INFORME FINAL DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

TABLA DE CONTENIDO:

INTRODUCCCION

1. GENERALIDADES.

Generalidades a tener en cuenta en el laboratorio.

Estudio microscópico de las bacterias.

Procedimiento para las coloraciones.

Técnicas tintorales.

2. COLORACIONES.

2.1 Laboratorio N º 1 técnica de coloración de Gram.

2.2 Laboratorio N º 2 coloración de esporas.

2.3 Laboratorio N º 3 coloración de ziclh-neelsen (clásica).

2.4 Laboratorio N º 4 coloración de ziclh-neelsen (modificada).

2.5 Laboratorio N º 5 coloración de la cápsula.

2.6 Laboratorio N º 6 coloración de gránulos de volutina.

3. MEDIOS DE CULTIVO.

4. DESINFECTANTES.

5. RECUENTO BACTERIANO

6. ANTIBIOGRAMA.

7. MARCHAS BIOLOGICAS.

8. HONGOS.

BIBLIOGRAFIA.

INTRODUCCION:

El siguiente trabajo ha sido realizado con el fin de presentar un informe sobre las diferentes técnicas de las coloraciones realizadas en el laboratorio de microbiología, así como las diferentes técnicas de cultivo.

En la parte inicial del trabajo se explica algunos factores a tener en cuenta para el manejo del personal, materiales y sustancias utilizadas en el laboratorio. Luego se hace una explicación de las técnicas tintorales y la coloracion de gram.

Enseguida se realiza una explicación detallada de cada uno de los laboratorios realizados. Cada laboratorio contiene objetivos, marco teórico, materiales, discusión y conclusiones.

Después, viene el desarrollo de los distintos laboratorios de medios de cultivo, desinfectantes, antibiograma, marchas biológicas.

La microbiología estudia, como su nombre lo indica, los microorganismos, en toda su extensión teniendo en cuenta sus estructuras y fisiología. Para este estudio la microbiología actualmente usa varios métodos para llevar a cabo sus estudios, entre estos métodos esta el de las coloraciones, usadas comúnmente en el laboratorio. Dichas coloraciones determinan la morfología del microorganismo estudiado, habiendo un colorante especial para determinar una característica esencial de la bacteria o de microorganismos en estudio, sin embargo para poder observar dichos organismos se necesita la ayuda de un microscopio, con el cual se observan las estructuras coloreadas y facilitan su estudio.

Las principales estructuras que se analizan en un laboratorio por medio de las coloraciones son entre otras: esporas, flagelos, cápsulas, gránulos metacromaticos o de volutina, pared celular, etc.

GENERALIDADES:

GENERALIDADES A TENER EN CUENTA EN EL LABORATORIO:

1.1.1 VÍAS DE INFECCIÓN: Los microorganismos pueden penetrar en el organismo a través de la boca (ingestión), por los pulmones (inhalación), a través de la piel (inyección), o por los ojos.

1.1.2 PREVENCION DE LAS ENFERMEDADES ADQUIRIDAS EN EL LABORATORIO:

principios de contención suponen la creación de:

Barreras primarias alrededor de los microorganismos para impedir su dispersión en el laboratorio.

Barreras secundarias alrededor del operador para que actúen como una red de seguridad si se rompieran las barreras secundarias.

Barreras terciarias que impidan alcance a la comunidad cualquier germen que no sea contenido por las barreras primarias y secundarias.

1.1.3 EQUIPO DE LABORATORIO:

• MICROSCOPIO: Devén estar provistos de oculares condensadores de gran campo. Los mas útiles para bajar aumentos son los de X 5 y X 10 y para microscopio de grandes aumentos (Inmersión en aceite) son aconsejables los objetivos fluorados X 50 y X 100.

• ESTUFAS: En los laboratorios médicos y veterinarios las estufas operan generalmente solo a 35-37º C. El laboratorio de microbiología alimentaria y el industrial requieren aparatos que trabajan a 55º, 28º-32º, 15º-20º C.

• BAÑOS: El contenido de un tubo de ensayo introducido en un baño María alcanza la temperatura deseada muchos mas rápidamente que en una estufa. Por esto dichos instrumentos se utilizan en incubaciones de corta duración.

• CENTRIFUGAS: Para microbiología es necesario una centrifuga capas de llevar portatubos de 15 y 50 ml. Y de funcionar a una velocidad máxima de 4.000 rev/min.

• Cabinas de seguridad: Utilizadas para aprensar y retener partículas infectadas transmitidas por el aire que se liberan en el curso de determinadas manipulaciones, por lo tanto protege a la persona del laboratorio.

TRATAMIENTO DE MATERIALES:

• Se deben llevar puestos guantes, tapabocas y delantales para su manipulación, para su desinfección se utiliza hipocloro Na. Dividido 1-5 o 1-10, formol al 10%, fenol, jabón tejo entre otros.

• Eliminación de Materiales:

• Líquidos : se evacuan por desagüe las salidas de líquidos a cañerias

• Materiales Contaminados: se esteriliza en un autoclave, tubos.

• Material Sólido: Caja Petri, se retira el material con una espátula y se coloca en bolsas negras. El material patógeno se coloca en bolsas rojas y luego se esteriliza las cajas de Petri

• Lavado de material: El material se lava en agua caliente y se utiliza jabón tego como bactericida neutro. Después se hace dos lavados con agua corriente y luego se lava con agua destilada.

• Secado de material: Tiene dos tratamientos.

• Colocar el material al medio ambiente y destaparlo para eliminar los residuos de agua.

• Colocar el material en una estufa u horno.

• Pipetas : se envuelven en un papel mantequilla o papel kraft que soportan temperaturas de esterilización 120-180ºC luego se pega con una cinta control a cinta de autoclave, cuando llega a temperaturas de esterilización aparecen franjas negras. Se le debe marcar la fecha de esterilización y el volumen de la pipeta.

• Cajas Petri: se encuentran en papel mantequilla o kraft, en paquetes hasta de 10 cajas.

• Esterilización del Material:

• Se matan la bacteria por dos métodos principales:

• Vapor húmedo: se coloca el material en un autoclave a 121ºC por 20 seg.

• Calor seco: se coloca el material en un horno a 180-200ºC por 2 horas, solamente material de vidrio o metálico.

• Almacenamiento de material: El material se debe guardar en sitios cubiertos como bodegas o alacenas.

1.2 ESTUDIO MICROSCOPICO DE LAS BACTERIAS:

1.2.1 OBSERVACION DE CELULAS SIN TEÑIR:

Leeuwenhoek en su siglo, y otros microbiologos de la mitad de siglo pasado, tuvieron que observar bacterias sin teñir. Las ventajas del estudio directo de las células vivas en su forma, disposición y tamaño natural fueron antagonizadas por el hecho de que el índice de refracción del protoplasma de microbios se acerca al agua y por ello las células y sus estructuras no pueden diferenciarse en forma neta entre sí y del liquido en que están incluidas.

1.2.2 EL MONTAJE HUMEDO:

Tipo corriente de presentación de las bacterias que se emplea aun. Se coloca en un portaobjetos una gota de cultivo de caldo y se le pone un cubre objetos. Pueden examinasen el organismo vivo con el objetivo de poca potencia y objetivo seco de alta potencia (esto es, 43X). El diagrama del condensador de abbe se cerrara parcialmente para que el haz luminoso sea de poco diámetro, por lo contrario, las células no se distinguirán del medio si se desea el estudio de los organismos se prefiere el método de gota suspendida. Se emplea un portaobjetos especial con una cavidad en uno de los lados. Se coloca el cultivo en un cubreobjetos limpio y se invierte para quedar sobre la depresión que obtura con agua, aceite o petrolato estudia con el objeto de poco aumento. Este tipo de montaje tiene utilidad especial para la observación continua de la movilidad bacteriana o para observar el crecimiento de células individuales de un microcultivo.

COLORACIONES BACTERIANAS:

El estudio microscópico de las bacterias se facilitan notablemente al tratarlas con colorantes o tintes. Con mas facilidad se aprecia la forma y tamaño relativo de los microorganismos teñidos; el colorante también permite la observación de ciertas estructuras celulares.

1.3 PROCEDIMIENTOS PARA LAS COLORACIONES:

1.3.1 RADICALES DE CROMOFORO Y AUXOCROMO:

Los colorantes son compuestos orgánicos que contienen radicales cromoforos, esto es, que producen color, y grupos de auxocromos que forman sales. Los grupos nitro (-NO2) y azo (-N=N) son cromoforos; los radicales hidróxido (-OH) y amino (-NH) es grupos auxocromo permiten la coloración de una de las fibras o tejidos, muchos colorantes de comercio son sales, pero se denominan colorantes basicossi la porción coloreada actúa como base, o ácidos si actúa como ácido. Pueden obtenersen colorantes básicos en forma de sales de sodio. Los colorantes ácidos en forma de sales de sodio. Los colorantes ácidos se emplean para teñir materiales básicos; v.gr; citoplasma, en tanto que los colorantes básicos coloran núcleos, algunos gránulos y otras sustancias ácidas.

1.3.2 MECANISMOS DE COLORACION:

La coloración de células y tejidos quizá sea una combinación de fenómenos físicos y químicos. Los fenómenos físicos de absorción, a pilaridad y osmosis participan en cierto grado. Por otra parte, la afinidad de los colorantes básicos por los tejidos ácidos y viceversa indica que hay reacciones químicas que conducen a la formación de nuevos compuestos.

1.3.3 PREPARACION DE FROTIS BACTERIANOS PARA COLORACION:

Antes de la tincion, las bacterias suelen encontrarse en agua u otro liquido en un portaobjeto limpio y fueron extendidas en una película uniforme y delgada. Se hace que la película seque en el aire, y los microorganismos son "fijados" al portaobjeots por substancias químicas o por calor moderado. Se conoce a dicha preparación como frotis o extensión fija.

COLORANTES SIMPLES:

Un colorante simple es una solución de colorante, por lo regular en agua o alcohol o agua. Muchas bacterias contienen material ácido distribuido en forma mas o menos uniformes en su célula. En consecuencia se coloran intensamente con colorantes básicos; v.gr; azul de metileno, violeta de cristal o fucsina carbolico (solución de fuscina básica en ácida carbolico por 100). El tiempo necesario para la coloración varia con la dilucion del colorante: de uno a cinco minutos para el azul de metileno, 15 segundos para el violeta de cristal.

Las extensiones teñidas son lavadas brevemente con agua, para quitar el exceso de colorante, secadas en el aire y después de ello quedan lista para el examen.

Se emplean colorantes sencillos para apreciar la forma, la disposición y el tamaño relativo de las bacterias y son útiles para identificarlas. No obstante, no muestran detalles finos de la estructura interna.

