PRÁCTICA 1.

AGLUTINACIÓN EN PORTA (GRUPOS SANGUÍNEOS) Sistema ABO y anti-D (Anti-Rho)

FUNDAMENTO

La determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO se efectúa enfrentando los hematíes problema con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti-A,B (grupo 0).

La presencia del antígeno D (Rho) se determina enfrentando los hematíes problema, en un medio proteico alto, con suero anti-D (Rho). La aglutinación o no-aglutinación de los hematíes ensayados, son indicativos de la presencia o ausencia del correspondiente antígeno en los mismos.

La variante Du , forma débil del antígeno D (Rho), puede detectarse mejor incubando la suspensión de hematíes con suero anti-D (Rho), efectuando a continuación la prueba de la antiglobulina.

MATERIALES

Azulejos limpios

Lancetas

Palillos

Sangre capilar

PROCESO

Tras dividir un azulejo en cuatro partes y haberlos denominado según el antisuero que acogerá cada uno, se añaden dichos antisueros anti-A, anti-B, anti-A,B y anti-D. Después se añadirán unas gotas de sangre en cada recuadro (la obtención de la sangre se hace por un método higiénico y rápido, Glucolet 2). Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada ensayo. Observaremos macroscópicamente si hay alguna aglutinación tras hacer reaccionar la sangre con los antisueros.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Si al término del periodo de reacción ( 2 minutos aproximadamente) no existiese ningún signo visible de aglutinación, se interpretaría como una reacción negativa a ese antisuero.

En cambio, si la reacción es positiva se observa que los hematíes aglutinan en segundos. Sin embargo para detectar los subgrupos más débiles de A debe agotarse el término de los 2 minutos, puesto que el suero anti-A puede aglutinar con cierta demora. El empleo rutinario del suero anti-A,B confirmará las sangres del grupo O.

RESULTADOS

En mi caso, se dio una aglutinación en la sangre mezclada con suero anti-A y anti-D. También se observó una leve aglutinación en el suero anti-A,B.

En conclusión, se deduce que mi grupo sanguíneo es A con Rh POSITIVO.

PRACTICA 2.

SISTEMA DE DETECCIÓN DE AGLUTININAS SÉRICAS

FUNDAMENTO

En esta práctica trataremos de detectar aglutininas séricas surgidas a partir de algunos procesos infecciosos. En este caso, se utilizará una bacteria que suele afectar en el organismo de los bovinos (Brucella color). La determinación se efectúa ensayando diluciones dobles del suero problema en solución salina con volúmenes iguales de suspensión antigénica estandarizada. Tras su incubación se determina el título de aglutinación del suero en presencia del antígeno específico correspondiente. Se denomina “título de anticuerpos” a la última dilución donde la reacción es positiva.

MATERIAL

Tubos de ensayo (8)

Pipetas

Solución salina

Suero

Suspensión bacteriana

PROCESO

Éstas son las disoluciones a preparar:

Nº tubo	1	2	3	4	5	6	7	8
S.salina	0.9	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Suero	0.1	*	*	*	*	*	*	0
Ag Susp.bacteriana	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Dilución final	½	¼	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	CONTROL NEGATIVO

*Se harán diluciones de la disolución anterior al 50%

Una vez hechas las disoluciones, se meterán en una estufa y se tendrán allí a una temperatura de 35ºC aproximadamente, durante 48 horas.

RESULTADOS

dILUCIÓN	½	¼	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256
RESULTADO	+	+	+	+	+	-	-	-

Titulación: 1/32

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Para interpretar los resultados según los tubos:

Si la reacción es negativa, el tubo permanece azul (el antígeno utilizado era azul) con un botoncito de aglutinación en el fondo, que indica que hay exceso de antígeno.

Si la reacción es positiva, se produce un aclaración del medio, que ya no es azul porque el antígeno está siendo capturado. El tubo ahora contiene una disolución incolora con un botoncito azul en el fondo. Este botón azul es una aglutinación, unos grumos de grandes redes antígeno-anticuerpo (porque todo el antígeno ha sido capturado por el anticuerpo).

PRÁCTICA 3.

INMUNODIFUSIÓN

FUNDAMENTO

Es uno de los métodos para detectar la unión entre el antígeno y el anticuerpo. Es un método de precipitación en el cual encontrándose antígeno y anticuerpo a concentraciones equivalentes formarán un precipitado, visible macroscópicamente.

