Prácticas de Metodología

Y

Bioquímica estructural

2. Cromatografía de filtración molecular.

En este tipo de cromatografía los componentes de una muestra se separan de acuerdo a su tamaño y forma molecular. La base de esta cromatografía es el “reparto” que sufren las moléculas entre un solvente y una fase estacionaria contenida en una matriz de porosidad definida. La columna se prepara con partículas de una sustancia inerte que contienen poros pequeños. Al pasar una disolución con moléculas de distintas dimensiones a través de la columna, las moléculas con un tamaño mayor que el de los poros se moverán sólo en el espacio que queda entre las partículas, y, por tanto, no sufrirán retraso en su recorrido a través del material de la columna. Sin embargo, las moléculas con un tamaño menor que el de los poros difunden hacia el interior y el exterior de las partículas con una probabilidad que aumenta a medida que disminuye el tamaño molecular. Por lo tanto, las moléculas son eluidas de la columna por orden de tamaños decrecientes.

Para un determinado tipo de columna o matriz se puede calcular un parámetro Kav de elución de una determinada molécula. La representación gráfica de Kav con respecto al logaritmo del peso molecular da una línea recta. Este parámetro se define como:

Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo) donde,

Ve = volumen de disolvente necesario para eluir las moléculas de interés.

Vo= volumen vacío o volumen necesario para eluir una molécula que nunca entra en la fase estacionaria.

Vt = volumen total de columna.

Material de la práctica.

• Tampón PBS (0,1 M de tampón fosfato; 0,15 M de NaCl pH 7.2).

• Sephadex G-100.

• Azul dextrano (10 mg/ml). 2.106 Da

• Rojo fenol (10 mg/ml). 345 Da

• Lana de vidrio.

• Columnas de vidrio.

2.1.Preparación de la columna de Sephadex G-100.

Nombre comercial de una matriz comercial constituida por polímeros de dextrano entrecruzados por epiclorihidrina. El grado de entrecruzamiento va a determinar el tamaño poro y éste va a determinar el rango de fraccionamiento de tamaños moleculares. Esta resina permite separar proteínas globulares cuyo peso molecular esté entre 4.000 y 150.000 Da. Esto último quiere decir que moléculas mayores de 150.000 Da serán incapaces de entrar en el poro de la matriz.

Preparación de la columna en la práctica.

El esquema de la columna es:

Los pasos que se siguen para preparar la columna para la filtración molecular son:

Lo que sucede al echar la resina en suspensión y abrir la pinza es que el PBS pasa a través de la lana de vidrio y se pierde, mientras que la resina queda retenida por la lana y se va empaquetando poco a poco.

Terminado el empaquetamiento, siempre poniendo más PBS por encima del frente del empaquetamiento para que la resina no se seque, se añaden unos ml de PBS por encima de la marca que hicimos. Después se pone parafilm y se deja hasta el día siguiente.

Incidencias.

• Rotura de una pipeta Pasteur. Fragmento de unos 4 ó 5 cm que quedó incluido en la resina, por debajo de la mitad de la columna.

• A la altura de ese fragmento de la pipeta hay unas burbujas no demasiado grandes y no en demasiada cantidad.

• En la parte superior de la columna se observan algunas burbujas pero muy separadas y pequeñas. Creemos que no estaban en un número suficiente ni tenían un tamaño suficiente para que la separación de proteínas se viera muy perturbada.

• Suciedades y partículas, (pelillos o fibras), podrían haber entrado en la columna por falta de limpieza en el material del que disponíamos.

2.2. Equilibrado de la columna.

Después del empaquetamiento tenemos que equilibrar la columna.

Procedimiento.

Los colorantes nos sirven para delimitar el intervalo de volúmenes entre los que deben eluir nuestras proteínas, puesto que sus pesos moleculares se encuentran entre los del azul y los del rojo, y la columna separa las proteínas en función de su peso molecular.

Aunque cogimos 2 ml por encima y por debajo de esos Vo y Vt para estar seguros de que recogemos las proteínas, esto no debería ser necesario si la elución es correcta.

Resultados del equilibrado de la columna.

VeA= Vo= 6 x 1,5 ml = 9 ml, pues recogimos el azul en la fracción 6.

