UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR

TRABAJO PRÁCTICO N°1:

MICROSCOPIA I

2009

Introducción

La curiosidad del ser humano por observar la naturaleza a escalas diminutas, nos ha llevado a desarrollar múltiples tecnologías para dicha tarea. Galileo Galilei (1564-1642) fue el pionero en la fabricación de lo que seria conocido hasta la actualidad como “Microscopio”, instrumento que nos ha dado la facultad de analizar el mundo biológico a niveles imperceptibles para el ojo humano. Robert Hooke (1635-1703) y Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723), fueron de igual forma, los primeros en realizar observaciones y descripciones sistemáticas a nivel microscópico, de tejidos humanos, vegetales y microorganismos1.

Estos avances, además de otros posteriores en el ámbito de la microscopia, permitirían que siglos después, Schleiden y Schwann, en 1838, definieran la “teoría celular”, lo que daría el paso definitivo al nacimiento de la biología celular2. Pero era necesario todavía, el desarrollo de técnicas de tinción y coloración, logradas a finales del siglo XIX, para poder hacer visible características incoloras y translúcidas de los organelos celulares; posteriormente la invención del microscopio electrónico a finales de la década de 1940, abrió nuevas posibilidades, dándonos a conocer detalladamente la estructura interior de la célula.

Lo que posee en común toda esta búsqueda y avance de nuevas tecnologías en el ámbito de la microscopía, es lograr la observación mas completa de los diferentes tipos celulares que existen, en su mayor nitidez posible, con el fin de poder visualizar, comprender e interpretar la actividad intracelular. Entonces, como alumnos de medicina que nos iniciamos en este ámbito de la biología, nos planteamos interrogantes como las siguientes: ¿Como se utiliza el microscopio?, ¿Como se manipulan las muestras para ser observadas?, ¿Qué tan importantes son los métodos de tinción celular?, ¿Cuál es la potencia resolutiva de los diferentes lentes utilizados actualmente? ...

Por las razones antepuestas, este práctico de laboratorio tiene como principal objetivo comprender el uso y estructura de instrumentos ópticos de laboratorio, que en nuestro caso será el microscopio óptico, además de observar y comparar diferentes tipos de muestras celulares3. Lo anterior hará imprescindible discutir con objetividad y el mayor respaldo bibliográfico posible, las observaciones hechas, y resultados logrados acerca de la observación de tejidos histológicos.

Materiales y Métodos

En el práctico de laboratorio, se procedió en primer lugar al reconocimiento de las diferentes piezas del microscopio óptico, en su sistema mecánico, óptico y de iluminación. De igual forma, en conjunto a la charla de la profesora, se conoció la función de cada una de estas piezas.

Las actividades propuestas utilizaron distintos métodos de y condiciones experimentales para su observación.

Actividad 1:

Consistió en registrar el poder de aumento (X) y la apertura numérica (NA) de cada lente objetivo, ocular, y la apertura numérica del condensador.

Con el valor de apertura numérica efectiva máxima (apertura numérica del lente con mayor resolución) y una ecuación dada, se calculó y registro el “poder de resolución”, y “límite de resolución” del microcopio en uso.

Actividad 2:

Se coloco un portaobjetos con la letra “E”, predispuesto en los materiales de trabajo, en la platina del microscopio, luego de ayustar la imagen con el desplazador de la platina se observo la muestra utilizando el lente objetivo 10X y 40X, dibujando las observaciones.

Actividad 3:

Se procedió a observar muestras previamente tratadas, de Corte de Intestino de Rattus norvegicus (Berkenhout), Tejido Hepático (hepatocitos) de Rattus norvegicus (Berkenhout) y Frotis de Sangre Humana. Los cuales fueron observados en el microscopio solo con las resoluciones de 10X y 40X por órdenes de la profesora. Dibujando en cada caso lo observado.

