Microbiología

Práctica 3: Identificación de un microorganismo: Pruebas bioquímicas.

La práctica consiste en la identificación de un germen procedente de cultivo puro que a su vez procede de un cultivo de los microorganismos presentes en una muestra de pimentón del que se aisló una de las colonias.

Lo primero que hacemos es una tinción de Gram para lo cual hacemos un frotis, con el asa de siembra, en un porta del microorganismo en cuestión que queremos identificar. Ponemos primero una gotita de agua en la que suspendemos la muestra, después fijamos con calor. Una vez fijada procedemos a añadir los distintos componentes de la tinción de Gram: primero el colorante principal, después el lugol, el colorante de contraste y el alcohol.

Nos interesa ver en el microscopio si es Gram positivo o negativo, esporulado o no, y si lo es, saber la forma de la espora (elipsoidal o esférica), la posición (central, central terminal o terminal) y si deforma o no al bacilo.

El resultado es que es un bacilo Gram positivo, esporulado, con la espora central, elipsoidal y que deforma al esporangio.

Si es aerobio, esporulado y Gram positivo, es del género Bacillus, ahora, para afinar más e intentar dar con la especie, hacemos cuatro pruebas bioquímicas.

La primera de ellas es la de Voges-Proskawer en la que se busca la presencia de acetoina o acetil-metil carbonil. Sembramos en un tubo con un medio líquido especial para dicha prueba. Tras la incubación 24-48h a 28ºC añadimos dos reactivos: -naftol en solución alcohólica (etanol) al 6% y una solución de KOH al 40%. Este último reactivo oxida a la acetoina formando diacetilo que se une a un residuo de guanidina del medio en que se hace la prueba, en presencia del -naftol. Se forma en la parte superior del tubo un compuesto rojo ladrillo que nos indica que es Voges-Proskawer positivo (V-P +).

Con la segunda de las pruebas se trata de saber si fermenta a la glucosa produciendo ácido, esto es, si es ácido positivo o ácido negativo. Se hace en un medio líquido glucosado que tiene un indicador de pH: púrpura de bromocresol. Este medio es de color violeta y si produce ácido va a virar a color amarillo, si no lo produce se queda de color púrpura, incluso podría hacerlo de un púrpura más intenso. En los dos últimos casos sería ácido negativo. En nuestro caso, nuestro Bacilo es ácido positivo.

En el mismo tubo de la prueba anterior se introduce una campana de Durham en posición invertida, que dependiendo de que aparezca una burbuja o no, nos va a indicar si es gas positivo o gas negativo. Nuestro microorganismo es gas negativo porque no aparece burbuja. Si hubiera sido ácido negativo solo podría ser gas negativo, siendo ácido positivo se podrían haber dado los dos casos.

La última de las pruebas bioquímicas consiste en investigar la producción o no de -amilasa que es la enzima que hidroliza el almidón. Para realizar esta prueba sembramos previamente, 48h a 28ºC y en posición invertida como siempre, en superficie en una caja de Petri, una o dos pequeñas estrías. Echamos sobre toda la superficie de la placa, incluidas las colonias, Lugol que va a teñir de negro-morado el almidón. Se va a teñir toda la placa y en nuestro caso no se tiñen las colonias ni sus inmediaciones ya que es amilasa positivo, es decir, nuestro bacilo produce -amilasa que ha hidrolizado el almidón. Si hubiese sido amilasa negativo, se hubieran teñido también las colonias.

Con todos los datos de que disponemos nos vamos a una tabla en la que aparecen distintas especies del género Bacillus y si son positivas o negativas con respecto a las pruebas bioquímica que hemos realizado. Además aparece si son esporulados o no y forma y posición de la espora así como si deforman o no al Bacilo.

!Nuestro Bacilo es Gram+, esporulado con espora central, elipsoidal que deforma al esporangio, V-P+, amilasa+, ácido+, gas-.

Según la tabla podría ser: B. subtilis, B. cereus, B. mycoides,

B. licheniformis, B. thuringiensis o B. anthracis.

Anthracis es parásito de animales (causante del carbunco), thuringiensis es parásito de insectos, licheniformis es anaerobio y patógeno al igual que cereus que suele formar cadenas (no es nuestro caso). Lo más probable es que se trate de B. subtilis o de B. Mycoides (del que no he encontrado información).

Para dar más exactamente con la especie deberíamos hacer algunas otras pruebas.