VbR= Vt= 16 x 1,5 ml = 24 ml, pues recogimos el rojo en la fracción 16.

Según estos datos tendremos que recoger 15+2+2 ml de nuestra muestra para recoger las proteínas.

2.3.Separación de proteínas.

Procedimiento.

Según los volúmenes calculados en el equilibrado nosotros teníamos que recoger la primera fracción 7 ml después de aplicar la muestra en la columna, con lo que recogimos 19 fracciones de 1 ml en el intervalo de volúmenes 7-26 ml.

Una vez que recogimos estas 19 fracciones, los ependorf se colocaron en una gradilla y se llevaron las fracciones al frigorífico. El dejar las proteínas a 4ºC se realiza para evitar que las proteínas se desnaturalicen y pierdan su actividad, ya que la filtración molecular separa las proteínas en su estado nativo. El que las proteínas estén en su estado nativo y que conserven su funcionalidad nos sirve para poder identificar en las fracciones determinadas actividades enzimáticas.

Incidencias.

• Quedo algo de rojo fenol entre la lana de vidrio y eluyó junto con las primeras fracciones de la muestra. Como consecuencia de esto en las dos primeras fracciones recogidas había algo de rojo, pero este colorante al no tener naturaleza proteica no interfiere o falsea los datos de la absorbancia obtenida en la prueba de Bradford.

• La elución del rojo y del azul se hizo bien, pero el rojo al llegar a la altura del trozo de Pasteur rota difundió un poco y no iba tan junto o compacto que al principio, en cambio el azul no sufrió ninguna difusión. No sabemos si la punta pudo influir negativamente en la separación de las proteínas por la columna de resina.

2.4.Regeneración de columna.

Paso realizado por los profesores, consistente en vaciar la columna con ayuda de PBS, para que la resina no se seque, para ser reutilizada. Después se quita la lana de vidrio y se lava la columna.

3.Determinación de proteínas y actividades enzimáticas.

3.1. Método de Bradford.

Este es uno de los métodos con mayor sensibilidad para la determinación de proteínas.

Una de las cuestiones que se nos pedían para este punto es la de encontrar el fundamento de este método, pero a pesar de disponer del artículo original de Bradford y del libro de instrucciones del reactivo de Bradford comercializado por Bio-Rad, nos ha sido imposible saber cuál es el tipo de interacción que le permite al azul brillante de Coomasie unirse a las proteínas, lo cual sí se sabe en los otros métodos de este tipo conocidos (Lowry, Biuret). Está claro que al unirse a la proteína, este reactivo, sufre un cambio en su máximo de absorbancia que es el que medimos con el espectrofotómetro, y que es proporcional, por tanto, a la cantidad de proteína. Así, cuánto más proteína halla en la disolución más cambio en la absorbancia habrá, es decir, más absorción habrá en el nuevo máximo que es 595 nm. El cambio es de 465 a 595 nm.

Según lo encontrado en la bibliografía utilizada, podemos decir de este método que:

• Es un ensayo de unión proteína colorante basado en el diferencial cambio de color de un colorante en respuesta a varias concentraciones de proteína. Este es un método de determinación de proteínas que implica la unión de Azul Brillante de Coomasie G-250 con las proteínas. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, se basa en la observación de que el Azul Brillante de Coomasie G-250 existe en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando se une el colorante a la proteína.

• El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo cual es imprescindible aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas.

• La unión colorante-proteína es un proceso muy rápido (2min) y el complejo permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso muy rápido, y que no requiere un tiempo crítico para el ensayo.

• Se pueden utilizar un gran número de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la automatización.

• Es un ensayo que elimina casi todos los problemas que había anteriormente con es tipo de ensayos.

• Las interferencias o no existen o son mínimas por cationes tanto sodio como potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (cuestión fácilmente solventable con la utilización de tampones). Los únicos componentes encontrados que dan una excesiva interferencia en el color del ensayo, son grandes cantidades de detergentes como el SDS, Triton X-100, etc.

• Preparación del colorante. Azul Brillante de Coomasie G-250 (100mg) es disuelto en 50 ml de etanol 95%. A esta disolución se le añade 100ml de ácido fosfórico 85% p/v. La solución resultante se diluye llevándola hasta un litro de volumen final. La concentración en la disolución final es 0,01% p/v de azul, 4,7% p/v de etanol y 8,5 % p/v de ácido fosfórico.

• Una dificultad observada en la realización del ensayo es la tendencia del complejo colorante-proteína a unirse a las cubetas. Esto resulta en una cubeta coloreada de azul: la cantidad de unión es poco importante en lo que se refiere al resultado del ensayo. Se suele lavar el tubo o cubeta con agua destilada entre medidas de diferentes muestras. Este azul se puede quitar y las cubetas se reutilizan sin problemas.

• La sensibilidad del ensayo depende de la naturaleza de la proteína, y en muestras complejas (aunque no es nuestro caso), en las cuales las proteínas se diferencian ampliamente en su respuesta al ensayo, puede ser difícilmente cuantificable. Sin embargo, recientes modificaciones en el ensayo han mejorado su eficacia en estas aplicaciones. Se aplica una cierta cantidad de SDS, el cual por si mismo causa una falta de desarrollo de color, es añadido a la muestra o al colorante. El SDS iguala la reactividad de las distintas proteínas, así que el ensayo puede ser utilizado para mezclas de proteínas. Esta igualdad produce tanto una disminución de la reactividad de proteínas con alta respuesta, como la albúmina, como un incremento en la reactividad en las proteínas con baja respuesta.

• Aplicaciones: Cromatografía, electroforesis, soluciones de proteínas complejas, química clínica, adaptable a la automatización.

Material de la práctica.

• Reactivo de Bradford

• PBS

• Albúmina bovina.

• Fracciones de proteína.

• Espectrofotómetro.

• Tubos de espectrofotómetro.

Procedimiento.

Resultados del patrón obtenidos a partir de la mesa 3C.

Resultados de absorbancia de las muestras.

Incidencias.

• Problemas con los espectrofotómetros, pues algunos no funcionaban (incomprensiblemente) y otros daban medidas extrañas e ilógicas. Además de la falta de aparatos disponibles. Al final medimos en uno que medía perfectamente, aparentemente.

• Fallo al preparar las muestras de las fracciones 4,5, y 6. Este fallo nos impidió ver si tenían proteína esas fracciones y complicó mucho la realización del cuaderno. Deducimos que debían tener proteínas a partir de la gráfica D.O. frente al número de fracción, pues estas fracciones quedaban dentro del primer pico que aparecía en esta gráfica. Después comprobamos que si tenían proteínas al correr el gel de acrilamida.

• Entendimos mal la aclaración del profesor, en la que decía que había que diluir 1/10 las muestras de la curva patrón si la segunda (la primera después del blanco) daba un valor de absorbancia de 1,3 o 1,4, aproximadamente. Pero nosotros al entender mal, diluimos las muestras patrón, 1/10, al obtener en la tercera muestra 1,2. Después de esta dilución, las medidas resultaron totalmente incoherentes. Por la falta de tiempo y por los nervios, no fuimos capaces de resolver este problema y decidimos tomar, como nuestra, la recta patrón de la mesa 3C, y medir con su mismo aparato y con el mismo tubo.

3.2. Determinación de la actividad catalasa.

Un método rápido para la determinación de la proteína catalasa es la observación de su actividad por la formación de burbujas en una solución que contiene H2O2.

Procedimiento.

Resultados de la prueba de la catalasa.

Según los resultados obtenidos en la prueba tenemos que la catalasa se encuentra en las primeras fracciones sobre todo en la 3 y en la 4 que se corresponde con el mililitro 9 y 10. Esto nos dice que la catalasa es una proteína de gran peso molecular al eluir pronto en la columna. Con la columna separamos las proteínas en fracciones según su peso y después con experimentos como este y como el siguiente de la lisozima, identificamos la presencia de determinadas proteínas en esas fracciones.

3.3. Determinación de la presencia de lisozima.

Un método rápido para la determinación de la actividad lisozima es la medida de la disminución de turbidez de una suspensión de pared bacteriana al agregar dicha proteína. Al incubar la suspensión con lisozima la pared celular se hidroliza originando fragmentos pequeños, reduciéndose la dispersión de la luz lo que se manifiesta en una reducción de la absorbancia a la longitud de onda de 450 nm. Así, la actividad enzimática será, por lo tanto, proporcional a la disminución en absorbancia.