Actividad 4

Utilizando una pipeta Pasteur, se colocó una gota de la muestra que contenía Euglenas (Euglena sp) y Paramecios (Paramecium sp) en la parte central de un portaobjeto. Sobre este, se puso un cubreobjetos, limpiando el exceso de agua con un papel absorbente, luego se observo con los lentes objetivos de 4x, 10x y 40x. De igual forma que en el procedimiento de las muestras anteriores, se elaboró un dibujo nítido y sencillo de lo observado.

Actividad 5

Dentro de la activad fueron usados 2 métodos de observación. Sin tinción y con tinción

-El procedimiento del método sin tinción consintió en:

Colocar una gota de agua destilada sobre un porta-objetos y sobre la misma, una muestra fina de catáfilo de Allium cepa (L.), la cual se extrajo cortando de forma transversal con un bisturí las capas internas del vegetal. Luego sobre la muestra se coloco un cubreobjetos. (En el método con tinción, antes de colocar el cubreobjetos se coloco una gota de lugol con un gotario sobre la muestra), y se extrajo el exceso de agua con un papel absorbente.

Ya con la muestra cubierta, se colocó el portaobjetos en la platina del microscopio regulando la posición de la muestra con el desplazador de la platina.

A continuación se observo la muestra a 4X, 10X Y 40X. Dibujando lo observado.

Resultados

Actividad 1.B

Se registro en la guía de trabajo los siguientes valores entregados en el laboratorio:

Lentes Objetivos

Aumento (X)	Apertura Numérica (NA)
4	0.10
10	0.25
40	0.65
100	1.25

Lentes Oculares

Aumento (X)	Apertura Numérica (NA)
10	18

Condensador

Apertura Numérica (NA)

1.25

Con los valores anteriores de apertura numérica, se utilizaron para calcular el poder resolutivo y el límite resolutivo del microscopio.

Calculo de poder y límite de resolución

Para calcular el poder y el límite de resolución, usamos la apertura numérica (NA) de interfase de aire: 1.0, y damos a λ un valor de 400 nm, que es el espectro de luz visible.

* Fórmula de poder de resolución: NA / 0.61x λ

Remplazando valores:

1.0 / 0.61 x 400 nm = 4.098 x 10^-3 nm

* Fórmula de límite de resolución: 0.61x λ / NA

Remplazando valores:

0.61 x 400 / 1.0 nm = 244 nm

Para efectuar cálculos con la apertura numérica (NA) de interfase de aceite, tomamos un valor de 1.25, y se mantiene el valor de λ (400 nm).

* Fórmula de poder de resolución: NA / 0.61x λ

Remplazando valores:

1.25 / 0.61 x 400 nm = 5.12 x 10^-3 nm

* Fórmula de límite de resolución: 0.61x λ / NA

Remplazando valores:

0.61 x 400 / 1.25 nm = 195,2 nm

Introducción aclaratoria

(Actividades 2, 3,4 y 5)

Los presentes resultados de las actividades 2, 3, 4 y 5 poseen un aumento ocular de 10X/18L. Todos fueron observados con objetivos 4X, 10X Y 40X. Las actividad 3, fue observada solo con los objetivos 10X y 40X, por sugerencia de la profesora, debido a la poca visibilidad con el objetivo de 4X.

El objetivo 4X presenta un aumento total de 40X, El objetivo 10X presenta un aumento total de 100X y finalmente el objetivo 40X presenta un aumento total de 400X.

Actividad 2: Letra E

Aumento de 10X

Con el aumento del lente objetivo de 10x, se vio la letra “E” invertida.

Aumento de 40X

Sólo se logró observar una porción de la letra bastante aumentada por lo que no se logró diferenciar si estaba invertida o no.

Actividad 3:

Intestino de Rattus norvegicus (Berkenhout)

- Enterocitos vistos al microcopio con aumento de 10X

- Se pudo ver diversas vellosidades en forma general, de colores rosado pálido, pertenecientes a la mucosa intestinal. Se apreciaron ciertas zonas de color azul intenso y parte del lumen intestinal.