COLORANTES DIFERENCIALES O POR CONTRASTE:

Los métodos de tincion diferenciales hacen que distingan las estructuras intracelulares o distinguen un tipo de células de otro. Pueden empleasen dos colorantes, y en la preparación final algunas estructuras celulares tipos de células tienen un color, y el resto otro. El primer aplicado es el colorante primario. Después de el puede hacer la difenciacion: aplicación de una solución que quita el colorante primario a algunas células o estructuras. El otro colorante, conocido como el colorante secundario o de contraste, se aplica. Para diferenciación de bacterias se emplea ampliamente la coloración o tincion diferencial.

TECNICAS TINTORALES:

Las coloraciones se basan en la utilización del benceno (C6H6) que es una substancia que de acuerdo a la carga negativa que se utilice se pueden diferenciar los colorantes básicos.

Él termino ácido o básico indica la parte del cronogeno por los grupos positivos o negativos que están en la bacteria, se utilizan radicales básicos.

Los colorantes ácidos o anionicos actúan de preferencia con Elion colorante (-) sobre los radicales de la bacteria. Los colorante básico o cationicos actuan como carga positiva sobre las partes (-) de las bacterias.

En las coloraciones se emplean mordientes, que son sustancias químicas que fijan los colorantes o facilitan la penetración dentro de la estructura bacteriana. Los mordientes más comunes son a base de : Yodo, ácido tónico, anilina, Yodoro de potasio y fenol.

DECOLORANTES:

Sustancias que se emplean para decolorar el colorante principal como: alcohol, acetona ácidos ( clorhídrico sulfúrico).

PROCEDIMIENTO PARA COLORACION:

(medio de cultivo sólido):

Las bacterias pueden crear en medios sólidos.

Desengrasar la lamina portaobjetos

Colocar una gota de agua destilada dentro de la lamina.

Quemar el asa y luego enfriar en el sitio donde no hay cultivo (caja Petri).

Tomar la muestra superficialmente y luego difundirla sobre la gota de agua destilada.

Fijar al calor hasta que se seque el frotis (para que las proteínas se adhieran a la lamina).

Marcar la lamina, en la parte de atrás a la que se encuentra la muestra.

( medios de cultivo liquido):

Desengrase la lamina portaobjetos.

Colocar la gota de agua dentro de la lamina.

Quemar el asa y tomar la muestra.

Colocar dos gotas de cultivo en la lamina y luego difundirla.

Fijar al calor hasta que seque el frotis.

Marcar la lamina por detrás de donde esta la muestra.

Iniciar la coloración.

• COLORACIONES:

LABORATORIO Nº 1 técnica de coloración de gram.

OBJETIVOS:

• Diferenciar bacterias gram (+) y gram (-)

• Observar la pared de esta bacterias.

• Reconocer la coloración de estas bacterias.

MARCO TEORICO:

Coloración de gram: por cristian gram en 1984. Sirve para diferenciar grupos de bacterias. El primer grupo bacterias gram (+) que tiene la pared gruesa y pueden fijar el colorante principal. El segundo grupo gram (-) que tiene la pared delgada y no pueden fijar el colorante principal.

Las bacterias gram (+) son de color violeta basado en la teoría de benians, que aseguro y demostró que el cristal violeta como colorante principal se mezcla con el yodo y forman un complejo yodo violeta, los cuales se muestran dentro del peptidoglucano y no pueden ser coloreado en las bacterias gram (-) no se forma grumos y son lavados fácilmente al agregarle el colorante de contraste. La pared de estas bacterias va a tomar el color rojo.

TINCION DE GRAM: El de coloración de gram es él mas empleado en bacteriología. Según se dividan las bacterias en dos grandes clases gram positivas y gram negativas; aun más, la reacción de gram guarda relación con otras propiedades de un microorganismo.

Después de aplicar el colorante primario, violeta cristal, se aplica una solución de yodo que actúa como mordiente y fija el colorante primario a los organismos gram positivos.

Después de ello se decolora la extensión por lo regular con alcohol 95% y de colora diferencialmente con un colorante de contraste v.gr : Safranina. Los microorganismos que conservan el colorante primario violáceo se llaman gram positivos; las células gram negativas pierden el colorante primario al decolorarse con alcohol y se coloran con el colorante secundario, SAFRANINA.

MECANISMO DE LA COLORACION DE GRAM:

En el pasado se propusieron las teorías químicas y de permeabilidad de la pared celular excitar el mecanismo de tincion diferencial de gram. En la actualidad se sabe que la permeabilidad de las pares celulares de las bacteria gram positivas y gram negativas difieren con las circunstancia en la etapa de coloración y este factor permite la perdida de colorante primario en los últimos microorganismos. Los constituyentes protoplasmáticos de la célula gram positivas y gram negativas se combina con violeta de cristal por un enlace ionico entre grupos ácidos y un grupo básico del colorante. El colorante, al quitarlo de la proteína celular o al añadirlo al complejo de la proteína celular o al añadirlo al complejo de proteína colorante.

Se piensa que el alcohol al 95% deshidrata las paredes de la célula gram positivas recibieron el mordiente y forma una barrera que incluye el complejo yodo-violeta cristal. Dicha "barrera" no se forma en las células gram negativas. Se sabe que las paredes de los microorganismos contiene un porcentaje alto de lípidos en comparación con los muchos microorganismos gram positivos, y en consecuencia, la solubilidad de los lípidos superficiales en alcohol quizás sea un factor que participe en la mayor facilidad de decoloración de las células gram positivas. No obstante, se necesita estudios anteriores para detectar estas cifras.

No hay linea neta de demarcacion entre los microorganismos gran positivos y gram negativos, hay una graduacion continua entre las especies que conservan el colorante primario, incluso despues de colorarlas varias horas, hasta hasta las especies que se decoloran en terminos de segundos. Los cultivos envejecidos de muchos microorganismos considerados gram positivos contienen numeros cresientes de celulas gram negativas. Algunos frotis individuales contienen celulas gram negativas y gram positivas, se han demoninado dichos cultivos GRANVARIABLES, conviene estardarizar los metodos cuidadosamente para obtener resultados constantes y fidedignos, y es necesario valorar y estudiar los resultados con los microorganismos, testigos de los que se conozcan la reaccion de gram, especialmente el trabajo critico de importancia.

MATERIALES:

• Asa

• Lamina porta objetos

• Lapiz de cera

• Cinta de enmascar

• Microscopio

• Papel absorvente

REACTIVOS:

• Cristal violeta

• Lugol

• Alcohol acetona

• Fucsina fenicada

PROCEDIMIENTO:

Despues de realizar los pasos de prosedimiento para la coloracio.

Adicionar el colorante principal (cristal violeta gram) y dejarlo durante 1 minuto.

Lavar con agua corriente.

Agregar mordiente (lugol) y dejarlo durante un minuto.

Lavar con agua corriente.

Adicionar el decolorante (alcohol acetona) dejarlo durante 20 segundos.

Lavar con agua corriente para retirar los residuos del colorante.

Agregar el colorante de contraste (fucsina o safranina gram) dejarlo por un minuto.

Lavar con H2O corriente.

Secar al medio ambiente o envolver la lamina suavemente en papel absorvente.

Colocar una gota de aceite de inmersion de microscopio.

Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DUSCUCIONES:

Al observar la lamina en el microscopio se observaron formaciones bacterianas de clor violeta y rojo que son los colores que toman las bacterias gram (+) y (-) respectivamente; al adicionarles, debido al complejo que forman o no de yodo-violeta.

DIFERENCIAS ENTRE GRAM POSITIVAY GRAM NEGATIVAS:

Bacterias gram positivas.	Bacterias gram negativas.
Contienen ribonucleato de magnesio.	No contienen ribonucleato de magnesio.
Muy sencibles a los colorante de trifenilmetano (v.gr. violrta cristal).	Son menos sencibles a los colorantes de trifenilmetano.
Sencibles a la penicilina.	Sencibles a la estreptomicina.
No son disueltos por KOH al 1%	Son disueltos por KOH al 1%
Su punto isoelectrico esta entre ph de 2 a 3.	Punto isoelectrico entre ph de 4 a 5
Cilindricos que forman esporas, muchos cocos (tambien las especies de lactobacillis y corynebacterium).	La mayor parte son basilos.
Toxinas (siaparen): exotoxinas.	Espirilas y cocos que no forman esporas.

CONCLUSIONES:

• Las formaciones bacterianas observadas de color violeta, corresponden a bacterias gram (+).

• Las formaciones bacterianas observadas de color rojo corresponde a bacterias gram (-).

• Se observo que las bacterias gram (+) tienen una pared mas gruesa que las gram (-).

LABORATORIO Nº 2 Coloracion de esporas:

OBJETIVOS:

• Identificacion de las siguientes esporas:

Bacillos: Anthacis, subtilis, cereus.

Bacillaccae:

Clastridiun: chavvoi, septicon, tetani, butulinou.

MARCO TEORICO:

Endosporas

Presentacion:

Las esporas son cuerpos de gran resistencia producidas en el interior de las celulas de ciertas bacterias. Se encuentrantodas especies de la familia bacteriacceae, que se divide en dos generos. Bacillus (cilindros esporangidos) y clostridium (cilindros maerobios esporangenos). Una bacteria generalmente produce solamente una espora. No conviene considerar a la esporulacion como un metodo de manipulacion de las bacterias como lo es en los mohos y levaduras.

CARACTERISTICAS FISICAS Y FISIOLOGICAS:

Las endosporas tienen forma esferica o eliptica y pueden estar situadas en cualquier sitio de la celula original o esporangio. Su diametro puede ser menor del resto del esporangio, igual al mismo, o mayor. Una celula con endospora central muy grande se asemeja a un, y por ello no se le denomina clostridio. Un plectridio es un esporangio, que contiene una endospora terminal de mayor tamaño. El tamaño de las endosporas difiere de una especie a otra; esta caracteristica suele tener cierta utilidad para clasificasion.

Las endosporas bacterianas no teñidas tiene gran capacidad de refraccion cuando se observan en el microscopio. Los metodos corrientes de coloracion tiñen solamente la capa esterna del revestimiento de la espora. El minterior de la espora puede ser teñida si se aplica calor. Este metodo aumenta la permeabilidad de la cubierta de la espora y permite la penetracion del colorantes intensos; por ejemplo: verde de malaquita o carbolfucsina y la coloracion intensa del citoplasma. Las endosporas teñidas resiten la decoloracion y pueden distinguirsen facilmente de las celulas vegetales u otras partes de los esporangios.

