MÉTODOS DE ESTUDIO DE CÉLULAS Y TEJIDOS.

La Biología celular depende mucho del desarrollo de nuevas técnicas para avanzar.

Describiremos cómo se emplean las distintas técnicas. Proporcionaremos ejemplos del tipo de información que obtendremos.

Una célula animal mide entre 19-20 m. Generalmente, las células animales son también incoloras y translúcidas debido al agua que contienen. Por ello, el descubrimiento interno de la célula a finales del siglo XIX, dependió del descubrimiento de colorantes. Éstos proporcionaron el contraste suficiente para observarlos, puesto que se unen a orgánulos concretos.

El microscopio óptico consta de dos lentes dispuestas en un tubo. Se disponen uno en cada extremo. Amplían sucesivamente el objeto, el cual está intensamente iluminado. De las dos lentes, una está cerca del objetivo a observar, y se le denomina LENTE OBJETIVO. La otra se sitúa junto al ojo y en la retina se forma la imagen. Esta segunda se llama LENTE OCULAR. Si se sustituye el ojo por una cámara podremos hacer fotografías.

Este dispositivo (lentes y tubo) se mejora añadiendo otros dispositivos: CONDENSADOR, debajo de la muestra concentra la luz emitida sobre el objeto. Debajo del condensador se encuentra el DIAFAGMA. Éste es ajustable y debe ser ajustado para cada objetivo con el fin de alcanzar la resolución óptima. Si lo abrimos al máximo habrá más resolución, pero habrá un brillo excesivo. Si el diafragma está cerrado se alcanzará la apertura numérica.

También pueden intercalarse dispositivos intermedios, por ejemplo, para aumentar el contraste.

Lo más importante de un microscopio es su PODER DE RESOLUCIÓN, que es la capacidad de distinguir dos imágenes distintas de puntos situados muy cerca. Se mide utilizando como unidad la inversa del límite de resolución:

PD= 1/L.R.

El límite de resolución es la distancia mínima entre dos puntos para que puedan distinguirse como tales. Son inversamente proporcionales (LR y PR):

El L.R.=K./AN

 es la longitud de onda de la fuente de iluminación, en este caso la luz natural, =550nm. La AN es la capacidad de las lente para colectar la luz. AN=n.sen, siendo n el índice de refracción del medio que separa las dos lentes, que es la volocidad a la que es atravesado el medio por una onda luminosa.

n (aire)= 1

n (aceite de inmersión)= 1.5

 es la mitad del ángulo del cono de rayos colectados por la lente objetivo desde un punto típico de la muestra. sen " 1.

L.R=0.61 x 550/1.5x0.93 = 240 nm, si lo comparamos con el L.R. del ojo humano, hemos multiplicado el poder de nuestra vista unas 1000 veces.

Aumentar el denominador no es posible, con respecto al sen. Podríamos ampliar ligeramente el índice de refracción con lentes de cuarzo (A.N.=1.4)

Con respecto al numerador, la longitud de onda no se puede disminuir y la k tampoco, pues es una constante.

SI en lugar de luz blanca usamos luz ultravioleta (K=0.61) y usamos lentes de cuarzo, obtendríamos el máximo de resolución. 150 nm, pero tiene el inconveniente de que la luz ultravioleta no es visible, y hay que hacer fotos. Este método no es útil en procesos normales. También se utiliza empleando marcadores fluorescentes.

Se obtienen los aumentos finales multiplicando los aumentos de la lente ocular por la lente objetivo: 10 x 20= 200X

MEDIOS PARA EL AUMENTO DEL CONTRASTE DE LAS PREPARACIONES:

Se utilizan las tinciones. Pero esto implica que las células quedan muertas durante la fijación. Cuando se extrae una muestra, nada más obtenerla se sumerge en un fijador, que las mata, deteniendo las actividades celulares. Por otro lado, muestras sin teñir son difíciles de observar.

Para estudiar el material vivo se emplea el microscopio DE CONTRASTE DE FASES, que supera la dificultad haciendo más visibles objetos muy transparentes.

La posibilidad de observar las diferentes partes de un objeto depende de la capacidad de obtener la luz de éstas. Los orgánulos difieren unos de otro por su índice de refracción, que depende de la composición de éstos.