En nuestro caso concreto se va a analizar la presencia de esta enzima en las mismas fracciones en las que realizamos el ensayo de la catalasa.

Procedimiento.

La suspensión de pared bacteriana se prepara a partir de la pared del microorganismo Micrococcus lysodeikticus (preparado comercial). 20 mg de este preparado se mezclan con 100 ml de tampón fosfato (100 mM; pH 6.2). (A nosotros se nos dio la suspensión ya preparada).

Los resultados de este ensayo.

Para calcular la actividad de cada fracción tenemos que utilizar una regla de tres inversa.

Se puede ver como en este caso la actividad lisozima se encuentra en las fracciones 10, 11, 12, 13, 14 que se corresponden con los mililitros 16, 17, 18, 19, 20. Esta es, por tanto, una proteína de menor tamaño que la catalasa. El hecho de identificar en estos dos grupos de fracciones dos proteínas, mediante los ensayos de actividad, no quiere decir que no pueda haber más proteínas en esas fracciones, pues al separar las proteínas en función del peso molecular, puede haber en esas fracciones otras proteínas a parte de las ya mencionadas, con pesos parecidos. Los dos grupos de fracciones se corresponden, como ya vimos, con dos picos en la gráfica de D.O. frente a número de fracción, que son las fracciones donde hay mayor concentración de proteínas y con las que tenemos que trabajar para ver cuántas y cuáles son las proteínas presentes en ellas.

6.Detección inmunológica de proteínas.

En ocasiones, cuando la cantidad de material biológico disponible es pequeña, muchos de los métodos químicos habituales para la identificación de moléculas fracasan. Los procedimientos inmunológicos dan solución a estas dificultades, pues posibilitan la determinación de cantidades pequeñas de proteínas en mezclas complejas. En esta práctica se trata de ilustrar la utilización de anticuerpos específicos para la identificación de proteínas de interés, previamente transferidas a una membrana de nitrocelulosa.

Material de la práctica.

• PBS

• Anticuerpo anti-albúmina (conejo).

• Leche en polvo.

• Anticuerpo anti-IgGs de conejo (cabra) unido a peroxidasa.

• 4-cloro-naftol.

• Agua oxigenada.

• Metanol.

• Detergente Tween-20.

• Bolsa de plástico.

• Selladora de plástico.

6.1. Incubación con anticuerpos.

6.2. Revelado de anticuerpos unidos a peroxidasa.

El segundo anticuerpo presenta la enzima peroxidasa unida, siendo esta actividad enzimática la que se va a utilizar para detectar la unión antígeno-anticuerpo. La solución de revelado contiene el compuesto 4-cloro-naftol que al actuar sobre él la peroxidasa va a dar lugar a un producto insoluble de color azul-violeta.

• 20 mg de 4-cloronaftol.

• 8 ml de metanol.

• 32 ml de PBS.

• 20 l de H2O2 (30%).

Es importante que los componentes se vayan añadiendo en el orden indicado, debido a que el 4-cloronaftol es insoluble en agua y debe solubilizarse inicialmente en metanol.

Resultado de la transferencia después de la inmunodetección.

7. Conclusiones.

Antes de empezar a sacar conclusiones sobre estos resultados, tenemos que recalcar que, debido al fallo cometido en la preparación de las muestras, para el Bradford, de las fracciones 3, 4, 5, y a que la recta patrón no era nuestra, todas nuestras conclusiones están condicionadas a ese fallo. Tuvimos que revisar las gráficas de otras parejas para imaginarnos como sería la nuestra. Debido a esto no estamos muy seguros de algunos de nuestros resultados y conclusiones.

Los apuntes que hacemos aquí son:

• Las fracciones características del primer pico son: 3, 4, 5, 6, 7. Dentro de estas las que tienen mayor concentración son: .

Se va echando resina resuspendida en PBS, y con la llave abierta sale el PBS y se espera a que la resina se empaquete, pues la lana de vidrio impide que salga.

Patrón

Muestra

F3

F5

F12