La estructura fina de las endosporas difiere algo de una especie a otra. En terminos generales, no obstante hay un centro rodeado por una membrana fina, la pared de la espora. En muchas especies se transformara en la pared celular del basilo futuro. Arededor de la pared se encuentra una segunda capa, esta capa esta incluida en dos cubierta de la espora (según la especie). Una cubierta de la espora puede ser lisa, arrugada o elevada en bordes, a veces con forma geometrica. (v. gr. Haxagonal). Por utimo todo lo anterior puede estar incluido en un EXOSPORIO, que se une intimamente a los lados pero que sobresale en el extremo de la espora.

Las esporas son, de los cuerpos vivos, las que mas resisten la accion del calor, desecacion y substancias quimicas toxicas, pero hay gran variacion entre las especies, algunas endosporas mueren en un termino de minutos a 80 a 90º C, en tanto que otras especies a la ebullacion duradera. Las esporas de un bacilo resisten 100º C. Incluso 20 horas. Hay variaciones entre las endosporas de un cultivo, algunas sobreviven la exposicion a un agente mortal, mas que las demas.

La resistencia notable de las endosporas indica su composicion quimica o estructura fisica diferente radicalmente de la de las celulas originales. El analisis quimico muestra que las endosporas contienen DNAY RNA, proteinas, lipidos, carbohidratos varias enzimas y minerales. Su concentracion hidrica es aproximadamente 25% menor que la de las celas vegetativas. Se ha sugerido que la proporcion de agua "unida", en relacion con el agua libre en las esporas, es mayor que en las celulas vegetativas. Ademas de ello, las esporas contienen mayor cantidad de calcio. Algunas de las proteinas son identicas a las que se encuentran en vegetativas, pero tambien se han encontrado proteinas peculiares de las endosporas. La formacion de una endospora, en consecuencias, entraña nueva sintesis e incorporacion de los constituyentes de la celula vegetativa.

Uno de los caracteres mas probables de las endosporas es la presencia de un compuesto acido dipicolinicoque se encuentra en todas las esporas examinadas y falta en las celulas. Comprende de 5 a 15% del peso seco de la espora. El acido dipicolimpeptido y otras sustancias, son producidas las esporas en germinacion y en forma simultanea se pierde la resistencia de las mismas. En consecuencia, parece que el acido dipicolinico depende la resistencia de la espora.

La actividad metabolica de las endosporas es bastante reducida. Incluyendo 3 o 4 enzimas y otras que estan enestado inactivo.

Se cuenta con datos que algunas de las enzimas y otras sustancias termolabiles en las endospras normalmente esta unidas en forma de compuestos quimicos con el acido dipicolinico y quiza con peptidos y calcio, estos complementos son noatblemente resistentes a la resistencia y a la baja actividad metalica de las esporas contribuyen con otros factores. La impermeabilidad del revestimiento de la espora impide la entrada de sustancias quimicas nocivas. El citoplasma deshidratado de la esfera no es util para calcular tipo de actividad quimica. Se ha mencionado este factor en la explicacion parcial de la imposibilidad de teñir las esporas, inactivas.

El primer signo de la formcion de esporas suele apreciarse como una cubierta eliptica de poca intencidad o una mancha clara en el citoplasma granuloso en un extremo de la celula. Esta zona poco a poco se hace mas densa que el resto del citoplasma y se colorea mas intensamente con los colorantes basicos hasta que forma una cubierta de la espora. Se demomina esta estructura primordio de la espora. Aumenta la capacidad y la viscosidad locales, y en termino de poco tiempo se desarrolla la pared de la espora, los revestimientos y la corteza.

El acido dipicolinoco es sintetizado anteriormente en el femomeno de formacion de la espora. Las celulas vegetativas estan mas o menos llenas de cromatina en forma de filamentos granulosos o de una barra larga. Un fragmento corto de cromatina en forma de filamentos granulosos o de una barra larga. Un fragmento corto de cromatina cerca del extremo de la celula se desplaza a la punta. Y este puede teñirse intensamente, y despues de transforma en un filamento helicoidal. en algunas especies hay datos de division y fasion de los cuerpo cromatinicos. A medida que se alarga el primordio de la expora en cresimiento, el filamento de cromatina se arroya en forma de 8 y su capacidad de coloracion poco a poco disminuye por la presencia de un material que se colora fuertemente y que quiza no es DNA, corriente. Este fenomeno se puede suele durar media hora.son dificiles apreciar los cuerpos cetonicos pero parece encontrarce serca de la superficie del citoplasma de la espora en forma de filamentos o cordones unidos.

Las esporas, en este momento tienen capacidad de refreccion caracteristica y resistencia la coloracion.

La etapa final o de maduracion y liberacion de la endopora, quiza necesita algunas horas. El esporangio, por lo regular esta vivo y es metabolicamente activo poco despues que se forma la endospora, peropor ultimo inicia la autolisis, es el metabolismo dirigen el propio protoplasma.

COLORACION DE SHAFFER- FULTON:

PROCEDIMIENTO:

que se absorva el colorante.

Calentar al mechero durante 5 minutos, procurarno no dejar hevir, el calor es el Adicionar colorante principal (verde de malaquita.) debe cubrir bien el frotis para mordiente.

Lavar con agua corriente.

Adicionar el colorante de contraste (safranina) y dejarlo en contacto por 30 segundos.

Lavar con H20 corriente.

Secar la lamina al medio ambiente.

Observar al medio ambiente.

MATERIALES:

• Asa.

• Lamina porta objeto.

• Lapiz de cera.

• Cinta de enmascarar.

• Microscopio.

• Papelabsorvente.

REACTIVOS:

• Verde de malaquita.

• Safranina.

• Fucsina fenicada.

• Alcohol acido.

• Azul de matileno.

COLORACION DE HANSEN:

PROCEDIMIENTO:

Adiciodar el colorante principal (fucsina fenicada.)

Calentar durante 5 minutos sin dejar hervir.

Lavar con agua corriente.

Decolorar con acido ascetico por 20 segundos.

Lavar con agua corriente.

Adicionar el colorante de contraste ( azul de metileno.) por 5 minutos.

Lavar conagua corriente.

Dejar secar la lamina.

Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSIONES:

• En la lectura de la coloracion de shaffer-fulton se observaron formaciones de color

verde que corresponde a las esporas; ese color es devido a la adicion del colorante principal que es el verde de malaquita. Las formas vegetativas se observaron de color rojo. Debido a la adicion de safranina.

• En la lectura de la coloracion de hansen se observaron de color rojo, que corresponde a las esporas; el color es debido a la adicion de fucsina fenicada. Que es el colorante principal. Las formaciones vegetativas se observan de color azul, debido a la adicion de azul de metileno como colorante de contraste.

CONCLUSIONES:

• En la coloracion de shaffer - fulton, las bacterias se observaron de color verde.

• En la coloracion de hansen, las bacterias se observaron de color rojo.

LABORATORIO Nº 3 Coloracion de zielh-neelsen (clasica).

OBJETIVO:

• Determinar microorganismos que no se puedan detectar con la coloracion de gram.

MARCO TEORICO:

Coloracion acidorresistente. Las microbacterias (v.gr; : M. Tuberculosis y M. Leprae) a semejanza de las endosporas, son dificiles de teñir, pero una vez teñidas con el colorante en forma permanente y pueden resistir el lavado con acido diluido.

En el metodo de ziehl- neelsen el colorante primario, carbofucsina, se calienta hasta la ebullicion durante cinco minutos; despues se decolora el frotis brevemente con H2SO4 o HCI alcoholico diluido y se colora con contraste con azul de metileno para revelar la presencia de organismos no acidorresistentes. Las bacterias acidorrecistentes conservan el colorante primario color de rosa o rojo; los demas microorganismos son decolorados por el acido y toman color azul.

La propiedad de acidorresistencia parece parese asociarse con la presencia de grandes cantidades de material lipoide, que puede comprender incluso 40% de la sustancia celular de M. Tuberculosis. Se ha dicho que el complejo colorante - fenol de la carbofucsina es mas soluble en los constituyentes celulares lipoides, que las mismas bacterias lo conservan pero no son el agente de decoloracion; en coosecuencia, microorganismos que caresen de gran concentracion de lipidos.

MATERIALES:

• Asa

• Lamina porta objetos

• Lapiz de cera

• Cinta de enmascarar

• Papel absorvente.

• Microscopio.

REACTIVOS:

• Fucsina fenicada.

• Alcohol acido.

• Azul de metileno.

PROCEDIMIENTO:

Despues de realizar los pasos del procedimiento de coloracion:

adicionar colorante principal (fucsina fenicada).

Soleter a calentamiento sin dejar hervir. ( solo, formacion de gases), durante 5 minutos.

Lavar con agua corriente.

Decolorar con alcohol acido y dejarlo 20 segundos.

Lavar con agua corriente.

Adicionar azulde metileno y dejarlo durante 30 segundos.

Lavar co agua corriente.

Dejar secar al medio ambiente.

Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUCIONES:

Al observar al microscopio la lamina de la coloracion de zielh - neelsen se observaron unos mocrorganismos de color azul y otros de color rojo. El color rojo corresponde a las bacterias, acidorresistentes, los demas microorganismos son decolorados por el acido y toman el color azul.

CONCLUSIONES:

Cuando son teñidas las microbacterias conservan el colorante y pueden resistir el lavado con acido mineral.

La propiedad de acidorresistencia se asocia a la cantidad del material lipoide.

LABORATORIO Nº4 zielh - neelsen (modificada):

OBJETIVOS:

• Coloracion de brucella.

• Reconocimiento de brucella.

MARCO TEORICO:

El genero brucella contiene microorganismos patogenos del grupo de riego III. (patogeno que produce generalmente enfermedad humana grave, pero que no se difunden de ordinario de un individuo afectado a otro); todas las manipulaciones que pueden producir aerosoles deben hacerse en cabinas bacteriologicas de seguridad en laboratorios y pruevas de gas. Hay en este genero tres especies importantes y otras varias mas pequeñas bacilos regulares gram - negativas. No son moviles, reducen los nitratos, pero no atacan a los carbohidratos cuando se emplea metodos de cultivo normales.

IDENTIFICACION:

Las colonias en los medios primarios son pequeñas, plantas o ligeramente elevadas y translucidas. Se hacen subcultivos en tubos inclinados de agar triptona glucosado con un papel de acetato de plomo humedecido en la parte superior del tubo. Para comparar la produccion del sulfuro de hidrogeno. Se hacen ensayos de inhibicion por cabrantes. En los laboratorios de referencia se utilizan tres concentraciones de tionina.

(1:25.000;1:50.000 y 1: 100.00) y dos de fuchina basica (1:50.000 y 1: 100.000) para identificar los giotipos.

Con fines diagnosticos, se siembran tubos de medios preparados brucella fionina y brucella fionina y brucella fudrina o se emplea agar suero triptona glucosado que contenga:

1: 50.000 de tionina.

1: 50.000 de fuchina basica.