- Enterocitos vistos al microcopio con aumento de 40X

Con este nivel de aumento mayor, se observa en gran escala una vellosidad intestinal de color rosado más oscuro que los tejidos circundantes; se vio su interior, con estructuras algo irregulares, pero aún no son demasiado visibles los enterocitos.

Tejido Hepático de Rattus norvegicus (Berkenhout)

- Hepatocitos visto al microcopio con aumento de 10X.

Era visible un cúmulo de hepatocitos aglutinados, de color blanquecino, entre los cuales se observaron varios vasos sanguíneos de coloración rojiza y de diferentes diámetros.

- Hepatocitos visto al microcopio con aumento de 40X.

A este nivel de aumento, sólo se observan los hepatocitos uno al lado de otro, en forma de malla, sin ninguna interrupción entre ellos. Se pueden apreciar claramente sus núcleos celulares y membranas plasmáticas; a pesar que no son tan visibles como los anteriores, es notoria la alta presencia de organelos en el citoplasma de cada hepatocito.

Frotis de Sangre Humana

La muestra entregada estaba dañada, y los componentes sanguíneos no se distinguían bien, tanto a resolución de 10X y 40X. Por esto, se utilizó una imagen entregada por la profesora, a una resolución de 320 X.

Aumento de 320X

En esta imagen fija, se podía observar los glóbulos rojos, de color rojizo con gran nitidez, y forma bicóncava, además de la presencia de glóbulos blancos entre los anteriores, de tono morado, y con gránulos internos. La distribución de ambos tipos celulares era aleatoria y dejaban suficiente espacio entre ellos para la circulación.

Actividad 4: Euglenas (Euglena sp) y Paramecios (Paramecium sp).

Muestras Frescas sin tinción.

En cuanto a los resultados obtenidos, se pudo observar claramente a las Euglenas y fue posible identificar algunas de sus partes, pero no fue ese el caso con el Paramecio.

Euglena vista al microscopio con aumento de 4x.

Se aprecia a los microorganismos de color verde claro, con evidente movimiento.

Euglena vista al microscopio con aumento de 10x.

Con este aumento podemos distinguir las características anteriores y, además, ver como las Euglenas realizan una suerte de cambio de forma: adquieren una forma circular y luego vuelven a su forma de bastones. Se aprecia un punto rojo en el interior: es el núcleo.

Euglena vista al microscopio con aumento de 40x.

Con este aumento, se logra discernir que el movimiento de las Euglenas; es un movimiento de volteo. Adicionalmente a esto, se puede ver sutilmente el flagelo.

Actividad 5: Allium cepa (L.)

Muestras frescas sin tinción

En cuanto a los resultados obtenidos, se pudo observar claramente las paredes celulares, núcleos de las Allium cepa (L.).

Vista al microscopio con aumento de 4x.

Se logran observar celdillas hexagonales que representan la pared celular de células vegetales. También es posible observar los núcleos.

Vista al microscopio con aumento de 10x.

Se logra observar la pared celular y el núcleo de mayor tamaño.

Vista al microscopio con aumento de 40x.

Se logran observar los núcleos ya con un gran tamaño. En el dibujo solamente se lograba apreciar una célula, y partes de células aledañas.

Todas las muestras se observaron de color blanco y negro.

Muestras frescas con tinción de lugol.

En cuanto a los resultados obtenidos, se pudo observar claramente las paredes celulares, núcleos, gránulos de almidón y citoplasma de las Allium cepa (L.) coloreadas debido a la tinción.

Vista al microscopio con aumento de 4x.

Se logran observar celdillas hexagonales que representan la pared celular de células vegetales. También es posible observar los núcleos de color violeta en conjunto con un citoplasma de color amarillo.

Vista al microscopio con aumento de 10x.

Las estructuras antes expuestas se ven de mayor tamaño

Vista al microscopio con aumento de 40x.