El microscopio de contraste de fases convierte las diferencias de índice de refracción en diferencias de claros/oscuros, que se hacen visibles al ojo humano. Esto depende de la capacidad de las ondas para interactuar entre sí. Ésto es lo que se llama INTERFERENCIAS.

Una variante de este microscopio es el Microscopio de NOMARSKI, en el que el rayo de luz blanca, después de atravesar las dos lentes se divide en dos rayos polarizado que siguen trayectorias distintas y que se interfieren entre sí. La imagen resultante aparece en relieve. Este microscopio es útil para el estudio “in vivo” de células.

El Microscopio de Fluorescencia tiene más resolución que otro convencional. SE usa para el análisis de células y tejidos tratados con colorantes fluorescentes (fluorocromos), o que tengan fluorescencia propia.

Las moléculas fluorescentes absorben la luz a una determinada longitud de onda y emiten luz a una longitud de onda más larga.

Si un compuesto de este tipo es iluminado a su longitud e onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permite pasar la luz a la longitud de onda emitida, el componente aparece iluminado sobre un fondo negro.

A diferencia del m. óptico, la luz incidente procede de una lámpara que atraviesa dos series de filtros. Uno para interceptar la luz antes de que llegue a la muestra y otro filtra la luz obtenida a partir de la muestra. El primero se selecciona de manera que sólo permite le paso de la longitud de onda que excita a un determinado colorante fluorescente. El segundo bloquea esta luz y permite el paso de las longitudes de onda emitidas por el propio colorante fluorescente.

La fluoresceína emite un color amarillo-verdoso. El primer filtro sólo deja pasar el azul (=450-490 nm). El espejo transmite la luz de 510-560 nm. Este colorante se utiliza para identificar proteínas u otras moléculas que hayan sido ampliadas covalentemente a un colorante fluorescente.

Hay dos colorantes fluorescentes: la FLUORESCEÍNA y la RODAMINA.

La Rodamina cuando es excitada con verde-amarillo emite una coloración rojo intenso. Acoplando los dos tintes en la misma célula pueden determinar la distribución de las diferentes moléculas. Las dos moléculas pueden detectarse simultáneamente en el mismo microscopio cambiándose el filtro por el necesario.

El Microscopio óptico de barrido con focal tiene acoplado un rayo de barrido mediante un sistema de espejos y rastrea punto por punto la preparación.

Los datos se registran en un ordenador que elabora una imagen de alta resolución, más perfecta que la obtenida con otros microscopios. También puede realizar una reconstrucción en 3D, integrando las imágenes obtenidas y rotar esta imagen para observarla desde distintos puntos de vista.

Los microscopios electrónicos utilizan como fuente de energía luminosa un haz de electrones dentro de una columna al vacío para evitar que sean desviados por el aire.

Supone un gran aumento en la resolución, pues usa electrones y no luz, pues su longitud de onda es 1100 veces menor que la luz blanca, así los electrones pueden contornear muy bien los objetos y esto proporciona buena resolución. LP= K x / AN. La masa de los electrones es de 1/1840 y hace que puedan ser desviados fácilmente, y por ello se trabaja a alto vacío. Para desviar los electrones de modo controlado se usan lentes, pero no ópticas, sino electromagnéticas.

El funcionamiento de este microscopio es el siguientes: se caliente el filamento incandescente que transmite electrones, que tienes a seguir una dirección rectilínea y vibratoria y se dirigen a la parte inferior.

Los electrones son concentrados en la muestra. Una segunda bovina funciona como lente objetivo, dando una imagen ampliada. La tercera bovina es el proyector que proyecta la imagen sobre una pantalla fluorescente o sobre placas fotográficas. Entre ambas lentes hay otra, también electromagnética, que aumenta más la imagen.

Si calculamos el L.R., la longitud de onda de los electrones es 0.005 nm. La A.N. es 0.01 y la K es 0.61. 0.61 x 0.05 nm./0.01= 0.3 nm. 0.3 nm es el mínimo L.R. Pero cuando observamos biomoléculas, como tienen átomos de bajo peso molecular, se impregnan con materiales pesados, como el Osmio y así tendremos más contraste. En materiales vivos, el L.R. no suele ser menor de 1 nm, ya que no puede ser mayor que 1/110 del grosor del corte. La resolución también depende del contraste.

