INMUNOLOGÍA

Y

SEROLOGÍA.

INMUNOLOGÍA Y SEROLOGÍA

DIAGNÓSTICO DE LA SÍFILIS.

Introducción a la metodología analítica:

Las reacciones serológicas para el diagnóstico de la sífilis comprende dos grandes grupos: las denominadas reacciones específicas y las inespecíficas.

La serología inespecífica, también denominada serología clásica por ser la primera que se utilizó tiene su fundamento en la amplia distribución natural del antígeno lipoídico del treponema o antígeno de Wasserman, que es el que actúa contra el anticuerpo correspondiente o reagina sifilítica.

En efecto del antígeno de Wasserman se obtuvo a partir del músculo cardiaco. El cual durante años ha mejorado su calidad antigénica, y así desde la utilización primitiva de los antígenos crudos constituidos por el extracto de órganos secos o disecados con agregados de colesterol, lípidos, etc. Se utilizaron luego los antígenos semipurificados constituidos por extractos de músculos cardiacos con cantidades definidas de lípidos agregados.

Y por último los utilizados en la actualidad que son los extractos purificados con sus tres componentes: lectina, cardiopilina y colesterol, dosificados en forma conveniente.

Los anticuerpos actuantes en este tipo de reacciones son las reginas sifilíticas, es decir el producto de la agresión textural desarrollada por la espiroqueta. Su característica es la inespecifidad y actúa contra el tejido lipoidal; su génesis se explica como consecuencia del transporte de las proteínas del treponema y de los fosfatos provenientes de la alteración del metabolismo lipídico.

Las reacciones específicas modernas son producidas por los anticuerpos específicos contra constituyentes proteicos hidrocarbonados de los treponemas que constituye la consecuencia de la agresión textural ejercida por las espiroquetas.

El conjunto de reacciones específicas para el diagnóstico de la sífilis comprende dos grupos de reacción:

las basadas en el empleo del antígeno proteico de treponemas patógenos

las que se valen del antígeno proteico para treponemas no patógenos

el representante del primer grupo y tal vez la más utilizada en la actualidad es la reacción de REITER, mientras la reacción de NELSON-MAYER o de TEST de inmovilización treponémica constituye el segundo grupo mencionado.

Quizás ocurra que los sueros de individuos no sifiligrado con las que se utilicen antígenos lipídicos y en mayor grado con las que utilicen antígenos lipídicos y en menor con los treponémicos, por una serie de influencias sea por diversos estados patológicos o por reacción de medicamentos tóxicos. Así en la lepra, tuberculosis, tifo exantemático, diversas enfermedades virósicas y diferentes espiroquetosis, trastornos catabólicos como la diabetes, neoplasias leucémicas, intoxicación arsénica, etéreas, alcohólicas, reacciones antivareolosas, antitetánicas, antidiftéricas, medicamentación por sulfas, algunos hipertensores, etc, integran una larga lista de causantes no por fuerza obligados pero si muy influyentes en el determinismo de las falsas reacciones positivas.

REACCION V.D.R.L..

REACTIVOS:

Antígeno. es una solución alcohólica de cardiopilina lectina y colesterol, estable a temperatura ambiente.

Cardiopilina 0.43 gr.

Lecitina 0.43 gr.

Colesterol 0.4 gr.

Alcohol absoluto cbp. 1000 ml.

Formol neutro 0.5 ml.

Fosfato disódico 0.093 gr.

Fosfato monopastico 0.170 gr.

Cloruro de sodio 10 gr.

Agua dest. Cbp. 1000 ml.

Con una pipeta se agregan al buffer 0.5 ml. Del antígeno gota a gota, agitando el frasco por rotación, evitando que la punta de la pipeta toque el frasco por rotación, evitando que la pipeta toque el líquido y completando toda la adición del antígeno en un lapso aproximado de 6 segundos, continuar la rotación durante otros 10 segundos, encontrándose lista la emulsión para su uso.

REACCION CUALITATIVA EN SUERO.

En una excavación de una poli cubeta se colocan 0.05 ml. De suero inactivado a 56° durante 30 minutos a 62° durante 5 minutos.

Con una pipeta especial se deja caer sobre el suero una gota de la suspensión antigénica. La gota debe equivaler a 0.016 ml por lo que es importante preparar una pipeta especial que suministre esa cantidad de emulsión antigénica. Esta cantidad de 0.016 ml en forma rutinaria se agrega con jeringa tuberculinica a la que se le aplica una aguja de calibre número 22. puestos en contacto con solución antigénica, se imprime un movimiento de rotación a la placa, ya sea de forma manual sobre la superficie de la mesa o bien con un aplicador durante 4 minutos.

La lectura de los resultados es inmediata. Con preferencia a observar al microscopio con débil aumento y escasa iluminación.

Se considera reacción negativa cuando aparecen pequeñas partículas antigénicas distribuidas de manera homogénea sin grumos. Cuando la reacción es positiva, aparecen grumos o conglomerados de distintos tamaños, que define los distintos grados de positividad expresados en cruces de una a cuatro.

REACCION CUANTITATIVA EN SUERO

Disponer una serie de tubos con 0.2 ml de cloruro de sodio 0.85 % en cada tubo.

En el primer tubo agregar 0.2 ml de suero inactivado, mezclar y pasar 0.2 ml de este tubo a la siguiente y así sucesivamente hasta llegar al último, del cual se desechan 0.2 ml.

Se tendrán 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; el resultado será positivo, 1:32.

ANTIESTREPTOLISÍNAS

La mayoría de los estreptococos del grupo “Beta” produce dos factores hemolíticos. La estreptolicina “O” y “S” capaces de producir la ruptura de hematíes y por lo tanto hemólisis.

En individuos infectados por estreptococos del grupo “Beta”, la estreptolisina “O” estimula la producción de antiestreptolisinas, mientras la estreptolisina “S” no genera anticuerpos. La antiestreptolisina “O” se encuentra de ordinario en el suero en escasa concentración y su presencia se debe a la frecuencia de infecciones estreptocócicas. Cuando el titulo de estreptolisinas es elevado indica una infección reciente importante de investigar si se atiende a las probables secuelas (complicaciones) como la: glomérulo nefritis, fiebre reumática o el eritema nudoso.

Se descubrió que pacientes que padecían una infección aguda a estreptococo y un marcado aumento de estreptolisinas durante un periodo latente posterior a la enfermedad, desarrollaron fiebre reumática, mientras aquellos pacientes en que su aumento de antiestreptolisinas fue ligero o moderado no desarrollaron fiebre reumática.

La determinación del titulo de estreptolisina es valiosa en el diagnóstico diferencial de la fiebre reumática inicial y la artritis reumática donde el titulo no resulta elevado.

FUNDAMENTO

Si se agrega estreptolisina o glóbulos rojos se producirá hemólisis. Cuando el suero del paciente contiene anticuerpos (estreptolisinas “O”) se pone en presencia de la estreptolisina (antígeno), se producirá una reacción antígeno-anticuerpo, con la subsiguiente neutralización de la estreptolisina “O” en parte o por completo según la cantidad de anticuerpo presente.

Si se encuentra una cantidad constante de anticuerpo mientras sea suficiente se producirá la neutralización del antígeno y no aparecerá hemólisis. Los resultados se expresan en “Unidades TOD” definidas al principio como la cantidad de suero capaz de neutralizar 2.5 dosis hemolíticas mínimas de una estreptolisina estandarizada.

REACTIVOS

1. Solución Buffer

NaCl 7.40 gr.

Fosfato monopotasico anhídrido 3.17 gr.

Fosfato di sódico anhídrido 1.81 gr.

Agua destilada cbp.

Ajustar el Ph de 6.5 a 6.7 conservar en refrigeración y deshacer en caso de que se desarrollen los hongos.

2. Suspensión de glóbulos rojos al 5 %:

En la solución buffer agregar hematíes del grupo “O” Rh positivo previamente lavados con solución salina tres veces,

(0.5 ml de hematíes en 99.5 ml de solución buffer).

3. estreptolisina “O”

4. suero del paciente inactivado, durante 30 min. A 56° o 5 minutos a 62° C.

Nota: cuando el suero no se utiliza inmediatamente se aconseja conservarlo en refrigeración.

VALORES NORMALES

El tubo No. 1 corresponde a 125 U.T

El tubo No. 2 corresponde a 250 U.T

El tubo No. 3 corresponde a 500 U.T

El tubo No. 4 corresponde a 1000 U.T

El tubo No. 5 corresponde a 2000 U.T

De acuerdo con la técnica desarrollada se consideran valores normales de 166 U.T. hasta 250 U.T.

TÉCNICA

Preparar las siguientes diluciones del suero usando solución de Buffer como diluyente.

4.9 ml de solución Buffer

agregar 0.1 ml de suero del paciente inactivado a la solución anterior.

TUBOS	I	II	III	IV	V
Solución buffer sin suero del paciente	0.6 ml.	0.5 ml	0.5 ml.	0.5 ml.	0.5 ml.
Solución buffer con suero del paciente	0.4 ml.	0.5 ml.	0.5 ml.	0.5 ml.	0.5 ml.
Estreptolisina “O” (activada)	0.25 ml.	0.25 ml.	0.25 ml.	0.25 ml.	0.25 ml.
INCUBAR A 37 ° C DURANTE 15 MINUTOS
Glóbulos rojos al 5 %	0.25 ml.	0.25 ml.	0.25 ml.	0.25 ml.	0.25 ml.

Agitar e incubar a 37° C durante 30 minutos.

Centrifugar a 1000 r.p.m durante un minuto.

Interpretación: reportar el tubo anterior en que se observó la hemólisis.

PROTEÍNA “C” REACTIVA

Esta es una proteína anormal que aparece en la sangre luego de la fase aguda de distintas enfermedades inflamatorias.

Su nombre proviene de la circunstancia de que forma precipitado con el polisacárido somático “C” no específico del neumococo. Al principio se pensó que se trataba de un anticuerpo del neumococo lo que se desecha en la actualidad porque aparece con frecuencia en forma independiente a toda infección neumocóica.

Algunos investigadores la consideran como precursor de anticuerpo, se sabe también que la proteína “C”puede aparecer en personas agamaglobulinémicas incapaces de elaborar anticuerpo por otra parte el hecho de que desparezca cuando la inflamación cesa.

Parecería más probable que aparezca como consecuencia de la destrucción textural en las necrosis masivas de los infartos o de ciertos tumores malignos, o en procesos inflamatorios, en las lesiones del sistema retículo endotelial, puede aparecer el indivando entonces un probable origen desconocido, no es un anticuerpo genuino porque carece de la cualidad de éste de organizarse como consecuencia del contacto de un organismo con el antígeno específico.

Quizás la proteína “C” es una globulina que contiene por lo menos dos componentes. Talvez sea una lipoproteína.

Las investigaciones realizadas demuestran una identidad absoluta de la proteína “C” cualquiera que sea la afección casual de su aparición. La proteína “C” reactiva se encuentra presente en el suero del paciente con distintos grados de actividad reumática. Debe insistirse sin embargo, que su existencia no es específica, desde que puede aparece como respuesta a otras condiciones inflamatorias. En los pacientes reumáticos tratados con corticoides, la positividad de la proteína “C” reaparece cuando se interrumpe el tratamiento, quizás por un mecanismo de rebote que dura algunos días. Si persiste la posibilidad debe reanudarse el mismo.

MATERIAL

Antisuero Antiproteína “C” (obtenible en el comercio)

Suero del paciente

Tubo capilar de 90 mm de long. Y 0.4 mm de diámetro

TÉCNICA

Por capilaridad se introduce en el capilar una cantidad de antisuero hasta llenar un tercio del mismo, luego se procede de igual manera con igual cantidad de suero del paciente, mezclar por inversión e insertar por un extremo del tubo en un trozo de plastilina el cual debe evitarse el contacto con la muestra o mezcla líquida, se incuba a 37° C durante dos horas.

Dejarla una noche en el refrigerador. Luego se lee adoptando el siguiente criterio:

Si no hay precipitado se informa negativo

Si hay positividad se indica con cruces, adjudicando una cruz por cada mm lineal del precipitado en el tubo capilar.

DIAGNÓSTICOS DE ARTRITIS REUMATOIDEA

INTRODUCCIÓN

La artritis reumatoide es una enfermedad sistemática crónica de etiología desconocida que afecta a la membrana sinovial, músculos esqueléticos y cartílagos y produce cambios degenerativos e inflamatorios, además de la artritis aparecen con frecuencia módulos subcutáneos como granulaciones sobretodo alrededor de los vasos sanguíneos y también en miocardio y pulmones. También las válvulas cardiacas pueden ser afectadas.

En las lesiones granulo matosas no hay depósitos fibrinoides como ocurre con el lupus eritematoso, enfermedad con la que guarda cierta semejanza citología.

Al principio hay linfocitos y luego evoluciona hacia la normalidad y puede finalizar con ligera leucopenia. Pueden presentarse células LE. Como el lupus eritematoso diseminado en un 2 %de los casos lo que permite establecer parentesco entre las dos enfermedades.

Las pruebas utilizadas para la investigación del factor reumaticazo pueden clasificarse en dos grupos:

reacción de hemoaglutinación

reacción de fijación de látex.

FUNDAMENTO

En éste método se introduce la novedad del calentamiento del suero a 56 ° C durante 30 minutos para destruir un factor normal antiglobulina que puede aglutinar las partículas de látex cubiertas con globulina y dar falsos positivos.

El calor también puede destruir inhibidores anticoagulantes reduciendo también los falsos negativos.

REACTIVOS

látex globulina. Partículas de poli estireno sensibilizadas con gama globulina humana

suero positivo para control.

suero negativo para control

diluyente. Solución reguladora de glicina salina Ph = 8.2. si al cabo de cierto tiempo la solución se encuentra contaminada o nebulosa no deberá utilizarce.

Solución buffer Ph = 8.2

Glicina 7.5 gr.

NaCl. 8.5 gr.

Agua dest. Cbp 1000 ml.

Ajustar al Ph a 8.2 en caso que sea necesario con hidróxido de sodio 1 N.

TÉCNICA

La detección rápida del factor reumatoide, es una prueba rápida, contribuyendo de esta manera en el diagnóstico de la artritis reumatoide.

El reactivo de látex globulina aglutinará en presencia de un suero adecuadamente diluido que contenga el factor reumatoide.

PRUEBA RAPIDA EN PLACA

inactivar el suero del paciente a 56° C durante 30 min. O a 62° C durante 5 min.

poner en un tubo limpio 1 ml. De solución glicina salina, Ph = 8.2 añadir una gota del suero problema y agitarse bien.

coloque una gota de mezcla anterior en uno de los óvalos de la placa de vidrio (el cartoncillo negro debajo de la misma facilitará la lectura en el microscopio)

agregar una gota del reactivo de látex globulina, mezclado perfectamente con un palillo, extendiendo sobre toda la superficie del óvalo.

CONTROLES NEGATIVO. Coloque en un óvalo una gota de suero negativo de control y agregue una gota del reactivo de látex globulina. Mezcle perfectamente bien con un palillo. POSITIVO. El mismo procedimiento anterior pero utilizando suero positivo de control.

oscile suavemente la placa durante 1 o 2 minutos y observe microscópicamente si aparece aglutinación.

INTERPRETACIÓN

Compare el resultado del suero problema con los controles negativo positivo.

NEGATIVO. Suspensión uniforme sin aglutinación visible, comparable al control negativo.

POSITIVO DEBIL. Aglutinación visible por formación de pequeños agregados o sólo aglutinación parcial.

POSITIVO FRANCO. Aglutinación visible por formación de agregados grandes y fondo claro. Comparable al control positivo.

Nota: suero proveniente de personas sanas pueden presentar reacciones falsas positivas, en general débiles, pero ésta incidencia es baja.

PRUEBA CUANTITATIVA EN TUBO

Esta prueba deberá llevarse a cabo con suero que han dado una reacción positiva por el método de lectura rápida en placa de vidrio.

TÉCNICA

coloque nueve tubos perfectamente limpios en una gradilla y márquelos del 1-9

ponga con una pipeta 1.25 ml de solución reguladora glicina salina, Ph = 8.2, en el tubo numero uno y 0.5 ml de cada uno de los tubos restantes.

añada 0.1 ml. Del suero problema al tubo 2, mezcle bien, transfiera 0.5 ml al tubo 3. continúe haciendo la misma operación hasta llegar al tubo 8, deseche 0.5 ml de este tubo. Al tubo 9 no se le transfiere líquido del tubo 8.

añada una gota del reactivo del látex globulina a cada uno de los 9 tubos.

mezcle bien e incúbelos durante 15 a 30 minutos a 37° C en baño maría

centrifugue a 2500 rpm, durante un minuto, desprenda suavemente el sedimento y observe si hay aglutinación microscópica.

INTERPRETACIÓN

El tubo 9 (control) negativo no deberá presentar aglutinación. En caso de presentarse algún otro factor distinto, el factor reumatoide es el causante de la floculación o aglutinación.

El título del suero corresponderá al último tubo en que se presente aglutinación total del reactivo látex globulina y se reportará de acuerdo a la siguiente tabla

TUBOS No	TITULO
1	20
2	40
3	80
4	160
5	320
6	640
7	1280
8	2560

REACCIONES FEBRILES

DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD

Los procesos febriles provocados por distintos microorganismos pueden diagnosticarse por el laboratorio, sea por el descubrimiento del agente causal, por el hallazgo de los anticuerpos generados durante el transcurso de infecciones provocadas por distintos gérmenes:

Salmonellas, brucellas, proteus, E. Coli, etc.

FUNDAMENTO.

Se trata de una reacción de aglutinación donde los anticuerpos actúan sobre los antígenos bacilares. La reacción se trata de una reacción de aglutinación donde los anticuerpos actúan sobre los antígenos vacilares. La reacción de Windal puede utilizarse en la placa de vidrio (reacción microscópica) o en tubos (reacción macroscópica)

REACCIÓN EN PLACA.

En los espacios de una poli cubeta se depositan, usando una pipeta adecuada a 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005 ml de suero, se agita el frasco que contiene el antígeno (“O” somático o “H” flagelar) depositando una gota de esto 0.03 ml en cada una de las cavidades de la poli cubeta, donde se ha ubicado el suero. Las diluciones aproximadas que resultan son: 1:20.1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc. Respectivamente.

Las diluciones 1:20, no tienen importancia clínica. Mayores diluciones pueden obtenerse si se usan diluciones del suero en solución salina 1:10.

Con una varilla de vidrio se mezcla el contenido de cada cavidad comenzando con la mayor dilución. Se mezcla con suaves movimientos de inclinación de la placa y se lee luego en un periodo que no exceda tres minutos.

Debe tenerse la precaución de que la fuente de luz en que se opera no suministre demasiado calor para evitar el desecado de la muestra antígeno suero pudiendo inducir aglutinaciones parciales erróneas, se clasifican los grados de aglutinación en cruces en la siguiente forma:

100 % de aglutinación + + + +

75 % de aglutinación + + +

50 % de aglutinación + +

25 % de aglutinación +

ausencia de aglutinación Negativo

el criterio de positividad se determina por la menor cantidad de suero capaz de producir el 50 % de aglutinación.

INTERPRETACIÓN

La reacción se considera positiva cuando la aglutinación se observa en una dilución 1:80 o mayor, lo que indicará infección tifoidea siempre y cuando no haya recibido vacunas antitíficas.

Por eso se aconseja recurrir al hemocultivo o urocultivo, dejan de ser adecuados y aumentas la importancia de la reacción de Widal a partir del día décimo.

La vacunación puede ser responsable de reacciones positivas durante varios años. En los pacientes sospechosos que recibieron la vacuna debe investigarse la fiebre tifoidea con una serie de reacciones de Widal practicadas en diluciones mayores.

Las aglutininas “H” pueden encontrarse con títulos altos durante meses en los vacunados y los antígenos tifoideos “O” en cambio tienen gran valor aún en títulos bajos.

Así por ejemplo los títulos 1:40 frente al “O” y 1:40 frente al “H” son decisivos en los vacunados.

REACCIÓN FEBRIL EN TUBO

TUBOS	1	2	3	4	5	6	7	8
Solución salina	0.1 ml	0.1 ml	0.1 ml	0.1 ml	0.1 ml	0.1 ml	0.1 ml	0.1 ml
Suero	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml
Ag. (“O”) o Ag. (“H”)	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml	0.2 ml

De la solución salina suero mezclar, pasar 0.2 al tubo 2 y así sucesivamente hasta el tubo número 8 desechar 0.2 ml de este último.

TUBOS 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280

INTERPRETACIÓN

La reacción positiva se aprecia por la aglutinación completa de las bacterias en forma de grumos y el líquido sobre nadante claro por completo.

Cuando se sospecha que una salmonella parafiti “A” o “B” sea el agente causal del proceso febril de la infección se aconseja investigar los anticuerpos paratíficos utilizando suspensiones bacterianas específicas con una metodología similar a la anterior.

BRUCELOSIS

También llamada fiebre ondulante o fiebre de cabra que son varias las especies de brucelas capaces de producirlas. En el género animal, se observa en las cabras, en el ganado vacuno y en los cerdos. La infección se transmite al hombre por la leche u otros productos de granja y también por el contacto diario con secreciones o tejidos del ganado enfermo.

Durante el transcurso de la enfermedad aparece la fiebre o sudoración, escalofríos, cefalea, dolores musculares (debilitamiento general) etc.

TÉCNICA

Se utiliza la técnica de la reacción de Windal en placa de vidrio, pero usando suspensión de brucella.

INTERPRETACIÓN

La reacción positiva (infección brucelósica) cuando existe aglutinación en la dilución 1:40 puede ser producida por aglutinaciones normales.

INFECCIONES PRODUCIDAS POR RICKETTSIAS

Se emplea un antígeno no específico constituido por variantes “O” de cepas no móviles de proteus vulgaris, conocidas como OX, OX2, 0XK. Los anticuerpos de la sangre de pacientes infectados aglutinan a estos antígenos con distinta intensidad según el tipo de infección.

TÉCNICA

De ordinario puede observarse aglutinaciones hasta las diluciones 1:20 a 1:40 por lo que la reacción se considera positiva cuando sobrepasa la dilución 1:80.

En las infecciones por rickettsias, al finalizar la primera semana de instalada la enfermedad aparecen títulos superiores a 1:80 y la segunda semana aumenta mucho y quizás llegue a títulos muy altos. En la convalencia disminuye el titulo con rapidez haciéndose la reacción negativa después de cinco o seis meses o más.

ENDOCRINOLOGÍA DEL EMBARAZO

La fecundación se realiza en la trompa de Falopio, cuando el espermatozoide se pone en contacto con el óvulo, logra penetrar en la cubierta de este, zona elucida y no permite la entrada de otro espermatozoide. La implantación se realiza durante el periodo luético del ciclo menstrual y en fase secretora endometrial en esta etapa se segrega estrógenos y progesterona.

PLACENTA

En una glándula de secreción interna que se diferencia de todo el sistema endocrino, por ser un órgano temporal (sólo está presente durante el embarazo), en una constitución genética diferente a la madre.

Produce hormonas con gran influencia metabólica sobre el organismo materno pero con un alto grado de autonomía e independencia de los mecanismos de regulación materna.

La placenta es la única glándula de secreción interna capaz de elaborar dos tipos diferentes de hormonas proteicas y esteroides porque las demás glándulas elaboran un tipo definido de hormonas.

UNIDAD FETO PLACENTARIA

El feto interviene en la metabolización de algunas de las hormonas elaboradas por la placenta. También posee capacidad para transformar determinados precursores o intermediarios que luego utilizará la placenta en la biosinesis hormonal. De todo esto se deduce que el feto no debe considerarse como un compartimiento pasivo de la producción hormonal, sino que interviene en forma activa en equilibrio funcional de la unidad feto placentaria y la actividad metabólica de ambos compartimentos; se complementan entre sí con una distribución de los sistemas enzimáticos de los esteroides durante el embarazo.

GONADOTROPINA CRÓNICA HUMANA

(HCG)

la placenta elabora dos tipos de hormonas gonadotropicas: la crónica y la lactógeno placentaria humana.

La HCG es una glucoproteína con un peso molecular de 60, 000 formada por dos cadenas de glucoproteínas con peso molecular de 30, 000 cada una.

La proporción de hidrógeno y de carbono en la molécula de HCG es de 17.8 a 19.5 formada por galactosa y hexosamina en una reacción molar de 2:1.

TÉCNICA Y FUNDAMENTO

La prueba está basada en el principio de inhibición de la hemoglutinación

Los eritrocitos cubiertos con HCG (sensibilizados a ésta) humana, se precipitan en presencia de un antisuero y forma una capa uniforme en el fondo del tubo de ensaye. Cuando a éste sistema se agrega un líquido que confine HCG por ejemplo: orina de una mujer embarazada, esta gonadotropina inhibe la reacción anterior y se forma en el fondo del tubo un anillo de eritrocitos.

METODO

MTERIAL BIOLÓGICO

La primera orina de la mañana. Es conveniente recomendar al paciente que disminuya la ingestión de líquidos en la tarde y noche anterior a la prueba que deseche la micción de las 22:00 hrs, de la noche anterior.

TÉCNICA CUALITATIVA

Colocar 5 ml de orina en un tubo de ensaye y centrifugar 10 minutos a 2500 r.p.m, en gradilla especial que se proporciona con los equipos colocar en una ampúla el antisuero linfolizado (0.25 ml)más glóbulos rojos sensibilizados (1 gota) y agregar 0.25 ml de orina.

Agitar la gradilla con movimientos de rotación durante un minuto y dejar en reposo durante dos horas, leer el resultado.

INTERPRETACIÓN

Ausencia de anillo. Reacción negativa

Presencia de anillo. Reacción positiva

TÉCNICA CUANTITATIVA

Hacer una serie de diluciones con agua destilada y la orina por titular dichas diluciones pueden ser, por ejemplo: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, etc, o bien 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 etc.

De cada una de dichas soluciones se colocan 0.25 ml en el ampúla que contiene antisuero y glóbulos rojos sensibilizados; se hace la lectura a las dos horas. La última dilución de la serie se forma claramente el anillo, dará la cantidad de gonadotropina criónica presente en la muestra de orina. La concentración de gonadotropina criónica en unidades por litro se calcula al multiplicar la sensibilidad de los reactivos por la última dilución en que se formó el anillo. Por ejemplo:

Sensibilidad de los reactivos: 1000 unidades / litro

Resultado positivo hasta la dilución 1:64

1000 X 64: 64 000 unidades / litro

con un volumen de 960 ml (orina de 24 hrs.) se obtendrá

57 600 unidades / litro

sensibilidad: 1000 unidades / litro

volumen recibido: 700 ml

resultado positivo: 1:32

32 X 1000 : 32 000 unidades / litro

METABOLISMO Y ELIMINACIÓN

Pocos son los conocimientos referentes al metabolismo de esta hormona. El máximo de eliminación se produce cerca de los 60 días de amenorrea. En la figura se observa que su ascenso y su descenso serán bruscos para luego estar presentes en cantidades mínimas durante el embarazo.

El descenso se produce cuando la placenta, está lo suficientemente madura como para continuar el desarrollo del embarazo alrededor de la semana 34 se observa un pico de significación fisiológica desconocida.

Luego que la HCG deja de actuar, no a valores nulos, porque se comprobó que mínima cantidad presente hasta el noveno mes se necesita para favorecer el proceso de biosíntesis de esteroide placentario.

Estudios de investigación encontraron que cerca de un 60 % de gonadotropinas séricas se elimina por los riñones.

En un embarazo normal no pasa de 30 000 en el primer trimestre

En el segundo está estacionario

El tercer trimestre se forma la hormona que va a producir las contracciones

Cuando el primer trimestre la hormona que se encuentra arriba de 30 000 indica un proceso neoplásico o un aborto incompleto.