Se pudo observar que las zonas con color púrpura son estructuras compuestas por carbohidratos y el color amarillo representa la escasez de los mismos. Gracias a su resolución, es posible observar citoesqueleto.

Discusiones

Dado el anterior registro de resultados respectivos a cada muestra, es necesario analizar y comprender los detalles de cada actividad.

En la actividad n°2, tras la observación de la letra “E”, ocurrió que, con el aumento del lente objetivo de 10x, se vio la letra invertida. Esto se debe a que el objeto se halla fuera de la distancia focal y, al pasar la luz por él, se refracta y la imagen que se forma es de mayor tamaño, invertida y real4. Con el aumento al lente objetivo de 40x, sólo se logró observar una porción de la letra bastante aumentada, por lo que no se pudo diferenciar si estaba invertida o no; pero según los principios físicos de la óptica, la imagen de 40x debió ser invertida, virtual y de mayor tamaño5.

Prosiguiendo con la actividad n°3, la observación de tejido intestinal de Rattus norvegicus, se pudo apreciar mediante la lente de 10X, la presencia de varias vellosidades intestinales, y un espacioso lumen intestinal. Se notó, también, la presencia de unas pequeñas estructuras de color azul oscuro, que por su ubicación en la parte más externa de la vellosidad, y una notable salida hacia el lumen, presenta una alta probabilidad de ser una célula caliciforme, producto de la alta actividad mucígena (lubricadora) necesaria en el intestino delgado. Algunos órganos, como el estómago, no tienen células caliciformes, porque su mismo epitelio es mucígeno6, a diferencia del intestino que necesita acción secretora de lubricación.

Sin embargo, en el laboratorio, se informó que el color de dicha zona se debía a una probable tinción. Utilizando el aumento de 40X, se observó una vellosidad intestinal en forma completa, con un color más blanquecino, correspondiente al vaso quilífero central7.

Respecto al tejido hepático de Rattus norvegicus, visto a través del aumento de 10X, presentó notorios espacios delimitados por membrana, entre los cúmulos de hepatocitos propios del tejido. Estos espacios presentaban un tono rojizo, característico de los diferentes capilares que tienen la tarea de oxigenar cualquier tipo de célula. Con la observación microscópica en un aumento de 40X, sólo eran visibles las aglomeraciones continuas de hepatocitos; la alta presencia de organelos en el citoplasma de estas células, se debe a sus variadas funciones en el organismo, como almacenamiento de nutrientes, formación de bilis, catabolismo del exceso de aminoácidos, destoxificación, entre otros8.

La última muestra de la tercera actividad, fue la observación del frotis de sangre, la cual sólo pudo ser visible, a través de la imagen del computador (no mediante los microscopios usados), en la que se constató las características clásicas de los glóbulos rojos, como su tono rojizo, forma bicóncava, y ausencia de núcleo celular por su alta especialización en el transporte de oxígeno9. Entre las células anteriores, se encontraban, en menor número, y de un tono visible morado, los glóbulos blancos, de forma ameboide, que dan la impresión de ser más pequeños que los hematíes, a pesar que los glóbulos blancos tienen diámetros casi iguales a los glóbulos rojos (7-8 um) como los linfocitos (8-10 um), o mayores como el monocito (15-20 um)10. Sin embargo, la causa que estriba en una apariencia más pequeña que los glóbulos rojos es que la parte morada visible es sólo el núcleo, que, en algunos casos, como los polimorfonucleares, llega a poseer 2 a 5 lóbulos de cromatina condensada.

El resto es el citoplasma, posee gránulos y es carente casi por completo de organelos, lo que le da un aspecto algo más transparente al citoplasma celular11.