1.5 nm en materiales biológicos es muy buena resolución. Si comparamos esta resolución con la del M. óptico, vemos que hemos mejorado y en el electrónico podemos acercar 1 nm. Ha mejorado unas 240 veces al óptico y 240.000 veces al ojo humano.

EN el M. óptico no vemos colores, sólo imágenes oscuras y claras. Las oscuras dispersan (electrón densas). Las claras son menos densas, que permiten a los electrones pasar libremente por ellas(zonas electrón transparentes).

La muestra se fija, se seca y se recubre con una capa delgada de un metal (oro o platino). Los electrones son dispersados o emitidos cuando este haz primario bombardea consecutivamente cada uno de los puntos de la superficie metálica. Esto origina una imagen sobre una pantalla de televisión.

Su poder de resolución es menor que el de transmisión, 10 nm (teóricos). Los aumentos directos son también menores (20.000 aumentos frente a los 100.000 de transmisión).

El principal uso es la observación en 3D de las células y componentes de tejidos para ver su morfología externa y organización espacial.

TÉCNICAS BIOQUÍMICAS:

• Citoquímica e Histoquímica:

Las tinciones comunes nos informan algo de las células y tejidos, de sus componentes. Por ejemplo, la HEMATOXILINA-EOSINA (técnica binómica). Éste está compuesto por la hematoxilina, colorante básico y la eosina, colorante ácido. Los componentes ácidos (ác. Nucleicos) se unen a la hematoxilina , que es básica y los componentse básicos se unen a la eosina que es ácida. Las primeras son basófilas y las segundas acidófilas.

Mientras le hematoxilina tiñe de azul, la eosina tiñe de rojo.

Hay muchos más colorantes. Pueden ser utilizados tres colorantes o más a la vez.

Se han ido desarrollando técnicas, que mediante reacciones químicas cuyo producto final puede ser detectado al unirse a un colorante, permite demostrar, por medios morfológicos, las modificaciones que se producen en un plano molecular en células y tejidos.

• La Enzimohistoquímica y la Inmunohistoquímica:

La enzimohistoquímica, por ejemplo, es la téncia de la FOSFATASA ÁCIDA DE GOMOL, que se emplea para demostrar la presencia de dicha enzima y por consiguiente, se demuestra la presencia de lisosomas que es donde se encuentra esta enzima. Tiñe de marrón. Estas técnicas son válidas en microscopía óptica y electrónica, pero aplicando el tratamiento específico para ser observado en dicho microscopio.

Las técnicas inmunohistoquímicas son similares. Si en tejido de rata hay proteína Actina, se obtiene actina purificada de rata y se la inyectamos a otro anima, conejo, por ejemplo. Entonces, producirá anticuerpo anti-actina. Estos anticuerpos se los inyectamos a la rata y se unirán a la actina, que es su antígeno. Ahora no se puede visualizar nada, pero si a la anti-actina le añadimos un fluorcromo o usamos el sistema PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA, consistente en unir a la actina la anti-actina, podremos visualizar un precipitado color marrón. Al anticuerpo le unimos una molécula de peroxidasa. De esta forma, el antígeno se unirá al anticuerpo y a la peroxidasa. SI a esto le añadimos Diaminobencianina, obtendremos un precipitado marrón.

Este método tiene la ventaja de que podemos usar el microscopio óptico y que las preparaciones son para siempre, pues las fluorescencias duran solamente unos días.

Las técnicas de enzimohistoquímica y inmunohistoquímica, valen tanto para microscopios ópticos como para electrónicos.

FRAGCIONAMIENTO CELULAR:

Se usa este método para separar los distintos orgánulos celulares para su observación bioquímica y al microscopio electrónico. La técnica se inicia con la homogeneización, destruyendo los tejidos en un homogeneizador, de manera que las células son comprimidas, quedando sus componentes (orgánulos) libres, pero sin llegar a destruirse. Unos 20 min. Bastan.

