Forma integrada de la ecuación de Michaelis

Puede pasar que alguna de las premisas que utilizábamos para formular la ecuación de M&M no sean válidas, de modo que no podemos utilizar la ecuación tal cual. Aún así, hay métodos matemáticos que nos permiten hallar las ecuaciones de velocidad. Dentro de todas las posibilidades, sólo veremos una, el incumplimiento de la velocidad inicial.

Si recordamos, al plantear el equilibrio decíamos que medíamos velocidades en condiciones iniciales. Esto nos permitía afirmar, en primer lugar, que la [S] a tiempo de medida era asimilable a la [S] inicial, y que la reacción ES * E + P era irreversible, por el hecho de considerar el consumo de S despreciable (si no hay consumo de S no hay producto que se pueda convertir significativamente en complejo). Se puede considerar Vo hasta un consumo del 5% del sustrato.

Pues bien, si tenemos un ensayo cinético en el cual no pueda determinar una Vo, sino que la velocidad de desaparición del sustrato, es realmente una derivada ("d[S]/dt), no podríamos aplicar el supuesto [S]t = [S]o y, por tanto, no podemos utilizar la ecuación de M&M. Este incumplimiento puede darse si:

• La reacción es extremadamente rápida, con lo que en intervalos de tiempo macroscópicos, (del orden de segundos) no podemos manejarla, impidiéndonos medir.

• El método de detección requiere un tiempo de análisis. Tiempo de detección.

El decaimiento de más del 5% del sustrato hace que v ya no sea velocidad inicial, pero no implica necesariamente que el otro supuesto resultado de la aplicación de la velocidad inicial sea falso, con lo que aún podemos considerar irreversible el paso de complejo a producto. El no poder considerar esto nos daría problemas adicionales.

Planteamiento de nuevas premisas

Tenemos entonces que [S]t " [S]o asumiendo que el consumo ([S]o " [S]t) > 5% [S]o. y decimos que podemos asumir todavía que la segunda etapa es irreversible. La ecuación de velocidad para la reacción inversa sería:
. Planteamos ahora ¿cómo podríamos hacer que
?:

Pues bien, 1 no se cumple ya que hemos dicho que no puede superarse un 5% de consumo. 3, por tanto, tampoco. 2, sin embargo, podría ser, con lo que en esos casos podríamos considerar la etapa irreversible.

También podríamos considerar la etapa irreversible si la Keq de la reacción fuera muy alta, (Kcat/Km)S >>>(Kcat/Km)P, según explicamos con la ecuación de Haldane, siendo Keq, al menos del orden de 1.000 o 10.000. Esto puede conseguirse también, como parte de la constante de especificidad, si KmS <<< KmP, y si repasamos las constantes que representaban a Kcat y Km:

Como se observa, las constantes cineticas del denominador de ambas Km son iguales, y solo se diferencian en el denominador. No es así con Kcat, que viene representada por las dos ecuaciones de inicio en cada sentido.

Se puede resumir entonces que podemos considerar también [S] constante si las constances cinéticas de las etapas cumplen esto: k1 >> k"1 y/o k2 >> k"1.

Alguno se preguntará, de que sirve tener una Keq tan alta. Para verlo más claro, pondremos un ejemplo. Tenemos [S]o = 100 M, [S]t = 10 M; con lo que se ha consumido un 90% del sustrato, quedándonos [P]t = 90 M.
. Keq, debe ser del orden de 10.000, de modo, que es obvio que 10.000 >>> 9, muy lejos del equilibrio, aún a pesar de haberse consumido un 90% de sustrato. Como consecuencia, la reacción tiene muchísima más tendencia a formar producto que a convertir este en sustrato, todo para conseguir que [P] sea 10.000 mayor que [S].