En cuanto a la actividad nº4, y como se indicó anteriormente en los resultados, no fue posible la observación de los Paramecios. Esto puede explicarse porque se usó la luz a una alta intensidad al comienzo y durante el práctico, lo que pudo provocar evaporación del agua de la muestra, deshidratando y destruyendo a dicho protozoo, ya que la regulación hídrica es vital en estos organismos de ambiente interno hipertónico, el cual necesita constantemente absorber agua por osmosis hacia sus vacuolas internas12.

A diferencia de lo anterior, las observaciones fueron satisfactorias en los aumentos correspondientes, sobre la Euglena, siendo posible la distinción de algunas estructuras, como el núcleo y el flagelo. Para efecto de todos los dibujos, el color verde se explica por la abundante cantidad de cloroplastos de la Euglena, lo cual nos confirma su característica de microorganismo autótrofo y fotosintético13.

Prosiguiendo, con la actividad n°5, en la comparación de dos muestras de catáfilo de cebolla, mostró cambios notables en los colores de ambas muestras; mientras que en el método sin tinción mostró pared celular y núcleo, la tinción con lugol destacó notablemente las mismas estructuras pero además hace posible apreciar gránulos de almidón y levemente destaca el citoesqueleto de la célula.

Esta coloración se debe gracias al tinte lugol, colorante ácido el cual forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. Este reactivo interacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, que se caracteriza por ser colorido, dando color diferente según las ramificaciones que presente la molécula14.

Conclusión

Como grupo pudimos concluir que, respecto a los resultados obtenidos, la mayoría de las observaciones y detalles concordaron con el respaldo escrito en recursos bibliográficos de ciencia biológica. Las ideas poco claras acerca de algunas observaciones, fueron finalmente comprendidas sin mayores dilemas.

Acerca del trabajo de laboratorio, recapitulamos que es necesario conocer los distintos componentes de los microscopios para su uso adecuado y así trabajar con todas las capacidades del material óptico. Como consecuencias de las actividades, comprendimos que un uso inadecuado de la luz puede atrofiar la muestra, una mala manipulación del tinte puede traer dificultades para observar los componentes vistos y que existen ciertas cualidades sensibles del instrumento que requieren de un uso especial, tal como el objetivo mayor de 100X. Otro de los conocimientos adquiridos a través del desarrollo del laboratorio fueron las capacidades de resolución que posee el microscopio, para facilitar la observación de componentes diminutos incapaces de ser vistos por el ojo humano; también las ventajas y desventajas que involucra trabajar con materiales frescos, o temporales, conservados por diferentes métodos químicos, además de las diferentes estructuras capaces de ser observadas con tintes en muestras biológicas. Por lo anterior, como grupo, hemos logrado lo propuesto en los objetivos principales, y despejado nuestras principales interrogantes planteadas inicialmente.

Bibliografía

• 1-2 Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter, “Biología Molecular de la Célula”. (2004). Ediciones Omega S.A., 4a edición, Barcelona. pp 550.

• 3-4-5 Universidad Andrés Bello, Guía N°2: Microscopía 1, Curso Bio 131, Laboratorio de Biología Celular, 2009.

• 6 “Intestino Delgado”, Wikipedia. La Enciclopedia Libre. http://es.wikipedia.org/wiki/Intestino_delgado

• 7-8-9-10-12-13Eldra Pearl Solomon, Linda R. Berg, Diana W.Martin, “Biología”. (2001). McGraw-Hill Interamericana, 5a Edición. pp 990, 909, 986, 908, 513, 515.

• 11 “Histología general. Tejido conectivo”. Escuela de Medicina. PUC.

http://escuela.med.puc.cl/publ/Histologia/paginas/co19453.html

• 14 “Tinción de Gram”. Guadalupe Guedea Fernández.

http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EElpZEVkykPMncqxmd.php

• Fig.1 - http://tomdiaz.files.wordpress.com/2009/03/001-structure-of-a-euglena1.jpg

• Fig.2 - http://images.encarta.msn.com/xrefmedia/eencmed/targets/illus/ilt/T595289A.gif

Paramecium

Fig. 1

Fig. 2