hidratación: Agua destilada 1 minuto.
4. Tinción nuclear: Hematoxilina de Harris durante 5 minutos.
5. Azuleamierito: Agua amoniacal, simplemente lavar.
6. Tinción citoplasma: Eosina 30 segundos.
7. Lavar: Agua destilada solo sumergir y sacar.
8. Deshidratación: Alcohol 60% - 70% - 80% - 96% 5 minutos en cada uno.
9. Deshidratación: Alcohol absoluto (dos frascos) 5 minutos en cada uno.
10. Aclaramiento: Xilol – Xilol – Xilol 5 minutos en cada uno.

Una vez realizada la tinción, se procede al montaje que consiste en cubrirla muestra con bálsamo de Canadá, posteriormente con el cubreobjetos, de modo que ya se tiene la muestra lista para poder ser observado por el microscopio.

La tinción se denomina universal, por que se aplica a todos los tejidos y demuestra en ellos casi todos sus componentes tisulares. Tiñe de azul con hematoxilina a los componentes basofilos: núcleo, nucléolo, cromatina, etc. La eosina tiñe de rojo a los componentes eosinófilos, o sea, los que tienen afinidad por los colorantes ácidos como ser: citoplasma, “sustancia intercelular, fibrina, hematíes, etc.

CORTES POR CONGELACIÓN

Es una técnica especial que consiste en solidificar el tejido, por medio de frío intenso (-25 grados centígrados). Para ello utilizamos micrótomos especiales que pueden ser:

Micrótomo de congelación.- Es un micrótomo común, con la diferencia que su platina de fijación presenta pequeñas perforaciones, por medio de la cual le llegan chorros suaves de gas carbónico que solidifica al tejido. De esta manera entonces este micrótomo se encuentra conectado, a un tanque que contenga gas carbónico.

Crióstato.- Es un micrótomo que se encuentra dentro de un refrigerador. Los cortes se pueden realizar manejando el micrótomo desde afuera. Los cortes por congelación resultan esenciales para ciertos métodos de tinción, así por ejemplo: para cortes de grasa y algún método de impregnación argentica, para el estudio del sistema nervioso central. También son indispensables para examen inmediato durante las intervenciones quirúrgicas. El espesor de los cortes suele ser más grueso, 10-15 cm.