El homogeneizador se somete a una primera centrifugación que se realiza a unas 1000 veces la gravedad de la tierra (20 min). Ahora los núcleos aparecen sedimentados y el resto de los orgánulos quedan en el sobrenadante. Éste se somete a una 2ª centrifugación a 10.000G, durante 20 in.. El sedimento formado serán mitocondrias, lisosomas y persoxisomas. El resto queda en el sobrenadantes, que se centrífuga por 3ª vez da 105.000 G durante 2 horas. El sedimento, que es la fracción microsomal, contiene retículo endoplasmático rugoso y liso, Aparato de Golgi y membrana plasmática. El sobrenadante, que es el citosol, está formado por el citosol, ribosomas libre, microtúbulos y microfilamentos. Para separar el retículo endoplasmático de los ribosomas se resuspende la fracción microsomal, que se trata con un detergente y se centrífuga a 105.000 G durante 20 min.

En el sedimento hay ribosomas y en el sobrenadante las membranas del retículo.

El sedimento de la segunda centrifugación, que eran mitocondrias, lisosomas y peroxisomas pueden suspenderse en una disolución de sacarosa y centrifugarse a 100.000 G durante 1 h. Ahora quedan lisosomas y peroxisomas en el sedimento y en el sobrenadante quedan mitocondrias.

A su vez, las mitocondrias también pueden romperse y centrifugarse a 38.000 G durante 20 min. Ahora quedará la matriz mitocondrial en el sobrenadante y en el sedimento las membranas,

Este sedimento se puede centrifugar y se obtendrá como sobrenadante la membrana externa y como sedimento la interna.

En ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA pueden separarse partículas más pequeñas como virus o macromoléculas, mediante ventanas transparentes en el tubo de centrifugación y empleando un microscopio óptico o electrónico podemos observar el desplazamiento de las partículas y la velocidad de sedimentación (coeficiente de sedimentación), que dependen del peso moléculas, tamaño y forma de las partículas y se expresa en unidades Svedberg (S).

Otra técnica son los CULTIVOS CELULARES. Son una manera de estudiar cómo actúan diferentes factores sobre células. Consiste en aislarlos de los organismos y colocarlos en un medio de cultivo donde proliferan. Es como un estudio “in vitro” que completa un estudio “in vivo” habitual.

El cultivo puede ser de fragmentos de tejidos o de uno o más tipos celulares previamente aislados del tejido. De esta forma se pueden cultivar los distintos componentes celulares y determinar las propiedades, que dependen de la interacción entre varios tipos celulares.

Los cultivos se realizan en la superficie de una capa de plástico sobre la que pueden crecer las células. A esa capa se le añaden los elementos necesarios para que se desarrollen. Varían según las necesidades de la muestra.

Las células cancerosas tienen un comportamiento especial, además de reproducirse indefinidamente, lo hacen muy rápidamente y sin necesidad de fijarse a ninguna superficie. Se pueden extraer de regiones tumorales, pero también se puede inducir la transformación de células normales en cancerosas con la adición de determinados agentes como virus o sustancias químicas.

Otro método es la CROMATOGRAFÍA, que se emplea para la separación y caracterización de moléculas y macromoléculas de la célula. Aprovecha la cualidad de que una sustancia puede estar formada con distintas solubilidades cada una y al ponerlas en contacto con un disolvente, éste las arrastrará por el sustrato. Un tipo común de cromatografía para separar pequeñas moléculas es la llamada CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN. Una gota de la muestra cuyos componentes queremos analizar, se aplica sobre papel absorbente, CROMATOGRAFÍA DE PAPEL, o sobre una hoja de plástico o cristal recubierta por una capa de un material absorbente e inherte como celulosa, sílice, etc., CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. A continuación se deja que agua o alcohol impregne el papel o vidrio desde uno de sus extremos. A medida que el líquido se va desplazando, va desplazando con él las moléculas de la muestra en función de su solubilidad en cada uno de los disolventes. Después de unas horas, la hoja se seca y se tiñe para determinar la localización de las distintas moléculas.

La CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA, se basa en separa las proteínas. Se prepara una disolución de proteínas y se hace pasar a través de una columna porosa. Las diferentes proteínas se van retrasando a causa de su interacción con la matriz de la columna y a medida que van fluyendo por la parte interior de la columna, pueden recogerse en su estado funcional. Según la matriz que se utilice, las proteínas se pueden separar en función de su carga: CROMATOGRAFÍA EN COLUNA DE INTERCAMBIO IÓNICO, según su hidrofobicidad se llamará C. HIDROFÓBICA, según su tamaño C. DE FILTRACIÓN o según su capacidad para unirse a distintos grupos químicos, C. DE AFINIDAD.