MICROSCOPÍA ÓPTICA.

INTRODUCCION

Microscopio es una palabra derivada del griego cuyo significado literal es “visión de lo pequeño”; como bien lo indica su nombre, nos permite visualizar elementos que a simple vista no son visibles, o difícil de ver en detalle.

La utilización de lentes para observar elementos aumentados se conocía desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina se vino a desarrollar durante el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon. La invención del microscopio compuesto (combinación de varias lentes) permitió el desarrollo de la microscopía y de avances en materia como la botánica y la biología celular; su invención se atribuye a diversos personajes históricos como Hans y Zacharias Janssen, Galileo Galilei, Cornelius Drebbel, Robert Hooke y Anton van Leeuwenhoek, siendo Hooke, en el año 1655, quien describe las primeras células (celdas) en cortes de corcho, y van Leeuwenhoek, en el año 1674, quien descubre a protozoos y posteriormente bacterias, a los que llamó “animalículos”.

Actualmente el microscopio es un instrumento de uso cotidiano en laboratorios de diagnóstico y de investigación, en diversas áreas como la bacteriología, patología, micología y, como en nuestro caso, en la histología. Por esto es necesario conocer sus componentes y principios de funcionamiento.

Sistema de iluminación: fuente de luz, filtros y diafragma.

Sistema mecánico: base, brazo, platina, tornillos, revolver, tubo y cabezal.

Sistema óptico: condensador, objetivos, prismas y oculares.

Conceptos importantes en microscopía

• Escala de reproducción: es la relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen. Por ejemplo, 4:1, 10:1, 40:1.

• Aumento: es la proporción entre el tamaño de la imagen observada al microscopio y el tamaño real del objeto. Aumento total se calcula multiplicando aumento de ocular por el del objetivo.

• Distancia frontal: distancia entre el objeto observado y la lente del objetivo utilizado, cuando se encuentra bien enfocada la muestra. Es inversamente proporcional al aumento.

• Profundidad de campo o de foco, o poder de penetración: espesor del preparado que se observa con nitidez, o profundidad de planos que están en foco en un momento dado. Con aumentos más grandes se observa sólo pequeños espesores con nitidez, mientras que por arriba y debajo de estos la imagen se desvanece; por lo tanto también es inversa al aumento.

• Campo observado: porción del preparado incluida en la imagen. Su tamaño también es inverso al aumento utilizado y va determinado por el área de campo visual de cada objetivo.

• Poder de resolución (PR): capacidad de los lentes de mostrar separados con nitidez dos puntos. Si el PR es mayor quiere decir que la distancia que separa estos dos puntos es menor. Por lo tanto da una imagen más detallada.

• Límite de resolución: distancia mínima que debe existir para que dos puntos del objeto se visualicen por separado.

• Apertura numérica: medida de la capacidad del microscopio de agrupar las refracciones de la luz producidas por los finos detalles del objeto. Es propia de cada objetivo.

Actividades

Cuadro N°1

Cuadro N°2

• Nombre las partes del microscopio óptico. ___________________________________________________________________

Más información en:

http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioMicroscopia.htm

TÉCNICAS DE PREPARACIÓN HISTOLÓGICAS.

Se denomina técnica histológica a todo aquel conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico con la finalidad de conferirle las condiciones óptimas para observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través del microscopio óptico o electrónico.

Se pueden distinguir dos tipos de procedimientos:

• Toma de muestra: biopsia (muestra de tejido u órgano de un ser vivo) o necropsia (obtener muestras a partir de un individuo muerto).

• Fijación: su fin es dar termino a la vida de las células impidiendo cualquier modificación postmortem (procesos autolíticos), manteniendo así la forma de los tejidos sin cambios notables en ellos. Para esto es necesario aplicar fijadores que se clasifican en dos grupos: OXIDANTES (ácido ósmico, ácido crómico, ácido acético, entre otros) y REDUCTORES (formaldehído, glutaraldehído, alcohol metílico, entre otros). Un fijador debe ser fácil de conseguir y manipular, no debe disolver componentes celulares, debe dar cierta dureza a los tejidos sin llegar al punto de hacerlos quebradizos y debe ser de bajo costo económico.

• Inclusión: corresponde a la formación de un bloque de parafina con la muestra en su interior. Para esto es necesario que la muestra se deshidrate en baños sucesivos de alcohol etílico de distinta concentración (en forma ascendente); luego se aplica algún líquido diafanizador como el xilol (aclaración) y finalmente se forma el bloque de parafina sólida con la muestra en el interior, formando un bloque que posteriormente se secciona para obtener las muestras.

• Obtención del corte: a través del micrótomo, instrumentos mecánicos que permiten obtener cortes de un grosor uniforme a partir del bloque de parafina con la muestra incluida. Los cortes van siendo colocados en el portaobjetos facilitando esto con una gota de agua que “recibe” el corte.

• Coloración o tinción: permite que una estructura celular o tisular adquiera una coloración específica. Se considera teñido cuando al ser lavada la estructura con el disolvente del colorante, esta no se decolora. Colorante es aquella sustancia capaz de transferir su color a otro cuerpo. Los colorantes pueden ser clasificados en:

Los anteriores pueden ser ácidos, básicos, neutros o indiferentes. Son ácidos o básicos dependiendo si la sal posee la parte ácida o básica con color, respectivamente. Las sustancias que atraen los colorantes ácidos se denominan acidófilas (eosina), mientras que las que atraen a los básicos se denominan basófilos (hematoxilina). Los neutros en cambio proporcionan color tanto por su parte ácida como por la básica (azul de metileno, giemsa). Los indiferentes no forman sales, por lo que no poseen capacidad de disociación electrolítica; son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos como el alcohol, y también grasas o lípidos, por ello son utilizados para detectar presencia de estos elementos en las células y tejidos (Sudán III).

Además, de acuerdo a como se tiñen las muestras se reconocen varios tipos de coloraciones.

• Montaje: consiste en agregar alguna sustancia adherente (resina natural como el bálsamo de Canadá, o resina sintética) diluida en xilol sobre el corte colocado en el portaobjetos ya teñido; las resinas deben tener un índice de refracción similar al del vidrio. Finalmente se coloca el cubreobjeto, cuidando que no queden burbujas; se debe dejar que el xilol se evapore y la resina se solidifique a una temperatura de unos 45º a 50ºC durante 24 a 48 horas.

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