PCR LÁTEX

Prueba directa

AGENTE DE DIAGNOSTICO

Prueba de aglutinación de particulas de látex para la prueba para la detección y cuantificación de proteínas C reactiva en suero.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

La prueba de PCR látex se basa en una técnica desarrollada por sangre et-al (8) . Las moléculas biológicas inertes de poliestireno látex son sensibilizadas con anti PCR obtenida de animales por medio de inmunizaciones.

La proteína C reactiva en el suero del paciente sirve como antígeno y cuando el suero contenido PCR se mezcla con látex sensibilizado se produce una aglutinación detectable microscópicamente .

DESCRIPCIÓN DE LOS REACTIVOS:

Reactivo de látex sensibilizado: suspensión de partículas de poliestireno látex en amortiguador salino de salina Ph 8.2.

Las partículas de látex están sensibilizadas con anti PCR humana obtenida de animales. El producto contiene azida de sodio al 0.1% como conservador y debe ser almacenado de +2° a +8 (275° K-28° K). Cuando no se utilice. No debe ser congelado y debe tenerse cuidado de que el gotero este bien serrado para evitar la evaporación del fluido y que pueda ocurrir la formación de agregados no específicos de las partículas .

Suero control positivo: suero humano estabilizado contenido proteína C reactiva a concentraciones de >o = 6 Mg. /l

Reactivo control negativo: contenido albúmina sérica bovina al 1 %, merthiolate al 0.1 % y azida de sodio al 0.1 % el cual ha sido probado como no reactivo con la suspensión de látex sensibilizado.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACIÓN

No se requiere ningún tipo de preparación del paciente para la obtención de la muestra, la sangre se recolecta por punción venosa, se deja coagular y el suero se separa por centrifugación.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

Método cualitativo:

esperar a que los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente.

poner una gota del suero problema en las áreas marcadas de la laminilla

colocar una gota de los controles positivo y negativo respectivamente en la segunda y tercera área marcada en la laminilla

mezclar el reactivo PCR látex hasta tener una suspensión homogénea y añadir 1 gota del reactivo de látex al suero y a los controles

mezclar con un agitador diferente para cada área

mover en ángulo de 45° la laminilla por 2 minutos

observar inmediatamente la aglutinación utilizando una fuente de la luz directa, comprobar las reacciones del suero y de los controles.

Interpretación

La aglutinación de las partículas de látex indica una reacción positiva. La sensibilidad del reactivo de látex de 6 Mg. /l

La no aglutinación o una ligera aparición de granulosidad que no exceda a la observada en el control negativo, indica un resultado negativo.

Procedimiento cuantitativo

preparar diluciones en serie usando como factor 2 si la última dilución del suero continuara mostrando aglutinación se sugiere utilizar un factor más alto, por ejemplo comenzando por 1:20 hasta 1:640 y si ésta dilución persistiera la positividad se debe realizar diluciones mayores

colocar 1 gota de cada dilución del suero en las áreas marcadas en la laminilla.

Nota: la laminilla suministrada en el equipo, es suficiente para probar todas las diluciones al mismo tiempo, pero las laminillas de pruebas anteriores se pueden utilizar. La misma pipeta puede utilizarse para todas las diluciones partiendo de la dilución más altas.

colocar una gota diluyente del suero como control de éste último

mezclar el frasco que tiene el reactivo de látex PCR hasta obtener una suspensión homogénea y añadir 1 gota de reactivo en cada una de las áreas de la laminilla

comenzando con el control del diluyente y con la dilución más alta a la más baja, utilizar un palillo para mezclar y extender los reactantes sobre el área marcada en la laminilla

proceder como en el paso 6 y 7 del procedimiento cualitativo

Interpretación de los resultados

La aglutinación de látex sensibilizado en la prueba cualitativa indica que el suero probado contiene proteína C reactiva.

En la prueba cualitativa el titulo está dado por la recíproca de la máxima dilución del suero que muestra aglutinación, multiplicando por la sensibilidad (6 Mg. /l)

La fuerza de aglutinación no es indicativa de la concentración de PCR en el suero problema. Una reacción débil puede ocurrir con niveles elevados o ligeramente elevados de PCR.

La ausencia de aglutinación indica una reacción.