En este caso, tenemos un antígeno soluble en un medio mediosólido, la agarosa, por lo tanto los antígenos se difundirán por el medio antes de precipitar. Si las bandas resultantes de estas precipitaciones están unidas será el mismo determinante antigénico el reconocido y si se cruzan serán diferentes, aunque se pueden dar los dos casos.

Hay métodos para mejorar los resultados como la aplicación de cargas eléctricas (inmunoelectroforesis), ya que se separan mejor las moléculas del antígeno.

Para visualizar mejor los resultados también podemos utilizar métodos de tinción con lo que se logrará diferenciar las bandas de mejor manera.

MATERIAL

• Placa de Petri

• Cinta aislante o celo

• Pipeta Pasteur de cristal

• 5 tubos eppendorf

• Micropipetas de 50 y 100 l

• 15 ml de PBS (Tampón Fosfato Salino) + 2%PEG (polietilenglicol) 6000 + 0.05% NaN2

• Agarosa

• 50 l de antisuero anti-BSA diluido 1:1 en PBS + 0.05% NaN2

• 200 l de PBS + 0.05% NaN2 + 10% BSA (albúmina sérica bovina)

PROCESO

Se preparan 250 ml (para 15 grupos) de PBS + 2% PEG 6000 + 0.05% NaN2 + 1% Agarosa

Calentar la preparación en un microondas hasta que la agarosa esté completamente disuelta. Esto suele producirse cuando la solución alcanza 100ºC.

Colocar 15 ml (aproximadamente) de esta solución caliente en las placas de Petri.

Dejar que solidifique la agarosa. Esto requiere al menos 30 minutos.

Colocar la placa sobre la figura dada y realizar agujeros en la agarosa siguiendo dicho modelo. Para ello se utiliza el extremo más ancho de una pipeta Pasteur.

Marcar cada pocillo por debajo de la placa siguiendo el modelo de la figura.

Realizar dobles diluciones de la preparación antigénica de BSA. Para ello seguir el siguiente esquema:

Colocar 50 l de cada reactivo en sus respectivos pocillos. Cubrir la placa y una vez que se hayan absorbido los reactivos en el gel, sellar la placa de Petri con cinta aislante o celo.

Dejar la placa incubando a temperatura ambiente durante 24-48 horas.

Examinar las líneas de precipitación.

RESULTADO

Esto fue lo que se pudo observar tras casi 48 horas de incubación:

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Se observa que a medida que la disolución del antígeno es más diluida, su banda de precipitación se va haciendo más fina y al observar que dichas bandas no se cruzan, se puede reafirmar que estamos trabajando con el mismo antígeno.

PRÁCTICA 4.

ÓRGANOS DEL SISTEMA INMUNE DEL RATÓN

FUNDAMENTO

En esta práctica se diseccionará a un ratón con el objetivo de observar y diseccionar su timo (órgano linfoide primario situado encima del corazón) y su bazo (órgano linfoide secundario situado a mano derecha y detrás del estómago).

MATERIALES

• Ratón

• Algodón y alcohol

• Material de disección (tijeras y pinzas)

• Plancha de disección

• Placa de Petri

• Buffer (PBS ó SS)

PROCESO

Eutanizar al ratón por dislocación cervical

Fijar el ratón a la plancha de disección

Aplicar alcohol en el ratón

Retirar el pelo del abdomen con un corte longitudinal

Cortar la piel y los músculos abdominales para exponer los órganos internos

Localizar el bazo y algunos nódulos linfáticos

Aislar el bazo y colocarlo en una placa Petri con 10 ml de Buffer.

PRÁCTICA 5.

AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DEL RATÓN

FUNDAMENTO

En esta práctica intentaremos obtener células mononucleares libres de eritrocitos y granulocitos.

MATERIALES

• Bazo de ratón

• Tubos de centrífuga

• PBS

• 3 ml de Ficoll-Hypaque

• Pipeta Pasteur

• Pipetas de 10 ml

• Centrífuga

PROCESO

Tamizar el bazo disgregándolo sobre un colador.

Recoger la suspensión celular con pipeta y pasarla a un tubo de centrífuga de fondo cónico.

Esperar 2 minutos la sedimentación del debris.

Recoger el sobrenadante.

Dispensar aproximadamente 9 ml de suspensión celular sobre la columna con 3 ml de Ficoll dejando resbalar suavemente por las paredes.

Centrifugar 20 minutos a 1750 r.p.m. y temperatura ambiente.