Premisas para la integración

Englobamos ahora las premisas de forma teórica a modo de resumen:

Integración de la ecuación de Michaelis

Partiendo de la ecuación de Michaelis, la igualamos a la de velocidad de desaparición de sustrato diferencial. Pasamos dt a un miembro y d[S] al otro para poder integrar entre t y 0 y entre [S] y [S]o respectivamente. Al resultado lo dividimos en ambos miembros por Km·t, dándonos como resultado la ecuación de una recta con forma y = ax + b:

En esta ecuación, podemos sustituir [S]o " [S] por [P] en el eje X y [S] por [S]o " [P] en el Y. El resultado de representar los datos en una gráfica, nos da una recta, como ya habíamos adelantado, que corta en x e y.

La representación puede hacerse por un experimento cinético donde mantenemos constante [S]o y medimos [P] o [S] a diferentes tiempos. Sabiendo Km, se recomienda empezar con una [S]o " 10 Km y dejar que dacaiga hasta que [S]t máximo " 0,1 Km. Y como en toda representación, cuantos más puntos mejor, esta es la razón de esas relaciones aproximadas.

El objeto de la integración no es otro que poder calcular, con mayor exactitud, los valores de los parámetros cinéticos de una reacción enzimática, que no cumple todas las premisas de la ecuación de M&M.

Kcat y Km en reacciones con varios complejos intermediarios

A diferencia del modelo descrito por Michaelis, este presenta una etapa más, pero también es irreversible. Aunque trataremos este tema más adelante, avanzamos este desarrollo para ésteres y enlaces peptídicos.

E + S ES ES'E

El mecanismo vale para la hidrólisis de ésteres, dando como P1 un alcohol y P2 un ácido, como ES la enzima con un hidroxilo unida al grupo R (la cadena unida al carbono) del éster y como ES' la enzima esterificada, que para soltar P2 hidrolizará el éster regenerando el hidroxilo.

Empezaremos a desarrollar la ecuación de velocidad de forma similar a como lo hicimos en anteriores ocasiones, y como lo haremos siempre, definiendo las especies entre las que se reparte [E]T y las velocidades individuales de transformación. En este caso, serán:

[E]T = [E] + [ES] + [ES']; VP1 = k2 · [ES]; VP2 = k3 · [ES']

Consideraremos la aproximación al estado estacionario, de modo que [ES] y [ES'] son constantes y, por tanto, las velocidades de aparición y desaparición de cada complejo son iguales, como ya hemos visto en otras ocasiones. De esas dos igualdades sacamos:

k1 · [E] · [S] =( k"1 + k2) · [ES]; k2 · [ES] = k3 · [ES']

Ambas igualdades nos son válidas para continuar. Ahora hay que despejar [E] y [ES'] y sustituirlos en la ecuación de [E]T, con el fin de sacar una expresión para [ES] que sustituir en la ecuación de velocidad genérica (v = k2 · [ES]). Después de sustituir las concentraciones de complejo “prima” y enzima libre, sacamos factor común a [ES] en el segundo término, para poder despejarlo sin problemas. Una vez despejado, multiplicamos en los dos términos por [S] para dejar “solas” las constantes cinéticas.

Al sustituir en la ecuación de velocidad, hay que hacer que en el denominador se encuentren constantes sumadas a [S], y por eso se divide el numerador y el denominador por (k2 + k3) /k3. El resultado es el siguiente:

El resultado es una hipérbola rectangular análoga a la representada por M&M. Vmax sigue siendo Kcat · [E]T, salvo que ahora Kcat incluye más constantes cinéticas, todas las implicadas en transformación. El valor de [S] a ½ de Vmax lo denominamos ahora Km'. Esta constante incluye todas las constantes cinéticas de todos los procesos que hemos considerado, menos, por supuesto, las de los inversos de las reacciones que hemos considerado irreversibles.

Esto nos da idea de la complejidad a la que vamos llegando, y nos demuestra algo que ya habíamos dicho:

ENZIMOLOGÍA

Integración de la ecuación de Michaelis

k"1

k1 k2 k3

P1 P2

Vmax/Km

"1/Km

Vmax

=