Se siembran los tubos o placas con un asa pequeña de un cultivo de 24 horas.

ESPECIES DE BRUCELLA:

Crecimiento en: necesita

Tipo de brucella	Fuchina	tionina	CO2	H20
B. Melitensis	+	+	-	-
B. Abortus	+	-	+	+
B. suis	-	+	-	+

BRUCELLA MELITENSIS:

crecen en agar. Sangre y agar suero triptona glucosado aerobicamente en 3 o 4 dias, no precisa dioxido de carbono para iniciar el crecimiento. Produce sulfuro de hidrogeno y no se inhibe por la fuchina o tionina. En las concentracciones utilizadas en los mdios comerciales.

Este organismo causa la brucelosis humana, fiebre mediterranea o de malta o fiebre ondulante. Los reservorios son las ovejas y las cabras y la infeccion se produce por la ingestion de la leche.

BRUCELLAS ABORTUS:

precisa de 5 - 10% de dioxido de carbo par inicir el crecimiento, form sulfuro de hidrogeno y se inhibe por la tionina pero no la fuchina. Causa el aborto contagioso del ganado vacuno. La ingesta de leche puede producir leche ondulante en el hombre enel hombre, siendo frecuentamente afectados los veterinarios y ganaderos por los aerosoles liberados durante el parto del aborto de los animales infectados.

BRUCELLA SUIS:

Esta especie no requiere dioxido de carbono para su crecimiento primario. Las cepas americanas producen abundante sulfuro de hidrogeno pero las cepas daneses no lo forman. Se inhibe por la fuchina, pero no por la tionina. Produce el aborto contagiosos del ganado y puede infectar al hombre, renos y gasos.

MATERIALES:

• Asa.

• Lamina porta objetos.

• Lapiz de cera.

• Cinta de enmascarar.

• Papel absorvente.

• Microscopio.

REACTIVOS:

• Fuchina fenicada.

• Acido sulfurico.

• Azul de metileno.

COLORACION ZEELH NEELSEN (MODIFICADA):

PROCEDIMIENTO:

Despues de realizar los pasos del procedimiento de coloracion:

Adicionar colorante pricipal ( fuchina fenicada) y dejarlo durante 10 minutos. (mordiente).

Lavar con agua corriente.

Lavar suavemente con agua corriente.

Decolorar con acido sulfurico y dejarlo durante 20 segundos .

Adicionar azul de metileno y dejarlo durante 30 segundos.

Lavar con agua corriente.

Agregar aceite de inmersion.

Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSION:

Al observar la coloracion de koster al microscopio, se observaron formaciones de color rojo rosado que correspondian a la brucella; el color de la brucella, era debido a que conservaba el colorante principal y el resto de la bacterias se observaron de color azul por que fueron decoloradas por azul de metileno.

CONCLUSIONES:

• La brucellas no se tiñe facilmente, pero cuando es teñida por el colorante principal; lo mantiene.

• La brucellas es un coco - bacilo generalmente aislado.

LABORATORIO Nº 5 Coloracion de la capsula.

OBJETIVO:

• observacion y reconocimiento de capsula.

MARCO TEORICO:

Fuera de la pared celular de casi todas las bacterias se encuentra una capa material a la que se le demomina según su espesor, composicion y solubilidad, microcapsula, capsula o material laxo.

La microcapsula es una capsula bastante delgada compuesta de proteinas, polisacaridos y lipidos. La sustancia laxa es semejante a las capsulas pero no es mas soluble en el medio en el que se encuentran y tienen menor integridad extructural.

Las capsula son estructuras gruesas, viscosa y gelatinosas que rodean las celulas de algunas especies. Algunas, capsula tiene extructuras precisas; otras quizas sean amorfas.

Se coloran debilmente y suelen demostrarsen por un metodo de coloracion por contraste o negativo en que se coloran el fondo y las demas extructuras celulares y las capsulas que dan en colores.

Las capsulas de los neumococos de algunos estreptococos incluyen polisacaridos; algunos de los distintos tipos de neumococos tienen un polisacarido distinto desde el punto de vista quimico. La capsula y la sustencia laxa de algunas de las bacterias esporogenas gram (+) son polipeptidos.

La capa extramural no es parte integral o esencial de la celula. Puede quitarse sin lesionarse y la celula la substituye. La presencia y cantidad de material capsular y el laxo depende de la composicion genetica del organismo y del medio. Las formas mutantes pueden tener mayor o menor grado dicho material que las forman normales. La formacion de la capsula y de la sustancias laxa son facilidades por medio que contengan azucares adecuados por ejemplo sacarosa desencadena la producion de capsula o sustancias laxa en algunos organismos que pueden utilizar la porcion de fructosa de la molecula, la porcion de destrosa no acumula un dextramo de alto peso molecular.

Las capsulas protegen a las bacterias contra la desecacion y otras agentes nocivos, resisten la fagocitosis, fenomeno de defensa en el leucocitos u otras celulas tisolares ingieren los cuerpos extraños y los dirigen. Las variantes no capsudas de los microorganismos a los que se les quitan las capsulas son ineridos facilmente por celulas fagociticas.

Las capsulas de las bacterias son causas de perdidas monetarias en las industrias alimenticas y de la leche, los jarabes y otras soluciones sacarinas presentan aglutinacion cuando se contaminan algunas bacterias encapsuladas.

MATERIALES:

• Asa.

• Lapiz de cera.

• Lamina porta objetos.

• Cinta de enmascarar.

• Papel absorvente.

• Microscopio.

REACTIVOS:

• Coloracon de Hiss.

• Cristal violeta.

• Sulfato de cobre.

• Coloracion de antony.

• Cristal violeta.

• Sulfato de cobre.

HAY DOS TIPOS DE COLORACIONES:

COLORACION DE HISS:

PROCEDIMIENTOS:

Despues de realizar los pasos de procedimientos de coloracion:

Fijar el frotis al calor.

Adicionar colorante principal ( cristal violeta).

Calentar durante un minuto (mordiente) en formacion de vapor pero sin dejar hervir.

Addicionar el colorante de contraste (sulfato de cobre) para retirar un poco el cristal.

Secar al medio ambiente.

Adicinar una gota de aceite de inmersion.

Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DICUSION:

Cuando se obsevo la coloracion al microscopio, la capsula se observo como un halo de color azul; translucido, alrededor de la bacteria se observo de color violeta.

COLORACION DE ANTHONY.

Despues de realizar los pasos del prosedimiento de coloracion:

PROCEDIMIENTO:

Hacer frotis y NO fijar.

Secar al medio ambiente.

Adicionar el contraste principal (cristal - violeta) y dejarlo durante 2 minutos.

Adicionar el colorante de contraste (sulfato de cobre).

Secar al ambiente.

Adicionar una gota de aceite de inmersion.

Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSION:

Al observa al microscopio la coloracion, se observo que las capsulas aparecen como halos ligeramente traslucidos y las bacterias aparecen teñidas de color azul y se encuentran ligeramente en el centro. Coloraciones debidas a los colorantes y a que el frotis no se fijo al calor.

CONCLUSIONES:

• En la coloracion de hiss; la capsula se observo como un halo azul translucido y la bacteria de color violeta.

• En la coloracion de anthony; la capsula se observa como un halo transparente y la bacteria de color azul.

LABORATORIO Nº 6 Coloracion de granulos de volutina.

OBJETIVOS:

Identificar los granulos de volutina en las bacterias.

MARCO TEORICO:

Es un cultivo envegecido de varios granulos o incluso aparecen en las celulas. Las inclusiones son cuerpos inhertes en las celulas. Muchas de ellas son materiales alimenticios de reserva, dado que se acumulan durante tiempo de aporte nutricional y disminuye la duracion de la inanicion. El carácter de las inclusiones varia con el organismo. En muchas especies bacterianas y en hongos, algas y protozoarios apatrecen granulos de bolutina, llamados granulos metecromaticos; se les colocan intensamente con colorantes basicos y estan integrados por acido fosforico polimerizado, conocido como polifosfato.

Tamaño: Las dimensiones de los cuerpos cromatinicos varian con las especies y en la misma especie en distintas epocas. Las celulas de una especie shapylococus posee cuerpos acromaticos de aproximadamente de una micra de diametro.

MATERIALES:

• Asa

• Lamina portaobjetos

• Cinta de enmascarar

• Lapiz de crea

• Microscopio

• Papel absorvente

REACTIVOS:

• Colorante de Loeffler

• Colorante de Von Stoltemberg

Hay dos tipos de coloraciones:

COLORACION DE LOEFFLER:

Tiene la caracteristica que el colorante tiene la afinidad por carbohidratos o almidones.

PROCEDIMIENTO:

Despues de realizar los pasos del procedimiento de coloracion:

Adicionar el colorante de Loeffler y dejarlo durante 10 min.

Lavar con agua corriente.

Secar al medio con papel absorvente.

Añadir aceite de imercion

Observar en el microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Al hacer la lectura al microscopio se observo una coloracion de azul intenso ya que el colorante de loeffler tiñe el ADN. Las bacterias se observaron de un color azul tenue.

COLORACION DE VON STOLTEMBERG:

PROCEDIMIENTO:

Agregar el colorante de Von Stoltemberg y dejarlo durante 15 min.

Lavar con agua corriente

Secar al medio ambiente

Agregar una gota de aceite de imercion

Observar al microscopìo

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Al hacer la lectura al microscopio se observo una coloracion roja intensa casi morada que correspondia a los granulos de volutina y el resto de la bacteria se observo de color rojizo.

CONCLUSIONES:

En la coloracion de Loeffler se observaron granulos de volutina de color azul intenso debido al colorante utilizado de Von Stoltemberg ocurrio lo mismo, pero el color fue mas intenso.

3. MEDIOS DE CULTIVO:

INTRODUCCION

Las bacterias contenidas en un producto patológico necesitan una serie de compuestos para su desarrollo ( una fuente de carbono, nitrógeno, elementos minerales y factores de crecimiento). Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes, en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con objeto de aislar las diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios complementarios.

Los sustratos energéticos y plásticos pueden ser suministrados por sustancias nutritivas contenidas en la maceración de la carne y vísceras.

Los aminoácidos o péptidos son aportados por las peptonas, que contienen todos los productos de degradación de las proteínas, sin vitaminas, y su composición exacta es variable según el tipo de sustrato y la enzima utilizados ( pepsina, tripsina o papaina). Los factores de crecimiento son suministrados por maceración y la adición de sangre, suero, extracto de levadura, liquido ascítico.

OBJETIVOS:

• Conocer que es un medio de cultivo, como prepararlo, manera de

conservarlo y la utilidad de éste para el crecimiento y desarrollo

de los microorganismos.

• Con la preparación de los medios de cultivo, poder adquirir

destreza en la siembra de microorganismos en diferentes medios

de cultivo.

• A partir de un cultivo, aprender a extender microorganismos Previamente cultivados, en un portaobjetos, para luego ser fijado, coloreado y observado al microscopio.

MARCO TEORICO

Los medios de cultivo puede dividirse según diferentes criterios: consistencia, origen, composición, utilización, etc.

POR SU CONSISTENCIA:

• Medios Líquidos

Contiene los nutrientes normales de un medio de cultivo, con adición de algún tampón, capaz de mantener el ph.

• Medios Sólidos

Un medio sólido se prepara añadiendo agar-agar a un medio líquido determinado. Este conjunto convenientemente esterilizado, se vierte en la caja de petri o en tubos. Las exigencias nutritivas y las condiciones fisico-quimicas son similares a las de medios líquidos, pero a diferencia de ellos, presentan la posibilidad de obtener colonias aisladas.

• Semisolidos

Para observar la motilidad de las bacterias se encuentran en un 35% de agar y 45% de gelatina.

POR SU ORIGEN

• Medios Sintéticos

Son aquellos que poseen unos compuestos químicos definidos disueltos en agua y se usan para los estudios metabólicos. Entre ellos se encuentran los medios mínimos con los que se intenta comprobar el crecimiento de una bacteria, con muy pocos nutrientes. Los medios semisintéticos son sintéticos a los que se añade factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico completo como por ejemplo el extracto de levadura.

• Medios Naturales

Son los preparados a partir de sustancias naturales animales o vegetales, de su composición no rigurosamente constante, por ejemplo el suero de la leche.

POR SU COMPOSICIÓN

• Medios Comunes

Son aquellos cuya única finalidad es el crecimiento de los microorganismos poco exigentes.

• Medios Enriquecidos

Son medios comunes u ordinarios a los que se añaden ciertos productos ( suero, sangre, liquido ascítico, glucosa,) que permiten el

aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibitorios de crecimiento, en bacterias exigentes.

OTROS MEDIOS

• Medios de Enriquecimiento

Son medios líquidos que favorecen o permiten la multiplicación de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de otras.

• Medios Selectivos

Son sólidos en los que la " selectividad" se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo compuestos químicos, que sea nocivo para las bacterias cuyo crecimiento no interesa. Entre los principales tenemos: cambio en el ph del medio, temperatura, altas concentraciones osmóticas, antisépticos, antibióticos.

• Medios Especiales

Son aquellos que se emplean para el cultivo de ciertas bacterias muy particulares , por ejemplo para micobacteria.

• Medios para identificación o Diferenciales

Son aquellos donde no solo crecen determinadas bacterias, sino que, además, éstas al actuar sobre alguno de los componentes específicos del medio, demuestran algunas de sus propiedades. Dentro de ellos existen dos tipos: aquellos en los que solo vamos a poder demostrar una determinada característica del microorganismo, que se denominan únicos o simples, y aquellos en los que se detectan varias

características de una forma simultánea, que se llama múltiples o combinados.

• Medios de Transporte

Son los utilizados para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento de la toma hasta su posterior siembra en el laboratorio.

• Medios de Conservación

Intentan mantener la viabilidad y los caracteres morfológicos, fisiológicos, etc. Hoy se tiende a utilizar los métodos físicos de conservación : congelación, desecación y principalmente liofilización.

• METODOS DE SIEMBRA EN LAS BACTERIAS

• Son todas aquellas técnicas que se utilizan para la transferencia de gérmenes en forma directa ( muestras de pus o de sangre).

• Pasajes o subcultivos: tomar un germen de medio selectivo o diferencial y sembrarlo en otra caja.

• Repique: tomar de las colonias una muestra, y la siembra se realiza en un medio diferencial o selectivo.

• Siembra

• Se efectúa con una asa bacteriológica, se utilizan cuatro medios de cultivo:

• MEDIOS SOLIDOS : Existen varias técnicas.

• Técnica de rejilla: se coloca la muestra en un extremo de la caja y con el asa se difunde.

• Técnica del espiral

• Técnica estría

• Técnica combinación rejilla con espiral:

MEDIOS SOLIDOS EN TUBO

Se hace con el asa desde el fondo del tubo hacia fuera en espiral

MEDIOS LIQUIDOS

Siembra vertical, se introduce el asa hasta el fondo y se gira, se hace en movimiento de big-ben.

MEDIO SEMISOLIDO

Para sembrar el asa debe estar recta, y por el centro del tubo se introduce el filamento hasta el fondo sin tocar pared y se retira igual.

ESTUDIO CUALITATIVO

Las siembras sobre medios sólidos, en superficie, dan lugar a la formación de colonias, masa constituida por muchos millones de bacterias que se aprecian a simple vista. El tamaño, así como el aspecto, es bastante constante para cada género y especie bacterianos y de ahí que pueden utilizarse como características diferenciales, a la hora del diagnostico, las siguientes cualidades:

FORMA

CIRCULARES	AMEBOIDA	FILAMENTOSA	FESTUNADA
FUSIFORME	RIZOIDE	IRREGULAR	HALOLIFORME

ESPESOR

PLANA	CONVEXA	PLANOCONVEXA
ACUMINADA	PAPILADA	UMBILICADA

BORDE

LISA	ONDULADO	DENTADO
LOBULADO	FILAMENTOSO	RUGOSO

• CONSISTENCIA

• Grasa

• Seca

• En forma de mantequilla

• Viscosa

• TRANSPARENCIA

• Translúcidas

• Opacas

• PIGMENTACION

• Rojo

• Amarillo

• Amarillo-verdoso

• La pigmentación puede ser interna o externa de la colonia.

• OLOR

• Colonias que producen olor aromático.

• Colonias que producen olor fétido.

• Colonias que producen olor dulce.

• HEMOLISIS

• Algunas bacterias producen una hemólisis beta, que es transparente alrededor de la colonia, otras producen hemólisis alfa, que es de color verdoso , y otras hemólisis delta, que es de color más oscuro.

• MATERIALES

• Asa

• E. Colli

• Mechero

• Cajas petri

• Agar nutritivo

• Tapabocas

• Lápiz de cera

• Cinta de enmascarar

• PROCEDIMIENTO

• Agregar el agar nutritivo a las cajas de petri

• Dejar en reposo hasta completa solidificación

• Esterilizar el asa

• Tomar la muestra de E. Colli

• Realizar la siembra ( se utilizó la técnica de estría).

• Marcar la caja

• Incubación a 37º C, por 48 horas

• RESULTADOS

• Se observó:

• Colonias brillantes translúcidas

• espesor: colonias planas.

• Bordes de colonias: dentados

• Colonias grandes

• Forma irregular

• Consistencia seca.

CONCLUCIONES

Se reconoció las diferentes formas de colonias que se pueden observar en un medio de cultivo.

2. Se logró realizar correctamente la siembra de un microorganismo

en un medio de cultivo.

3. Por medio de las practicas se determinó los constituyentes

principales que debe tener un medio de cultivo, para un excelente

crecimiento de los microorganismos sembrados.

4.DESINFECTANTES:

INTRODUCCION

Para la desinfección puede utilizarse una gran variedad de sustancias químicas y todas aquellas reciben el nombre común de desinfectantes. Algunos de ellos son reactivos ordinarios, otros son formulaciones especiales, registradas con nombres comerciales. Generalmente hay diferencias marcadas entre la actividad de algunos desinfectantes cuando se ensayan en condiciones óptimas por la técnica de Rideal- Walker u otras menos acreditadas. Los efectos de tiempo, temperatura, ph, y la naturaleza química y física del artículo que se va a desinfectar y la materia orgánica presente, no son a menudo totalmente considerada.

Existe un espectro aproximado de sensibilidad de los microorganismos a los desinfectantes. Los más sensibles son las bacterias vegetativas, los hongos y los virus que no contienen lípidos. Las micobacterias y los virus que no contienen lípidos son menos sensibles y los esporos son por lo general resistentes.

En la elección de los desinfectantes, deben tenerse en cuenta algunas consideraciones a cerca de su toxicidad y de los efectos perjudiciales que puede tener sobre la piel, ojos, y vías respiratorias.

Los desinfectantes más utilizados en los trabajos de laboratorio son los fenoles y los hipocloritos. Los aldehidos tienen una aplicación limitada y el alcohol y las mezclas de alcoholes son menos populares.

OBJETIVOS

• Reconocer las características y la importancia de los principales desinfectantes utilizados en el laboratorio.

• Comprobar el efecto de los desinfectantes sobre las bacterias que se encuentran en el medio ambiente.

• Observar la acción de diferentes desinfectantes, sobre una o varias clases de bacterias.

MARCO TEORICO

Los desinfectantes son aquellas sustancias químicas capaces de destruir en 10 a 15 minutos los gérmenes depositados en un material inerte o vivo, alterando lo menos posible el sustrato donde residen y abarcando en aquella destrucción todas las formas vegetativas de la bacterias, hongos y virus ( excepto el de la hepatitis ).

En la practica, los desinfectantes son potentes microbicidas, pero hasta cierto punto tóxicos o irritativos para los tejidos vivos, por lo que se aplican en superficies, ambientes u objetos contaminados.

La velocidad a la que se realiza la esterilización de un producto contaminado bacteriológicamente al que se le ha agregado un desinfectante se ha visto que está en función de una serie de factores como lo son, la concentración de la sustancia , la temperatura, el ph, la composición química del medio donde se aplica el agente químico, la especie bacteriana que contamina el producto, etc. En general se ha visto que, para una circunstancia determinada, las bacterias mueren e progresión geométrica con relación al tiempo de exposición; El tiempo en que se obtiene la esterilización completa de un producto por un desinfectante varía mucho de unas bacterias a otras dentro de la misma concentración de producto activo.

Las condiciones que debe reunir un buen desinfectante son:

• Que se pueda utilizar en condiciones altas

• Que se homogenice uniformemente en un diluyente, sea esta agua o alcohol, para que tenga el producto activo la misma concentración en toda su masa.

• Que su preferencia o su actividad se manifieste en soluciones acuosas que penetren en los exudados, pus, sangre, etc. Donde los organismos puedan estar ocultos.

• No ser tóxico para los tejidos humanos sin que precise el uso de guantes o el lavado inmediato de superficies vivas con la que haya entrado en contacto.

• Que no resulte corrosivo para metales, madera, superficies pintadas, etc.

• Que su tensión superficial sea baja para que penetre fácilmente en las rendijas, hendiduras, de las superficies vivas o inertes.

• Que sea económico.

• Acción efectiva en presencia de materia fecal y sustancias grasas.

• Poder desodorante.

VALORACION DE DESINFECTANTES

La valoración del poder antibacteriano de un desinfectante químico puede efectuarse determinado su poder bacteriostático o bactericida. El primero se obtiene mediante el coeficiente de inhibición ( CMI) , es Decir, determinado la concentración mínima de dicha sustancia capaz de inhibir el crecimiento y reproducción de una determinada bacteria. El poder bactericida o concentración mínima bactericida se determina calculando la cantidad mínima de dicha sustancia capaz de producir

la muerte de una suspensión patrón en un tiempo determinado; si se trata de formas vegetativas, obtenemos el coeficiente letal mínimo, y si son bacterias esporuladas, el coeficiente letal máximo.

Las bacterias más utilizadas para os diferentes métodos para valoración de desinfectantes suele pertenecer a colecciones internacionales y son las más usadas enel medio ambiente: s. Aureus, E. Colli, P. Vulgaris, P. Aeruginosa, S. Faecalis.

RESISTENCIA A LOS DESINFECTANTES

La sensibilidad mayor o menor de las distintas bacterias a los compuestos químicos varía según el mecanismo de acción de estos. La pared celular más compleja, de los gram - explicaría su mayor resistencia a los desinfectantes. La especial resistencia de p. Aeruginosa parece deberse a su pared celular, estabilizada por iones de Mg. El alto contenido de ceras y la naturaleza hidrófoba de la pared celular explican también la resistencia del genero Mycobacterium.

Las consecuencias de estos hechos en el uso de sustancias germicidas en los hospitales son patentes; de ahí la necesidad de determinar el valor de los desinfectantes en cada centro sanitario, según las técnicas antes descritas.

MATERIALES

• Peróxido de hidrógeno.

• Mechero

• Lápiz de cera

• Cinta de enmascarar

• Hisopos estériles

• Tapabocas

• Asa bacteriológica.

• Glutarex

• Mertiolate.

• Creolina

• Hipoclorito

• Peróxido de hidrógeno.

• Formol

• Alcohol.

• Cajas de agar nutritivo.

PROCEDIMIENTO

• Frotar la mano en algún sitio sucio del laboratorio.

• Trazar una línea imaginaria en el centro de la mano.

• La mitad de la mano se desinfecta con creolina y la otra mitad se deja infectada.

• Con el lápiz de cera trazar una línea en la mitad de la caja con agar nutritivo, para que este quede dividido en dos.

• Se toma un hisopo estéril y se toma una muestra de la parte de la mano infectada.

• Esta muestra se siembra en una de las dos mitades de la caja con agar nutritivo.

• Se toma otro hisopo estéril y se toma una muestra de la parte de la mano desinfectada con creolina.

• Esta muestra se siembra en la otra mitad de la caja con agar nutritivo.

• Se marca la caja, y se incuba a 37ºC por 48 horas.

RESULTADOS

El comportamiento de los diferentes desinfectantes utilizados fue variado, se pudo observar que los desinfectantes que obtuvieron una mejor respuesta fueron alcohol, hipoclorito, glutarex.

Desinfectan Te/ Grupo	Alcohol	Hipoclorito	Glutarex	Mertiolate	Formol	creolina	Peróxido de hidrógeno
1	+
2		+
3			+
4				-
5					+
6						+
7							-
8	+
9		+
10			+	+
11					-
12						-	+

(+) cuando actúa el desinfectante

(-) cuando no actúa el desinfectante

En la caja que se sembró el desinfectante, se tomo una muestra y se realizó la coloración de Gram, se observó que crecieron bacilos Gram (+).

proteus

Desinfectant Grupo	Mertioliate	peróxido	hipoclorito	glutarex	Creolina	formol	Alcohol
2	+++	++	+	++	+	-	-
4	+++	++	+++	+	++	-	-
6	+++	+++	+++	++	+	+	-
8	+++	++	+	+	++	+++	-
10	+++	++	+	+	+	+++	+
12	+++	+	+	+	++	+++	-

Para el proteus los mejores desinfectantes fueron el mertiolate y el hipoclorito.

1. Mertiolate +++

2. Hipoclorito ++

3. Peróxido +

4. Glutarex

CONCLUSIONES

• Se identificaron las características que debe tener un desinfectante ideal.

• Mediante las pruebas realizadas a cada desinfectante, se conoció cuales de ellos son los más efectivos.

• Por medio de la coloración de gram se identificó el tipo de bacterias que no fueron destruidas por el desinfectante.

5. RECUENTO BACTERIANO:

INTRODUCCION

Frecuentemente es necesario determinar el tamaño y la cantidad de la población bacteriana de una muestra.

Si se requiere un recuento total, debe tenerse presente que muchos a de los gérmenes contados pueden estar muertos o que son indistinguibles de otras partículas materiales. El recuento de gérmenes vivos se funda en que se desarrolla de cada germen una colonia visible. Sin embargo, las bacterias estarán raras vez separadas por completo de sus vecinas y se agrupan frecuentemente en racimos de gran número, en especial cuando se reproducen activamente. Por ello, una colonia aislada puede originarse de un solo organismo o de cientos aún de miles de organismos. Cada colonia se desarrolla a partir de una unidad viable; puesto que cualquier agitación, como sucede en la preparación de diluciones puede deshacer o inducir la formación de racimos, es naturalmente difícil obtener resultados reproducibles. Rara vez las bacterias se hallan distribuidas uniformemente en una muestra y como por lo general, se examinan solamente muestras pequeñas, pueden introducirse grandes errores.

No son raros los errores de mas o menos el 90% en recuentos del orden de 10000 a 100000 por ml, aún con la mejor técnica con una interpretación liberal de los resultados. Carecen de valor las cifras que se obtienen de una prueba aislada.

OBJETIVOS

• Exponer la importancia que tiene el recuento bacteriano en la determinación de colonias formadas por un microorganismo sembrado

• Explicar la forma correcta de realizar un recuento directo.

• Reconocer los diferentes grupos de bacterias que se buscan en el recuento directo.

MARCO TEORICO

El recuento se denomina, también, recuento de gérmenes viables, se detectan la mayoría de los gérmenes patógenos que hay en una muestra determinada de alimentos, orina, o agua.

Existen varios grupos de bacterias que se buscan en el recuento bacteriano.

• Mesófilas aeróbicas : todas aquellas bacterias que encuentran alimentos y se puede aislar en un medio aerobio.

• Coliformes : bacterias que se originan en el tracto intestinal; E. Colli, klepsiela, proteus, contaminación de origen fecal.

• Clostriduim : bacterias anaerobias indican un proceso térmico insuficiente.

• Staphylococos : si hay presencia es por contaminación en el proceso.

Para realizar el recuento en un contados de colonias simples se escogen placas que presenten entre 30 y 300 colonias. Se pone la placa abierta, con la base de vidrio hacia arriba, sobre una superficie iluminada. Se cuentan las colonias con una lupa de 75mm y un contador de mano. Se marca el vidrio sobre cada colonia con la punta de un rotulados. Se calculan las colonias o el recuento de organismos vivos/ ml multiplicando el numero medio de las colonias por placa contable por el recíproco de la dilución. Se da el informe como "unidades formadoras de colonias/ml" (ufc) o como " recuento de organismos vivos/ml".

Si todas las placas contienen más de 300 colonias, se divide la placa en sectores, por ejemplo, un cuarto o un octavo de la placa, se cuentan las colonias en esos sectores y se incluye el valor del sector en los cálculos.

Para trabajo en gran cantidad, son esenciales los contadores semi o totalmente automáticos. En el primero la pluma empleada para marcar el vidrio sobre la colonia se conecta a un contador electrónico que indica el número contado en una pequeña pantalla. En modelos totalmente automáticos una cámara de tv o un haz de láser examina la placa y el resultado se muestra o se registra en una pantalla o en un mecanismo de lectura.

PREPARACION PARA DILUCIONES

Cuando se haga diluciones de líquidos por ejemplo leche, para recuentos bacterianos, se procede de la siguiente manera:

Se mezcla la muestra por agitación. Con una pipeta recta, se hunde en la muestra, se toma 1 ml. Se deja caer en el primer blanco de dilución,; se espera 3 segundos. Esta pipeta se elimina.

Con una pipeta limpia se mezcla el contenido del primer tubo y dejando caer 10 veces el líquido; se toma 1 ml que se transfiere al siguiente blanco de dilucion; se procede de la misma forma para todas las diluciones que se requieran, recordando que cada vez deba eliminarse la pipeta después de vaciarla de su contenido, ya que de otra forma el líquido de la superficie externa producirá un error acumulativo.

DISTRIBUCION DE LA MUESTRA

• Con una varilla de vidrio: colocar en cada caja 0.1 ml de la muestra y distribuirla con una varilla. ( técnica de superficie).

• Técnica por profundidad: colocar 1 ml en cada caja de petri, y luego se le adiciona en el medio de cultivo a una temperatura de 40º C, a cada caja se le adiciona 15 ml del medio, luego se agita suavemente y se espera a que endurezca.

• Técnica de emparedado: primero se tiene el medio de cultivo preparado en la caja, luego se adiciona 1 ml de la muestra y después se la agrega más medio de cultivo.

MATERIALES

• Medio de cultivo

• Cajas de petri

• Pipetas estériles.

• Tubos de ensayo con 9 ml de solución peptonada al 0.1 %

• Tapabocas

• Asa bacteriologica

• Lápiz de cera

• Cinta de enmascarar

• Mechero

PROCEDIMIENTO

Hacer diluciones hasta 10-4, se utilizan dos pipetas una para dilucion y otra para sembrar, para sembrar se toma la dilución más alta. Después marcar las caja de petri como 2, 3, y 4, a cada caja se le coloca 1 ml de la dilución correspondiente, luego se lleva a incubación por 48 horas.

Si la placa tiene pocas ufc se cuentan todas y se anota. Cuando son superiores a 300 ufc se puede hacer una división de 7 cuadrados ( horizontales), por 6 cuadrados (verticales); y la sumatoria se multiplica por 5 porque el área total del medio de cultivo es de 65 cm cuadrados. Cuando es superior a 10 ufc, se sacan 4 cuadrados y se suman ejemplo.

35+25+30+30=120/4=30*65 (área).

Cuando es mayor de 2 se coloca el resultado de la menor dilución, se suman las 2 y se saca la media aritmética.

Siempre se expresa el recuento estimado con 2 números enteros, mas la división del logaritmo.

RESULTADOS

Muestra de leche

• = 40 47900000

• = 3 514000

10 = 2 960000

------------------

6264000

RF 63 * 10 UFC/ml

Grupo	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Ufc	14*10	36*10	18*10	60*10	51*10	32*10	17*10	19*10	31*10	63*10	35*10	34*10

Muestra de yoghurt

10 =300000

10 = 5000000

10 =90000

---------------------

305090000

RE = 31 * 10 ufc/ml

Grupo	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Ufc	37*10	31*10	40*10	71*10	22*10	30*10	49*10	34*10	52*10	57*10	46*10	31*10

Muestra morcilla ( SOLIDO)

Morcilla - proteus

Papel reynols

Pinzas desinfectadas

10gr morcilla + 90 sln peptonada

se mezcla = 10

1 ml

Grupo	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Ufc	14*10	36*10	18*10	60*10	51*10	32*10	17*10	19*10	31*10	63*10	35*10	34*10

CONCLUCIONES

• se reconocieron las diferentes unidades formadoras de colonias formadas en la siembra de cualquier microorganismo.

• Se logró cuantificar las unidades formadoras de colonia formadas después de la siembra de leche y orina

6. ANTOBIOGRAMA:

INTRODUCCION

Se ha desarrollado muchos métodos nuevos para la determinación de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antibacterianos y de análisis de tales agentes en los fluidos corporales.

Las técnicas ordinarias de difusión para la determinación de la sensibilidad a los antibióticos de organismos aislados de especímenes clínicos han sufrido gravemente las dificultades de la estandarización. Se duda si los ensayos con el mismo organismo, hechos en diferentes lugares, conducirían a recomendaciones para el tratamiento constante.

La técnica de difusión clásica exige que se aplique una fuente del agente antimicrobiano a la superficie de un medio sólido. La difusión del agente a través del medio inhibe el crecimiento de un organismo sensible que crezca en o sobre él hasta un grado determinado parcialmente por la receptividad del organismo. Sin embargo, se sabe actualmente que un cierto número de otros factores puede afectar el tamaño de las zonas de inhibición y que estos factores deben ser controlados.

OBJETIVOS

• Identificar los antibióticos más utilizados que pueden o no inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos.

• Conocer la función y correcta utilización del antibiograma. Para el tratamiento de una infección.

• Utilizar el antibiograma como una técnica adecuada para establecer la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos.

MARCO TEORICO

Los antibióticos son sustancias orgánicas producidas por microorganismos, que fueran capaces de actuar sobre otros microorganismos inhibiendo su crecimiento o destruyéndolos. Para ser antibióticos debe cumplir las siguientes condiciones:

Especificidad: consiste en su actuación frente a un grupo determinado y limitado de microorganismos. Este comportamiento se debe a que los antibióticos actúan en un lugar anatómico concreto de la bacteria.

Elevada potencia biológica: Es decir, que sea activo a pequeñas concentraciones, actividad que suele expresarse como concentración mínima inhibitoria ( CMI), equivalente a la más baja concentración de antibiótico, dada en ug/ml, capaz de inhibir el crecimiento bacteriano.

Toxicidad selectiva: los antibióticos, cuya toxicidad para las células del organismo humano debe ser mínima, son, sin embargo, tan activos que pueden destruir las bacterias patógenas en el interior del organismo humano( sangre u otros tejidos).

ACCIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS SOBRE LAS BACTERIAS

Sobre cocos y bacilos gram + y - : son los antibióticos llamados de

"amplio espectro" , pues actúan sobre la mayoría de especies bacteriana.

En este grupo se encuentra el clorafenicol, las tetraciclinas, betalactaminas de amplio espectro, aminoglicósidos, rifampicina, sulfamidas, y nitrofuranos. Los demás amplio espectro son el clorafenicol, y las teraticlinas.

Sobre cocos y bacilos gram +: El antibiótico principal de este grupo es la penicilina, cuya baja toxicidad y uso indiscriminado han dado lugar a la aparición de microorganismos resistentes a su acción, en especial estafilococos. El otro antibiótico principal de este grupo es la fosfomicina que actúa sobre bacilos gram -.

Sobre cocos gram - : Se incluyen algunos antibióticos, por lo general de corto espectro, que se emplean en el tratamiento de las infecciones por estafilococos resistentes a la penicilina, como la vancomocina, ristocetina y novoblocina.

MECANISMO DE ACCIÓN

Para que un antimicrobiano ejerza su acción, es necesario que llegue al foco infeccioso, penetre en las bacterias y alcance intracelularmente la concentración necesaria. La entrada en la bacteria se puede lograr por difusión o transporte activo.

Una vez dentro del organismo, la actividad del antibiótico puede ser:

Bacteriostática, inhibiendo la multiplicación de forma reversible, o bactericida, determinando un efecto letal. En general, cada grupo de antibióticos actúa preferentemente de una forma u otra. Son antibióticos bacteriostáticos: tertaciclinas, clorafenicol y macrólidos; y bactericidas: aminoglicósidos, polipeptidos,y fosfomicina.

VALORACIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS

Se lleva a cabo mediante dos métodos:

Dilucion:

Consiste en obtener diluciones dobles y progresivas de un antibiótico. El procedimiento se puede realizar en medio líquido o sólido.

Si se cultiva en una suspención bacteriana sobre estos medios, en un momento determinado se obtiene concentraciones de antibiótico suficientes que no permiten el desarrollo de los gérmenes. Recibe el nombre de concentración mínima inhibitorio la mejor cantidad de concentración de antibiótico, que es capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria.

Sobre medio liquido, con diluciones progresivas de antibióticos en los tubos, al añadir una cantidad fija de bacterias, en aquellos tubos donde la bacteria desarrolla y multiplica aparece turbidez. Cuando el antibiótico inhibe el crecimiento, aparece un aclaramiento de toda la masa líquida del medio de cultivo.

DIFUSIÓN EN AGAR

Mediante este sistema se prueba la eficacia de varios antibióticos a partir de una siembra en superficie sobre un medio sólido de una suspención bacteriana, depositando a continuación sobre ella discos de papel de filtro impregnados de antimicrobianios.

Como el agar está suficiente húmedo, los antibióticos difunden y se crean así concentraciones progresivamente decrecientes a partir del disco. En aquella zona donde la concentración de antibióticos es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria, aparece un halo de inhibición. La valoración de los halos se hace por patrones obtenidos de forma que se hayan correlacionado la CMI, el diámetro del halo de inhibición y la carga de antibiótico del disco.

MATERIALES

• Medio de cultivo

• Pipetas de 1 ml estériles

• Hisopos de algodón estériles

• Sensidiscos de antibóticos

• Tubos de caldo nutritivo

• Tapabocas

• Asa bacteriológica

• Cinta de enmascarar

• Lápiz de cera

• Mechero

PROCEDIMIENTO

Se toma la muestra( orina, sangre, pus, etc) luego se siembra en un agar sangre o BHT, luego se observa unas UFC de distintos tamaños y colores a la UFC se le hace un repique en agar sangre y se hace un cultivo puro, luego del cultivo puro se saca un poco y se siembra en un tubo con caldo nutritivo que se lleva a incubación * 1 hora a 37º C, luego se coloca en cajas que contengan medio Muller Hilton y se coloca 0.3 de caldo nutritivo, luego se difunde con el hisopo por toda la caja, se deja al ambiente por 5 minutos, para que se seque , luego se colocan los sensidiscos ( 4 ) en la caja y se lleva a incubar a 37ºC por 48 horas.

RESULTADO

Se utilizaron diferentes antibióticos para observar la eficacia ante el B. Antracis, y se obtuvo:

Antibiotico.	Accion.
Cefalotiniana.	30-25
Eritromicina.	20-21-21
Ac. Nadicidico.	20-r-15
Bacitricina.	10-r-10
Amoxacilina.	25-25-27-25
Asteronan.	R
Amicacina.	30-35
Penicilina.	30
Cloxacilina.	r-20
Cefalin.	r-r
Neomicina.	30
Licomicina	25

Halo de inhibición :

Menor de 15: resistencia a los antibióticos

Mayor de 20 : sensible a los antibióticos.

Escherichia colli gram -

Antibiótico grupo	Lincomici	cefaperaz	cloxacicli	Oxacilin	Etreptomi	gentamici	amoxacilin	minacin	ceftalizin
1	R	15	r	R
2		15	r		r	12
3	R			R	r	10
4	R	15	r				10
5	R	15	r	R
6	25	r						20	30

Staphilococos gram +

Antibiotico Grupo	cefa	cloxacili	gentamici	minacin	Ceftacili	cefalotin	eritromici	Ac pipemid	novomioci
7						20	10	20	12
8	25	r		20	25
9		r		r				15	r
10
11			15				r	10	r
12	20	r	20						r

CONCLUCIONES

• Por medio de la técnica del antibiograma se conoció la susceptibilidad del B. Antraciis a determinados antibióticos.

• Se logró una adecuada interpretación del antibiograma.

• Mediante la realización del antibiograma se conoció el fundamento, la técnica, y la aplicación del mismo.

7. MARCHAS BIOQUIMICAS:

INTRODUCCION

Las bacterias producen enzimas que metabolizan diversos sustratos. Estas enzimas han sido usadas tradicionalmente como marcadores para diferenciar grupos de especies y han sido cuidadosamente seleccionados por los diferentes sistemas de identificación:

Oxidación : se traduce a un cambio de color en la parte superior del tubo, debido a una producción de ácido en aerobiosis, revelada por el indicador de ph del medio elegido.

Fermentación: se traduce por un cambio de color en el tubo, debido a una producción de ácido en anaerobiosis, revelado por el indicador de ph del medio elegido.

Asimilación : se traduce en un comportamiento del microorganismo, en la parte superior del tubo cuando el sustrato es utilizado como única fuente de carbono presente.

Los tubos contienen medios deshidratados tales como: urea, citratos, vp, nitritos, indol, motilidad, tda, etc. Otros son azucares como: glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, arabinosa, subitol, etc.

Los diferentes tubos se inoculan como una suspención bacteriana, luego durante la incubación el metabolismo produce cambios de color espontáneos o bien a la adición de reactivos específicos.

Se realiza la lectura de dichas reacciones con una tabla de lectura y de este manera se identifica el genero y especie de la bacteria.

OBJETIVOS

• Identificar por medio de las marchas bioquímicas los diferentes procesos metabólicos que tienen las bacterias sobre determinados sustratos.

• Reconocer los diferentes medios de reacción que tienen las marchas bioquímicas.

• Reconocer el fundamento y la aplicación de las marchas bioquímicas.

MARCO TEORICO

Las marchas bioquímicas son técnicas de laboratorio que son de gran ayuda para diferenciar unas bacterias de otras cuando son muy parecidas. Se aplican especialmente para el diagnostico de bacterias gram -.

Las marchas tienen como fundamento la acción o procesos metabólicos que tienen las bacterias sobre determinados sustratos, se estudia:

• Catabolismo proteico: Proceso natural de las bacterias, que actúan desdoblando o produciendo proteasas, ureasas, o gelatinasas.

• Metabolismo glúcido: Acción o capacidad que tienen las bacterias para desdoblar carbohidratos, azucares, almidón, etc.

• Metabolismo lipídico: Propiedad que tiene una bacteria para producir lipasas o lecitinas.

MEDIOS

Citratos : determina la capacidad de un microorganismo para utilizar como fuente única de carbono, en su metabolismo, el citrato. Empleado para diferenciar microorganismos de genero enterobacterias de otros.

Sulfuros: determinar la capacidad de un microorganismo para producir, mediante reacción enzimática, sulfuro de hidrógeno a partir de aminoácidos.

Indol: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir indol a partir de triptófano presente en agua peptonada. Empleada para ayudar a la diferenciación de bacilos gram - .

Rojo de metilo: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir ácido en caldo dextrosa fosfatado. Empleada como ayuda en la identificación de entrobacterias.

Nitritos: Determinar la capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a nitritos, anitrógeno gas o a hidroxilamina. Empleada para la identificación de géneros de enterobacterias y otros.

Ureasa: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir ureasa que transformara la urea en amoniaco. Se utiliza para la identificación de géneros de proteus y otros.

Voges proskauer: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir un compuesto final de carácter neutro, de la fermentación de la glucosa. Se utiliza para la diferenciación de microorganismos gram -.

En la actualidad para la diferenciación de microorganismos existen los API; es un sistema da identificación que asocia una galería bioquímica miniaturizada, estandarizada y una base de datos.

Las galerías API constan de 20 microtubos que contienen los medios deshidratados, los primeros 10 microtubos son bioquímicas convencionales, los 10 restantes son azucares. Durante la incubación de la galería, el metabolismo de las bacterias producen cambios de color, espontáneos o bien, la adición de reactivos específicos.

MATERIALES

• Medios cs, tsi, mr-vp, sim, simons, y citratos.

• Asa bacteriológica.

• Tapabocas

• Cinta de enmascarar

• Mechero

• Reactivo de kovacs

• Rojo de metilo

• KOH

• Alfanaftol.

PROCEDIMIENTO

El cultivo de las bacterias sospechosas se siembra sobre los medios de cultivo específicos de las marchas bioquímicas; luego se lleva a incubación a 37º C por 48 horas, y se observan las reacciones.

RESULTADOS

• Para evidenciar la presencia de indol se agrega 3 gotas de kovacs; la reacción positiva se evidencia por un anillo rojo en la superficie del tubo, cuando es negativa no se observa ningún anillo.

• Para producción de sulfuros, si la reacción es positiva se observa de un color negro, si la reacción es negativa permanece del mismo color al medio específico.

• La reacción de motilidad se identifica por turbidez del medio específico.

• Para la identificación de citratos se presenta turbidez en el tubo o la aparición de un color azul intenso en el agar.

• Para la identificación de ureasa, si toma un color rosado intenso es positiva, y cuando permanece de color amarillo es negativa.

• Para el rojo metilo, se agregan 3 gotas de rojo de metilo al medio MR-VP, si la bacteria produce la reacción ácido mixta se observa un anillo rojo en la superficie del tubo, si es negativa permanece amarilla.

• Para la reacción de butilemglicol, se agregan 2 gotas de KOH y 2 de alfanaftol; cuando es positiva forma un anillo de color rojo en la superficie de tubo, cuando es negativa permanece amarilla.

PROTEUS

Reacción medio	7	8	9	10	11	12
S.C	+	+	+	+	+	+
LIA	+	+	+	+	+	+
TSI	+	+	+	+	+	+
S	+	+	+	+	+	+
I	-	-	-	-	-	-
M	+	+	+	+	+	+
UREA	-	-	-	-	-	-
M.R	+	+	+	+	+	+
VP	-	-	-	-	-	-

E. COLI

Reacción medio	1	2	3	4	5	6
SC	+	+	+	+	-	-
LIA	-	-	-	-	-	-
TSI	+	+	+	+	+	+
S	-	-	-	-	-	-
I	+	+	+	+	+	+
M	+	+	+	+	+	+
UREA	+	+	+	+	+	+
MR	+	+	+	+	+	+
VP	-	-	-	-	-	-

KLEBSIELLA

Reacción medio	1	2	3	4	5	6	7
SC	-	+	-	+	+	+	-
S	-	-	-	+	+	+	+
I	-	-	-	-	-	-	-
M	+	+	+	+	+	+	+
LIA	-	-	-	-	-	-	-
TSI	+	+	+	+	+	+	+
UREA	+	+	+	+	+	+	+
MR	+	+	+	+	+	+	+
VP	-	-	-	-	-	-	-

E. COLI

REACCIÓN MEDIO	8	9	10	11	12
SC	-	+	+	-	+
S	-	-	-	-	-
I	+	+	+	+	+
M	-	+	-	-	-
LIA	-	-	-	-	-
TSI	+	+	+	+	+
UREA	+	+	+	+	+
MR	+	+	+	+	+
VP	-	-	-	-	-

CONCLUCIONES

• Por medio de las marchas bioquímicas se identificó que tipo de bacterias reconoce cada medio.

• Se reconoció la importancia y utilización de las marchas bioquímicas.

• Por medio de la practica se logró una adecuada manipulación de esta técnica.

8. HONGOS

De más de 100000 especies existentes de hongos en la naturaleza, la mayoría son saprofitos y no llegan a 100 las que han demostrado su capacidad de producir enfermedades en el hombre. Los hongos son beneficiosos por su papel en el ciclo natural del carbono, en la nutrición de la plantas o en la producción industrial de bebidas ( vino, cerveza) alimentos ( pan, queso), y los mas variados productos químicos incluidos los antibióticos. Algunos pueden alterar los alimentos o utensilios humanos, pero muy pocos son patógenos.

Son conocidos desde hace mucho tiempo las intoxicaciones por setas venenosas, más recientemente, las producidas por toxinas elaboradas por hongos contaminantes de alimentos ( micotoxinas). Pero el grupo más importante en medicina es el constituido por hongos que producen infecciones clínicas por crecer en tejido cutáneo o subcutáneo, o más profundamente.

OBJETIVOS

• Realizar una siembra de hongos a partir de una caja contaminada.

• Observar las características morfológicas de los hongos

• Reconocer los diferente medios de cultivo para el crecimiento de los hongos.

MARCO TEORICO

Los hongos poseen una estructura celular eucariota y se han incluido dentro del reino protista, con las algas y protozoos. Hoy por sus características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y ecológicas forman un nuevo reino, FUNGI.

Los hongos se caracterizan por ser células eucariotas y heterotrofas ( necesitan compuestos orgánicos como nutrientes), se presentan en forma de levadura, o de hifas poseen una pared rígida y se reproducen sexual o asexualmente.

Las hifas pueden tener una serie de elementos con diversas misiones, como órganos apresorios ( para fijación ), depredadoras ( para captura), estolones ( para búsqueda de nuevas zonas nutritivas), rizoides( que penetran en el sustrato primitivo para buscar alimento). La parte de micelo que penetra en el sustrato y absorbe sustancias para la alimentación, se conoce como micello vegetativo; la que se proyecta por encima de la superficie del sustrato se llama micello aéreo o reproductor, porque tiene entre otras la función reproductora o de dispersión de la especie, mediante esporas.

Por su forma y superficie se distinguen diversos tipos de esporas, que pueden ser pigmentadas y proporcionar un determinado y característico color a la colonia o talo del hongo

Clasificación :

El reino de los hongos se clasifica en dos grandes grupos: Myxomicota, en el que no se encuentran patógenos humanos, y Eumycota, en el que se distinguen cuatro subgrupos por la formación de esporas sexuales y que son de interés patógeno: zygomycotina, ascomicotina, basidiomycotina, deuteromicotina.

MEDIOS DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE HONGOS

• Saboureaud: Contiene un 4-5% de azúcar y esta constituido por una base de extracto de levadura y algunos extractos de carne, este medio se usa para el aislamiento de hongos.

• Patata - Dextrosa: para la producción de esporas.

• Mycosel: Patata- Dextrosa + antibiótico, son de 2 clases : clorafenicol y cicloexamida, los antibióticos se usan para evitar el crecimiento de bacterias gram + y gram -; ideal para detectar hongos patógenos en uñas, piel, cabello, etc.

• OGY: ( oxitetraciclina-glucosa-yeast), se usa para el control de alimentos más que todo carnes y también para detectar hongos.

PARA OBSERVAR LOS HONGOS EN EL LABORATORIO SE DEBE TENER EN CUENTA:

las características de la colonia: color, olor.

El aspecto de la colonia: algodonoso, seco, etc.

MATERIALES

• Medio A. Saboureaud

• Caja contaminada de hongos

• Caja de petri en forma de v

• Laminilla

• Lamina portaobjeto

• Asa bacteriológica

• Agua destilada

• KOH al 10%

• Lactofenol

• Microscopio

• Cinta de enmascarar

• Mechero.

PROCEDIMIENTO

La primera parte el A. Saboureaud se deja abierto por 5 minutos donde se pueda contaminar, luego se hace el repique de una caja contaminada.

La segunda parte en la caja de petri en forma de v se coloca una lamina portaobjeto, luego se saca un trozo de agar y se pone sobre la lamina, luego se siembra el hongo en el trozo de agar oprimiéndolo con el asa, luego se agrega agua destilada alrededor y empapando la toalla dentro de la caja, por ultimo se tapa y se sella con cinta se incuba a 37 grados por 48 horas.

COLORACIÓN DE HONGOS

TÉCNICAS:

• En una lamina portaobjeto colocar KOH al 10%, luego se mezcla en el centro de la lamina con la muestra de hongos, luego se coloca una laminilla cubriendo esta solución y se observa al microscopio.

• En una lamina portaobjeto se coloca la muestra con una gota de azul de lactofenol, luego se coloca una laminilla cubreobjetos, y se observa al microscopio.

CONCLUCIONES

• Se reconoció las diferentes formas de crecimiento de los hongos en un medio nutritivo.

• Se conocieron cuales son os requerimientos que tienen los hongos para obtener un excelente crecimiento.

BIBLIOGRAFIA

• MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA MEDICA; A Pumarola; Editorial Salvat, segunda edición; 1987.

• MANUAL DE TECNICAS DE MICROBIOLOGIA MEDICA; F.J. Baker , Editorial Acribia.

• TOXICOLOGIA DE LOS ALIMENTOS. 2 edición Ernest Linder.

• HIGIENE Y TOXICOLOGIA DE LOS ALIMENTOS. Bettu. C Hobbs. Editorial Acribia

• MÈTODOS MICROBIOLOGICOS; C. H Collins; editorial Acribia.

• MICROBOLOGÍA MÉDICA. JAWETZ, MELNICK Y ADELBERG. Ed. El Manual Moderno. Santafé de Bogotá. 1996.

9