Recoger la interfase de separación con pipeta Pasteur en la cual se observan tres fases en el fondo: una zona roja con eritrocitos, otra zona con Ficoll y por último, un anillo denso donde están las células deseadas.

Disponer las células mononucleares en un tubo de centrifugar, suspender en PBS y realizar un lavado de 10 minutos a 1750 r.p.m.

Resuspender la pastilla en 1 ml de PBS.

PRÁCTICA 6.

RECUENTO CELULAR Y TINCIÓN VITAL

FUNDAMENTO

Recontar la población de células viables en la suspensión celular obtenida en la práctica anterior.

MATERIALES

• Células mononucleares de bazo de ratón

• Colorante azul de trypan al 0.5%

• Hemocitómetro (Neubauer mejorado)

Uso del hemocitómetro o cámara de recuento celular Neubeauer improved

La cámara del hemocitómetro está dividida en 9 cuadros. Las 4 esquinas del cuadrado están divididas en 16 cuadrados, y el cuadrado central está dividido en 25 cuadrados, los cuales a su vez están divididos en 16 cuadrados pequeños. Los cuadrados grandes, cada uno tiene un área de 1 mm2. Cuando se pone la muestra entre el cubreobjetos, la profundidad de la cámara es de 0.1 mm. El volumen total en cada cuadrado grande es el siguiente:

1 x 0.1 = 0.1 mm3 = 0.0001 cm3 = 10-4 ml

PROCESO

Tomar 100 l de suspensión celular.

Incorporar igual volumen de colorante vital.

Agitar y poner 10 l de la suspensión en la cámara de recinto celular. Contar las células transparentes y las azules.

Calcular el porcentaje de viabilidad.

RESULTADOS

% viabilidad	Nºcélulas vivas/cuadro	nºcélulas/ml
99%	99	5 x 107

Obtenemos esta cantidad de células por mililitro de disolución, teniendo en cuenta que el producto se debe multplicar por 2, porque estamos trabajando con una dilución 1:2 (porque hemos utilizado colorante al 0.5%).

PRÁCTICA 7.

TINCIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

FUNDAMENTO

Se utilizará el método de tinción Diff-Quick para hacer un frotis sanguíneo.

MATERIAL

• 2 portaonejtos/persona

• Sistema Diff-Quick de coloración

• Microscopio óptico

PROCESO

Se realiza en el porta una extensión de una gota de sangre. Para ello se utilizará otro porta colocándolo sobre el primero con una inclinación de unos 45º.

Se deja secar la extensión a temperatura ambiente.

Se realizan:

• 5 inmersiones de un segundo cada una en el contenedor con fijador (Fast Green + metanol)

• 5 inmersiones de un segundo en el contenedor con el colorante I (Eosina G)

• 4 inmersiones de un segundo en el contenedor con el colorante II (Tiazina)

• 2 lavados con agua destilada

Se deja secar la preparación y se observa en el microscopio óptico.

RESULTADOS

Teniendo en cuenta que normalmente se observa un número de trescientas células para hacer un frotis de sangre y en nuestro caso se han observado solamente cien células, no resultara raro que algún porcentaje sea más alto o más bajo de lo esperado:

células	porcentaje
Neutrófilos	31%
Linfocitos	52%
Monocitos	17%
Eosinófilos	0%
Basófilos	0%

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

En este caso, hemos obtenido un porcentaje anormalmente superior de linfocitos y de neutrófilos, debido a que el frotis de sangre observado pertenece a un individuo que está sufriendo una infección viral provocada por Herpes Foxter.

Debido a esta infección viral, el número de linfocitos en sangre aumenta considerablemente, y con ello, los linfocitos T colaboradores inducen el aumento del número de monocitos en sangre.

INDICE

PRÁCTICA 1.

AGLUTINACIÓN EN PORTA (GRUPOS SANGUÍNEOS) Sistema ABO y anti-D (Anti-Rho)

PRACTICA 2.

SISTEMA DE DETECCIÓN DE AGLUTININAS SÉRICAS

PRÁCTICA 3.

INMUNODIFUSIÓN

PRÁCTICA 4.

ÓRGANOS DEL SISTEMA INMUNE DEL RATÓN

PRÁCTICA 5.

AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DEL RATÓN

PRÁCTICA 6.

RECUENTO CELULAR Y TINCIÓN VITAL

PRÁCTICA 7.

TINCIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS