GENÉTICA

INTRODUCCIÓN

• Darwin: Multiplicación, Variación, Herencia - Define la Selección: es lo que determina que la Variación y la Herencia conlleven o no un éxito reproductor mayor. La población que tiene el rasgo que da mayor exito reproductor es la que sobrevive y esos genes se seleccionan.

• Bateson: 1906. La Genetica es la que se ocupa de la Herencia y la Variación. Hoy en día esa definición se actualizó a otra más incierta. Es la ciencia que se ocupa del conocimiento relacionado con los genes.

HISTORIA

• HIPOCRATES (500 aC): Copias diminutas de cada organo viajan a las gónadas y se materializan creando organos pequeñitos. (PANGÉNESIS)

• ARISTOTELES (400 aC): El hombre aporta la matriz, la mujer la forma (EPIGENESIS)

• LAMARCK (1800): Lo que uno haga afecta a los descendientes (similar a la pangénesis) - no da una clara razón para la transmisión de genes, la variación y la herencia o el soporte físico de los genes. No existía lupa ni microscopio y no se creía en las células o los óvulos, etc.

• PASTEUR Y TYNDALL: Refutan la teoría de la generación espontánea

• DARWIN (1859): El origen de las especies - teoría evolutiva (muy buena teoría, lástima que de genes sabía poco y dudaba de su existencia)

• WEISSMAN (1883): Corta la cola a ratones y hace experimentos para ver si su descendencia recuperaba la cola - parecía que si......por lo que la pangénesis estaba rechazada - define dos SOMAS - el SOMA GERMINAL - el SOMA CORPORAL

• REDESCUBRIMIENTO DE LOS EXPERIMENTOS MENDELIANOS (1900): comienza el período mendeliano de la GENETICA DE LA TRANSMISIÓN

• SUTTON y BOUEN (1902): Teoría cromosómica de la herencia - las características hereditarias están en los cromosomas.

• JOHANNSON (1903): Define genotipo, fenotipo, gen (unidad de información hereditaria para un caracter)

• BATESON (1906): Primera definición de la genética

ÉPOCAS

• 00-40 PERIODO MENDELIANO (PRINCIPIO DE LA GENETICA CLÁSICA)

• 40-60 CODIGO GENÉTICO - naturaleza del MH (GENETICA MOLECULAR!!!!)

• 60-70 GENETICA DE LA REGULACION Y EL DESARROLLO

• 70-00 NUEVA GENETICA (manipulación molecular)

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TEMA 2 - GENETICA MENDELIANA

LOS EXPERIMENTOS DE MENDEL

Mendel era un monje agustino que vivía en Breno (Reino Austria, hoy Chequia). Los monasterios por esa época eran las fuentes de conocimientos más seguras y precisas ya que además de instruir académicamente a todos los monjes, eran bibliotecas importantes del saber.

Por esa época, la "ciencia" era importante sobre todo para poder desarrollar nuevas y mejoradas formas de cultivo que aseguraran a los terratenientes un rendimiento productivo acelerado y preciso. Muchos estudios se conducían sobre manzanas, cereales y otros.

Mendel comenzó sus experimentos en 1856, con el objetivo de conseguir un método de cultivo más preciso y correcto. Para ello, tomó una planta ornamental muy valiosa, el guisante de olor o de jardín. Observando caracteres fácilmente observables y discontinuos, y utilizando métodos bastante avanzados para realizar retrocruzamientos, autofecundación y entrecruzamientos, consiguió, luego de muchos años, unos resultados sorprendentes.

De hecho, sus experimentos dieron unos resultados tan sorprendentes que seguramente no habrían significado nada para cualquiera menos para Mendel. Su segunda gran habilidad residió en utilizar aritmética simple para tratar de relacionar los números y valores que había obtenido en sus experimentos. Eso le permitió ver que la distribución de los caracteres en la herencia no era tan azarosa como en un principio paracía ser.

Los resultados de los experimentos le permitieron concluir sus principios Mendelianos, hasta hoy válidos como generalidades en el proceso de la herencia.

Sus experimentos fueron publicados en una revista agrícola en 1866. Lo hacen abad y deja de estudiar los guisantes. Mendel fallece en 1884 y recién en el año 1900 vuelven a salir a la luz sus ideas de mano de muchos plagios encubiertos (REDESCUBRIMIENTOS).

Durante los primeros años del siglo XX, los científicos más excelsos de la comunidad mundial se dedicaron a criticar y tratar de probar la falsedad de los experimentos de mendel. Las ansias por probar si la validez existía para animales, para otras plantas, crece enormemente. EL MUNDO ES MENDELIANO hasta los años 40........

CARACTERISTICAS Y FUNDAMENTOS DEL EXPERIMENTO

• Estudió 7 características discontinuas por separado. Se estudiaba siempre un par de características contrapuestas.

• Su objetivo inicial fue buscar líneas puras (aquellas que por autofecundación siempre daban el mismo rasgo en todos sus descendientes). Para la autofecundación utilizaba bolsitas para encerrar las flores. Así se aseguraba de que no hubiera polen extranjero. Para cada rasgo obtuvo estos individuos que llamó: GENERACION PARENTAL (P)

• Luego cruzaba las dos líneas puras para un mismo caracter obteniendo híbridos. Estos primeros descendientes poseían uno de los dos caracteres, no una mezcla de los dos. De esa manera quedaba probado que la herencia genética no era una combinación de los caracteres dando algo intermedio, sino que uno de los dos caracteres prevalecía sobre el otro dependiendo del individuo.

• Esa primera descendencia la llamó PRIMERA GENERACIÓN FILIAL (F1). Todos los individuos de F1 poseían uno solo de los caracteres, el que Mendel llamó DOMINANTE.

• Los individuos F1 (sin importar cuales eran sus caracteres) volvían a autofecundarse dando lugar a la SEGUNDA GENERACIÓN FILIAL (F2). En estos individuos, reaparecían los caracteres que habían desaparecido en la F1. Por cada 3 descendientes que poseían el rasgo DOMINANTE, había 1 que poseía el rasgo perdido.

• Mendel no se detuvo ahí, aunque los resultados parecieran desconcertantes. Volvió a realizar otra autofecundación, con cada planta por separado, nuevamente con el mismo metodo de las bolsitas. Descubrió que la TERCERA GENERACIÓN FILIAL (F3) tenía las respuestas al desconcierto del paso anterior. Cada 3 individuos de la F2 que poseían el rasgo dominante, uno daba F3 SOLO con el rasgo dominante, mientras que dos daban la misma mezcla que se había producido en F2. Los individuos que poseían el rasgo perdido, por autofecundación daban invariablemente una descendencia TODA ELLA CON EL RASGO PERDIDO

• Mendel contabilizó todo y le aplicó las aritméticas básicas para sacar números enteros a partir de todos sus resultados.

• Para realizar los cruzamientos o hibridaciones, Mendel castraba las flores que iban a servir como femeninas, arrancandoles los estambres. Luego pintaba sus estilos con polen de la planta macho y cerraba la flor con una bolsita para evitar contaminación. Fue muy importante que Mendel repitiera los cruzamientos invirtiendo los papeles de las plantas de la generación parental. Esos cruzamientos se conocen como CRUZAMIENTOS RECÍPROCOS y fueron fundamentales para entender que algunos de los caracteres estaban relacionados con el sexo del donador de la herencia.

TERMINOS MENDELIANOS

Mendel habló de particulas, pero nunca de genes. Para él, cada individuo poseía dos particulas que contenían información para la misma característica pero en sus dos variaciones opuestas. Los gametos solo llevaban una de esas dos particulas y cuando se mezclaban gametos femeninos con masculinos, se generaba un nuevo individuo que tenía nuevamente dos partículas (HERENCIA PARTICULAR)

Una de las dos partículas llevaba el rasgo dominante y por lo tanto, siempre que estuviera en el individuo, este presentaría el rasgo dominante. La segunda particula podía ser la dominante, o la recesiva. Para que un individuo presentara el rasgo recesivo, necesitaba tener sus dos partículas recesivas. Un individuo solo transmitía a su herencia una de sus dos partículas.

Así concluyó que las dos líneas puras (P) eran AA y aa. Al mezclarlas, solo podían surgir individuos que poseyeran las dos partículas, y por lo tanto que presentaran el rasgo dominante (F1 eran todos Aa).

Autofecundando esos individuos la posibilidad de que sus descendencias presentaran rasgo dominante era de 3/4, mientras que la probabilidad de que surgieran individuos que presentaran el rasgo recesivo era de 1/4. Esto se verificaba experimentalmente en los resultados de los calculos de Mendel.

Evidentemente, 1/2 de los individuos F2 tendrían Aa, mientras que 1/4 tendrían aa y el último 1/4 tendría AA. Los resultados de la herencia particular fueron llamados ASPECTOS por Mendel. Así, un cuarto de los individuos tenían el aspecto correspondiente a la particula recesiva y tres cuartos el de la partícula dominante.

TERMINOS DESARROLLADOS POSTERIORMENTE

Los individuos que poseen una herencia genética del tipo AA y aa son llamados HOMOZIGOTOS.

Los individuos que poseen una herencia genética del tipo Aa son llamados HETEROZIGOTOS.

Las características DOMINANTES se encuentran opuestas a las RECESIVAS. Estas características se presentan según cual sea la dotación alélica para un mismo gen. Si se tienen los alelos recesivos y dominantes, el dominante prevalece. Si se tienen alelos recesivos unicamente, entonces la característica presentada es la recesiva. Si se tienen solo alelos dominantes, entonces la característica presentada es la dominante.

EN OTRAS PALABRAS, SOLO LOS INDIVIDUOS HOMOZIGOTOS RECESIVOS PRESENTAN EL ASPECTO DEL CARACTER RECESIVO. LOS INDIVIDUOS HETEROZIGOTOS SIEMPRE PRESENTAN EL ASPECTO DEL CARACTER DOMINANTE.

Johannson en 1903 ya habla de Genotipo y Fenotipo. Se considera Genotipo a la dotación alélica que posee un individuo y que determina cual será el Fenotipo. Se considera Fenotipo al aspecto que presenta el individuo adulto. En un análisis Genotípico de la F2 Mendeliana:

Si la p(A) = p (a) = 1/2

p (AA) = 1/4

p (aa) = 1/4

p (Aa) = 1/2

En un análisis Fenotípico:

3/4 de los individuos presentan el rasgo dominante

1/4 presenta el rasgo perdido

Clase 4 - comenzamos con la continuación de los experimentos de Mendel....

Recordamos lo del analisis genético y lo de los cruzamientos recíprocos, lo de los términos genéticos (homo y heterozigóticos, etc.)

¿Qué más hizo Mendel?

RETROCRUZAMIENTO

Consiste en tomar individuos de la F1 y cruzarlos con las dos líneas puras (Parentales).

O sea, es cruzar Aa con aa y Aa con AA. Los resultados evidentemente son:

Para Aa + AA = 1/2 son AA y 1/2 son Aa (la mitad heterocigoticos, la mitad homocigóticos dominantes)

Para Aa + aa = 1/2 son aa y 1/2 son Aa (la mitad heterocigóticos, la mitad homocigóticos recesivos)

Pero ojo, en algunos casos muy especiales, no todas las lineas puras son homocigóticas, por lo que estos retrocruzamientos son esenciales en el análisis genético.

CRUZAMIENTO PRUEBA

Consiste en cruzar cualquier híbrido con individuos P de la línea homocigótica recesiva. Cualquier híbrido cruzado con un homocigótico recesivo, no necesita ser heterocigótico. Se llama prueba porque sirve para verificar cual es la dotación alélica del individuo probado.

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Caracter: Aspecto de la semilla (gen - sabemos que un gen regula el tema ya que analizamos geneticamente el rasgo y sigue una secuencia o patrón mendeliano de aparición; si no se hubiera comportado así, )

Fenotipos: Liso (Dominantes), Rugoso (recesivos)

Genotipos: Aa, AA, aa

Alelos: Dos genes, uno dominante y otro recesivo controlan la expresión del gen. Existen genes monoalélicos (ejemplo: el numero de cabezas en los humanos), pero también hay algunos que tienen más de dos.

CONCEPTO DE "SALVAJE"

SALVAJE = SILVESTRE = WILD

Es la variante más común que tiene un gen en una población dada. OJO! No tiene porque ser la variante dominante, aunque tenemos una tendencia a pensar eso. Porqué no? Porque hay muchas otras variables que afectan la expresión génica.

Ejemplo: Color de los ojos. Imaginemos que solamente hubiera dos variables en los humanos: claros y oscuros. Sabemos que los hijos de parejas que tienen las características claro/oscuro suelen tener todos los hijos oscuros. Esto realmente no sucede en humanos, pero en otros animales SI. O sea que nuestros F1 serían todos oscuros. Pasa algo así con el color del pelo también, y otras características que dependen de la producción de melanina.

Así, la característica de pelo oscuro es la SALVAJE, SILVESTRE o WILD. Los que no tienen el pelo y los ojos oscuros son los MUTANTES.

Pero si nos vamos a otros sitios, la situación es justo la contraria. En escandinavia, los SILVESTRES son los rasgos claros, y los MUTANTES son los rasgos oscuros.

OJO. También es importante distinguir que lo salvaje puede referirse al fenotipo y al genotipo. El fenotipo de dos individuos puede no revelar sus diferencias genotípicas. Por eso, genotípicamente, tener un color u otro, no define que seas salvaje o no. Pero si la mayor parte de la gente tiene AA y la menor parte Aa o aa, entonces el AA es el salvaje y aa o Aa son los mutantes genotípicamente.

Con estas características, ya podemos pasar a tratar de crear arboles genealógicos. Se hacen muchísimo en humanos, aún en laboratorios de criminología. Se hacen sobre todo porque no nos dejan hacer cruzamientos con humanos. No solo eso, sino porque tenemos unos tiempos de generación muy raros.

(Ver la hoja de árboles genealógicos)

ALELOS

Mendel llegó a plantearse cosas muy complejas. Si uno se fija en dos características a la vez....qué sucede?

Tomó las siete caracerísticas de dos en dos y repitió el análisi genético.

Cuando cruzó Lisos y rugosos salían todos lisos. En la F2 salían 3 lisos por cada 1 rugoso.

Lo mismo sucedía con el amarillo (dominante) y verde (recesivos)....SISI NOS COMEMOS LOS GUISANTES RECESIVOS!!!!!

El tema es que consiguió lineas puras de Amarillos y Lisos y de otros Verdes y Rugosos.

En la F1 obteníamos todos Amarillos y rugosos (hibridos dominantes), pero en la F2 aparecían datos muy raros. Aparecían por cada 9 Amarillos Lisos, 3 Amarillos Rugosos, 3 Verdes Lisos y 1 Verde Rugoso

O sea que aparecían 9 con las dos características dominantes, 6 que combinaban las características dominantes y recesivas y 1 que tenía las características recesivas.

EL TOTAL DE AMARILLOS SIN EMBARGO ERA 12 por cada 4 DEL TOTAL DE VERDES (proporción total 3 a 1 - la misma que tenía en el experimento sencillo)

EL TOTAL DE LISOS ERA 12 por cada 4 DEL TOTAL DE RUGOSOS

(proporción total 3 a 1 - la misma que tenía en el experimento sencillo)

UTILIZANDO LAS MATEMÁTICAS

p amarillo = 3/4

p verde = 1/4

p rugoso = 1/4

p verde = 3/4

p una característica Y la otra = p una característica . p otra característica

p amarillo y rugoso = 3/4 . 1/4 = 3/16

p verde y liso = 3/4 . 1/4 = 3/16

p verde y rugoso = 1/4 . 1/4 = 1/16

p liso y amarillo = 3/4 . 3/4 = 9/16

ESTO DECÍA QUE LAS CARACTERISTICAS ERAN INDEPENDIENTES!!!

PRINCIPIOS DE MENDEL

• SEGREGACIÓN DE LOS CARACTERES: Para cada característica, hay dos caracteres que segregan, independientemente el uno del otro en la segunda generación. Hace referencia a que si hay dos rasgos que se fusionan en la F1, aparecen nuevamente los dos en la F2. Se refiere a UNA SOLA CARACTERISTICA

• TRANSMISIÓN INDEPENDIENTE: Nos dice que cuando estamos viendo dos rasgos distintos, cada uno de ellos se comporta y se transmite indepenedientemente. Eso hace que en la famosa F2 me aparezca el 9:3:3:1 que realmente esconde el 3:1 de la primer característica y el 3:1 de la segunda.

Además, Mendel también experimentó con tres características.

Obtuvo las mismas conclusiones cuando experimentó con las tres características.

El tema es que aumenta el número de genotipos y fenotipos. En la F2 tenemos 27 genotipos y 8 fenotipos diferentes. Mirando cada pareja de alelos por su cuenta, se comportan exactamente igual.

Una subdisciplina Mendelista se ocupa de este tipo de analisis. Ampliaciones o variaciones del mendelismo son una parte de la genética muy importante.

RELACIONES MATEMATICAS MENDELIANAS - en cualquier libro de genética...

Los humanos tenemos 10000 genes que sirven. Un ordenador puede hacer los calculos y nos dan cifras increibles. Con solo 10 características tenemos casi 60000 genotipos diferentes!!!!

www.netspace.org/MendelWeb

"En el centenario de Mendel: la genética ayer y hoy" Editorial Alhambra, 1984. JR Lacadena y Col.

Se editó hace muchos años, con lo cual tiene muchos errores. Lo bueno es que tiene muchos experimentos y resultados de la palabra de Mendel traducidos al castellano. Es de lectura amena.

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DIVISION CELULAR: MITOSIS Y MEIOSIS

Son procesos diferentes. COMPLETAMENTE DIFERENTES. Pero tienen fases que son muy similares. Imaginemos que tenemos unas células con un "único cromosoma" (uno y su complementario)

Ambas comienzan con una duplicación del genoma. O sea que tenemos cuatro cromátidas por cada cromosoma. Hay algunas combinaciones en el caso de la meiosis. En la primera división se separan los cromosomas por células, 1 en cada. La segunda división solo se da en la meiosis. En esa división se generan cuatro células en la que el numero cromosómico es la mitad que en la célula normal, o sea un cromosoma por cada célula, con una cromátida.

En el caso de aplicar el mendelismo tenemos o siguiente.

Las líneas puras tienen el cromosoma con el alelo A y el cromosoma conjugado con el alelo A; y el cromosoma con el alelo a y el cromosoma conjugado con el alelo a también.

Se da la duplicación genómica antes de la meiosis. Por eso tenemos AAAA y aaaa.

Cuando se da la meiosis I en ellas, terminamos con dos células por cada célula incial. Estas células tienen AA cada una; o aa en el caso de la otra línea pura.

En la segunda meiosis tendremos la consecuente separación de cromátidas. Finalmente terminaremos con cuatro células por cada célula inicial. Cada una de ellas tendrá un único alelo en su cromosoma.

Se da la fecundación y se genera el zigoto 2n que tiene ahora una A y una a.

Se vuelve a dar la meiosis. Se generan 2 A y 2 a. Esas cuatro células se autofecundan entre si dando:

AA, Aa, aA y aa., las posibilidades de la F2.

Si consideramos otro alelo más, tenemos que considerar un caso en el que la célula tenga 4 cromosomas diferentes. Así tenemos realmente 4 cromátidas que se duplican dando 4 cromosomas.

Tenemos Aa Bb, un híbrido. Cuando se de la meiosis, me generará cuatro tipo de gametos. Unos gametos AB, unos aB, otros Ab, otros ab.

O SEA QUE MENDEL ESTABA REALMENTE DESCRIBIENDO EL PROCESO MEIÓTICO. SI NO CONSIDERAMOS A MENDEL ESTARIAMOS NEGANDO LO QUE SABEMOS DE LA TEORIA CELULAR SOBRE LA MEIOSIS.

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AMPLIACIONES DEL MENDELISMO

La primera ampliación es la de las VARIACIONES en la DOMINANCIA.

La vida es más compleja y analizar su transmisión suele ser más complejo que los experimentos de Mendel. Porqué? PORQUE NO TODOS LOS GENES SE COMPORTAN IGUAL.

GENES CON DOMINANCIA INCOMPLETA (INTERMEDIA)

En el Dondiego de Noche (planta con flores rojas, rosas y blancas)

Las líneas puras parentales tenían RR (flores rojas) y rr (flores blancas)

La F1 tenía todas flores Rosas (Rr). O sea que los híbridos no presentaban ningun rasgo. O sea, Mendel estaba equivocad???? NO! No estaba equivocado. Sus principios se seguían cumpliendo. El tema es que el rasgo era producto de una combinación.

La F2 tenía Flores Rojas en una relación 1/4, las Flores Rosas 2/4 y las Flores Blancas 1/4.

La relación matemática tenía sentido. El tema es que el rasgo para Rr no era el dominante, sino una "combinación" de los rasgos paternales. HABIA TRES FENOTIPOS CON 1 SOLO CROMOSOMA!

También podríamos plantearnos que esto solo tiene que ver con plantas y con pigmentación, pero esto también ocurre en animales y en muchos casos.

La MUTACIÓN BAR es realmente una cosa comun en genética. Si el ojo salvaje de Drosophila es de una forma, el ojo BAR es diferente, con forma de bastoncito o barra. PODEMOS CONSIDERAR LA CARACTERISTICA DE LA FORMA, PERO TAMBIEN EL NUMERO DE CONOS QUE FORMAN EL OJO COMPUESTO (la mutación bar tiene un numero menor de ocelo).

Si cruzamos el mutante con el salvaje obtenemos un ojo intermedio medio deforme, que es un caso de Dominancia incompleta entre el gen WILD y el alelo BAR.

Es muy común que en los híbridos mutantes existan fenotipos intermedios.

GENES CON CODOMINANCIA (no es lo mismo!)

El ejemplo típico del grupo sanguíneo. El primer grupo sanguíneo descubierto fue el M y el N. Los descubrió Landsteiner. Está el gen LM y el LN.

Un individuo puede ser homocigótico para M, para N o puede ser heterocigótico. En los cruzamientos habituales de todos lo genotipos posibles, se consiguen cosas muy peculiares.

Si los parentales son homocigóticos se consiguen todos los descendientes de un unico grupo sanguíneo, M o N.

Si se cruza un homocigótico con uno heterocigótico, se obtiene la mitad de un grupo M o N y la mitad del grupo MN. Estos MN pueden recibir sangre de cualquiera de los padres.

Si se cruzan dos heterocigóticos se obtiene la mitad de un grupo mezcla MN, un cuarto M y un cuarto N.

Si se cruzan dos homocigóticos, uno M y otro N, los descendientes son todos MN, heterocigóticos.

Esto es un caso típico de codominancia. Realmente M y N son dos variantes para la misma glicoproteina de membrana. Los MN no tienen una dominancia intermedia, o sea una proteina intermedia. Los MN presentan las DOS proteinas. No es que tengan mayor número de proteinas, sino que la mitad son de un tipo y la mitad son del otro.

La Anemia falciforma es exactamente igual. Están los individuos que tienen la forma normal (homocigóticos normales) y los que tienen la forma falciforme (hemoglobina anormal, heterocigóticos). Los mutantes, gracias al cielo son los falciformes. Si un individuo tiene padres heterocigótico y homocigótico, por su sangre tiene LOS DOS TIPOS DE ERITROCITOS.

DOMINANCIA ALTERNANTE

Los dos alelos del heterocigoto se expresan uno tras otro a lo largo del desarrollo del individuo (enfermedad de huntington)

DOMINANCIA INFLUIDA POR EL SEXO

El cromosoma con las cosas importantes es el X. O sea que hombres y mujeres. Las características propias de un sexo están en el Y, para los hombres. La falta del Y es la que produce la diferencia en las mujeres.

Ganado ovino y presencia de cuernos

Calvice en humanos

DOMINANCIA CONDICIONADA

ej. Epistasias

Los genes actuan en colaboración. La dominancia de un gen puede condicionar la dominancia y la expresión de otro gen.

También este caso incluye el condicionamiento producto del ambiente y el desarrollo.

ALELISMO MULTIPLE

Hasta ahora vimos que cada gen tiene dos alternativas (“alelos”).

Pero un investigador francés estudiando el color del pelaje de los ratones. Consiguió tres líneas puras, una para el rasgo pelaje gris, otro para negra y otro para amarillo.

Hizo los cruzamientos entre las 3 y los retrocruzamientos (total de 6 experimentos…)

Amarillo dominaba sobre gris y sobre negro

Gris dominaba sobre negro

Negro nunca aparecía en la F1.

Estableció una serie alélica.

En el locus (localización del gen) c podíamos tener el alelo c1, c2, c3….cn.

Los organismos diploides tendrán dos alelos en el mismo genoma. Había muchos más genotipos y fenotipos.

Gen polimórfico: un gen es polimórfico cuando tiene varias formas y ninguna de sus alternativas supera al 95% de la población. Si alguna lo supera que hacemos? El gen es monomórfico (¡eso realmente es una mentira! ¡Está mal considerar que el resto son mutaciones! Pero es un convenio).

Esto es común?

Es mucho más común el caso de alelismo múltiple, pero suelen haber genes monomórficos (a la manera biológica) con mucha frecuencia también.

El sistema ABO de receptores proteicos glicosilados en eritrocitos humanos es típico de un caso de alelismo múltiple. Los tres alelos posibles se llaman iA, iB e iO. Se establecen relaciones de dominancia diversa. Los individuos iAiA, los iAiB, los iBiB, los iOiO, los iOiA y los iOiB. Esos son todos los genotipos posibles. A tiene dominancia sobre O. B tiene dominancia sobre O. Entonces hay cuatro fenotipos: los del grupo A (iAiA iAiO), los del grupo B (iBiB iBiO), los del grupo AB (iAiB) y los del grupo O (iOiO). Los alelos A y B son CODOMINANTES. El alelo O es recesivo siempre.

Los del grupo AB solo pueden recibir del grupo A o B ya que sino se forman hemocomplejos que se aglutinan precipitando. Los del grupo O solo pueden recibir del grupo O, pero pueden donar a todos los individuos.

Los alelos White de Drosophila también es un ejemplo típico. El alelo más salvaje es el W+ que da el color de ojos rojos, el habitual en Drosophila. Hay una gran cantidad de otros alelos, el alelo coral (Wco), el alelo eosina (We), el alelo naranja, el alelo…, hasta llegar al alelo W que es el de color de ojos blancos. Solo en el caso de que se tenga WW podemos tener una mosca de color de ojos blancos. Todos son dominantes sobre el blanco que es recesivo para con todos. Pero no todos son dominantes sobre el siguiente.

Cuando se cumplimentó el estudio genético con un estudio preciso de la pigmentación del ojo de Drosophila… se vió que el W+ tenían la cantidad máxima de pigmento en el ojo, mientras que los W tenían la cantidad de pigmento minima. Todo el rango del resto de combinaciones alélicas iban teniendo los valores intermedios desde 0,004 hasta 1,25.

Esto llevó a pensar que tal vez podría haber ISOALELOS, o sea alternativas genéticas distintas que muestran el mismo genotipo. Esto ocurre cuando alelos diferentes que presentan un fenotipo muy similar visto por el ojo humano. Dan el mismo fenotipo aparente pero son alelos diferentes (W+-Wo y Wco-Wo dan colores muy similares).

El sistema S es un sistema de autocompatibilidad que existe desde las plantas hasta los primates. Existen muchísimos alelos para el locus S, entre 12 y 40 normalmente. Lo que hace es impedir que prosperen los frutos y las semillas en homocigosis, de tal manera que una planta TIENE problemas para autofecundarse, pero no los tiene para fecundar otras. Se evita la homocigosis, y se fomenta la heterocigosis. Así se evitan ciertos efectos de alelos letales y deletéreos que suelen ser recesivos. Evitando la homocigosis recesiva se evita el tema. Lo veremos más adelante. Ojo…esto no quiere decir que las plantas no puedan autofecundarse. Muchas plantas SI permiten la autofecundación.

El grano de polen es haploide y lleva uno de esos alelos S. Solo fecundará en un pistilo que tenga una constitución genética diferente. Una flor S1S3 solo produce S1 y S3. No puede autofecundarse ya que todas sus células son S1S3. Cuando el S1 o el S3 toquen en el pistilo de la misma planta, no liberará su tubo polínico.

La región MHC (Major Histocompatibility Complex)

Es una región de genes que aparece en todos los mamíferos. En los humanos se llama HLA. Es una región amplia de unas 40 megabases. Ahí hay una serie de genes que controlan la compatibilidad de tejidos. Eso se vió por primera vez cuando se ensayaron los trasplantes animales. La sangre es un tejido!!! A veces se veía la compatibilidad pero la mayor parte de las veces había incompatibilidad. Esos marcadores celulares están codificados en el MHC. Son característicos de las células del cuerpo de un individuo.

El organismo responde en contra de los tejidos implantados.

¿Pero como puede haber “compatibilidad” si prácticamente es imposible que tenga los mismos marcadores? Digamos que unos emiten una señal menos fuerte y son menos detectables, el cuerpo tarda mucho más incluso a veces nunca se da cuenta de que no son suyos.

Un individuo realmente presenta para cada locus de la región una combinación alélica. Existen muchos alelos encima para cada gen. O sea que hay 40 genes multialélicos que se combinan. Esa combinación que se nos da a cada uno es prácticamente irrepetible. Encima se suelen transmitir en conjunto en lo que se denominan Haplotipos. O sea que le pasamos a nuestros descendientes la combinación de un cromosoma o del otro.

Alguien podría ser K11 K45, L23 L2, I3 I31, M5 M7, V19 V1,… (dos alelos para cada gen…recordar!)

La verdadera compatibilidad no existe.

Como se buscan donantes? Se busca la mayor compatibilidad posible. Obviamente tu padre y tu madre son los más adecuados. Seguramente con tus padres compartirás la mitad. Alguno de tus hermanos también podría tener una combinación muy adecuada. Además se te dan inmunodepresores durante toda la vida, para evitar el reconocimiento.

Hoy en día es una vía para atacar el problema del cáncer. Tres cuartas partes de las personas tienen un cáncer en la vida, pero muchos ni nos damos cuenta. Lo raro es NO tener un cáncer.

El cáncer se debe a células mutadas que comienzan a proliferar brutalmente. Uno de los cambios más importantes es la modificación de la región HLA. Entonces nuestro cuerpo al detectar células transformadas, se las carga (NK, Tc…etc.). Cuando el sistema inmune deja de atacarlas o no puede irremediablemente surgen los carcinomas.

Muchas de las enfermedades que padecemos tienen relacion con la presencia de ciertos alelos del MHC. Esas enfermedades suelen deberse a una hipersensibilidad o autoinmunidad del sistema inmune. Las enfermedades autoinmunes suelen ser complejas ya que no suelen depender a veces de un único alelo, sino combinación de ciertos alelos en ciertos loci.

Ojo, eso no es determinismo genético. No quiere decir que la presencia de un gen o de un alelo estemos condenados a tener un tipo de cáncer. Más del 50% de lo que pueda pasar depende del ambiente en que se desarrolle el gen. Sin embargo, no se puede hacer vista gorda frente a la estadística. No hay que ser catastrofista, no existen los genes de una enfermedad. Pero lo que sí: la sensibilidad puede aumentar….. (ejemplo - sensibilidad al Herpes tipo I es mayor si se tiene A1 en el MHC; pero si no entras en contacto con el virus, nunca podes tener la enfermedad)

Tipos de genes:

Monomorficos - A

Dimórficos - A, a

Polimórficos - A1, A2, A3, A4….

PRUEBAS DE ALELISMO!

Como se que tengo un gen monomorfico?

Fácil…todos los individuos de la población tienen el mismo gen.

Como se si es dimorfico?

Tengo que hacer un analisis genético como el mendeliano con los individuos de la población…

Además hay que hacer todo tipo de cruzamientos porque puedo tener cosas como codominancia, etc.

Como se si es polimorfico?

Hay tres tipos de plantas. Así que puede haber polimorfismo. Empezamos haciendo cruzamientos de las lineas puras y los recíprocos. Verificamos cuales son los rasgos de las F1. Un rasgo debería desaparecer y otro debería aparecer 2 veces de cada 3. El rasgo que aparece más es el dominante y un alelo dominante debería ser el correspondiente a ese rasgo. El que no aparece es el recesivo y el otro es el alelo intermedio. Hay tres alelos y un solo locus.

PERO si lo que sale en la F1 es todas con el rasgo dominante, aun cuando cruzamientos las lineas puras que no tienen el rasgo dominante… deberé pensar que existen varios loci para el mismo gen, esto quiere decir que realmente hay DOS GENES, y no se cuantos alelos puede haber...

Recordemos que locus es la posición concreta que tiene un gen en un cromosoma. Es mal comparado con una plaza de garaje. Realmente lo que es es la posición del gen. Si yo tengo en el locus A en un cromosoma el alelo A1 y en el locus A del homólogo el A3, yo soy un individuo A1 A3. Pero al dominante para un loci se lo suele llamar +. Por ello, si yo tengo en el locus A para cada cromosoma el alelo + +, yo tengo el carácter dominante, +.

VEAMOS UN EJEMPLO PARA ESTO

Hipótesis 1: El caso del pelaje de los ratones Amarillo domina sobre Gris que a su vez domina sobre Negro, el recesivo. Vemos que en F1 tenemos 2 Amarillos por cada 1 Gris. Evidentemente en el segundo locus se tiene unos genes que no se meten, no controlan el tema, es el rasgo típico y salvaje.

Hipótesis 2: Imaginemos que combinamos un individuo que es Gris y que tiene el GG en el locus primero y ++ en el locus segundo y lo cruzamos con un individuo que es Negro pero que tiene el NN en el locus segundo y ++ en el locus primero. Si combino ahora los dos individuos me sale un individuo que tenga +N en un locus y G+ en el otro. Entonces en cada locus el + dominará y el individuo tendrá pelaje amarillo. Evidentemente el segundo locus SI CONTROLABA ALGO EL COLOR DEL PELAJE. Lo que sucedió es que se generó un individuo que es DOBLE HETEROCIGOTO, o sea heterocigoto en cada locus.

OTRO EJEMPLO

Asumimos de entrada, imaginemos que ya hicimos el experimento, que un carácter está relacionado con dos loci. En el locus A tenemos alelos A (Verde) y a (alelo inactivo no produce pigmento); en el locus B tenemos alelos B (pigmento Amarillo) y b (no produce pigmento).

Los individuos que tienen dominancia A y B en ambos loci tienen color Azul.

Si cruzamos Azules (AABB) con Amarillos (BBaa) tendremos individuos Azules AaBB (salvajes). Si cruzamos Azul y Verde (bbAA) tenemos individuos Azules BbAA (salvajes). Pero si combinamos Amarillo (BBaa) y Verde (bbAA) tenemos nuevamente individuos Azules (BbAa).

INTERACCIONES GÉNICAS

Los genes suelen interactuar entre ellos y los caracteres raras veces están conectados con un fenotipo. Un ejemplo típico es el complejo caso del metabolismo y sus enzimas, que por supuesto están relacionadas con genes concretos.

Dos tipos:

• Las que no modifican las proporciones mendelianas en la F2

• Las que modifican las proporciones mendelianas en la F2 - “EPISTASIAS”

Un ejemplo de la INTERACCION GENICA SIN MODIFICACION DE LA PROPORCION 9:3:3:1

La cresta de las aves de corral es diversa. Hay individuos que tienen crestas en roseta, en guisante, en nuez o sencilla (la típica en piquitos). Primero se consiguieron líneas puras. Pero el problema es que había interacción génica entre dos loci, cada uno únicamente con dos alelos. El locus Rr y el locus Pp. De tal manera que los individuos R_P_ eran con cresta en Nuez; los individuos R_pp tenían cresta en roseta; los que eran rrP_ la tenían en guisante; los que eran homocigótico doble recesivos rrpp tenían cresta sencilla, la “normal”.

Se consiguieron lineas puras RRpp, rrpp, rrPP y RRPP. Se combinaron por cruzamientos todos con todos, pero por supuesto, la cresta sencilla se perdía y se podría haber considerado como un caso de dominancia intermedia. Pero se hizo la F2 y por supuesto que la sencilla aparecía.La proporción se cumplía: 9 individuos tenían nuez, 3 tenían roseta, 3 tenían guisante y 1 tenía cresta sencilla.

EPISTASIAS

Es un mundo inmenso, y es lo que sucede más frecuentemente. En la realidad muy pocas veces se puede asociar un alelo con un carácter o rasgo de una manera tan simple como la que vió Mendel. Cada vez se descubren más epistasias. Hay algunas muy sencillas, como las que involucran dos loci y dos alelos por cada locus, pero hay combinación e interacciones entre 3, 4, 5…n loci. Además cada locus suele tener más de 2 alelos. Como es de suponer, el caso de las epistasias puede ser muy difícil, y además es lo más común.

Un gen es epistático cuando otro es hipostático. El gen epistático es el que influye sobre el gen hipostático. O sea, uno “modifica” al otro. Las epistasias pueden ser simples o dobles (dominante, recesiva y dominante-recesiva).

Ejemplo de EPISTASIA SIMPLE DOMINANTE: El alelo dominante de una pareja alélica suprime o altera la acción de otra pareja alélica (gen hipostático). En Drosophila, el Gen A determina que se forme (recesivo) o no el ojo (dominante). El Gen B determina el color del ojo, pardo dominante o incoloro si es recesivo.

Se consiguen dos lineas puras: los que no tienen ojos (AAbb) y los que tienen ojos pardos (aaBB). La F1 salen todos sin ojos (A___). En la F2 aparecen 12 individuos sin ojos (9 A_B_ y 3 A_bb), 3 con ojos pardos pardos (aaB_) y 1 con ojos incoloros (doble recesivo, aabb).

Ejemplo de EPISTASIA SIMPLE RECESIVA: El alelo recesivo de una pareja alélica suprime o altera la acción de otra. Típico en mamíferos, hay un gen C que controla que seamos coloreados o seamos albinos (en recesión) y un gen B que controla que seamos de color negro (dominante) o marrones (recesivos).

Obtenemos dos líneas puras entre pelos negros CCBB y pelos albinos ccbb. En la F1 aparecen todos negros BbCc. En la F2 aparecen 9 de pelo negro (C_B_), 3 de pelo marrón (C_bb) y 4 albinos (cc__).

Ejemplo de EPISTASIA DOBLE DOMINANTE: Uno cualquiera de los productos (alelos) dominantes de dos parejas alélicas (dos loci) es suficiente para originar el fenotipo analizado.

Producción en plantas de clorofila: Hay dos loci. El loci A en dominancia produce clorofila, en recesión no produce. El loci B en dominancia produce clorofila, en recesión no la produce. O sea que hay como si fuera un gen duplicado. ¿Para qué sirve eso? Porque es una función muy necesaria y si tengo dos genes hay menos posibilidades de que me muera si se me jode un gen. O sea, si tengo un gen solo y se me jode, me muero. Las que tienen genes duplicados tienen una ventaja adaptativa.

Si tengo las lineas puras para los dos loci y las cruzo, tendré todas plantas con clorofila…A_B_, pero cuando hago la F2 me encuentro con 1 planta “albina” (aabb) por cada 15 verdes ().

Ejemplo de EPISTASIA DOBLE RECESIVA (genes complementarios): Para que se exprese un fenotipo es necesaria la presencia simultánea de los alelos dominantes de dos genes. El color de la flor del guisante es un ejemplo clásico. Un gen A dice si el pigmento es púrpura o blanco. El gen B dice si se produce pigmento o no.

Cruzamos las lineas puras y obtenemos todos individuos púrpuras AaBb. Hago la F2 y salen 9 de color purpura y 7 de color blanco, pero por distintos motivos (pueden no producir pigmento __bb o producir pigmento blanco aaB_).

Ejemplo de EPISTASIA DOBLE DOMINANTE Y RECESIVA: El alelo dominante de un gen suprime la acción del otro y el segundo en homozigosis recesiva suprime la acción del primero. O sea que los dos pueden ser epistático e hipostáticos, depende como se encuentren.

El color de las plumas de gallos y gallinas. El gen C en C da color y el c no da color. El gen I da en I inhibición del color y i permite la coloración

En la F2 tenemos 9 blancos (C_I_), 3 colorados (C_ii) y otros 4 blancos (cc__).

GENES MODIFICADORES

Es un gen que modifica la acción, el fenotipo de otro. Generalmente son modificaciones cuantitativas, es decir de gradación. Hay muchísimos genes modificadores. Hay algunos que controlan por ejemplo el número de las quetas de la mosca. Si la mosca tiene muchas o pocas no suele ser dos alelos que controlen la cantidad de quetas. Sino que hay una gradación.

Un ratón puede tener en un locus el control para el pelo marrón, pero en otro locus puede haber una pareja que modifique cuan marrón es el pelo marrón.

Hay modificadores llamados SUPRESORES. Un gen supresor es un modificador llevado al extremo. Estos inhiben la expresión de otro gen. En un caso de interacciones génicas, los genes modificadores son siempre genes que necesitan interactuar con otros.

GENES LETALES Y DELETEREOS

Un gen letal es un gen que conduce a la muerte prematura del individuo que lo porta. Es una combinación alélica que conduce a la muerte! Pero la combinación puede ser dominancia o recesión. Son muy interesantes ya que no debería poder haber muchos, pero si algunos son necesarios para mantener la salud genética de una población. Hay una definición más operativa: cualquier gen que impida la reproducción es un gen letal. Desde el punto de vista genético, un individuo que no puede reproducirse está muerto.

Realmente es una alteración de las proporciones mendelianas, ya que ciertos individuos podrían morir tempranamente, dando lugar a que ciertos fenotipos no se reprodujeran…

Los genes deletéreos son los que reducen la viabilidad o la fertilidad de un individuo. No te conduce a la muerte biológica o genética, pero rebaja tu valor adaptativo.

1) Letales dominantes: Es un alelo que produce los efectos letales con que solo haya una copia de él. Son los más raros, ya que podrían ser los salvajes y acabar con una población. Solo sobreviven los homocigóticos recesivos. Se cree que aparecen por mutación recurrente. Ojo: en todas las generaciones aparecen individuos que aparecen con el alelo A. Pero sus parentales no lo tenían, digamos que fue una mutación desafortunada que se dio en el momento de la fecundación.

El 30% de las fecundaciones son abortadas de manera my prematura. Eso sucede por diversas anomalías. Son embriones que llevan aberraciones muy importantes. El otro 70% no sobrevivió y ya es saludable, sino que pueden aun así aparecer cosas como anomalías y trastornos del desarrollo. O sea que la letalidad es algo relativamente NORMAL.

Los genes letales suelen estar relacionados con una Temperatura, con la cantidad de Luz, requerimientos nutricionales, etc. Es frecuente cuando un individuo tiene un problema para desarrollarse en una temperatura externa. Por ello el gen letal se estimula y produce la muerte prematura del individuo. Lo de la luz es muy típico en las plantas. Si un individuo va a salir con una clorofila pobre, en unas condiciones lumínicas pobres la planta se muere. Los mutantes auxótrofos son también supertípicos. Son organismos que no son capaces de sintetizar por ellos mismos algún metabolito esencial. Si no lo pillan del medio no sobreviven. Los mutantes cuando están en un medio rico funcan bien, pero si están en un medio pobre, la letalidad se manifiesta. El gen Epiloga no aparece en homocigosis ya que se abortan instantáneamente. Los pocos que sobreviven son heterocigóticos. Estos tienen problemas de crecimiento, tumores, retraso mental, etc., por lo que son personas que fallecen antes de los cuatro años. La corea de huntington, se manifiesta generalmente alrededor de los 40 años. Es un gen letal que te mata antes de lo que está establecido para la esperanza media de vida de tu población.

Dominantes letales en homocigosis: Agarraba ratas amarillas para conseguir una linea pura. Cruzaba las líneas pero siempre salía una aguti (pelo de tres colores) por cada 2 amarillas. El pibe no conseguía nunca la línea pura. Por qué no lo conseguía? Porque había un alelo que en homocigosis conducía a la muerte. Los amarillos eran los heterocigotos. Los homocigotos positivos eran grises. Los doble recesivos morían siempre.

El gen creeper en gallinas produce graves problemas de movilidad (patas cortas y vuelo dificultoso). Los normales eran los individuos que eran recesivos, y por lo tanto normales.

En humanos, casos extremos de anemia falciforme. En homocigosis del alelo de hemoglobina normal los humanos tenían eritrocitos normales. La forma de hoz se veía en heterocigosis, pero el efecto no se notaba excepto en condiciones pobres de O2. Los individuos que llevaban en homocigosis los dos alelos de anemia falciforme terminaban teniendo problemas para sobrevivir.

2) Letales Recesivos: La fenilcetonuria, la hemofilia, la enfermedad de TaySachs, el albinismo y muchos otros problemas típicos en humanos. Son los más frecuentes en la naturaleza. Son más frecuentes por motivos obvios. Los genes mortales o deletéreos tienden a desaparecer por mera selección natural.

3) Letales mutantes: Si una mutación hace que sobre un gen deletéreo se cree un alelo dominante no deletereo, lentamente el alelo mutante se impondrá sobre el gen original haciendo que este quede socialmente oculto.

La fenilalanina se transforma en tirosina por una transaminasa. Esa enzima esta regulada por el “gen de la fenilcetonuria”. Solo en el caso de doble recesivo el gen puede traer problemas a los individuos. Los fenilcetonuricos tienen mucha más fenilalanina en sangre en consecuencia. Presentan retrasos parciales o a veces microcefalia y otros retrasos graves. Se suele comprobar mediante la llamada “prueba del talón”, una prueba enzimática que se hace en el nacimiento. Cuanto antes se detecta, mejor se puede arreglar el tema. Generalmente se aplican dietas bajas en fenilalanina. Luego del desarrollo, la dieta puede cambiarse por una más alta en fenilcetonas.

La hemofilia es un gen normal ligado al cromosoma X. Suele haber mujeres homocigóticas para la hemofilia, heterocigóticas sin hemofilia y homocigóticas sin hemofilia. Los hombres solo tienen un X así que o lo tienen o no lo tienen.

La enfermedad de Tay Sachs es muy típica endogámica en la población judía. Ciertos esfingolípidos se acumulan por no poder ser transformados. Se acumulan en tejidos nerviosos y producen retrasos mentales. A los 3 o 4 años suele producir la muerte, casi con seguridad.

El albinismo es muy típico y afecta a muchas cosas, tiene muchas formas. Aparece en individuos de distintas maneras. La producción de melanina es una ruta compleja que se produce desde muchos puntos. Intervienen cosas tan locas como los genes de la testosterona. Puede ser desde poco deletéreo hasta letal…

Letales equilibrados (balanced lethal genes): Descubiertos por Muller (1913). Los generamos nosotros mismos para la experimentación. Seleccionamos individuos que llevan varios genes letales que nos permitan mantener a esas cepas en estricta heterocigosis. A veces podemos querer mantenerla por muchas razones. Entonces se promueve la heterocigosis mediante la introducción de estos genes. En una cepa de Drosophila, portadora de la mutación ReaOeD. Buscaba líneas puras. El gen R era recesivo y en homocigosis recesiva morían. Además, en heterocigosis, las alas estaban reducidas. El tipo esperaba que mezclando los heterocigóticos salieran 2 Rr (alas pequeñas) por cada 1 RR (alas normales). Pero no consiguió eso… Los RR de la F2 se le morían también!!!

Luego se dio cuenta de que había dos loci para el mismo gen. En el segundo locus había solo dos formas, una forma L que era letal y luego la forma R dominante normal. Entonces el L era letal cuando estaba homocigótico en el loci segundo, cosa que sucedía a veces cuando el loci primero tenía RR. Los individuos que sobrevivían tenían que ser los heterocigóticos para los dos loci. El tema es que el tipo descubrió eso sin nada de genética molecular.

A efectos prácticos, las líneas puras sirven solo en casos especiales. Los alelos deletéreos no suelen aparecer en heterocigosis, por lo tanto, el descubrimiento de Muller fue muy importante.

PLEIOTROPÍA: Un gen que tiene múltiples efectos fenotípicos. Generalmente los alelos que tienen multiples efectos se dice que tiene efectos pleiotrópicos. El alelo W, visto anteriormente, tenía que ver con la coloración del ojo. El White hacía que el ojo fuera blanco en homocigosis, pero no solo regulaba eso, sino muchas otras cosas que tenían que ver con la línea de producción de pigmentos, como por ejemplo, cosas relacionadas con el tamaño de la espermateca...

La fenilalanina también puede aumentar en sangre y en orina por culpa de la pleiotropía del gen.

La pigmentación de muchos animales está relacionada con la producción de testosterona de los machos.

VEREMOS OTRAS VARIACIONES DE LAS PROPORCIONES MENDELIANAS…

HERENCIA LIGADA AL SEXO

Bateson experimentaba con las aves de corral. Cuando cruzaba un gallo con las plumas en bandas, con una pigmentación característica, con una gallina de color uniforme. Le salía una F1 todos con bandas. Cuando hacía el cruzamiento recíproco, recibía algo diferente. La F1 tenía mezclas de individuos con bandas e individuos lisos.

Goldschmidt investigó con polillas y le salió un experimento muy similar. Cuando ponía polillas hembra claras y machos oscuros, obtenía todos individuos oscuros. Cuando ponía polillas hembra oscuras y machos claros, obtenía hembras claras y machos oscuros.

Esto generó un lío para muchos investigadores de la época. Alguien llamado Morgan, un tal Thomas Morgan que recibió el Nobel en 193_ investigó el tema. Es el tipo que metió a Drosophila en el medio genético-citológico para el estudio. Simplemente por practicidad…

Obtenía individuos mutantes con los ojos rojos. Cruzaba hembras de ojos rojos, normales, con machos de ojos blancos. Obtenía una F1 toda con ojos rojos. En la F2, por cada 3 individuos con ojos rojos, salía 1 con los ojos blancos. Los individuos de ojos rojos 2 eran hembras y 1 macho por cada macho con ojos blancos. O sea que las hembras siempre tenían ojos rojos, y los machos, la mitad tenían ojos blancos y la mitad de ojos rojos.

Cuando hacía el retrocruzamiento, obtenía la mitad de machos con ojos blancos y la mitad de machos con ojos rojos; y la mitad de hembras con ojos rojos y la mitad con ojos blancos.

Si hacía los recíprocos, obtenía todos los machos con ojos blancos y todas las hembras con ojos rojos.

Esto era un caos, pero él había leido muchas cosas sobre cromosomas, etc. Sabía que en Drosophila hay tres pares de autosomas en ambos sexos. Mientras que en el sexo femenino hay dos cromosomas iguales, en los machos hay una pareja de cromosomas pero que eran diferentes entre sí. Las hembras eran XX y los machos eran XY. Lo del ADN no se sabía. La teoría cromosómica de la herencia no existía ni siquiera. Él se tragó el sapo de que los principios mendelianos no funcionaban y se inventó que los caracteres hereditarios iban en los cromosomas. Sabía mucho de meiosis y de fisiología, así que con esos datos en la cabeza se imaginó que había genes ligados a un tipo concreto de cromosoma.

HIPOTESIS DE MORGAN:

Carácter color de ojos: alelo W+ rojos (salvaje) alelo W blanco (mutante). El rojo es dominnate

Su locus está en el cromosoma X. Por lo tanto, si yo soy hemicigótico para un gen (los machos para el gen W), significa que tengo solo un alelo de dicho gen y tendré el rasgo determinado por ese gen inequívocamente.

SISTEMA DE DETERMINACION DEL SEXO

Además de los sistemas cromosomicos hay sistemas no cromosomicos:

• nivel de ploidía (en los himenópteros y otros organismos, “los huevos no fertilizados dan lugar a individuos macho y que los huevos fertilizados dan lugar a hembras” - realmente es un sistema complejo formado por 9 alelos - entonces se supone que los organismos n son macho y los 2n son hembras)

• mecanismo alélico (hay alelos sexuales en vez de cromosomas sexuales - el sexo es determinado por 1 o varios loci - se cree que 9 alelos son los que realmente controlan el sexo en himenópteros)

• factores ambientales (hacer que sea más viable el organismo - nivel de feromonas, temperatura, humedad, luz, etc.)

Los sistemas cromosómicos son los más típicos:

• el sistema xx (hembras) /xy (machos) ves el clásico pero no es ni por cerca el más común

• el sistema zw (hembras) /zz (machos) está muy extendido

• el sistema xx/x0 (se tienen 2 juegos de autosomas y 2 copias del cromosoma x ó 1 copia en el otro sexo - los gametos serán AX o A - las hembras producirán solo AX y los machos AX o A - al final la mitad de los individuos son de cada tipo… asi que las proporciones son las mismas)

• además hay situaciones muy diversas

Diferencias entre animales y plantas: A las plantas les gustan los sistemas cromosómicos múltiples: es difícil detectar el sexo en una planta, además de que hay plantas con todos los cromosomas y que los activan en partes específicas dando lugar a bisexualidad, monoicas - además hay plantas con un solo organo reproductor, etc. O sea que el tema es muy difícil en plantas. Es raro saber como las plantas hacen para comportarse como hembras o machos.

La hemicigosis es la característica que afecta a los genes que están en el cromosoma X de los varones o en el cromosoma Y. Esos genes en el hombre no tendrán un alelo pareja. Todo lo de uno u otro cromosoma se expresará.

La pseudodominancia es similar a la hemicigosis, pero que dice que hay homología en algunos segmentos de dos cromosomas. Es el caso de los cromosomas X e Y en hombres. Esto explica que un cromosoma realmente evolucionó a partir de otro. Además explica el tema de la apareación meiótica. Ese reconocimiento es necesario para que la meiosis sea exitosa. Cada uno debe ir a un polo, por lo que es normal que tengan un segmento de homología.

Los genes que están homólogos en las zonas especiales sí pueden tener condiciones de homocigosis y heterocigosis normal. Los genes fuera de las zonas homólogas serán hemicigóticos.

Los individuos homogaméticos son los que tienen todos gametos iguales, es el caso de las hembras humanas. Los individuos heterogaméticos son los que tienen gametos diferentes unos de otros, es el caso de los varones que tienen gametos que llevan los autosomas + el cromosoma X y los que llevan autosomas + el cromosoma Y.

Los autosomas son todos los cromosomas que en principio no están involucrados en el sexo. Los cromosomas sexuales son los que determinan el sexo cuando hay individuos con sistemas cromosómicos del determinismo del sexo. En los organismos que no tienen cromosomas sexuales no se puede hablar de autosomas ya que no existen.

OJO!!! Realmente el sexo está determinado por genes. Algunos genes clave están en los cromosomas sexuales. Otros están distribuidos por los autosomas. Hace 20 años se creía que el determinismo del sexo era solo por los cromosomas. Ahora se sabe que realmente depende de donde y como tengas los genes. No es imposible tener hombres XX y mujeres YX.

En drosophila, se ve que la mayoría de moscas tienen 2 juegos de autosomas con XX si son hembras y XY si son machos. Realmente el Y no pinta nada, lo que importa es la falta de dos copias del X. Si se tiene dos copias del cromosoma X entonces casi seguro sos hembra. Además Drosophila tiene mucha plasticidad en el numero de cromosomas sexuales y autosomas.

Lo que se hizo en los experimentos es buscar la relación entre la cantidad de cromosomas autonómicos y la cantidad de cromosomas X. Si la relación X/A era superior a 1 se obtenían casi siempre hembras. Si la relación era inferior a 0,5 se conseguían hombres. Si tenían entre 1 y 0,5 salían intermedios.

Entonces se ve claramente que no hay cromosomas que regulen el sexo, sino que son la dosis de copias del gen y el producto del gen las que hacen que seas macho o hembra.

Los humanos estamos hechos para ser hembras. No somos hembras porque tenemos genes claves en el Y. El tema es que por el camino algo cambia para que seamos varones. El comienzo del desarrollo de hecho es común entre los dos géneros. Una señal hace que la hembra deje de ser hembra y termine siendo varón.

No es de extrañar que el determinismo del sexo esté relacionado con pocas cosas. No habría reproducción si hubiera muchos genes específicos de un género: ¡NO SERIAMOS COMPATIBLES! Es interesante que seamos lo justito diferentes como para que haya meiosis y fecundación, para que haya variabilidad…

Los humanos varones que son X0 son no fértiles (además de ser feminoides - síndrome de Turner). El Y0 no es viable y se aborta.

CROMOSOMAS X eY

El cromosoma X es metacéntrico con dos brazos, el p y el q. El Y es acrocéntrico con un segmento apareante en la brazo corto. El segmento diferente está en el brazo largo.

En los cromsomas X hay 1000 genes aproximadamente. En el Y hay 250 genes. Eso no es por el tamaño. No sería sostenible que tuvieramos tantos genes exclusivos de varones, sino no seríamos compatibles con las hembras. La mayor parte del cromosoma Y está heterocromizado y tiene poca función génica.

En el segmento apareante hay 21 genes “autosómicos”.

Herencia ligada a los cromosomas sexuales.

Los caracteres recesivos saltan de una generación a la siguiente. El patrón es diverso, no es la proporción mendeliana. Los machos son hemicigóticos y expresan todo lo que esté, sea recesivo o dominante. Las hembras son las únicas que funcionan mendelianamente. Las mujeres pueden ser “portadoras” y llevan por fuerza el X del padre y por lo tanto siempre tendrán latente el gen de lo que sea que tuviera el padre en su X. Si tengo un padre hemofílico, sus hijas serán todas portadoras por ejemplo. Si una hembra con XAXa se empareja con un macho normal tendrá la mitad de los hijos varones con hemofilia y la mitad de las hijas hembras portadoras. Los caracteres recesivos ligados a cromosomas sexuales se manifiestan mucho más, en consecuencia, en los machos.

Ejemplos: La hemofilia tiene una frecuencia de 1 entre 50000. Cursa en homocigosis con letalidad. En las mujeres por razones fisiológicas ya que la hemorragia menstrual no se detendrá. Son raros los casos y además hay tipos varios de hemofilia. Hay hemofilia leve, grave, etc.

El daltonismo está ligado y 1 de cada 12 varones lo tiene. Aunque también hay más o menor grado.

El albinismo ocular. La distrofia de Ducheme, la feminización testicular…

Los caracteres dominantes son también comunes. La hipofosfatemia hace que haya deformidades oseas por malformación y mala incorporación de fosfato. En la Dentinogénesis imperfecta también pasa algo similar.

Éstos genes dominantes. (dirección del OMIM - www3.mcbi.mlm.mih.gov/omim)

HERENCIA LIGADA AL CROMOSOMA Y

• Herencia holándrica: características ligadas al cromosoma Y. Ninguna es importante ya que sino las mujeres no serían viables. El gen TDF (SRY) es un gen determinante del sexo y los testículos. Si hay un individuo XY pero al que no le funcione el TDF sale como hembra.

• Hipertricosis en la oreja - plumeros en las orejas

• Ictiosis - piel escamosa (se pierde la piel y salen unas escamas feas oscuras rugosas costrosas como piel de elefante)

HERENCIA LIGADA A AMBOS CROMOSOMAS (pseudoautosómica)

• El gen MIC-2 en el grupo sanguíneo X-G en humanos

• El locus Bobbed en Drosophila - es una mutación recesiva que va en el X, pero que si el Y tiene el dominante entonces no pasa nada en los varones - si mezclamos las lineas puras, la linea F1 es la salvaje (tienen el alelo dominante en uno de sus cromosomas, el X las hembras, el Y los machos) - si hacemos la F2, se obtiene que el macho tiene todos salvajes (todos comparten el “mismo” Y) mientras que las hembras serán mitad bobbed y mitad salvajes (porque comparten la mitad de ellas el XbXb y la otra mitad X+Xb)

COMPENSACION DE LA DOSIS GÉNICA

En cuanto al número de cromosomas, el hecho de que exista un Y hace que la cantidad de cromosomas esté más o menos compensada. Pero en cuanto a la cantidad de copias de un mismo gen que se podrá tener, los machos tienen un solo X, mientras que las hembras tienen el X verdadermente duplicado. En resultado, las hembras tendrían mayor cantidad de producto génico que los hombres. Pero eso lo resuelven los hombres:

• En Drossphila, el cromosoma X de machos se hiperactiva, trabajando casi al doble. Así se compensa la cantidad final de producto génico entre machos y hembras.

• En Nematodos, que tienen un sistema XX X0, el X de machos es el único que funciona al 100%, mientras que la presencia de dos X hace que cada uno funcione al 50%. Enconclusión, por regulación génica, cada sexo tiene el mismo producto.

• La inactivación en Humanos (Barr - corpúsculos de barr en el núcleo de las células femeninas) se da mediante un centro de inactividad que serviría para “sexar” el individuo. Las aplicaciones derivadas fueron sobre todo de divertimento científico y en clínica forense. Sin embargo, esto falla muchísimo por lo que no es completamente determinante. Que sucede realmente? En las hembras, el corpúsculo inactiva uno de los dos X. La inactivación se da por heterocromatinización del cromosoma X. Ese proceso hace que el cromosoma se haga heteropignótico (oscuro) - se hace casi casi inerte. El proceso de inactivación es complejo, pero se sabe mucho.

• En el 16º día de la gestación (gastrulación), cada una de las células, supuestamente al azar, de los dos X, inactiva uno.

• Entonces los descendientes de esas células llevarán inactivado el mismo cromosoma (casi con seguridad).

• Pero se pueden establecer linajes celulares diferentes a partir de cual de los dos X. Por ello las mujeres son “mosaicos” genéticos. En algunas células expresan un X y en otras el otro. Si una mujer es heterocigótica, en algunas células tendrá el fenotipo A y en otras células tendrá el fenotipo a. O sea que la expresión en hembras es super rara.

• Ellas están preparadas para eso.

El centro de inactivación X (XIC) es un punto del cromosoma que cuando es activado, la inactivación va “pasándose” expandiéndose al resto del cromosoma. Eso lo regula el XIST-X que a su vez está regulado por el TSIX que es quien decide qué cromosoma será el que se inactivará.

Están involucrados procesos epigenéticos. Está involucrada la metilación y demetilación del ADN. Un fragmento de ADN con metilguanosina, y metilcitidina suele inactivarse y no se expresa. También hay unas secuencias llamadas L-1 que son elementos transponibles. Además también están involucrados los iRNA (RNA interferentes que impiden la transcripción).

No se inactiva TODO el cromosoma X. Hay casos de pseudodominancia para algunos genes. Verdaderamente, el otro cromosoma tampoco está completamente activo. O sea que hay microactivaciones en el cromosoma inactivo y microdesactivaciones en el cromosoma activo.

La inactivación no es realmente al azar, aunque en humanos es relativamente azarosa. Sin embargo, la experiencia demuestra que si un gen importante está raro en uno de los cromosomas, será ese el que se inactive. Hay evidencia empírica de resultados claros, pero no se sabe mucho de mecanismos de control para ello.

Otros organismos inactivan siempre el mismo cromosoma, sin importar que eso pueda llevar a deleción o letalidad.

Y PARA QUÉ EL SEXO?!

(ver temas próximos)

TEMA 3 - RECOMBINACIÓN Y LIGAMIENTO

TEORIA CROMOSOMICA DE LA HERENCIA

Inmediatamente después de los redescubrimientos de los principios mendelianos de la herencia, dos personas por separado enunciaron lo mismo: Sutton (recién licenciado de EEUU) y Boveri (un profesor alemán consagrado). Cada uno por separado enunció la teoría cromosómica de la herencia.

Los caracteres hereditarios están en los cromosomas, los vehículos portadores de la herencia. El como y el porqué tardó muchos años, pero ambos propusieron esto.

Integraron conocimientos de genética mendeliana, y otros conocimientos varios. Eran tipos supercapaces. Desde 1970 hacia delante había microscopios capaces y poderosos. La tecnología es fundamental para el avance de la ciencia. Ambas van de la mano. Vieron que había CROMOSOMAS, unas cositas negritas dentro de los núcleos. A la vez descubrían el Golgi, los plastos, las mitocondrias. Pero el tema es que se dieron cuente de que los cromosomas tenían un número constante. Los organismos que eran todo iguales entre sí tenían el mismo, los organismos diferentes tenían un número diferente. Ejemplos: Cromosomas B. Excepciones: Aneuploidías.

También ven que hay mitosis y meiosis y que eran procesos en que los cromosomas se dividían. Además, la mitosis ocurría en la línea somática y la germinal. La meiosis ocurría solo en la línea germinal y se reducía el número de cromosomas a la mitad. A la vez, seguían pasando cosas rarísimas. Henking, McClung, Wilson eran citólogos que veían que el número cromosómico en ciertas especies de hemípteros era diferente entre hembras y machos. Los machos tenían 17, y las hembras tenían 18 cromosomas. Se llamó X el último cromosoma de las hembras, porque era misterioso su aparecer. Tiempo después se vio que eso estaba relacionado con el sexo. Además se vió que las hembras tenían DOS X mientras que los hombres solo tenían UNO. Al final se descubrió que el sexo se heredaba por la presencia o ausencia de esos cromosomas. Entonces EL SEXO SE HEREDABA!!! Esa fue la primera evidencia de que una característica se heredaba a través de los cromosomas.

Además de los experimentos de Henking, MacClung y Wilson en hemípteros, hubo otros experimentos. Estos experimentos sirvieron para respaldar los primeros.

Los de Carothens y Blakeslee vinieron primero. Tiempo después, los de Morgan de herencia ligada al sexo fueron definitivos.

Experimentos de Carothens (citóloga):

Comprobó la segregación independiente del cromosoma sexual (el X) y un marcador cromosómico. El cromosoma 2' y el 2 eran diferentes. El 2' tenía heterocromatina distal marcada con un marcador heterocromático citológico que se podía seguir. O sea que analizando un número suficiente de meiosis, se veía que la segregación de ese cromosoma era al azar. Se podía distribuir azarosamente con respecto a X. Se producían gametos que llevaban o no 2' y llevaban o no X. Los cromosomas se comportaban IGUAL QUE LOS GENES DE MENDEL, o sea que tenía sentido.

Había un orgánulo citológico que estaba relacionado con la herencia mendeliana - el cromosoma.

Experimentos de Blakeslee con Datura (Estramonio):

Principios activos - utilidad farmacéutica. Su cápsula donde está el fruto y las semillas presenta una variabilidad muy grande. El tipo buscó analizar genéticamente el carácter, pero se le armó un lío enorme. Entonces analizó el número cromosómico de cada una de las especies. Las más abundantes tenían 24 cromosomas (cápsula salvaje), y todas las demás (mutantes) tenían 25 cromosomas. Eso quería decir que normalmente n = 12. Pero para cada uno de estos grupos de plantas mutantes, la diferencia estaba en que teniendo todos un número cromosómico 2n = 24, tenían un cromosoma adicional de alguno de los 12 y que además eran diferentes entre sí. Por ejemplo: la cápsula pinchuda tenía un cromosoma extra del número 1. La cápsula lisa tenía una copia extra del 3, etc.

O sea que la presencia de un cromosoma adicional podía modificar un carácter tan importante y visible! Además importaba cuál cromosoma era el que sobraba. Como los cromosomas se transmitían, era obvia la conclusión.

Experimentos de Morgan con Drosophila melanogaster:

Experimentos con el carácter ojos rojos - ojos blancos. Correlacionó las características en una serie de cruzamientos que daban resultados difíciles con la posibilidad de que esas características estuvieran ligadas a genes que estaban en los cromosomas sexuales. Se planteó su hipótesis de que el gen “color de ojos” estaba en el cromosoma X de Drosophila, basándose en la teoría cromosómica de la herencia. Sin quererlo tal vez, logró darle el apoyo más fuerte que la teoría había tenido hasta entonces.

Experimentos de Calvin Bridges (experimentos definitivos en los años 30):

Hizo que todas las ciencias naturales cambiaran su orientación. Todo se recondujo a estudiar el cromosoma, el núcleo, etc. 10 o 15 años adelantes se vió que el ADN era el material hereditario, etc. Pero los experimentos de Calvin Bridges, muy cercanos realmente, fueron el desencadenante.

Trabajaba con Morgan, que se había convertido en el gran converso a los principios mendelianos. Estaba reproduciendo los experimentos de Morgan y se puso a hacer numeritos como Mendel había hecho 50 años antes.

Cuando cruzaba hembras de ojos blancos que tenían la constitución cromosómica XwXw y machos de ojos rojos Xw+ Y, aparecía una F1 casi completamente normal, a excepción de algunos individuos extraños. Aparecían muy pocos individuos machos con ojos rojos (algo teóricamente imposible) y hembras de ojos blancos (algo también teóricamente imposible). Eso sucedía con una posibilidad de 1 de cada 2000 de los normales. Lo lógico era pensar que era un error, pero Bridges se puso a pensar y experimentó muchísimo para delucidar un experimento que tenía una baja frecuencia.

Cogió los individuos mutantes de la F1 y los intentó cruzar, pero vió que los machos eran esteriles. Además cruzando machos normales con ojos rojos con hembras mutantes de la F1 obtenía cosas muy interesantes. En un 96% de los casos obtenía hembras de ojos rojos y machos de ojos blancos tal como era predecible por la teoría cromosómica de la herencia. Pero en un 4% de los casos obtenía excepciones raras: machos de ojos rojos pero esta vez fértiles y hembras de ojos blancos nuevamente. QUE ESTABA PASANDO!?!?!

Bridges decía que había una NO-DISYUNCIÓN de los cromosomas X en las hembras de ojos blancos. O sea que entre las hembras de ojos blancos P, había un fenómeno raro. Según Bridges el tema consistiría en que la hembra con ojos blancos, en la meiosis genera gametos femeninos SIN EL CROMOSOMA Xw y gametos femeninos CON DOS CROMOSOMAS Xw. O sea que estos gametos anómalos eran los que eran fecundados. Cuando se cruzaban con machos Xw+Y, que generaban gametos Xw+ y gametos Y. Haciendo las fecundaciones posibles teníamos individuos machos estériles Xw+ O, hembras con ojos rojos XwXwXw+ y hembras con ojos blancos XwXwY; además de machos Y O que morían por no tener el X.

En la segunda parte del experimento, cuando se hacía el retrocruzamiento, se cruzaban las hembras con ojos blancos XwXwY con machos de ojos rojos Xw+Y. Por el problema de la no disyunción, se generaban gametos de seis tipos: Xw O, XwXw, XwXwY, XwY, O Y, O Xw. Combinandolos con los gametos de los machos con ojos rojos normales, se generaban 12 genotipos resultantes: estos resultados generaban algunos fenotipos solapantes y se obtenían un 4% de los individuos resultantes con genotipos que eran impredecibles por la teoría mendeliana clásica. Estos eran los machos con ojos rojos Xw+Y y las hembras con ojos blancos XwXwY.

Esto llevó a concluir que si hay un cambio en los cromosomas, una anomalía en la meiosis y una alteración en el equilibrio cromosómico, hay una alteración consecuente en los caracteres ligados a ellos. O sea que esto fue absolutamente definitivo e inició la carrera de la citogenética y la citología como ciencias. Estamos en el año 30.

La NO DISYUNCION es una anomalía, una mutación. Dos cromosomas que debían segregarse se van juntos a un polo. Eso trae como consecuencia las cascadas de anomalías que Bridges descifró. Si los mutantes existen en el análisis genético, ¿cuán complejo se puede poner todo esto?

Hasta la fecha, en genética, el uso de mutantes es insustituible. Inevitablemente el análisis en genética está basado en lo raro y lo mutante. Y si no se tiene se induce y se provoca. Porque estudiando la generalidad no se obtiene información. Lo raro nos sirve para estudiar lo normal. Si algo es raro y sabemos que es raro por algo, podemos inducir que los demás son normales por tener lo opuesto. En ningún ejemplo podemos estudiar lo normal dejando de estudiar lo raro.

La no disyunción puede ser de dos tipos depende de si sucede durante la primera fase de la meiosis o durante la segunda fase.

La no disyunción no es una rareza. Como se vió, se produce en Datura con una frecuencia relativa bastante alta. En Drosophila pasaba otro tanto, según vió Bridges. El síndrome de Down es una trisomía del par 21. Ese tercer cromosoma es porque el gameto venía con 2 en vez de con uno solo de los cromosomas para un par, o sea una no disyunción.

Mosaicos o Quimeras genéticos: Organismos con distinta constitución genética en distintas partes de su cuerpo. Las mujeres y los individuos del otro sexo son mosaicos, según vimos el otro día. Los estudios de Morgan y Bridges estudiaron también este tema.

En una mosca se producía en la primera división una no disyunción. La mitad del organismo tendrá solo un X, mientras que el resto del organismo tendrá XX. Se generan células derivadas de las primordiales. Habrá dos poblaciones celulares, las XX y las XO. Pero entonces las moscas serán ginandromorfos: mitad macho y mitad hembras. Las características secundarias serán en la mitad del cuerpo como hembras y en la mitad del cuerpo como machos. Vieron que eso ocurría en Drosophila con cierta frecuencia: no siempre había no-disyunción mitótica en la primer división. Por supuesto que la línea germinal podía ser de tipos diferentes también.

LIGAMIENTO, RECOMBINACION y ENTRECRUZAMIENTO

1906 - Experimentos de Bateson y Punnet sobre el Guisante de Mendel

Estudiaban el color de la semilla y el tamaño del polen. Hicieron los cruzamientos entre las líneas puras Purpura y Largo con Rojo y Corto

Se obtenía un análisis similar al que había conseguido Mendel. Sobre 381 casos, se esperaban 215 P_L_, 71 P_ll, 71 ppL_ y 24 ppll. Pero se obtenían unos valores que según el análisis de Chi cuadrado era significativamente diferente. Había muchos más individuos que tenían características similares a las parentales. O sea que había más de los P_L_ y más de los ppll de los que cabía esperar y había menos cantidad de las otras dos categorías.

Aparecía lo que Bateson y Punnet llamaron LIGAMIENTO entre las dos características. El rasgo rojo y polen corto estaban ligados. El rasgo Purpura y polen Largo estaban ligados también. Por eso se obtenían más ejemplares que correspondían a los rasgos parentales.

Las características dominantes estaban ACOPLADAS y las características recesivas estaban ACOPLADAS también.

La explicación que le dieron, teniendo en cuenta que estaban trabajando del lado Mendeliano, fue que era una desviación del análisis Mendeliano.

Lo que ocurría según ellos es que después de la meiosis (Strasburger ya la había descubierto algunos años antes), los gametos que llevaban P_L_ o ppll sufrían mitosis adicionales que hacía que aumentara su proporción. La explicación dada era mala ya que esto no sucedía!

Las categorías genéticas que corresponden a las características parentales se llamaron PARENTALES. Las categorías que corresponden a las características nuevas generadas se llamaron RECOMBINANTES.

EXPERIMENTOS DE MORGAN

Años después en los 30, Morgan hace cruzamientos entre parentales de dos tipos. Los de ojos púrpura y alas vestigiales y los de ojos rojos y alas normales. Se obtenían todos individuos con ojos rojos y alas normales (características dominantes).

Cuando se hacían los cruzamientos prueba, se esperaba lo clásico: uno de cada tipo: el número de individuos con la combinación de rasgos parentales debía ser igual al número de nuevas combinaciones.

Pero en el experimento se vió algo similar a lo que habían visto Bateson y Punnet. Había muchos más parentales que nuevas combinaciones.

Morgan siguió experimentando. Combinó parentales que eran homocigótico dominante para un gen y homocigótico recesivo para el otro y viceversa. Se obtuvo la F1 típica.

Pero cuando se volvía a esperar que apareciera en el cruzamiento prueba el 1:1:1:1…..

Se obtenía otra vez una mayor cantidad de individuos con la combinación de rasgos que tenían los parentales.

Morgan hizo una hipótesis: Las combinaciones parentales se deben al ligamiento. Los genes van en los cromosomas y cuando genes para distintas características van en el mismo cromosoma, van físicamente ligados y se transmiten juntos.

Como cada parental le pasa a la descendencia uno de los dos cromosomas, el F1 le pasará a la F2 uno de los dos cromosomas, seguramente uno de los dos parentales. En conclusión, habrá muchos individuos que se parezcan a los parentales.

Esto estaba muy bien….pero entonces como se generaban las nuevas combinaciones de rasgos?

Había mucha gente que ya se había ocupado de estudiar, desde los años 1900 la meiosis. Se había descubierto el tema de los quiasmas y ya se sabía que los cromosomas se duplicaban y apareaban antes de la primera división. Había un sobrecruzamiento entre las hebras.

Morgan reinterpretó todo eso en su cabeza y se le ocurrió que tal vez, en ese apareamiento, podía haber una recombinación de los genes de los dos cromosomas. Además, el había visto que tenía la misma proporción de recombinantes de un gen que del otro. Así que tenía sentido que se generaran cromosomas recombinantes de esa forma, aunque en una proporción lo suficientemente pequeña como para que aún así siempre predominaran los fenotipos parentales.

Morgan relacionó el proceso genético observado de la recombinación con el entrecruzamiento, sobrecruzamiento o crossing-over que se observaba a través de los quiasmas. Supuso que las cromátidas no hermanas se ligaban y se recombinaban los genes generandose hebras nuevas a partir de la meiosis.

Grupo de ligamiento: Todos los genes que van en un cromosomas. Todos lo que van en el cromosoma 1 se llaman grupo de ligamiento 1…. Nosotros tenemos 23 grupos de ligamiento en 46 cromosomas ya que nuestra dotación genética es 2n.

CORRELACION ENTRE ENTRECRUZAMIENTO Y RECOMBINACION - experimentos de McClintock

Estaban estudiando el cromosoma 9 del maíz. Estudiaban el locus C (color o no de la semilla) y W (textura). Hizo un cruzamiento entre un híbrido con el cromosoma dominante marcado con heterocromatina y un doblehomocigótico recesivo.

Comprobó que los individuos con fenotipos parentales tenían los cromosomas idénticos a los de los parentales. Y que los recombinantes tenían cromosomas que eran mitad el de uno de los parentales y mitad la heterocromatina del padre de un lado o del otro. Esto quería decir que molecularmente, los cromosomas físicamente se recombinaban. Fue la comprobación final para una hipótesis que ya iba siendo teoría…

TIPOS DE RECOMBINACION

RECOMBINACION INTERCROMOSOMICA y SEGREGACION - caso mendeliano típico

Los cromosomas se separan al azar y se originan las cuatro combinaciones posibles entre los dos loci estudiados en una proporcion 1:1:1:1

RECOMBINACION INTERCROMOSOMICA y ENTRECRUZAMIENTO - crossing-over

Los loci están en el mismo cromosoma

Cuando se da la recombinación se generan unos pocos individuos que tienen fenotipos resultantes de la recombinación de genes de los cromosomas parentales

El resto de individuos tiene siempre las características producto de la herencia de los cromosomas parentales intactos

El locus A y B son loci dependientes. Están ligados en el mismo cromosoma. Lo que le pase a uno le vincula al otro. Generalmente hay más parentales que recombinantes (datos experimentales). No salen más recombinantes porque solo saldrán cuando haya entrecruzamiento.

DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO: Es simplemente que cuando estamos analizando dos características independientes (2 loci) esperamos 1:1:1:1 (50% parental, 50% recombinantes) y en una F2 esperamos 9:3:3:1. Si los dos loci están ligados se producen desequilibrios en las proporciones ya que hay modificaciones producto del entrecruzamiento posible.

Ligamiento absoluto: Los alelos van juntos siempre y nunca pueden recombinar.

Desequilibrio de ligamiento: Los alelos pueden recombinarse y generar desequilibrio en las proporciones fenotípicas mendelianas que esperaríamos en un cruzamiento prueba o en una F2.

FACTORES QUE AFECTAN A LA FRECUENCIA DE ENTRECRUZAMIENTO

En situaciones de Entrecruzamiento aparecen fenotipos recombinantes solo si se produce entrecruzamiento. ¿Qué es lo que hace que se produzca?

Asumimos que en todos los bivalentes ocurre por lo menos un entrecruzamiento o quiasma. Eso deriva empíricamente de todas las situaciones analizadas hasta la fecha. No hay ninguna localización estable para el sitio de entrecruzamiento. ¿Qué hace que haya más o menos quiasmas?

Si hay pocos entrecruzamientos, habrá más fenotipos parentales que recombinantes y viceversa.

Ejemplos:

SEXO

En el sexo heterogamético se asume que hay menos entrecruzamientos (en nuestro caso en los hombres)

En el sexo homogamético hay más entrecruzamientos (en nuestro caso en las mujeres)

Esto es un caso general y tiene casos extremos. Por ejemplo, en Drosophila, los machos son aquiasmáticos (no entrecruzan para nada).

OJO! Que no haya entrecruzamiento no implica que no haya recombinación. La segregación alélica clásica mendeliana es el método más común para generar recombinantes. Miremos el cuadro debajo:

• Cuantos gametos diferentes se pueden producir por segregación? 2 a la n (numero de cromosomas - 23 en el hombre: 2 a la 23 da 8,4 E06 o sea que nosotros podemos producir 8 millones de gametos diferentes simplemente por segregación)

• Cuantos gametos se pueden producir por entrecruzamientos? Desde ninguno (en el caso de los machos de Drosophila) hasta muchísimos (en el caso del hombre por ejemplo)

Los machos de Drosophila entonces, no tienen recombinación en sus gametos? NO. Tienen variabilidad, la generada por segregación (2 a la n donde n es 4: 16 gametos diferentes)

• Siempre que haya entrecruzamiento habrá recombinación? NO. Si hay entrecruzamiento en un individuo que es doble homocigoto, todos los gametos serán iguales.

• Siempre que haya segregación habrá recombinación?

EDAD

Los estudios realizados en moscas, ratones, etc. indican que según aumenta la edad disminuye la frecuencia de entrecruzamiento.

FACTORES MATERNOS

El gameto pequeño aporta solamente el núcleo. El citoplasma lo aporta prácticamente entero la madre. En Drosophila, conejos, plantas, etc. se vió que cuando la madre pertenece a una línea pura donde la frecuencia de entrecruzamiento es alta, sus descendientes lo heredan. O sea que la frecuencia de entrecruzamiento se hereda. Hay algo en el citoplasma que tiene que hace que la descendencia tenga una frecuencia de entrecruzamiento determinada.

FACTORES NUTRICIONALES

Hay muchas maneras de incrementar o reducir en modelos experimentales. Muchos antibióticos, o aumentando los niveles de Calcio y Magnesio pueden incrementar o disminuir la frecuencia de entrecruzamiento.

FACTORES RADIACTIVOS

Niveles ligeros de radiación incrementan la frecuencia de entrecruzamiento y pueden incrementar la frecuencia de recombinación. Niveles muy suaves de radiación ligera pueden incrementar la recombinación. Aún cosas como la radiación UV puede causar un aumento en la frecuencia

GENOTIPICOS

Muchos genes están involucrados en la recombinación. Cambios en esos genes pueden hacer que la frecuencia cambie.

PUNTOS CALIENTES de ENTRECRUZAMIENTO

No se producen los entrecruzamientos COMPLETAMENTE al azar. Ciertas regiones son más propensas al entrecruzamiento. Los puntos fríos son precisamente lo contrario.

CARTOGRAFIADO GÉNICO Y CROMOSÓMICO (Gene Mapping)

Es un mapeo de los cromosomas. Las características están dispuestas en los cromosomas de una manera concreta. No están simplemente dispersos. Sabemos que los cromosomas son realmente dos moléculas lineales de DNA, por lo que los genes deben estar dispuestos también en línea, más o menos uno al lado de otro.

Los mapas de ligamiento fueron los primeros que comenzaron a construirse. Son los más utilizados, en humanos y en otras especies también. Son mapas genéticos, o sea que lo que se identifica son genes.

También se pueden hacer mapas físicos, en los que, por hibridación in situ, RCLPs y gene sequencing se crean replicas reales físicas de moléculas de DNA.

MORGAN Y ALFRED STURTEVANT (un estudiante en el laboratorio de Morgan)

Fue la hipótesis de Sturtevant que los genes iban en línea uno detrás de otro (en esa época no se sabía nada sobre moléculas de DNA). La probabilidad de que haya un entrecruzamiento entre dos genes dependerá de las distancias entre esos dos. Puedo hacer un experimento y medir cuantas veces ocurre un entrecruzamiento entre dos genes, así que se puede medir fácilmente. La frecuencia de entrecruzamiento entre dos genes cercanos será muy baja. La frecuencia de entrecruzamiento entre dos genes alejados será más alta. Además si los genes están en loci más o menos constantes, las frecuencias deben ser más o menos constantes.

Se eligieron dos rasgos que estaban ligados (eso se había visto por experimentos previos): alas normales/ alas vestigiales y color rojo/ color púrpura. Se obtuvo las líneas puras y se consiguió la F1.

En un cruzamiento prueba, se cruzaban hembras hibridas que tenían alas normales y de color rojo con machos doble recesivos que tenían las alas vestigiales y de color púrpura. Se obtenían los fenotipos parentales (los que tenían cromosomas paternales sin entrecruzamiento) y en menor cantidad los fenotipos recombinantes (los que tenían cromosomas que habían sufrido entrecruzamiento).

Sturtevant decía que la probabilidad de que el entrecruzamiento ocurriera era un valor constante, ya que los loci debían ser constantes. Eso lo comprobó para Drosophila y el porcentaje de recombinantes para esos dos genes era más o menos constante.

El porcentaje que obtenía en concreto de recombinantes (ojos purpuras y alas normales, ojos rojos y alas vestigiales) en éste caso era 11%. Eso significaba 11 unidades de mapa genético entre los dos loci.

Si dividimos un mapa genético en 100 genes equidistantes entre sí, es obvio que la posibilidad de que haya un entrecruzamiento entre los genes N1 y N100 es del 100%. Eso significa 100 unidades de mapa genético y una frecuencia de recombinación de 1. Entre el N1 y el N70 habrá 70%, etc.

¿Cómo distribuyo yo TODOS los genes?

Se amplia el analisis. En vez de hacerlo con dos genes se hará con 3 loci. Eso generará los llamados mapas de tres puntos (tres loci). Tiene una mecánica muy sencilla, tipo crucigrama. ESTO CAE FIJO EN EL EXAMEN.

LOS MAPAS DE TRES PUNTOS NOS DICEN SI LOS GENES ESTAN LIGADOS, EN QUE ORDEN ESTAN LOS GENES y A QUE DISTANCIA RELATIVA ESTAN UNOS DE OTROS.

ejercicio de Drosophila:

3 mutaciones recesivas en Drosophila: sc - scute (ausencia de quetas), ec - echinus (ojos raros), vg - vestigial (alas reducidas)

Se deben medir en hembras que son las únicas quiasmáticas en Drosophila. Se hace el cruzamiento prueba entre una hembra F1 y un macho triple recesivo. Obviamente si la recombinación no dependiera del entrecruzamiento, sino solo de la segregación, deberíamos obtener unas proporciones equivalentes de 1:1:1:1:1:1:1:1 sin embargo esto no se obtiene.

Los fenotipos observados se ponen en una tabla. Obviamente hay 4 fenotipos que son más frecuentes y 4 que son mucho menos frecuentes. Se van mirando las características de dos en dos.

Para nuestro experimento: los individuos ScEc son 478 y los Sc+Ec+ son 474; los individuos recombinantes ScEc+ son 26 y los Sc+Ec son 30. Obviamente los genes van ligados.

Ahora debemos fijarnos en otra pareja de loci. Para el experimento: los individuos EcVg son 251 y los individuos Ec+Vg+ son 255; los individuos recombinantes EcVg+ son 257, y los Ec+Vg son 247. En éste caso se ve que los genes Ec y Vg están equilibrados en proporcion 1:1:1:1 por lo que seguramente segregarán independientemente ya que no están ligados.

Finalmente sabemos que Sc y Ec están ligados, mientras que Ec y Vg no lo están. En conclusión Sc y Vg no estarán ligados. Entonces nos resta únicamente medir la distancia entre Sc y Ec midiendo la frecuencia de recombinación.

( 26 + 30 / 1008 ) . 100 = 5,5 centimorgans

Esos 5,5 será la distancia a la que estarán

ESO ES IMPORTANTE… NOSOTROS MEDIMOS FRECUENCIAS DE RECOMBINACION, NO FRECUENCIAS DE ENTRECRUZAMIENTO….SI SE PRODUCEN DOS ENTRECRUZAMIENTOS ENTRE DOS GENES….NO SALDRA RECOMBINACION….PERO SI HUBO ENTRECRUZAMIENTO!!!!

Los loci “sinténicos” quiere decir que van en el mismo cromosoma (es sinonimo de “ligados”)

MAPAS DE TRES PUNTOS - parte II

Volvemos con un experimento de Drosophila y eta vez usamos las características Sc, Ec y Cv - crossveinless

Se hace el cruzamiento prueba típico y tenemos 6 fenotipos. Las dos clases parentales las conocemos y salen que tienen más proporción que las clases recombinantes. Así que todo parece ir bien. Como sabemos que Sc y Ec van ligados queda comprobar si Cv también está ligado.

Tomamos Sc y Ec y le hacemos el análisis. Salen 928 parentales y 59 recombinantes. Obviamente salen ligados. Haciendo el calculo de la frecuencia sale nuevamente 5,5 como se esperaba.

Ahora tomamos Ec y Cv. Salen 901 parentales y 81 recombinantes. O sea que efectivamente están ligados. Buscamos la frecuencia de recombinación y salen 8,2 centimorgans.

Entonces tendremos 3 loci en un gen, pero solo tenemos las distancias, no sabemos hacia que lado están dispuestos!!! Como hacemos!!!! Inevitablemente habrá que hacer el análisis para Sc y Cv. Finalmente obtenemos que están ligados a una distancia de 13,7 centimorgans.

Ahora sí podemos terminar de construir el mapa. Además podemos agregarle el gen Vg que sabemos que está en otro cromosoma.

Así y de a poco se van construyendo mapas genéticos a partir de ligamientos.

PARA DOS GENES…..LA MAXIMA FRECUENCIA DE RECOMBINACION SERA SIEMPRE 50 centimorgans. Eso es porque para dos genes que estén alejados como para que siempre haya recombinación, la mitad de los gametos serán recombinantes. EL PROBLEMA ES QUE ENTRE DOS GENES QUE ESTAN EN CROMOSOMAS SEPARADOS TAMBIEN LA FRECUENCIA SERA 50 POR LO QUE CUANDO LA FRECUENCIA DE RECOMBINACION NOS DA CERCANA A 50 NO PODEMOS ASEGURAR NADA….

Para hacer verdaderos mapas se analizan miles de experimentos hasta conseguir aclarar el mapa.

MAPEAR (mapping) = CARTOGRAFIAR

Los individuos F1 heterocigóticos de Drosophila son mujeres (obviamente mujer ya que son las únicas quiasmáticas que pueden tener fenotipos recombinantes).

EFECTOS DE LOS DOBLES ENTRECRUZAMIENTOS

Primero se debería ver que hay entrecruzamiento a partir de un cruzamiento prueba (hembra triple heterocigoto x macho recesivo)

En frecuencia alta tenemos a los parentales. En bajas frecuencias tenemos las clases recombinantes. Siempre podemos saber cuales son los parentales, aunque sea simplemente porque son las clases con mayor frecuencia.

Hay muchas clases recombinantes en los casos de doble entrecruzamientos.

Buscamos las frecuencias de entrecruzamiento para los loci. En nuestro ejemplo, estudiando drosophila, para el gen CV, C y V nos dan los siguientes resultados. Entre CV y C hay 6,4 cm. Entre C y V hay 13,2 cm. Entre CV y V hay 18,5 cm.

Encontramos los puntos y hacemos el mapa de 3 puntos. Pero aparece un problema. Entre CV y C hay 6,4. Entre C y V hay 13,2. A partir de esto, la distancia entre CV y V debería ser 19,6 cm en vez de los 18,5 que salen experimentalmente. Eso es evidencia de que el doble entrecruzamiento sea posible entre los genes.

Entonces volvemos a ver nuestra tabla inicial donde teníamos las clases recombinantes. Ahí se ve que dos clases son especiales. Tienen muy baja frecuencia, aun menor que la de las otras clases recombinantes. Cuando vemos más claramente, se evidencia que sus fenotipos son resultado de dobles entrecruzamientos, uno entre el gen CV y C y otro entre C y V. Entonces sumamos el número de individuos de las dos clases y lo multiplicamos por dos. Ese valor deberá ser añadido al número de recombinantes para el cálculo de la frecuencia de recombinantes entre CV y V. Además debe ser multiplicado por dos porque hubo dos entrecruzamientos.

Finalmente debemos poner los valores correctos en el mapa. Corregimos el mapa y ya está listo.

INTERFERENCIA Y COINCIDENCIA

Asumido que pueden haber dobles recombinantes… ¿hasta que punto el hecho de que haya un quiasma en una región influye sobre la generación de quiasmas cercanos? Puede interferir negativamente si lo que hace es generar que haya más dobles entrecruzamientos de lo esperado. Puede interferir positivamente si lo que hace es impedir la formación de dobles entrecruzamientos cercanos.

El coeficiente de coincidencia se calcula entre el número de dobles entrecruzamientos observados y esperados. Si observamos más de los esperados, el número estará por encima de uno. Por lo tanto la interferencia se calcula haciendo la resta entre 1 y el coeficiente de coincidencia. Si hay más observados de los esperados, la resta nos dará un número negativo. Eso quiere decir que hubo interferencia negativa, se generaron más quiasmas de los esperados. Si hay menos observados que esperados, la resta dará un número positivo y la interferencia será positiva.

Ejemplo: La probabilidad de que haya doble entrecruzamiento entre 3 genes que están separados por 20 cm unos de otros será la siguiente.

Si A - B = 20cm y B - C = 20cm

La probabilidad de que existan los dos entrecruzamientos será 0,2 x 0,2 = 0,04

La Interferencia será I = 1 - obs / 0,04

Si el número de observados es 0,04, la interferencia será 0 y los genes serán independientes. Si la interferencia es 1 no hubo quiasmas dobles: se dice que la interferencia es completa. Si I es positiva, hubo interferencia positiva y se generaron menos quiasmas de lo esperado. Si la I es negativa se generaron más quiasmas que 0,04.

INTERPRETACION MOLECULAR

Interferencia negativa: Es normal pensar que si las enzimas para la generación de un entrecruzamiento (Rec…etc.) están en un punto generando un entrecruzamiento, en los puntos cercanos se generan entrecruzamientos con más frecuencia. Eso es obvio: las enzimas están cercanas y pueden actuar ahí con mayor facilidad.

Interferencia positiva: La generación de un quiasma implica que estéricamente en las zonas cercanas no quepan las enzimas que deben generarlo en esas inmediaciones. Eso es obvio, las enzimas que se implican en la generación del quiasma son muchas y molestan espacialmente el acceso de otras enzimas en puntos cercanos.

CASOS POCO COMUNES

Si tenemos valores próximos a la distribución?

Ejemplo de 500 casos. Tenemos 140, 135, 110 y 115.

Hacemos el test de Chi cuadrado. Para cada caso el número de observados menos esperados lo hacemos al cuadrado y dividimos por los esperados. Entonces obtenemos que mi resultado es 5,2. Lo analizamos para el número de grados de libertad (número de clases fenotípicas menos 1). Nos sale una probabilidad de entre 0,2 y 0,1. Eso quiere decir que entre el 10 y 20 porciento de las veces, saldrán desviaciones como las observadas. Obviamente no podemos decir nada así que debremos suponer que no tenemos ligamiento.

Si el número de entrecruzamientos es mayor que 2?

Los número impares de quiasmas entre dos genes son los únicos que conducen a gametos recombinantes. Los números pares dan gametos parentales.

Entonces lo que se calcula con los mapas son las posbilidades de que haya gametos recombinantes. Puede darse que haya entrecruzamiento y se generen gametos parentales como se vió antes. Pero eso no me interesa. Solo me interesa la recombinación.

Si el número de entrecruzamientos es 2 y obtenemos recombinantes?

Eso quiere decir que los entrecruzamientos no se producieron entre las mismas dos hebras. Puede que se generen dobles entrecruzamientos en diagonales o en hebras complementarias. En éste último caso, todos los gametos generados sserían de clase recombinante. En el caso de las diagonales, se obtendría la mitad de recombinantes y la mitad no recombinantes.

Si la distancia entre dos genes es de 50 cm?

Eso quiere decir que puede ser que los genes estén en cromosomas diferentes!!!

Entonces lo correcto es tomar genes que estén “entre medias” de esos dos genes. Hay que distinguir entonces entre la longitud genética de un cromosoma y la distancia de recombinación entre dos loci. Entre dos loci nunca puede superar 50 cm. En un cromosoma, la longitud genética casi siempre suparará más de 50 cm. Eso no quiere decir que dos genes no puedan estar a una longitud genética de más de 50… sino todo lo contrario. Si tomo dos genes que estén a una longitud de más de 50, lo más seguro es que entre ellos haya siempre recombinación. Siempre que se pueda dar.

PROBLEMAS PARA HACER HASTA EL MIERCOLES QUE VIENE

En el maiz hay tres loci A, B, C

Para cada uno hay 2 alelos, uno dominante y uno recesivo.

El A en homocigosis hace que aparezcan anteras en flores femeninas

El B en homocigosis recesiva produce el acortamiento de los internados

El C en homocigosis recesiva produce bandas blancas en el borde de las hojas

Tenemos una planta heterocigótica para esos tres loci. Le hacemos un cruzamiento prueba.

Los fenotipos de la descendencia son los siguientes:

Determinar las relaciones de ligamiento y la distancia entre ellos y la interferencia en el supuesto de que exista.

PROBLEMA EJEMPLO 2

En el maíz están los loci V, F y b

El dominante de V da hoja verde, el recesivo palida

El F da en dominancia fetilidad, en recesión infertilidad

El b da color brillante o mate (en recesivo)

Nos dan el mapa de 3 puntos

Nos piden que determinemos la segregación en el cruzamiento prueba si la interferencia de V+/V y F+/F es del 40%

¿HASTA QUE PUNTO LOS SUJETOS HAPLOIDES ESTAN SUJETOS A LOS PRINCIPIOS MENDELIANOS DE LA HERENCIA?

Los hongos eucariotas haploides son un ejemplo típico.

Que ventaja aportan al estudio genético?

En un diploide hay dos copias de cada cromosoma con lo cual se establecen relaciones de dominancia potencialmente entre los distintos alelos de un mismo gen. Porque? Porque hay dos copias.

En un haploide, hay solo una copia de cada cromosoma con lo cual toda la información en ese cromosoma se expresará, sea la que sea. Hay un solo alelo de cada cosa, por lo que sea lo que sea se ve. El análisis es por tanto más sencillo.

Sí puede haber interacciones génicas… pero no de la misma manera que se ve en los diploides.

Además hay organismos haploides y diploides sin reproducción sexual. En esos casos no hay gametos ni fecundación, con lo cual la cosa es aún más simple.

En los sexuales haploides, en algun punto habrá un zigoto diploide. Esa célula entrará en meiosis para devolver el número cromosómico a n. La única parte de su ciclo que son diploides es en la fecundación y formación del cigoto. Entones si hay meiosis habrá segregación independiente…etc como los principios mendelianos se aprecian siempre que haya meiosis, si en los haploides hay meiosis entonces la segregación será fundamentable mediante Mendel.

En Clamidomonas solamente se pueden fecundar individuos que tengan el gen “apareamiento tipo +” con los que tengan el “apareamiento tipo -”. Si analizamos la reproducción de individuos que tengan los fenotipos opuestos para un gen dado (ejemplo: color amarillo o verde)…

El cigoto tendrá tanto los genes Y+ como los Y- y tanto los mt+ como los mt-

Finalmente después de la meiosis podremos obtener todo tipo de individuos adultos haploides. Depende de cómo sea la meiosis, obtendremos todos individuos parentales o todos individuos recombinantes. En un caso, al final, la mitad de los individuos será Y-mt-, mientras que la otra será Y+mt+ (ditipos paternos). En el otro caso obtendré ditipos no paternos, mitad Y-mt+ y mitad Y+mt-.

También puede haber entrecruzamiento. Los haploides por supuesto que entrecruzan. En el cigoto habrá meiosis a partir de un individuo diploide, por lo que obviamente habrá entrecruzamiento. Si hay entrecruzamiento en una meiosis podemos obtener tetratipos a partir de un solo cigoto. Entonces a la vez se producen individuos parentales y recombinantes todo ello producto de la misma meiosis.

SEGREGACION Y TRANSMISION EN HAPLOIDES: EL EJEMPLO DE LOS ASCOMICOTAS

En los ascomicetos, el cigoto se llama ASCA. Sufre meiosis dando lugar a 4 ascosporas haploides. Esas esporas cursan mitosis y el ASCA liberará 8 ascósporas. Si se sigue un cierto gen concreto, veríamos que la mitad de las ascósporas, 4, contendrían dicho gen. Las otras 4 tendrían el alelo opuesto. Finalmente las esporas regeneran individuos haploides pluricelulares nuevamente.

Pero no solo eso, las 4 ascósporas que tengan el alelo marcado estarán una al lado de la otra en el asca. Las otras cuatro estarán también dispuestas a continuación. Por eso se habla de productos meióticos ordenados.

Este tipo de ordenación se llama SPD, segregación en la primera división. Es obvio pensar que meióticamente, el dichoso cromosoma que lleva el gen se separe en la primera división, separando los dos fenotipos. También se llama segregación ordenada 4:4. Pero si hay entrecruzamiento, la evidencia no es la misma. En los casos de entrecruzamiento, las ascósporas estarán en disposición alternada. Eso quiere decir que hubo entrecruzamiento y los alelos no se separaron hasta la segunda división de la meiosis (SSD, segregación en la segunda división). En estos casos la segregación ordenada será 2:2:2:2, o 2:4:2.

Pero en cuantos casos suele haber SPD y en cuantos SSD?

En la experiencia, para dos genes dados se sacaron los siguientes resultados:

Se obtuvieron 162 y 132 SPDs. Se obtuvieron 9, 11, 19 y 12 SSDs. Eso en un total de 300 ascas analizadas.

Como calculo entonces la distancia de mapa para ese gen?

Con respecto a qué la calculo?

Se calcula con respecto al centrómero (son realmente genes!!!). Se mira el número de recombinantes (los SSDs), se los divide por la mitad y se los divide por el total de casos analizados y se multiplica por 100. Finalmente me da en este caso una distancia de 7.

Por qué se divide por dos la frecuencia de recombinación?

Porque del total de las ascósporas, solo hubo recombinación en la mitad de las cromátidas que finalmente se dividirán entre las ascósporas. Entonces el número de individuos recombinantes es la mitad de los SSDs.

Se puede hacer mapas de tres puntos de la misma manera. Uno de ellos seguirá siendo el centrómero. El hecho de que los descendientes aparezcan organizados en las ascas nos hace posible que utilicemos el centrómero para eso.

Si cogemos dos genes: A y B (tamaño y color respectivamente) tendremos lo siguiente:

Se generan 7 patrones diferentes que son los reales, a partir de los 36 ascas posibles. Esas 7 ascas posibles reales no aparecen todas en el mismo número. Aparecerán las proporciones --,--,--,--:++,++,++,++ con mucha mayor frecuencia. Las otras ascas posibles, 6, serán todas recombinantes. Las posibilidades recombinantes serán:

-+,-+,-+,-+:+-,+-,+-,+- (ditipo recombinante repulsor)

--,--:-+,-+:++,++,+-,+- (tetratipo)

--,--,+-,+-,++,++,-+,-+ (tetratipo)

--,--,++,++,++,++,--,-- (ditipo recombinante acoplador)

-+,-+,+-,+-,+-,+-,-+,-+ (ditipo recombinante repulsor)

--,--,++,++,+-,+-,-+,-+ (tetratipo)

Pero si observamos para un solo locus, como el a, nos salen 3 de los 4:4, 3 de los 2:4:2, y 1 de los 2:2:2:2.

De estos tipos entonces cuales son recombinantes y cuales parentales. Hay que mirar un loci por un lado y un loci por otro. Hay que considerar además el centrómero para realizar el mapa de 3 puntos, obviamente. Además hay que ver bien si los dos loci están, antes que nada, ligados en un mismo cromosoma. Luego hay que ver el orden y finalmente las distancias.

EN UN EJEMPLO TIPICO:

Cuando podemos decir que las ascas son recombinantes?

Cuando analizando un loci se ve que aparecen en alguna asca, desordenadas por SSD. Hay que recordar que puede ser que para un gen haya SPD mientras que para otro sea SSD.

Distancia del locus a al centrómero (en el ejemplo)

Cuento las ascas recombinantes para a. Las sumo y las divido por la mitad como quedé. Eso lo divido por el total y lo multiplico por cien. Me da el resultado de la frecuencia de recombinación entre a y el centrómero.

Distancia del locus b al centrómero (en el ejemplo)

Cuento las recombinantes para b y hago lo mismo. Saco luego la frecuencia de recombinación entre b y el centrómero.

Recordar que saco todo para la distancia al centrómero dado que estoy utilizando la organización de las esporas en el asca para determinar cuales son los recombinantes.

En el ejemplo la distancia de a es 8,4. La distancia de b es 13. Como se puede saber entonces como están dispuestos linealmente A, B y el centrómero?

Para a, de 168 casos recombinantes, en 159 hay también recombinación con b. Eso quiere decir que si hay solo un entrecruzamiento en a, por ejemplo, el loci b también se recombina!! Si la hipótesis fuera que el centrómero está entre a y b, los entrecruzamientos entre a y el centrómero no afectarían a los entrecruzamientos entre b y su centrómero. Pero si cuando hay entrecruzamiento en uno le afecta al otro, es completamente necesario pensar que los genes están del mismo lado del centrómero.

Pero porqué se me producen casos en que a recombina y b no? Porque son los casos de doble entrecruzamiento. B se recombina pero el segundo entrecruzamiento, que ocurre entre a y b, devuelve el loci b a la disposición inicial. En el ejemplo nuestro, para el loci a había 168 recombinantes, de los cuales 159 eran dobles recombinantes pero que se producían por un único entrecruzamiento. Los restantes 9 son casos de doble entrecruzamiento.

PRODUCTOS GENÉTICOS DESORDENADOS

En Saccharomyces cerevisiae (Levadura) se generan ascas desordenadas. Si tenemos una espora ab y otra ++ tendremos un zigoto diploide dihíbrido +a+b. Los productos de una meiosis salen desordenados pero juntitos en el asca. Se generan 3 tipos de ascas ya que los productos están desordenados.

Se generan ditipos parentales (2ab, 2++) , ditipos no parentales (2a+, 2b+) y los tetratipos (ab, ++, +b, a+)

Analizando dos características, las posibilidades son:

Que estén ligadas

Que no estén ligadas

Si están ligadas queremos cartografiarlas!

Cuando dos características están ligadas, los ditipos parentales se originan simplemente cuando no hay recombinación. Las cromátidas se separan en la segunda división y salen los ditipos parentales.

Los ditipos no parentales salen unicamente cuando hay un doble entrecruzamiento entre los loci de las características, en diagonal. Los tetratipos salen cuando hay un entrecruzamiento sencillo.

Cuando no están ligadas, los ditipos salen por segregación independiente. Los ditipos no parentales salen por segregación independiente. Los tetratipos salen por entrecruzamiento entre los centrómeros y los loci de las características en los cromosomas que correspondan. Puede haber recombinación en uno solo, en los dos o en ninguno. Así se generan los 4 tipos posibles.

Si los genes están ligados, lo normal es que que salgan DP, algunos TT y muy pocos DNP. Si fueran no ligados, deben salir DP y DNP más o menos en la misma proporción; mientras tanto, el número de TT debería ser bajo.

Así entonces analizando el número de DP, DNP y TT puedo saber si están ligados o no.

COMO CALCULO LA DISTANCIA SI ESTAN LIGADOS?

(½ TT + DNP) / total de Ascas .100 = frecuencia de recombinación

Porque no dividi el DNP por dos? Porque hubo doble entrecruzamiento y debería considerar todos los DNPs como si fueran ascosporas recombinantes. Solo divido los TT que son donde hubo solo un entrecruzamiento.

LO QUE NO SE PUEDE SACAR ES LA DISTANCIA AL CENTROMERO!!!

ESO PORQUE NO SALEN ORDENADOS!!!!!

SEGREGACION SOMATICA Y RECOMBINACION MITOTICA

Hasta ahora vimos la segregación cromosómica y la recombinación genética. Hablabamos de lo que sucedía en la meiosis.

Pero esto no solo ocurre en la línea germinal, sino también en la somática. En la línea somática solo hay mitosis. ¿Puede haber entonces segregación y recombinación?

Desde hace bastante tiempo que se sabe que sí hay recombinación en la mitosis y segregación somática.

Como todo se estudió en Drosophila melanogaster (1930). Bridges vió que había una mutación M dominante que hacía que las quetas fueran más delgadas.

En una mitosis típica, el individuo heterocigótico separaba las cromátidas, se duplicaban y se separaban las células que llevaban cada una la misma información genética que la célula original. Las células hijas entonces eran también heterocigóticas y por lo tanto poseían la característica de las quetas delgadas.

Pero en algunos casos se podía producir la no disyunción de cromosomas. De forma que cuando teníamos individuos heterocigóticos, en algunas zonas del cuerpo aparecían quetas normales. Empezó a hacer análisis genético y citológico y vió que esas zonas donde había quetas normales había habido una no disyunción en la mitosis.

Los cromosomas homólogos se replicaban y cuando migraban las cromátidas a los polos, las cromátidas de un cromosoma no hacían disyunción y por lo tanto viajaban juntas a un polo. En conclusión se creaban células hijas diferentes entre sí, una con 3 cromosomas homólogos y 1 con 1 solo cromosoma. La célula que era trisómica seguía siendo fenotípicamente M. Pero la célula que se había quedado con un cromosoma, si se quedaba con el alelo normal, esa célula generaba quetas largas. Pero eso solo no. Porque todas las hijas de esa célula iban a ser igual que ella y por lo tanto todas iban a ser de quetas largas. Entonces Bridges vió que alrededor de las células que eran monosómicas, había células trisómicas para ese cromosoma. Evidentemente, lo que se había visto en el laboratorio de Bridges años antes y que había servido para confirmar la teoría cromosómica de la herencia, todavía tenía jugo.

También había otro proceso llamado pérdida cromosómica. El cromosoma no se enganchaba al huso y por lo tanto luego de la citocinesis se perdía. De forma que una de las hijas sería normal, pero la otra hija sería monosómica para ese cromosoma, produciéndose un fenómeno con resultados similares al de la no disyunción.

CONCEPTO DE VARIEGACIÓN

El variegado es un tipo de fenotipo. El fenotipo es variegado si distintas partes de un organismo tienen un fenotipo diferente. Una planta con hojas verdes en una zona y hojas blancas en otra son de fenotipo variegado. Una mosca con quetas largas y cortas, un individuo que tiene en una mano 5 dedos y en otra seis, o que tiene el pelo de dos colores en los dos hemisferios de la cabeza…son todos fenotipos variegados.

El mosaico se refiere al genotipo. Cuando diferentes células del cuerpo tienen genotipos diferentes se llaman mosaicos genéticos. El concepto es similar al variegado, solo que aunque haya mosaicos no siempre habrá variegados. Además no siempre tendremos mosaicos en los casos que veamos variegados (ejemplo: influencia del ambiente en zonas concretas de un individuo)

RECOMBINACION SOMATICA

C. Stern en el laboratorio de Morgan, seis años más tarde, está trabajando con dos mutaciones: una que produce las quetas cortas y curvadas y otra que produce color amarillo en Drosophila. Esas mutaciones recesivas tenían sus loci localizados en el X, detrás del centrómero. Ya habían hecho mapas y todo.

Hicieron cruzamientos entre hembas heterocigóticas con machos que eran homocigóticos para uno u otro loci. Aparecían hembras heterocigóticas y machos con la mutación de las quetas.

Cada tanto encontraba hembras que tenían manchitas amarillas o pequeños parches de quetas curvadas. Pero en una muy baja proporción de casos encontraba moscas hembra que tenían ambas características recesivas en parches, pero que siempre iban juntitos. Entonces tenía moscas hembras con parches de un tipo, parches de otro tipo y finalmente hembras con parches dobles de los dos tipos.

Si la segregación mitótica era normal, las células hijas eran heterocigóticas normales, con el fenotipo salvaje. Pero si hubiera un entrecruzamiento entre los cromosomas homólogos, se generan cromosomas recombinantes que podían dar células amarillas como hijas.

Pero además Stern debía explicar como aparecían parches de células con quetas curvadas y los dobles parches.

Para lo último, propuso que el entrecruzamiento no se daba entre los dos loci, sino entre el centrómero y el primero de los dos loci. Entonces se generaban 2 líneas: células amarillas y células con quetas curvadas. Además se habían originado juntas, de manera que los dobles parches estaban explicados.

Para lo de los parches con quetas curvadas debía haber entonces un doble entrecruzamiento similar a como ocurrían en meiosis. Los cruzamientos se daban entre los dos loci y entre un loci y el centrómero. Finalmente cuando los cromosomas se separaban quedaban hijas que eran una de ellas salvaje y la otra una mutante con quetas curvadas. Los parches de células con quetas curvadas quedaban también explicados…. Pero lo único que no se veía es el momento donde se producían los quiasmas, una cosa que tenía evidencia citológica a través de la microscopia.

ESTO TAMBIEN EXISTE Y ES MUY FRECUENTE E IMPORTANTE EN HUMANOS
Las recombinaciones en las inmunoglobulinas y todas las proteínas que tienen grupos globulínicos y que están en el sistema inmune son esenciales. Los fragmentos V, J y D se recombinan en la línea somática para dar lugar a células linfocíticas que reconozcan una gran variedad de moléculas.

Las recombinaciones también son importantes cuando lo que se tiene controlado en heterocigosis es un gen deletéreo. Si ese gen deletéreo se queda en doble recesión por culpa de entrecruzamientos somáticos o por culpa de no disyunción, el resultado puede ser muy jodido porque estamos dando lugar a líneas germinales potencialmente peligrosas. Es algo así lo que sucede con el gen de la p53 y otras proteínas guardianas que velan por el correcto cumplimiento del ciclo celular.

CICLO PARASEXUAL EN HONGOS (Pontecorvo 1940)

Existen hongos haploides que de vez en cuando se fusionan y organizan un cigoto que pasa una meiosis. Su fase 4n da lugar a individuos haploides nuevamente regenerando los adultos.

Pero también hay un ciclo parasexual. En vez de fusionarse organizando un cigoto puede fusionarse creando un heterocarionte, una célula en la que conviven dos núcleos que no llegan a fusionarse siempre. Algunas sí se fusionan y crean un sincarionte. La diferencia es que la célula transitoriamente diploide se mete en una mitosis en vez de una meiosis. Finalmente se generan dos células 2n nuevamente y que antes o después, por procesos que todavía ahora, casi 60 años después de descubierto el ciclo, no conocemos, se separa en dos células haploides. Este mecanismo no es más que un medio de generar variabilidad mediante recombinación y segregación. A éste ciclo se le llama PARASEXUAL dado que finalmente se consigue lo mismo que mediante el ciclo sexual solo que a través de fusión y mitosis. Habíamos quedado que el ciclo sexual involucra necesariamente meiosis, con lo cual no se le puede poner un nombre de sexual sino de parasexual.

La importancia en estos hongos de este ciclo es fundamental. Es parte esencial de su naturaleza, tanto que la utilizan para sobrevivir.

COMO LOCALIZAMOS GENES EN LOS CROMOSOMAS HUMANOS?

COMO SE PUEDE HACER??????

SE HACE IGUAL SOLO QUE NOSOTROS SOMOS DIPLOIDES POR LO CUAL DEBERIAMOS HACER CRUZAMIENTOS PRUEBAS PARA CADA PAR DE GENES…..

PRIMER PROBLEMA….. ESTA FEO…….NO SOLO ESTA FEO OBLIGAR A QUE DOS PERSONAS TENGAN HIJOS….ADEMAS EL TIEMPO DE DESARROLLO ES LARGO…… CON LO CUAL NO PODEMOS HACER CRUZAMIENTOS EN HUMANOS…….

SOLUCION?

CARTOGRAFIADO GENETICO DE NEWTON-MORTON

Se analizan pedigríes, arboles genealógicos y familias que tengan número de descendientes amplios que permita estudiar las características.

PUNTUACIONES LOD (Logarithm of the Odds)

Plantea unos números. Las puntuaciones Z o LOD se analizan para una familia en concreta. Implican ligamientos de genes. Realmente son el logaritmo de la probabilidad de un cociente (la probabilidad de recombinación entre dos loci estudiados). Se ensayan hipótesis y se comparan con las evidencias de los pedigríes.

Z = número de individuos que me tocan de recombinantes / número esperado por segreg. independiente

Ese valor Z da un valor numérico. Si Z es mayor o igual a 3, implica que la proporción es mayor a 1 por cada 1000. Eso quiere decir que el proceso es 1000 veces más probable que ocurra por recombinación que por segregación independiente. A partir de ahí se acepta. Pero como se consiguen 1000 individuos para llegar al valor 3????? Se mezclan fusionando genealogías similares como si solo una pareja hubiera tenido todos los hijos de todas las genealogías.

Esto se hace solo en humanos.

CARTOGRAFIADO POR HIBRIDACION DE CELULAS SOMATICAS

Es otro sistema habitual en humanos. Es algo razonablemente antiguo. La tecnología tiene entre 20 y 30 años. En unas condiciones determinadas se fusionan células de distintos organismos como el humano y el ratón. Aparte de humano y ratón, de manera habitual se trabaja con humano y hamster, ratón y pollo, hamster y toro, ratón y hamster, etc.

El caso típico es juntar una línea timoral de raton con un fibroblasto humano. Se las considera inmortales ya que tienen una capacidad indefinida de división, a diferencia de lo habitual en las células cancerosas, que se programan para morir en unas condiciones. Esto se hace en presencia de un virus llamado Sendai, o en presencia de Polietilenglicol. Se puede conseguir también por choques eléctricos para fusionar membranas. Una vez fusionadas las células, se originan heterocariontes híbridos de células somáticas. Algunos heterocariontes darán lugar a sincariontes. Se da un proceso de reducción cromosómica. Se pierden en cada división algunos cromosomas, preferentemente de humanos. Finalmente se consigue una línea estable. A partir de ese momento quedan todos los cromosomas de ratón y algunos de humanos. Generalmente quedan de 1 a 20 cromosomas humanos. No necesariamente quedan por parejas. Pueden quedar un 1, dos 2, dos 3, un 4….etc. Lo más habitual es que queden 7 humanos, relativamente bajo. El proceso es fundamentalmente al azar y no se conoce bien el proceso de reducción, aunque se intuye que o no se replican o no migran adecuadamente en las divisiones.

Los cromosomas 7 y 11 tienden a quedarse. El 9 tiende a desaparecer rápido. Cómo cartografiamos entonces?

Para el proceso se obtienen varias lineas celulares. Se comprueba la producción del gen rastreado en las líneas celulares. A partir de los resultados, sabiendo que lineas tienen cuales cromosomas, se puede saber en que cromosoma está el gen.

Las líneas además pueden irradiarse para conseguir mutaciones puntuales en los cromosomas. Se pueden acortar cromosomas por fragmentación a partir de rayos X. Si tengo líneas celulares que comparten un mismo cromosoma, y las irradio de formas diferentes. Genero mutaciones en fragmentos alternativamente y voy comprobando puntualmente si el gen se producía en el fragmento eliminado (en ese caso la célula no lo producirá) o no. Entonces se puede ir rastreando dentro.

CELOMICA

Igual que la genómica o la proteómica, se refiere a la ciencia que se ocupa de los cultivos celulares y el estudio de la célula en su conjunto. Es una disciplina nueva dentro de la biología molecular.

• Aporta rapidez: no necesito tener individuos completos con tal de tener las células que me interesan. Además se pueden generar condiciones artificiales para que se promueva la división y el crecimiento de los cultivos.

• Aporta especificidad: no necesito analizar todo el individuo. Puedo directamente utilizar células hepáticas, fibroblastos, eritrocitos, etc. viendo específicamente la expresión o no expresión de genes en esas células en concreto.

• Nos permite hacer fusión entre organismos que de otra manera sería imposible: esas tecnologías permiten fusionar células y ver como se comportan los genes en esas condiciones desarrollandose tecnologías derivadas como el cartografiado recién comentado.

• Podemos ensayar fármacos y probar agentes mutagénicos: se puede ver la actuación de sustancias específicamente en las células que tenemos y hasta podemos obtener células sanas o enfermas y ver que tal actuan los fármacos con cierta precisión. Así podemos evitar las cuestiones éticas sobre sacrificio de animales para probar fármacos, etc. Lo mismo con agentes mutagénicos u oncogénicos.

Tipos de cultivos:

• Líneas primarias: son las líneas embrionarias, células nada diferenciadas que potencialmente mantienen su capacidad total de diferenciación. Entre esas líneas primarias están las células madre somáticas. Pueden desarrollarse hacia cualquier tipo celular. Generalmente son líneas que solo admiten de 50 a 100 divisiones y luego el cultivo se pierde por apoptosis?¿

• Líneas transformadas: son líneas que han sido inducidas por un virus a tumorales o que provienen de un tumor y tienen todas las peculiaridades propias de un tumor: se dividen indefinidamente o casi indefinidamente y sin control. Las más famosas son las líneas HeLa (el primer cultivo transformado obtenido a partir de una señora que tenía un tumor de cuello de útero que dono las células a la ciencia, 1952).

• Líneas establecidas: células transformadas con un fenotipo determinado que le corresponde y que muestran ser perfectamente inmortales en tanto no les falten los requisitos obvios como un medio externo rico en nutrientes. Las tumorales suelen requerir mucha energía. Suelen requerir un anclaje (crecen mal en un medio líquido). Esas líneas tienen además la llamada inhibición por densidad. Es decir que no crecen ilimitadamente, sino que en un momento, el cultivo se para porque unas células se pegan a otras y detienen su replicación.

• Líneas diferenciadas: células que se extraen y se cultivan. En presencia de nutrientes, crecen, aunque poco. Las células de sangre se cultivan para los análisis por ejemplo. Se consiguen a partir de tejidos u otros cultivos diferenciados. Pero no son inmortales, ni se pueden dividir ilimitadamente. Se pueden conseguir también a partir de células madre que son células totipotentes. El problema es que no se conocen todos los métodos para llevarlas a diferenciación específica. Eso se consigue en algunas líneas mediante señales moleculares celulares (citoquinas, etc.)

OTROS CARTOGRAFIADOS: CARTOGRAFIADO CON MARCADORES MOLECULARES y otros tipos

• RFLPs: polimorfismos para la longitud de los fragmentos de restricción

• SSLPs: polimorfismos para la longitud de secuencias sencillas. Incluimos los mini y microsatélites

• SNPs: polimorfismos de un único nucleótidos: generación de microarrays y chipDNA

• STS: sequence tagged site: sitios de secuencia específica

• ESTS: los

• por deleción génica

• Hibridación in situ: pintado de cromosomas (chromosome painting) y kariotipado espectral (sky)

• Secueciación: el maximo cartografiado de nucleótidos posible

TEMA 4 - EXPRESION FENOTÍPICA Y MEDIO AMBIENTE (interacción fenotipo - ambiente)

GENOTIPO y FENOTIPO

Son terminos introducidos en 1909 por Johanssen. El Fenotipo es una expresión del genotipo. Son los rasgos que presenta un individuo y que pueden afectar a su morfología y comportamiento. El Fenotipo no se transmite. Se transmite el genotipo. De esto se sabe mucho desde hace mucho tiempo. Además no se transmite todo el genotipo, sino solo el genotipo de la línea germinal.

EXPERIMENTO: una ratona albina y una ratona homocigótica de color normal. Si se le eliminan los ovarios y se le trasplantan a la ratona de color oscuro. Cuando se cruzan los individuos albinos, todos los descendientes serán heterocigotos y de color normal. Eso es prueba de que el genotipo que se transmite es el de la línea germinal.

El genotipo es la constitución genética de un organismo.

La relación del fenotipo y el genotipo no es directa. El fenotipo se constituye a partir de interacciones. Los genes no son más que potenciales proteínas. Hemos visto que hay interacción génica. Eso vendría a ser el nivel más simple de interacción generadora de fenotipos. Pero también estan las epistasias. Las interacciones alélicas. La interacción con orgánulos celulares. La interacción de células, de tejidos, de órganos y sistemas. De toda esa unión surge un individuo, pero que tampoco está aislado, ya que está en relación con el medio que le provee de nutrientes, y con los individuos de su comunidad y su ecosistema.

El ambiente de un genotipo engloba todas esas interacciones para un gen concreto. O sea que tiene un significado especial en genética. Un mismo genotipo puede dar fenotipos diferentes, incluso opuestos. Las pecas pueden ser una influencia ambiental solar, o un producto génico concreto. Los descendientes de una pareja homocigótica dominante AA - heterocigótica Aa serán todos del mismo fenotipo pero de genotipos diversos: AA o Aa.

Se pueden compartir genotipos en individuos clónicos.

CLON: un clon es un individuo genéticamente idéntico, o sea genotípicamente iguales. En bacterias y organismos unicelulares sin reproducción sexual es frecuente encontrar individuos que genéticamente sean iguales. Eso porque tienen reproducción que no implica variabilidad directamente.

En plantas, los esquejes son clones verdaderos, con lo cual incluso clonamos plantas sin saberlo. El clonaje entonces es tan viejo como la humanidad.

En humanos tenemos a los gemelos monocigóticos (gemelos MZ): es decir que provienen de un mismo cigoto original. Eso quiere decir que hubo una única fecundación. El embrión temprano se fracciona en dos dando lugar a dos organismos que serán iguales. Sin embargo, uno de ellos siempre se lleva más cantidad de nutrientes y vitelo, razón por la cual uno siempre es más debil que el otro. Serán además del mismo sexo. El otro caso es el de los gemelos heterocigóticos que provienen de una doble fecundación. Esos realmente no son clones. La diferencia entre gemelos y mellizos no existe. Se suelen llamar gemelos y mellizos a lo mismo, con lo cual, la distinción no es lenguaje científico.

Un aviso extra: es muy jodido determinar que dos personas gemelas sean monocigóticos o no.

Si son heterocigóticos, pueden ser dicigóticos (si son 2), tricigóticos (si son 3), tetracigóticos (si son 4), etc.

Pero los gemelos monocigóticos no tienen el mismo fenotipo. Se comparten muchos por fuerza, ya que el genotipo es muy determinante en el fenotipo, pero la interacción de genes con el ambiente es más determinante aún. Por ello, si las variaciones ambientales son mayores, las diferencias serán aún mayores. Hay ejemplos más que obvios. Puedo agarrar un geranio, le hago esquejes y planto en diferentes lugares, con ambientes diferentes. Evidentemente, de los que estén en un lugar con muchos nutrientes comparados con otros que tengan menos nitrógeno, hará que algunos sean diferentes (más o menos crecimiento, etc.)

NORMA DE REACCION de cada genotipo:

El genotipo 1 en el ambiente 1 me dará un fenotipo que podríamos llamar 11. El genotipo 1 en el ambiente 2 me dará un fenotipo 12. Así sucesivamente. Con 2 genotipos y dos ambientes tendré 4 posibles fenotipos. Si se ponen números suficientes, para todos los genes y todos los ambientes. Habrá muchos fenotipos diferentes. Entonces existe una plasticidad fenotípica muy grande.

Si F = G + A

Entonces VF = VG + VA

Observamos muchos fenotipos porque hay muchos genotipos y muchos ambientes.

Ahora debemos descomponer eso y hacerlo operativo. Ya sabemos como se produce la variación genotípica. Se evidencia que hay variación fenotípica. Pero nos falta la variación ambiental.

La varianza es la desviación sobre otros estadísticos. Entonces podemos ver esa varianza como de ajustada está a la realidad. Entonces la manera operativa de ver esto es tener las varianzas fenotípica, genotípica y ambiental.

Eso se puede determinar a partir de experimentos y visualizaciones. Contamos y sacamos los valores que queremos a partir de nuestro muestreo. Entonces podremos determinar que la varianza fenotípica dependerá de la varianza genotípica y ambiental. Pero si hacemos los cálculos nos falta algo. La VF es mayor que la suma de VG y VA. Nos falta un término adicional

El término adicional que le falta a la ecuación es una varianza de interacción genotípica-ambiental. Esa varianza es muy difícil de determinar. Se incluyen por ejemplo el llamado “ruido de desarrollo” que son modificaciones en el fenotipo que dependen de unas interacciones entre ciertos nutrientes requeridos en la producción genética embrionaria. Como no se puede calcular no queda más que determinarla como un componente estocástico que será mayor o menor dependiendo del estudio.

PENETRANCIA

Muchas características genotípicas no tienen una expresión automática en el individuo que las porta. Puedes tener el genotipo correspondiente y no expresarlo. Hay muchas características:

• Penetración completa: una vez que tienes un genotipo lo vas a expresar (es un término poblacional: el 100% de los individuos de una población que tiene el genotipo también lo expresa) - ejemplo: el ABO y el RH en los grupos sanguíneos

• Penetración variable: ahí hay toda una serie de rasgos y características que no se expresaran en todos los individuos portadores sino en un cierto porcentaje de ellos. Ese porcentaje se llama penetrancia de un fenotipo con respecto a un genotipo. En Drosophila está la mutación LOBE que afecta el tamaño del ojo de las moscas. Solo el 75% de los individuos con la mutación LOBE la expresan. Entonces no vale solo con tener el alelo, sino que también depende de muchas cosas. La penetrancia es entonces del 75%.

EXPRESIVIDAD

Se refiere a como aparece un fenotipo entre la gente que tiene un genotipo igual.

• Expresividad completa: una vez que se tiene un rasgo y que se expresa, se expresa en todos los individuos de la misma manera.

• Expresividad variable: una vez que se tiene un rasgo y que se expresa, se expresa con diferente magnitud en diferentes individuos. La polidactilia depende de un cambio genotípico único. Pero algunos individuos la tienen en una extremidad sola, otros en dos, o en tres o en cuatro. Entonces no todo lo que tenemos se expresa siempre.

FACTORES QUE AFECTAN A LA PENETRANCIA Y A LA EXPRESIVIDAD

• Factores genéticos: la dominancia, las interacciones genéticas (epistasias), la letalidad génica

• Factores ambientales:

• Factores ambientales externos: por ejemplo:

• La Temperatura - mutación BAR de Drosophila afecta la forma del ojo y el número de facetas. Cuando un individuo lleva la mutación BAR, la expresión será diferente en función de la temperatura. Por encima de cierta temperatura están menos afectadas que por debajo de cierta temperatura. - además en determinados organismos también determina el sexo. - en los conejos himalaya la coloración del pelaje depende de la temperatura. Llevan un alelo de albinismo. Si se crían por debajo de 25 o 15 grados, se les pigmenta la punta de las orejitas, las patitas y el rabo. El precio del mercado aumenta en los individuos himalaya que tienen ese patrón de coloración. - en plantas hay variedades de cereales como la cebada que son deficientes en clorofila pero que esa deficiencia puede expresarse o no dependiendo de la temperatura a la que se cultivan.

• La Luz - en plantas que presentan una deficiencia de los pigmentos fotosintéticos. Si son heterocigotos pero tienen suficiente luz, con la clorofila que tienen les sobra para completar su ciclo. Pero en condiciones menos favorables de luz, su fenotipo es enano ya que no se desarrollan bien. - en los genotipos de humanos pecosos, dependiendo de la radiación que reciban podrán desarrollar las pecas o no. En verano, una persona pelirroja casi seguro tendrá pecas. En invierno, lo más seguro es que las pecas desaparezcan.

• La Nutrición - dependiendo de la disponibilidad de alimentos los genotipos iguales pueden desarrollar fenotipos muy diferentes - el ejemplo de los mutantes auxótrofos es un típico ejemplo de microbiología. Los protótrofos son los que pueden vivir con pocos nutrientes y pueden producir todo lo que necesitan. Los mutantes auxótrofos son los que tienen una deficiencia para producir algun metabolito por ellos mismos. Eso suele ser porque se les mutó inactivándose una proteína clave del metabolismo. Entonces el resto de compañeros de especie deben suministrarle ese metabolito, por ejemplo un aminoácido esencial.

• Las Relaciones maternas - en animales que tienen relación con la madre o el desarrollo embrionario es muy importante - si la madre tiene una nutrición mala o fuma o bebe durante el desarrollo puede haber variación en el fenotipo del hijo - si una madre fuma, o se droga o tiene sida, esos serán fenotipos que se le pasarán al hijo.

• Factores ambientales internos: son más dedicados

• Edad - algún reloj tenemos los animales que hace que nuestro fenotipo se exprese de diferentes maneras a lo largo de nuestra vida. EL clásico ejemplo es el de las canas. Pero también hay ejemplos de fenotipos que aparecen en una edad concreta con mayor fuerza: a partir de los 40 años, la diabetes melitus afecta con más fuerza. O sea que la relación genotipo - fenotipo no es directa.

• Sexo - ciertas características se expresan de una manera en un sexo y de otra manera en el otro - un ejemplo es la calvicie que es mucho más acusada en los machos que en las hembras - además la expresividad de la calvicie es diferente también. Eso tiene que ver con la carga hormonal diferente según el individuo etc. - HAY ALGUNAS CARACTERISTICAS QUE ESTAN LIMITADAS POR EL SEXO - eso quiere decir que la expresividad es completa o nula dependiendo del sexo. Los genes para la presencia de cuernos están afectados por el sexo y también por la edad. - También hay otro ejemplo que es la pilosidad o la vellosidad masculina y femenina. Hombres y mujeres tenemos los mismos genes pero la expresión es diferente. - El labio leporino que es una malformación congénita que consiste en una malformación que recuerda al labio de los conejos (“leporino”). Eso se corrige con una cirugía. Es más frecuente en los varones que en las mujeres también. - La espina bífida también está afectada por el sexo. Es más frecuente en chicas.

FENOCOPIAS (Goldschmidt 1935)

Individuos que teniendo un genotipo aparentan tener un fenotipo que no corresponde a su genotipo. Las personas que tienen un genotipo que conduce a la diabetes pueden tener un ambiente más adecuado y la inyección de insulina le hará que su fenotipo sea el normal. Ojo! Eso no evita que el páncreas no secrete insulina, pero su fenotipo externo será bueno. Los fenilcetonúricos también son un ejemplo típico. Se puede alterar el ambiente para retirar de la dieta la fenilalanina. De esa manera simulan ser normales. Además luego del desarrollo ya pueden comer con fenilalanina, etc. Están fenocopiándose. La talidomida es una enfermedad que afectó a Europa durante un tiempo mientras era empleada con las embarazadas por los vómitos, los mareos y los vértigos. Se llegó a la conclusión de que un incremente que se veía en la arqeuiropodia que son alteraciones en las extremidades de bebés, se debía a la talidomida, que tenía una actividad mutagénica sobre los genes de esta enfermedad. Los casos se dispararon de una manera alarmante, pero como España era pobre en los 40… no hubo casos de estos. En Italia ocurrió algo similar con una niebla tóxica de un escape químico de una fábrica. Los que tomaban el fármaco o eran afectados por la niebla fenocopiaban a los mutantes.

Podemos hablar de la rubéola o la pancreatitis también. Alguien con una pancreatitis tiene el fenotipo diabético sin tener las condiciones genotípicas para ello. Eso también es una fenocopia.

El Fenotipo Bombay: se determinó en la ciudad Hindú de Bombay donde es algo relativamente frecuente. Individuos que aparentan ser del grupo sanguíneo 0 en pruebas sanguíneas, cuando se les utiliza la sangre para transfusiones se generan problemas de incompatibilidad. Entonces son o no son del grupo 0??? Hay una sustancia precursora que pasa al antígeno H. A través del locus AB0, dará grupos sanguíneos normales. El paso de la sustancia precursora al antígeno H está controlado por el locus Hh. Los homocigóticos hh no producen el antígeno H y por lo tanto no se produce la sustancia H. Por ello no presentan grupo sanguíneo alguno y por lo tanto se toman como falsos 0. El h es muy infrecuente excepto en esas poblaciones en Bombay. Entonces solo se ven esas fenocopias en Bombay.

GENEALOGIAS

ESTUDIOS DE GEMELOS: estudiar características en gemelos tanto monocigotos como di, tri o policigóticos. Si el fenotipo es el resultado de una interacción entre el genotipo, el ambiente y la interacción entre ambos, qué nos aportan los gemelos? Que tienen el mismo genotipo. Entonces si tengo dos individuos que comparten el genotipo pero que presentan fenotipos iguales, se podría valorar si las circunstancias ambientales fueron las mismas. Además si los ambientes fueron diferentes, pero tienen el mismo fenotipo se podría considerar q para ese rasgo, el genotipo es muy determinante. Y viceversa, si frente a genotipos iguales tenemos fenotipos diferentes, tal vez no tiene tanto que ver con los genotipos como con los pequeños cambios ambientales que haya podido haber.

Se crean fenómenos de concordancia y discordancia en igualdad de ambientes o distintos ambientes, respectivamente.

Diferencias entre gemelos idénticos y fraternos:

Altura en centímetros: en gemelos idénticos, las diferencias medias son escasas. Además da igual si están criados juntos o separados. En los fraternos, las diferencias son superiores y equiparables a la de hermanos de diferentes partos. Una conclusión posible es que la característica es muy influida por el genotipo.

Peso: en gemelos idénticos las diferencias son pocas, pero en gemelos juntos es menor que en gemelos separados. En los fraternos, las diferencias son similares a la de los separados. La de hermanos es similar. Por ello depende más del ambiente que de otra cosa.

Tamaño de la cabeza: También es un componente fundamentalmente ambiental

IQ de Binet: éste en cambio parece más determinado genotípicamente.

PROBLEMA: esta parte está sacada de un trabajo que data del año 37. En esa época, la detectabilidad de gemelos mono y dicigóticos era mala. Segundo problema: porqué toma datos para cosas como la inteligencia. Los psicólogos llevan años tratando de determinar la inteligencia con lo cual es muy difícil analizar características tan inabordables.

CONCLUSION - NORMA DE REACCION

Cada genotipo tiene una norma de reacción. Todo ese conjunto de fenotipos posibles son la norma de reacción. Hay características que tienen una norma de reacción estrecha o limitada como los grupos sanguíneos, el sexo, etc.

Experimento ratas listas - ratas tontas

En un ambiente normal determinamos los fenotipos de ratas listas y ratas tontas. Se consiguen las lineas puras. Las ratas listas cometen menos errores que las tontas en el ambiente normal. En un ambiente favorable, las listas cometen los mismos, hay un límite. Pero las tontas cometen menos. En el ambiente desfavorable, las ratas listas cometen muchos más errores.

Experimento de Dunlop - producción de lana en cuatro líneas de ovejas australianas.

Ponen las ovejas en 3 ambientes diferentes, A, B y C. Para la raza 1, en el ambiente A produce buena lana. Para la 2 conviene el ambiente C. Para la 3 conviene el ambiente B. Para la 4 conviene tanto el B como el C. Esto quiere decir que el ambiente es importante para la producción de lana, pero importa mucho más la interacción de los genes de cada línea con cada ambiente en particular.

Mutación BAR

El número de facetas desciente según la temperatura o aumenta dependiendo del genotipo que se tenga. En el genotipo salvaje normal, el número de facetas desciende. En los mutantes infrabar, el número de facetas asciende con la temperatura. En los ultrabar, el número de facetas desciende, pero en general tienen un número de facetas más bajo que el de los infrabar o el de los salvajes. A una cierta temperatura, los salvajes pueden terminar fenocopiando a los infrabar. También ocurre a temperaturas bajas entre los infra y los ultrabar. Son claras influencias de un agente externo en el fenotipo.

PROBLEMAS - erratas

Prob 17:

No cultivos:: 123, 21, 42, 7

Fenotipos: ABC, AbC, abc, abC

Prob 15:

En la columna 3-4 tenemos los fenotipos AB, ab, AB y Ab

VARIACION Y GENOTIPO: UNA NUEVA ETAPA DE LA GENÉTICA - LA GENETICA CUANTITATIVA

Se ocupa de los rasgos con variación continua.

La variación discontinua nos ha ocupado hasta ahora: alternativas discretas como presencia-ausencia, o variables cualitativas, etc.

Ahora veremos rasgos genéticos que se asocian con fenotipos gradados de manera que es difícil encontrar dos individuos absolutamente idénticos fenotípicamente. Comprenden muchas características fisiológicas como el grado de coloración de la piel o el pelo o los ojos, o las cantidades de hormonas o enzimas circulantes, o la cantidad de producto de un gen, la altura, el peso, son todas cosas similares, el número de células en algunos organismos, etc.

Se estudian a partir de muestreos sobre individuos. Ejemplo: altura de individuos. Se pueden establecer clases para simplificar los fenotipos. Para la altura podríamos hacer clases cada 1 o 5 cm pero también para 1 mm y podríamos tener muchísimos fenotipos.

Los rasgos genéticos suelen ajustarse de forma normal, es decir como una variable de distribución normal en forma de campana Gaussiana.

En los comienzos de la genética hubo un enfrentamiento entre los BIOMETRAS y los MENDELIANOS. De forma que los Mendelianos defendían los postulados mendelianos de la herencia y hacían sus experimentos con características cualitativas. Los Biometras era la gente que al intentar reproducir los experimentos mendelianos en características contínuas no podían encontrar los principios mendelianos ahí. Entonces decían que si el mendelismo era real, como mucho servía para características inútiles y discretas, que en general eran la minoría. Dicho esto…la cosa se aclaró bastante con los experimentos de Johannsen que fue quien propuso los términos de genotipo y fenotipo en base a esos experimentos.

Experimento de Johannsen - las Judías Princesa (variedad comercial)

Quería determinar si el peso de la semilla (característica comercial importante, además de genética). Hace cruzamientos intentando establecer si el peso estaba genéticamente determinado. Quería ver como podíamos conseguir las mejores judías y las más productivas.

Aisló 19 líneas diferentes que podían separarse por el peso. Cada línea tenía un peso medio diferente del de las demás. Pero las judías no eran iguales dentro de cada clase. O sea que cada clase tenía una varianza considerable. O sea que el hizo sus líneas basándose en sus clases.

Pero cuando sembraba semillas de mucho peso la descendencia tenía también un peso que encajaba en la misma categoría. Tuvieran los progenitores el peso que tuvieran, si eran de la línea pesada…la progenie tendría un peso medio igual al de la media de la clase de la progenitora.

Eso lo llevó a concluir que debía haber algo en los genes relacionado con ello.

Entonces qué hacía que dentro de una de estas líneas puras las semillas fueran más o menos grandes. Si tenían el mismo genotipo… Entonces determinó que eso era el ambiente. Cada línea corresponde a una variación de genotipo + ambiente para dar el fenotipo de cada uno de los individuos de cada línea.

Esto implicaba que había un control genético de una variación cuantitativa.

Eso generó mucha más polémica aún entre los biometras y los mendelianos.

El tema empezó a resolverse con los experimentos de Nilson-Emle. Estaba haciendo experimentos con trigo. Aunque nos cueste trabajo creerlo hay una gradación de semilla de forma que el endospermo, y por lo tanto la harina podía cambiar desde blanco hasta rojo. Es un carácter cuantitativo. El sabía que en la naturaleza aparecían desde semillas blancas hasta semillas rojas pasando por todo el espectro intermedio. Estaba interesado por una variedad que fuera económicamente rentable. O sea que era un experimento con un cierto valor comercial. Hizo muchos experimentos y llegó a la conclusión de que el color en el trigo está controlado por 3 loci, 3 genes cada uno de ellos con dos alternativas. Por ello, como los organismos eran diploides….podíamos encontrar todos los genotipos desde AABBCC hasta aabbcc. Descubrió que los realmente blancos eran los que tenían el alelo doble recesivo en los tres loci. Los rojos más intensos tenían doble dominantes en los tres loci. Entonces la coloración intermedia dependía del número de alelos dominantes. Es decir que había un efecto aditivo de alelos dominantes. Si se tenía 1 alelo dominante el individuo era algo más cercano al rojo. Si se tenían 2 dominantes…el tono era algo más intenso…así hasta tener los 6 alelos dominantes AABBCC.

Solo 1 de 64 individuos tendrá aabbcc y será blanco puro. Los que reciban 1 solo alelo serán 6 de 64. Los que reciban 2 serán 14. La mayor parte de los individuos recibirían el número intermedio, o sea 3. Los importantes comercialmente eran los que tenían hasta 2 alelos.

Esto aportaba un modelo genético real.

O sea que los rasgos cuantitativos también estaban controlados mendelianamente. El tema es que en estos casos eran rasgos poligénicos es decir controlados por muchos genes con efecto aditivo. Es decir que cada alelo contribuía un poquito al fenotipo. Luego el fenotipo final era modulado por el ambiente.

Para 1 par de genes con solo 2 alelos…los AA son de un fenotipo, los aa son de otro. Los F1 tendrán un fenotipo diferente. En la F2 tendremos una segregación simple. Los AA y los aa serán 1/22 ; los Aa serán ½. Si teníamos dos loci teníamos en la F2 la típica ½2.2 para los AABB y los aabb. Para los

Numero de clases en F1 es siempre 1

Numero de clases en F2 es No de alelos + 1

Proporción de homocigotos dominantes o recesivos en la F2 es 1/22n

En el género Nicotiana, se hizo un experimento. Se conseguía una línea pura en que todas las flores tenían una corola corta. La media le daba 40,5 mm. Tiene otra línea con la longitud de la corola de media 93,3 centímetros. Cuando las cruzaba conseguía individuos con longitud media intermedia. Cuando hacía la F2 le salían individuos que los agrupaba en clases otra vez…pero la distribución era más. Pero sin embargo, ninguno de los más cortos eran como los más largos de la línea P corta, y ninguno de los más largos eran tan largos como los más cortos de la línea P larga.

Si el carácter hubiera estado controlado por 4 loci, de cada 256 individuos, 1 debería haber salido tan largo como la P1 y 1 debería haber salido tan largo como la P2. O sea que por fuerza el rasgo tenía que estar controlado por 5 loci, ya que de 444 experimentos ninguno salía con un fenotipo igual a alguno de los parentales.

Ya con 5 locis…..tenemos la posibilidad de 1/1024. Si con 1024 experimentos salía 1 de cada P entonces el rasgo estaba controlado por 5 loci. Si no salían…entonces necesitamos o hacer más experimentos o suponer que había más de 5 loci.

La pigmentación humana por ejemplo tiene toda la pinta de estar controlada por 4 loci cada uno con 2 alelos y con modelos de herencia aditiva como lo que tenemos en el maíz. Dicho eso, hay muchas cosas que tienen que ver con el ambiente. La persona más pigmentada tiene 8 alelos de pigmentación. Una persona con 8 alelos recesivos tendrá pigmentación nula. Eso tiene un resultado obvio….un individuo con 5 alelos dominantes si se cruza con otro de 5 alelos deominantes….el descendiente que pueda recibir menos alelos tendrá 4 alelos. El que tenga más tendrá los 5. Pero personas poco pigmentadas pueden tener hijos muy pigmentados. Si se tienen 2 alelos por pareja pueden salir individuos con 4 alelos de pigmentación y que sea muy pigmentado, el doble que sus padres.

Como sabemos cuantos genes están implicados?

Debes mirar si en la F2 ya te están saliendo individuos con fenotipos paternales.

Si la variabilidad ambiental es muy grande para el carácter ya tenemos problemas porque las clases empiezan a solaparse y todo ya es más difícil.

Hasta ahora vimos genes con efecto aditivo….pero la interacción puede ser diversa. Además….si los genes interactúan entre sí…o los alelos interactúan entre sí con cosas como dominancia intermedia….o combinada…etc…..imaginate lo difícil que se puede poner…

Además si los genes son epistáticos….ya tenemos cosas complejísimas. Lo del maíz salió bien de pedo… pero muchos otros experimentos habrán fallado en el camino hacia el conocimiento.

Además hay genes que pueden tener en vez de un efecto aditivo, un efecto multiplicativo. Con lo cual si se juntan 3 alelos dominante…sale un fenotipo muy superior. Y eso también es difícil de ver con facilidad. ¿Cómo se arregla esto? Con mucho trabajo y dedicación. La genética cuantitativa por eso es una de las ramas más difíciles de la genética.

Se ocupa de los QTL (Quantitative Traits' Loci) es decir genes de caracteres cuantitativos.

Como se hace esto?

Con mucho tratamiento estadístico y matemático, con muchísimo tiempo de trabajo, pero valiosísimos, porque efectivamente a la economía le suelen interesar los rasgos medibles y cuantitativos. Además muchos rasgos son poligénicos y hay que tratar con ellos con herramientas para estudiar QTLs.

POLIGENES EN RASGOS DISCONTINUOS

Experimentos de Wright con conejillos de indias. Estudiaban el número de dedos en extremidades.

El número de dedos es un número concreto finito.

Planteaba que encontraba individuos que tenían 3 dedos o 4 dedos. Hizo cruzamientos para observar la genética de esta característica.

Su hipótesis era que un único gen controlaba el proceso de manera que el A daba 3 dedos y el a daba 4 dedos. Lo habitual entonces era tener 3 dedos.

Cruzaba individuos puros de 3 y 4 dedos. Los de la F1 eran de 3 dedos. Con ello quedaba claro que esa F1 era normal.

Pero en la F2 le salieron 188 A y 44 a. Eso era algo similar a 3:1 con lo cual su modelo estaba más o menos bien.

Cuando hacía el cruzamiento prueba…obtenía 50% A y 50% a. Finalmente parecía que el análisis estaba concluido.

Pero fue un paso más allá y cruzó los A del cruzamiento prueba con dobles recesivos. Si su planteamiento fuera correcto, debrían haber salido otra vez 50-50. Pero le salían 73-28.

Llegó a la conclusión de que el rasgo estaba controlado por varios genes con efecto umbral.

Lo que proponía era que el rasgo estaba controlado por 4 loci, cada uno con 2 alelos. Estaba AaBbCcDd…. Los individuos con de uno a cuatro alelos dominantes tenían 3 dedos. Los individuos con 5 a 8 alelos dominantes tendrían 4 dedos. O sea que el número de alelos dominantes determinaba el fenotipo, pero este no cambiaba gradualmente con el número de alelos dominantes, sino que a partir de un número de alelos dominantes se pasaba a un fenotipo completamente diferente.

Con cada cruzamiento que iba haciendo en sus experimentos, los alelos dominantes se iban difundiendo. Pero como siempre sucede en casos de poligenia….una vez retrocruzaba individuos que tenían 3 dedos pero ya por muy poco….con individuos que tenían 6 o 7 (su línea pura “recesiva”)….le salían ¾ de individuos “recesivos”. Claramente la idea de la poligenia explicaba sus previos resultados.

Esto tenía una explicación molecular?

Claro que sí. Cada dominante añade algo más de producto génico. Cuando se tiene una cantidad de producto puede desatarse algún proceso embriogénico que haga que los individuos tengan 1 dedo de más o lo normal…

VARIACION BIOLOGICA

¿Qué parte es genética y qué parte es ambiental?

Esto es importante para un determinado rasgo. La genética estudia solo la parte hereditaria, las reglas y leyes que la controlan. La otra parte tendrá una regulación diversa.

Los ejemplos son obvios: si la cantidad de carne que puedo obtener a partir de una vaca puede controlarse genéticamente, por poco que sea…..es necesario saber cuánto es genético para ver como puedo mejorar mi productividad.

Para ello se utiliza la herramienta bioestadística de la varianza. Cuando los individuos son más o menos iguales….los individuos se ajustan bien a la media y la varianza es pequeña. Eso es un rasgo generalmente con mucha determinación y suele ser porque a) el ambiente en que se desarrolla el gen es muy estable o b) porque la parte genética importa más que la ambiental

La varianza es S2 = sumatoria de (Xi-X)2 / N-1 = desviaciones a la media

Varianza Fenotípica = Vgenética + Vambiental + Vinteracción G-A

Para descomponer la varianza genotípica hay muchas posibilidades

• efectos aditivos: se´gun se acumulan los alelos el fenotipo cambia gradualmente A1A1 = 4 gramos A2A1 = 5 gramos, A2A2 = 6 gramos. Evidentemente la adición de cada A2 produce un gramo más de peso.

• Efectos dominantes: A1A1 = 4 gramos, A2A1= 6 gramos, A2A2= 6 gramos. Con la presencia de un alelo dominante ya cambia el fenotipo.

• Efectos Epistáticos: aaBB= 4, AaBB= 5, AABB= 6, aabb= 4…..etc.

Para la varianza ambiental debemos determinar multitud de componentes. Hay factores internos y externos. Estos se combinan por lo que podemos desgranar la Va en un número complejo de varianzas: externas, internas, interacción interna-externa.

Finalmente tenemos la varianza de la interacción genética-ambiental. Ahí incluimos el llamado RUIDO DE DESARROLLO. La presencia de una vitamina en un momento concreto del desarrollo es definitiva para que se concluya el ciclo de la división de una célula.

Ahora tenemos la Vf descompuesta en muchas otras varianzas, la aditiva, la dominante, la epistática, la ambiental externa, la ambiental interna, la de interacción G-A.

Pero esto es muy difícil desde el punto de vista del cálculo matemático. Algo se deben haber inventado los genéticos para el cálculo….

HEREDABILIDAD

Es una herramienta, un concepto operativo desarrollado en los años 40 que ha ayudado mucho a trabajar en esto. Pero ha traído también muchos problemas.

Pero primero debemos saber qué es la Familiaridad.

Un rasgo tiene alta familiaridad si es familiar. Un rasgo familiar se expresa más en el entorno de una familia, en grupos emparentados entre sí. Si un rasgo aparece en toda una población de parientes entonces se podría intentar concluir que es un rasgo con alto determinismo genético. Pero eso es una mala costumbre. El contraejemplo claro está en la transmisión de cultura o la transmisión de la religión a través de la sangre. Pero también ciertas costumbres nutricias familiares da origen a deficiencias nutricionales que pueden confundirse con enfermedades genéticas asociadas con rasgos familiares.

Pero qué es la heredabilidad?

Es un cociente entre la varianza genética y la fenotípica. Se denomina H2 = VG / VF

Si la heredabilidad es la Vg/Vf, como la Vf = Vg + Va, entonces H2 = VG / VG + VA

Varía entre 0 y 1. Entonces es la proporción de la varianza fenotípica atribuible a la varianza genotípica, al componente genético. Si H2 = 0, la VG = 0. Si H2 = 1, la VA = 0. Claro que esto no nos dirá nada sobre el rasgo, excepto su importancia genética relativa.

La Vf siempre se saca de una F2 hecha en unas ciertas condiciones ambientales.

La Va se saca siempre a partir de cruza de líneas puras, ya que todos los descendientes F1 son genéticamente iguales. Finalmente se puede hacer Vg= Vf-Va. Con Vg sacado ya se puede saber la H2.

INTERPRETACION DE H2

Experimento 1: la Vg entre los clones de mi Pelargonium (esquejes) es 0. Controlo la biomasa. Los planto en ambientes heterogéneos. La heredabilidad será 0. Con lo cual Vf = Va.

Experimento 2: si planto plantitas todas en el mismo invernadero no hay variación ambiental. Por eso la Va es 0. Toda la varianza será genética, con lo cual la heredabilidad me dará 1.

Experimento 3: tomo plantas distintas de pelargonium y las planto en un ambiente homogéneo y desfavorable….mientras el ambiente sea homogéneo, la H2 será otra vez 1.

Experimento 4: en realidad suelo tener plantas distintas en ambientes distintos. La Vg nunca es 0. Por ello lo normal es que la H2 esté entre 0 y 1.

Por ello lo que debo procurar es hacer fija alguna de las varianzas para determinar la heredabilidad….pero nos queda interpretarla!!!

Alguien poco informado podría decir que si para un rasgo, la heredabilidad de la biomasa es 1, se podría decir que la base genética de esto es muy alta. Pero no es eso….la base genética de la biomasa es la misma en todos los casos!!!! Aunque la heredabilidad no sea siempre la misma….la base genética siempre es la misma!!!! La heredabilidad cambiará cada vez que cambie la experimentación dependiendo de cuál sea la condición que mantenga constante, si la Vg o la Va y cuanto la controle.

BLOQUE III - TEMA 5 - bases moleculares de la herencia

Los requisitos del material hereditario - El RNA como material hereditario en organimos unicelulares procariontes…

El material genetico es el responsable de transmitir y expresar la información biológica. Es lo que nos diferencia de los seres inertes.

Qué tiene que cumplir el material genético?

• capacidad de almacernar la información biológica

• capacidad de ser versátil para poder permitir diversas formas de vida

• debe ser estable - si se altera la información biológica esto puede contrariar otros prerrequisitos

• capacidad de expresarse - no puede ser solo un disco de información sino que debe poder conseguir algo con ese material (debe poder leerse)

• capacidad de transmitirse - de célula a célula y de un individuo a sus descendientes para perpetuar la vida

Esa sustancia responsable del material hereditario son los Ácidos Nucleicos.

Localización del material genético:

• Núcleo (se vió ya a fines del siglo XIX cuando la tecnología de microscopios permitió ver células y núcleos)

• Cromosomas (sXX)

Se sabía que en el núcleo había CROMO-SOMAS (cuerpos coloreados), pero hasta fines del XIX y principios del XX no se vió que el material genético estaba en el núcleo.

Friederick Miescher llama nucleina a la sustancia ácida rica en fósforo que está presente en los núcleos. Las descubrió en el pus donde había muerte de leucocitos. Aisló núcleos y caracterizó la sustancia que estaba en los núcleos.

Kossel en 1871 caracteriza a la nucleina como una sustancia rica en purinas y pirimidinas.

Todavía no está definido ni gen, ni los principios mendelianos de la herencia. La gente no tiene la más minima preocupación sobre herencia molecular en ésta época. Por lo tanto no se sabía ni se necesitaba ni se podía saber nada, con la cantidad de tecnología que había.

Eran tiempos en que la ciencia biomédica estaba destinada al furor de las vacunas. Se acababan de descubrir los microorganimos, etc. y el furor era salvar vidas. En esa época Griffith buscaba una vacuna para la neumonía que por ese entonces se llevaba millones de vida por delante. Era una enfermedad que estaba en los ratones y estudió en ese organimo modelo. Tenía dos cepas, la R y la S.

La cepa S era la virulenta y la R era la que no provocaba la enfermedad. La S era lisa y brillante. La cepa R era rugosa. Sabía que las S producían enfermedad en humanos.

Eso era debido a la cápsula de mucopolisacáridos que rodeaba a la membrana plasmática. La que tenía la cápsula era irreconocible y por lo tanto la infección no era atacada por el sistema inmune.

Inactivando por calor el principio biológico e inyectando el microorganimos muerto inmunizaba contra el microorganimos vivo. El problema es que si inyectaba la S inactivada, el ratón vivía y ya no padecía la enfermedad….pero la cepa S junto con la cepa R inyectados simultáneamente hacía que el ratón muriera. Lo más grave es que cada una de estas materias, la muerta y la viva, ninguna de ellas por separado pueden producir la enfermedad común. Encima de la sangre del ratón en vez de rescatarse anticuerpos, salían solo bacterias de tipo S.

Llegó a la conclusión de que había un principio transformante que estaba en las S muertas por calor que convertía a las R vivas en bacterias S vivas.

Grifith consiguió muchas cosas pero no resolvió el puzzle ni consiguió la vacuna aunque hizo cosas impresionantes en el Imperial Collage para la la biomedicina.

Desde entonces hubo muy poco en conjunto para ayudar a esto….

El paradigma de ese momento ya lo conocemos….experimentos de Morgan, descubrimiento de genes, teoría cromosómica de la herencia, etc. Nadie sabía que había en los cromosomas y los núcleos. Se suponía que lo que había era las proteínas. Son diversas, abundantes, etc. Son todas muy distintas…por lo tanto lo que se pasa son las proteínas. Se había aislado desde el punto de vista químico el ADN y el ARN para llegar a la conclusión de que son materias extraordinariamente aburridas y monótonas. Eran así porque eran polímeros estúpidos de los mismos nucleótidos que se repiten. Era frágil, larga y tonta. Se creía que no valía para nada. Además estaba en todos los individuos por igual. Nadie pensaba de que fuera responsable de nada…

El ARN todavía más frágil, etc. …. Las proteínas tenían todas las papeletas y mientras se descubría sobre genética….poco se sabía de genética molecular.

Recién en los años 40 unas personas retomaron los experimentos de Griffith. Eran Avery, MacLeod y McCarty. Estamos en la 2ª Guerra Mundial. Están muriendo soldados en el frente más por neumonía que por bombazos. Se busca la vacuna de la neumonía. Pero tropiezan con las mismas piedras que Griffith.

Hicieron muchos experimentos. Es uno de los mejores ejemplos de honestidad científica y experimentación bien hecha. Lo hicieron para contrastar lo que ellos creían.

Ellos intentaban refutar la hipótesis de Griffith de que el ADN era el material transformante hereditario. Intentaron atacarlo por todos lados…pero mediante los experimentos, en vez de comprobar lo que pensaban….cambiaron el mundo.

Ellos vieron que en el núcleo había ADN, ARN y muchas proteínas (de ellas la mayoría histonas).

Experimentos: Extracto de células S fundamentalmente compuesto por ADN con pocas proteínas. Lo que hacen es calentar y matar a las proteínas. El ADN se renaturaliza. Plaqueando el tema salen colonias R y unas cuantas colonias S. Ahí ya no hay ratones por medio. O sea que nada sucedía en el ratón. Lo que sucede estaba demostrándose in Vitro.

Descubiertas las proteasas que degradaban proteínas, intentan tratar el extracto con proteasa y con Rnasa para ver si eliminando toda excepto DNA. Y aún así aparecían las R y las S. Entonces el principio transformante no era ni el ARN ni las PROTEINAS!!! DEBIA SER DNA!!!

Cuando se utilizaba DNA asas para tratar, el DNA se rompía y se obtenían colonias solo S.

Petabamos las células S. Aislabamos sus compuestos: Azucares, Grasas, RNA, Proteínas y DNA. Se lo metían en el año 44 a las células R vivas. Lo único que llegaba a transformar las células R era el DNA. Estaba confirmado…con química analítica se logró terminar de comprobar el tema….

¿Qué sucedió?

La comunidad científica se divide. La mayor parte de la gente no lo creía. Mucha gente había trabajado toda su vida creyendo en que las proteínas eran la base transformante… Era difícil aún con experimentos clave.

Era una época en que había poca revistas, con una periodicidad bimensual, con un ritmo de publicación muy lento. Hasta que un artículo trascendía podía pasar mucho tiempo. Era difícil divulgar todo esto…

Los experimentos no fueron respaldados como requerían hasta casi 8 años más tarde.

Algunos grupos de gente rara se puso a trabajar en esa línea con poco éxito. Lo importante lo consiguen Hershey y Chase en el 52. Estaban trabajando con el grupo de Max Dellbrook (el grupo PHAGE). Estaban trabajando con microorganismos en vez de con organismos superiores. Creían que era más fácil estudiar cosas pequeñas en organismos más simples.

Comienza el boom de la microbiología y el estudio de la bioquímica microbiológica.

Los fagos eran los virus que comían bacterias… se sabía que producían infecciones. Pero hasta el año 50 no se consigue la tecnología para estudiar los virus.

En sus experimentos, con el T2, ya saben que el fago tiene solo proteínas y DNA. Estudiaban la infección en E. coli. Su duda clara es que no sabían cuál era el material informativo de los virus. Podía ser solo proteínas o virus.

Marcaron con radiactividad las proteínas y el DNA. Con fósforo radiactivo marcan DNA y con azufre marcan proteínas. El azufre está en la cisterna en los puentes disulfuro. El ADN no llevaba azufre y por lo tanto es fácil usar estos rastreadores.

Cuando infectamos con los virus radiactivos, el marcado se queda fuera de las bacterias y al lavar el cultivo, las cápsulas desaparecen. Además de que los virus que se producen no son radiactivos. La radiactividad desaparece!!!

Cuando infectaban con fósforo radiactivo, el marcado se incorporaba al ADN de la bacteria. Pero cuando se lavaba, la radiactividad se quedaba en las bacterias y los virus rescatados de esas bacterias también eran radiactivos. O sea que lo que se pasó de una generación a la otra fue el DNA!!!

Se les dio el premio novel. Se dio una revolución clave. A la gente se le cayó la venda de los ojos y todos dijeron …..era el ADN!!!!!

La revolución y el furor fue tal que en solo un año, en el 53, con una carrera desenfrenada para delucidar el DNA….aparece la estructura de la doble hélice de Watson-Crick. De repente, todo el mundo estudiaba el DNA!!!!!

Qué se tiene hasta ahora….

En bacterias y virus hay ADN….

Pero en los cromosomas de la famosa herencia se sabe que hay todavía proteínas…..

Entonces?!? - REACCION DE FEULGEN (tinción específica de DNA allí donde se encuentra). En las eucariotas se tiñen los núcleos así que sabemos ya que definitivamente el material genético lo tienen.

Pero también sabemos que el ADN absorbe en la cromatina de los núcleos para una longitud específica. También sabemos que usando endonucleasas de restricción también se nos cortan los cromosomas….con lo cual la evidencia es clara. Las proteínas eran las accesorias.

Lo que no se sabía todavía era que el RNA también podía llevar información genética….

Hay organismos que usan RNA como material hereditario. Esos son exclusivamente virus. Eso se vió en esos virus específicos. El virus del mosaico del tabaco tenía RNA + proteínas. Eso se ve recién en el 55 (Fraenkel Conrat / Williams). Se usaban proteasas para degradar las proteínas de la cubierta helicoidal.

Tomando unas proteínas de otra unidad viral y mezclandolas, el virus se reconstruía. Pero cuando se infectaba la planta, la infección respondía al fenotipo del virus del que se había usado el RNA. O sea que las proteínas tampoco

En el 56, se vió que unicamente con el RNA aislado del virus….se podían reproducir las lesiones y las infecciones….Luego se hacían aislados de la infección y salían virus completos, aún con cubiertas. O sea que todo lo que tenía la información completa para la replicación de virus…estaba en el ARN.

Eso se extrapoló luego a virus de DNA…..estaba hecho…… Los ACIDOS NUCLEICOS ERAN LA CLAVE DE LA HERENCIA

Priones

El problema de esto…es que trabajamos 50 años pensando en que el ADN era lo que podía replicarse…..y al final no era así….jaja

Los priones son proteínas que son capaces de infectar y replicarse….

El kuru de los caníbales de Papua. La enfermedad de Creutzfeld-Jacobs. El insomnio familiar letal.

Priones infecciosos - los que se meten en el cuerpo y actúan como chaperoninas modificando otras proteínas del cuerpo para que actúen como ellos…

Priones genéticos - los que afectan al genoma y hace que produzca priones infecivos

Priones esporádicos - mutaciones somáticas o cirugías anómalas

Hoy en día sin embargo ya no se cree que estas proteínas puedan considerarse material genético deberían ser capaces de no solo producir infecciones, sino de expresar, mantener y transmitir la información biológica que llevan.

Ningún organismo del planeta funciona solo con proteínas. Todos los seres vivos que cumplen con las características de ser vivo tienen alguna forma de Acido Nucleico.

O sea que ésta polémica es una polémica falsa. Ni los priones ni las proteínas son elementos hereditarios.

TEMA 6 - PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

• Ácidos: sustancias cargadas negativamente

• Nucleicos: Se aislaron del núcleo

Son un azúcar de 5 carbonos que puede tener un hidroxilo o un hidrógeno en el carbono 2. Es una ribosa o una 2'-desoxirribosa. Eso no es poco ya que hará la diferencia entre el DNA y el RNA!

Las bases púricas son la Adenina y la Guanina, forman parte de las purinas. El grupo amino está en el 2 en la guanina y en el 6 en la adenina. En la guanina hay un ceto en el 6. Esa es la única diferencia.

Las bases pirimidínicas son la Citosina, la Timina y el Uracilo. La diferencia entre la timina y el uracilo es que la timina tiene un grupo metilo en el 5. La Citosina tiene un amino en vez de un metilo.

La unión de una ribosa o una desoxirribosa con una base púrica o pirimidínica darán lugares a nucleósidos. La base nitrogenada se une al carbono 1' de la ribosa o la desoxiribosa por un enlace mediante su Nitrógeno estructural. Los posibles son la adenosina, la guanosina, la citidina y la timidina o la uridina y sus versiones desoxi.

La unión de un nucleósido con un ácido fosfatídico dará lugar a un nucleótido. Los posibles son el ácido adenílico (AMP), el ácido guanidílico, el ácido timidílico, el ácido citidílico y el uridílico, y sus versiones desoxi….

LA ESTRUCTURA DEL DNA

Fue un hito en la historia de la humanidad. Fue un pistoletazo de salida. En Cambridge utilizaron datos que habían dejado a la vista personas como Franklin y Wilkins o Pauling o Chargaff. También utilizaron interpretaciones de experimentos de difracción con rayos X, etc.

Recibieron el premio nobel en 1962. Ellos fueron James Watson, Francis Crick y Wilkins.

Franklin falleció prematuramente por culpa de un cáncer y si no hubiera muerto, hubiera recibido también el premio nobel por sus experimentos con rayos X.

Chargaff… la regla de Chargaff. Hay igual cantidad de bases A y bases T. Hay igual cantidad de bases C y G. Con lo cual, desde un punto de vista de químico analítico consideró que las bases debían estar relacionadas entre sí. O sea que los moles de pirimidinas eran iguales a los moles de purinas. Pero nadie interpretó eso hasta que llegaron Watson y Crick.

Watson y Crick lanzan en una publicación tan directa como el Nature, un artículo tan cortito como MOLECULAR STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS, un artículo de una página que les bastó para proponer su teoría…

Hay dos ejes. Los azúcares están separados por fosfatos. Siempre están unidos entre el fosfato 5' y el hidroxilo 3'. Esos enlaces son covalentes y bastante fuertes, con lo cual los esqueletos azucarados fosfatados son bastante sólidos. Las bases nitrogenadas quedan todas lanzadas hacia fuera del eje. El último nucleótido por un lado tendrá un extremo hidroxilo. El último nucleótido por el otro lado tendrá su extremo fosfato libre.

Lo que dicen Watson y Crick es que los dos ejes son antiparalelos, o sea que uno discurre en el sentido inverso del otro. Las bases nitrogenadas se enfrentan de manera que se forman enlaces débiles entre ellas que mantienen la estructura del DNA en conjunto. Con lo cual por cada extremo de esta macromolécula tendremos un extremo libre fosfato y un extremo libre hidroxilo.

Entre las bases se establecen puentes de hidrógeno. Esto lo pueden hacer fundamentalmente gracias a que son cadenas antiparalelas. Si las cadenas no fueran antiparalelas, los enlaces puente hidrógeno no se hubieran dado. Esos enlaces puente hidrógeno son fácilmente rompibles y reconstruibles. Por ejemplo con el calor. Watson y Crick vieron un experimento en el que una solución viscosa de DNA, cuando era calentada, su viscosidad disminuía muchísimo. Eso interpretaron que solo se podía dar si había muchísimos puentes hidrógeno.

A partir de los datos de difracción de rayos X, determinaron que la estructura macromolecular del DNA debía ser una doble hélice formada por el enrollamiento de las dos cadenas.

La doble hélice dejaba dos acanalamientos, uno mayor y uno menor. Ese lugar era esencial para el acoplamiento de proteínas que se irán enroscando en los canales. Esas serán proteínas reguladoras.

El canal menor tiene muy poco espacio para que las cosas quepan. El canal mayor dejaba mucho más espacio.

Pero además Watson y Crick dejaron propuesto el motivo biologico de la información contenida en la molécula. Proponen que hay un código genético que está encerrado en la secuencia de nucleótidos. Esa secuencia es la que constituirá los genes que luego serán transmitidos a la herencia.

Además, aún hay más. Dicen que la transmisión debe darse de forma que cada una de las hebras funcione como molde para las nuevas hebras.

Esa doble hélice se abriría y cada hebra sería el molde para cada hebra nueva. En cada replicación entonces, dos hebras se mantenían y dos eran sintetizadas de novo.

Pero ese era el modelo de un tipo de DNA que luego se bautizó como tipo B.

Pero con el tiempo se fueron descubriendo nuevas estructuras posibles. Estaba la A, que era igual que la B pero más rechonchit. Y luego también se descubrió la Z que giraba para el otro lado.

Siempre era DNA…o sea que lo que cambiaba era otra cosa para que la conformación cambiara…

Lo importante eran las condiciones fisicoquímicas del ambiente y la cantidad de purinas y pirimidinas que había en la secuencia. Determinadas secuencias en condiciones determinadas podían ponerse en las conformaciones determinadas.

En la A, la major groove era mucho más grande, dando lugar a entrada de proteínas más grandes. Pero la minor groove era mas pequeña haciendo que fuera casi imposible la entrada de proteínas.

En la Z solo había un surco.

CARACTERISTICAS DEL ADN-B

1 micra

1 picogramo

Genoma humano - 2,8 picogramos

Las configuraciones C, D y E son solo in Vitro. La D y la E se consigue sin guanina.

La mayor parte del DNA in vivo está en conformación B, aunque parte está en configuración Z o A.

Pero el ADN en los seres vivos siempre están equilibrados por asociación con proteínas. Al ser un ácido muy activo, necesita una cierta estabilización química dado que es poco estable.

Las estructuras son de orden superior, en las que el ADN se enrolla con proteínas formando dominios de superenrollamiento (supercoiling). Así se alcanzan estructuras terciarias y cuaternarias del ADN. Por eso el ADN no es plano solamente, sino que forma unos grumitos.

FORMAS DE ESTUDIO DEL ADN

ESTUDIOS DE CENTRIFUGACION: establecer gradientes de sedimentación que permiten separar las moléculas de ácidos nucleicos. Esos gradientes suelen ser de sucrosa o de cloruro de cesio.

La sucrosa discrimina moléculas de DNA por su tamaño. El cloruro de cesio discrimina moléculas por su densidad.

El tamaño aporta poca información sobre la secuencia. Además hay técnicas más directas y precisas como la electroforesis para saber el tamaño. Pero la densidad parece que aporte poco. Pero es una medida indirecta del contenido en parejas CG. Esos pares CG son más densos y ocupan menos volumen que los pares AT. Por lo tanto, una molécula rica en CG es distinta que una molécula de AT. Es más densa.

Entonces podemos discriminar por orden de qué molécula tendrá más contenido en CG.

Por qué es útil la proporción At-CG??? Porque es especie específica (si no individualmente específica)

Un polímero sintético de A-T tendrá un porcentaje de CG nulo y una densidad de 1,679.

El neumococo tiene un 42 porciento de CG y una densidad de 1,7.

La Eschericcia tiene 1,71 de densidad y 51 porciento de CG.

Así cada especie tiene una densidad diferente.

Puedo de ésta manera distinguir y saber de qué especie es mi DNA…

El cloruro de Cesio crea una especie de gel. En función de la fuerza centrífuga, las más densas quedan abajo en el eppendorf. El ADN entonces se distribuye en una zona concreta de toda la columna. El ADN de dos especies distintas tendrá distinto.

Con suficiente poder de resolución podríamos incluso distringuir DNA de individuos diferentes.

En el eppendorf se ve realmente una banda principal y algunas bandas satélites. Se llaman así porque se apartan de la principal. Esos satélites nos están diciendo que unas fracciones del DNA tienen una cantidad de bases CG ligeramente diferentes. Esas bandas satélites suelen ser resultantes de los cachitos rotos de cromosomas que se producen por la manipulación del laboratorio. Esos microsatélites de DNA tienen tamaños pequeños y que tienen densidades diferentes. Entonces no debemos fijarnos en esos satélites sino en la banda principal.

ESTUDIOS POR DESNATURALIZACION: la energía del calor rompe los puentes de hidrógeno. El ADN purificado y en solución tiene un pico de absorción característico a 260 nm. Pero esa absorción varía según el contenido en GC de la molécula y según la temperatura.

Según aumenta la temperatura, la absorción aumenta también. Eso ocurre dado que se están separando las dos hebras de DNA. Lo que era una molécula doble unida entre sí por puentes de hidrógeno, se está separando en dos hélices. Es por eso que la absorción cambiará. También cambiará la viscosidad dado que el volumen también cambia.

La Tm (Melting Point) es la temperatura en la que la mitad de la molécula está desnaturalizada.

Pero claro, un par CG tiene tres puentes de hidrógeno y un par AT tiene 2. Por ello cuando hay más contenido en CG se necesita más temperatura para alcanzar la Tm.

Esta propiedad del DNA de desnaturalización y renaturalización cuando se vuelve a las condiciones anteriores nos permite hacer muchos experimentos diferentes e incluso usar estos procesos en otras recetas.

Pero no solo el calor rompe los puentes hidrógeno. Ciertos agentes químicos también lo logran.

Pero qué ocurre en la naturaleza?

El DNA se abre para transcribirse, para expresarse, para regularse y para replicarse. O sea que la desnaturalización es una propiedad esencial de la molécula para que cumpla sus funciones. En el laboratorio eso se consigue con calor. Las células lo consiguen con unas proteínas, con sales, etc.

Estrategias derivadas para Hibridación in situ, Southern y Northern blotting….

Una estrategia clave en el estudio de DNA es desnaturalizar el DNA y una vez desnaturalizado, rastrear secuencias mediante sondas de DNA (DNA probes) que llevan un marcador de cualquier tipo. Esas sondas se hibridan en una región complementaria y allí donde la encuentre se acoplará y como lleva un marcado nos permitirá localizar esa secuencia complementaria. La capacidad de reconocimiento de las bases de secuencias complementarias es enorme. Hasta el punto de que una secuencia de hasta 20 pares de base nunca se equivoca en condiciones naturales. Y si está marcada nos permite rastrear en un blot si está o no está.

CURVAS CoT:

Son curvas de Concentración por Tiempo.

Al comienzo tenemos todo el DNA perfectamente desnaturalizado. Nos miden el tiempo que tarda en renaturalizarse una concentración de moléculas de DNA completamente desnaturalizada. Si es muy rica en AT, tiene que hacer muy pocos puentes para la renaturalización. Por ello tardará más tiempo una molécula más rica en CG.

Se establecen entonces curvas mediante el logaritmo de la concentración inicial multiplicado por el tiempo que tarda en renaturalizarse. Se construyen las curvas CoT y luego se comparan las secuenias.

Lo primero que se renaturaliza son las secuencias repetidas. Por ello nos permite saber cuantas secuencias muy repetidas, cuantas secuencias algo repetidas y cuantas secuencias de copia única puede haber. Como eso está tabulado y es una característica específica de filo o de grupo, podemos llegar a identificar el organismo a través de secuencias de DNA.

El CoT medio es el Cot que es necesario para la renaturalización de la mitad de todas las secuencias. Cuanto mayor es el tamaño del genoma, el Cot medio es mas grande.

El Cot se mide en Moles . Segundo / Litro.

La cantidad de escalones de la CoT nos podrá decir cuantas clasificaciones diferentes de secuencias podemos hacer sobre el total de secuencias del genoma de una especie.

EL RNA

El azúcar estructural es la ribosa que tiene un oxígeno clave.

Es una molécula sencilla, no es una doble hélice.

Sin embargo sí suele presentar puentes hidrógeno. Presenta autoapareamiento y normalmente también forma estructuras dobles y hasta triples. Pero eso lo consigue mediante enlaces intramoleculares.

En los procariontes todos los tipos de RNA son sintetizados por la RNApol. En los eucariontes tenemos RNA pol II que sintetiza mensajeros, la RNA pol III del transferente y la RNA pol I del ribosómico.

Hay muchísimo más RNA que DNA siempre. Además está tanto en el núcleo como en el citoplasma y siempre en mayor cantidad.

Del total del RNA hay dos tipos:

El RNA codificante que es el que da lugar al premRNA. Ese representa el 4% únicamente del total de RNA de la célula. Ese pre mRNA nuclear madura al pasar el citoplasma. El RNA heterogéneo nuclear (hnRNA) está en parte constituido por ese pre mRNA.

En la maduración se añade la cola de poliA y el cap de 7 metil Guanosina.

Finalmente se da el proceso de Splicing mediante el complejo del Spliceosome. Se retiran los intrones y solamente los exones unidos darán lugar al mRNA maduro que se traducirá.

El rRNA no codificante que da lugar al pre rRNA, el pre tRNA y muchos otros tipos.

El rRNA constituirá partes importantes en los ribosomas.

El tRNA será el que permita la transferencia de aminoácidos correctos al ribosoma.

El snRNA (está solo en eucariotas) es una familia enorme y heterogénea de DNAs pequeños que están en el núcleo. Algunos son mRNAs mensajeros inmaduros de los pequeños. El resto son microRNA que se cree que participan fundamentalmente en regulación. Dentro de ellos encontramos el iRNA que es el RNA silenciador o de interferencia.

El snoRNA es el small nucleolar RNA que controla la síntesis de rRNA en el nucleolo. Esos pequeños RNAs son altamente desconocidos.

Los scRNA son los small cytoplasmic RNA. Son microRNAs que no son mensajeros que son fundamentalmente catalíticos y reguladores.

Finalmente tenemos un grupo de RNAs exclusivos de bacterias que ni siquiera sabemos para qué valen.

Evidentemente las visiones del dogma central de la biología molecular eran algo reduccionistas y deberían ser abandonadas, como mucho manteniéndolas de forma operativa.

Pero aún así, visiones algo más actualizadas como la siguiente, tampoco parecen ser hoy la forma más completa de pintar la situación:

DNA - mRNA

DNA - tRNA

DNA - rRNA

rRNA + mRNA + tRNA = proteínas

TRANSFERENTE RNA (tRNA)

El aminoácido se une al extremo libre 3'. El tRNA es conocido por la transferasa en su anticodón que va en el brazo del anticodón. Además es reconocido por su brazo D y su brazo TC.

RIBOSOMAL (rRNA)

Los ribosomas son unas ribonucleoproteínas. Están las proteínas unidas a rRNA. Hay dos subunidades en animales que están formados por unas 21 proteínas en total y 3 rRNA diferentes. En los procariontes, el 28S tiene muchísimos nucleótidos y proteínas.

El rRNA 16S por ejemplo se autoaparea formando una estructura espacial complejísima.

De su funcionamiento sabemos muy muy poco. Sabemos que hay secuencias de reconocimiento para los mRNA, pero también se ven que tienen otras funciones.

En las células son genes que están muy copiados. Eso es un índice de su importancia. Los transferentes es igual…

El RNA CATALITICO

Ciertos RNA tienen función catalítica. Se descubrió en un protozoo como Tetrahymena. Se vió que el RNA tiene funciones como si fueran una enzima. A veces por sí solos a veces formando parte esencial de ribonucleoproteínas. Es un mundo bastante nuevo por descubrir aunque hay muchos casos ya descubiertos. Se sabe poco en general sobre mecanismos. La Ribonucleasa P se ocupa de la maduración de los RNA de transferencia en el extremo 5'. Da un corte (es una nucleasa) en el extremo y lo deja preparado para ser funcional. Lo interesante es que quién tiene la propiedad funcional verdadera es el RNA.

FUNCIONES REGULATORIAS

Cada vez se ven más RNAs reguladores de las funciones génicas y el desarrollo. Los iRNA forman parte de todo ese conjunto de RNA nucleolar o heterogéneo nuclear. Hace que ciertos mRNA se traben y así controlan expresión. Controlan además ciertos procesos como la heterocromatinización y la inactivación del cromosoma X. También la metilación, etc.

FUNCIONES ESTRUCTURALES

Ocupa un volumen enorme en la célula. Sus funciones no son únicamente expresar, regular o catalizar. También tienen funciones estructurales en muchos casos. O sea que forma parte de la arquitectura nuclear y la arquitectura citoplasmática. Parece que forman estructuras clave.

EN LOS ULTIMOS AÑOS CADA VEZ SE ESTA BARAJANDO MAS LA POSIBILIDAD DE QUE LAS MOLECULAS CLAVE EN LA VIDA SEAN LOS RNA Y NO EL DNA. PARECE SER QUE MAS QUE NADA, EL DNA ES UN MECANISMO PARA ALMACENAR Y REPLICAR DE FORMA ESTABLE LOS RNAs…pero nada más. Y PARA TRANSMITIRLA A LA DESCENDENCIA.

EL RNA ES EL QUE VERDADERAMENTE LLEVA LA BATUTA, ETC…..

TEMA 7: CROMOSOMAS y EVOLUCION

El cromosoma no es algo específico de los eucariontes. El cromosoma es el total de la información genética contenida en una molécula de DNA asociada a proteínas. Los procariontes y los virus también tienen cromosomas.

El hombre tiene unos 3 mil millones de pares de bases. El tamaño del genoma, el número de cromosomas y la forma son conceptos que parecerían tener relacion, pero no la tienen con total seguridad. Realmente hay estrategias para la formación de cromosomas y que dependen del filo dentro de todos los seres vivos. Tenemos por lo tanto, cromosomas bacterianos, animales, vegetales, y los más heterogéneos que son los víricos.

Los organismos más “sencillos”, en tanto y en cuanto hablamos de unicelulares, tienen muchísimo menos tamaño cromosómico. Pero luego hay muchas excepciones. La Arabidopsis se apaña con 100.000 kb y el Caenorhabdites también. El humano tiene algo más y el maíz tiene un 50% más.

No hay por lo tanto una linealidad entre la evolución y la cantidad de kb. El genoma humano haploide (gameto) tiene 23 cromosomas. Eso son unas 3000000000 pb. Eso es algo así como un metro de DNA.

El cromosoma humano tiene 1 molécula de DNA con 82 mm. En metafase tiene 10 micrómetros.

Un gen típico de mamífero

Es difícil relacionar la cantidad de genes que tenemos con respecto a la cantidad de cromosomas o el número de pares de bases que tenemos.

En el humano sin embargo se estiman unos 30000 genes. Cada vez es un número que se rebaja más.

Se tiende fundamentalmente a localizar promotores y ORFs para ver si podemos estimar el número de genes. Pero muchos genes no tienen promotores y muchos otros tienen varios promotores para sólo ellos. Eso es porque se consiguen en distintos momentos del desarrollo o en distintos tejidos proteínas diferentes a partir del mismo gen. Entonces es difícil determinar a ojo el número de genes de un organismo. Sobre todo y esencialmente porque no sabemos todavía bien lo que es un gen.

Lo que sí se puede determinar es la cantidad mínima de genes que necesita un organismo para vivir. Se vió que en un micoplasma autónomo podía vivir con 350 genes y poco más. Se consideraba el organismo más básico. Se creo un organismo nuevo, completamente artificial con doscientos y pico genes a partir de un corta y pega por ingeniería genética. Aparentemente con poco más de 200 genes un organismo podría vivir autónomamente con algunas fuentes nutrientes.

GENOMAS VIRALES

Son organismos extremadamente sofisticados en el sentido que han encontrado una manera de transmitir información con la mínima expresión posible. Es algo muy preciso y delicado.

Se clasifican de muchas maneras, tan variable como la opinión de la gente. Están los filamentosos y los icosaédricos en general. Además luego dependiendo de qué tipo de ácido nucleico mete en la célula tendremos de DNA y de RNA. Luego sus cromosomas pueden ser lineales o circulares y de cadena sencilla o doble!! Luego también se clasifican según infecten bacterias, animales y vegetales. A su vez, esta clasificación se puede hacer más o menos detalladamente.

Además hay muy poco consenso al tratar de establecer filogenias evolutivas de genomas virales.

Están caracterizados porque pasan mucho tiempo sin metabolismo y no tienen uno propio sinó que lo piden prestado de otro organismo. Sin embargo muchas bacterias y hongos hacen lo mismo y no pueden vivir sin un huésped…y no se les cuestiona si están vivas o no…

Lo que comparten es la sencillez, la eficacia y poco más. Los metemos en el mismo cajón porque conviene, pero realmente no se sabe nada acerca de la filogenia o su origen…

Poco también se puede decir acerca del cromosoma vírico. Hay virus filamentosos y pseudoesféricos. En los virus filamentosos, el AN está formando complejos con las proteínas. En la estructura filamentosa completa viaja la molécula. Cuando se llega al huésped la proteína desaparece fuera y el DNA se mete dentro como un tornillo en muchos casos.

En los pseudoesféricos, en muchos casos nos presentamos frente a una cápsida hueca donde dentro va el DNA y que puede tener cola o no, retráctilo o no, etc. Esa estructura es rígida y dentro va el AN. Es el caso típico de los fagos. En los pseudoesféricos, la mayor parte de las veces, el AN va unido a proteínas que lo estabilizan y lo mantienen. Nunca hay que imaginar AN desnudo.

Las proteínas VPg son proteínas de bajo peso molecular que son características de estos cromosomas víricos en los pseudoesféricos. Estabilizan el DNA. También es muy difícil saber lo que sucede dentro de una cápsida una vez se ensambla. Con la tecnología actual es difícil llegar más allá.

En el SV40, además tenemos un cromosoma pseudonucleosomal. Tiene un enorme parecido con el nucleosoma. Es raro pero es un modelo estupendo dado que permitió aprender mucho sobre el nucleosoma en un modelo vírico.

VIROIDES Y VIRUSOIDES

Los viroides son unos organismos algo más sencillos y menos elaborados que los virus. Y por ello más perfectos. Estas son verdaderas moléculas sueltas de RNA circular o semicircular de unos 400 nt que aparecen generalmente en plantas. Aparentemente no llevan cápsida y actúan como un virus aprovechando la maquinaria de la célula vegetal para expresarse y replicarse.

Los virusoides son considerados RNA satélite que aparecen también en plantas. Dentro de virus vegetales se ven unas moléculas de RNA lineal que consiguen lo mismo. Son algo así como los plásmidos de los virus. Digamos que pueden estar o no, pero no son esenciales para los virus (dispensables).

Cuando aparecen, funcionan un tanto por su cuenta y se encapsidan junto con el otro virus.

GENOMAS BACTERIANOS

Las bacterias son procariontes. Tienen un nucleoide, es decir, no tienen un núcleo aislado por una membrana en un orgánulo. El nucleoide puede ocupar hasta el 80 % de la bacteria. Eso no quiere decir que el nucleoide sea simplemente DNA desnudo flotando en el citoplasma. Es un material bastante comprimido y en casos asociado a la membrana y la envoltura bacteriana para que lo proteja.

Tiene complejos superenrrollados para compactarse. Es como una fibra que se autoretuerce sobre ella misma infinidad de veces.

Hay algo así como un centro denso del cual se emiten los dominios y los superdominios bacterianos. Son dominios tanto estructurales como funcionales. Tienen entidad propia en ambos papeles. En cada dominio podemos encontrar operones (es decir genes coordinados y de expresión común) para ciertas funciones en esos dominios. Los dominios superenrollados pueden tener desde media kilobase hasta varios cientos. La media está en 10 kb.

Los dominios están formados por la molécula que va haciendo búcles que están asegurados con unas proteínas. Cada bucle tiene la molécula de DNA que va enrollada en unas proteínas.

Se han aislado ya algunas responsables de este superenrrollamiento.

La SMC, la HV, la H1 (H-NS), la P y la MukB. Son proteínas con funciones similares a las de las histonas en los eucariontes. El DNA sin ellas sería muy inestable y frágil.

El cromosoma suele ser circular en las bacterias. Sin embargo, muchas otras tienen cromosomas lineales. Los circulares en eucariontes son muy muy raros. Todo lo contrario en bacterias, pero también hay cromosomas lineales.

Además muchas bacterias tienen policromosomas es decir muchas copias de un mismo cromosoma. Además luego hay muchas que tienen muchos cromosomas diferentes. Y luego hay algunas que tienen fragmentos extracromosómicos: moléculas adicionales de DNA como los plásmidos. Estos a su vez pueden ser circulares (generalmente) o raramente lineales. Tienen también proteínas estabilizadoras. Son dispensables. Presentan funciones adicionales como las resistencias a antibiótico.

Los genes del plásmido pueden incluirse y recombinarse en el cromosoma bacteriano y quedarse ahí (HFVs…). Con la evolución ciertos genes pasan al genoma basal y entonces las bacterias lo incorporan.

Pero las bacterias suelen tener problemas equilibrando la cantidad de genes y el tamaño cromosómico que pueden soportar. Así suelen eliminar genes inútiles y especializarse por ambientes. Es por eso que tenemos más que nada estirpes más que especies bacterianas.

TEMA 8: EL MATERIAL GENETICO EN ORGANISMOS SUPERIORES: CROMOSOMAS EUCARIOTAS

El material hereditario no es solo ADN. Se transmite también algo de RNA y algunas otras señales epigenéticas. Nos quedamos con que el material fundamental es el ADN. Está en el núcleo en forma de cromosomas. Cada cromosoma es una molécula de DNA.

Hay DNA también en el citoplasma. Ahí hay ADN y RNA en las mitocondrias y en muchos eucariontes hay además ADN en los plastos (no solo cloroplastos). Se cree que también hay ADN en el centrosoma (los centríolos - los orgánulos formados por parejas de microtúbulos y que organizan polarmente la célula). En la división se replica y cada uno va a un polo. Ahí formarán las fibras del uso. Se sabe lo que hay ultraestructuralmente y sabemos el proceso. Pero se cree que hay ADN o ARN en el centríolo que coordina el proceso de replicación.

En éste tema nos ocuparemos del DNA con el núcleo como cromosomas únicamente.

El ADN en otros organismos nunca está desnudo. En los eucariotas tampoco. Es una molécula dinámica, está constantemente leyéndose y transcribiéndose, además de replicándose o compactándose. Eso implica interacciones con muchas proteínas. Esas interacciones obviamente suelen darse a nivel de los surcos mayor y menor del DNA, pero no solo. También hay proteínas que permiten formar superestructuras con las hebras. Las vimos en el nucleoide de las bacterias. Ahí había una compactación bastante interesante. Pero eso no es nada comparado con lo que sucede en los eucariontes.

Una molécula de ADN-B tiene 20 angstroms de diámetro. Cuando el ADN se arrolla formando nucleosomas, crea un hilo de nucleosomas. El ADN se enrolla en los núcleos de histonas y se organiza con otras proteínas en una superestructura primaria. Se obtiene así una fibra de 11 nm de diámetro. Esa fibra luego forma un solenoide que es una fibra 40 veces más compacta que la original. Eso lo logra mediante un retorcimiento secundario. En una superestructura más avanzada se forma el SCAFFOLD de solenoide. El solenoide tenía 30 nm de diámetro. Ahora el scaffold tiene unos bucles doblados y forma una fibra de media micra. Esos bucles se organizan formando una hélice de bucles radiales. Eso dá una fibra de una micra que es más o menos lo que podemos estimar que tiene un brazo de cromatida metafásica.

Cuando los genes no se expresan, el DNA está compactado. Si el DNA está laxo, generalmente se expresa. La cromatina (cuerpos coloreados) es todo el DNA dentro del núcleo, pero no solo. Es toda la materia que se tiñe con colorantes específicos. La cromatina tiene DNA, proteínas y ARN, básicamente lo que hay en el núcleo. Por cada molécula de DNA hay una proporción de histonas equivalente más una proporción de proteínas no histónicas de ½. Las histonas permiten la compactación del DNA y la estabilización. Las no histónicas hacen muchas cosas, además de que la proporción puede aumentar hasta 1,5. Eso es así de variable porque el núcleo cambia dependiendo del momento en el ciclo celular. Las no histónicas suelen ser proteínas reguladoras del núcleo. Un núcleo activo tiene más proteínas que uno menos activo. El ARN aparece en proporciones muy muy variables. Además parte de él es hnRNA (RNA muy inmaduro) pero también hay otras cosas, rRNA, snRNA, etc. También están los ARN reguladores, los RNA estructurales (asociados a las láminas nucleares). O sea que hay muchas cosas muy complicadas en el núcleo. Es difícil asignar ese RNA a las funciones. Además de que el hnRNA puede aislarse pero luego no se puede saber qué función desempeñan. No se pueden retirar de uno en uno hasta ver que hacen o qué no hacen…..pero para saber más de ellos….falta tiempo.

La mayor parte del ciclo celular, una célula está en interfase. Los cromosomas están individualizados en el núcleo, pero no se descomponen en más de una molécula. El tema es que están tan descondensados que no podemos saber su localización exacta. Se supone que las moléculas están esparcidas por ahí, no en cachos, pero descondensadas!

En la etapa S, de síntesis, la cantidad de DNA se duplica, pero ahora tenemos más cromosomas pero tampoco podemos verlos como siempre los pintamos. Solo se ven así con sus brazitos y sus cromátidas cuando estamos en metafase o anafase.

Los cromosomas en división están tan compactados que la cantidad de RNA en ellos es muy baja. Son sobre todo histonas y DNA muy compactado e inactivo. Es por eso que es una manera errónea de pintar un cromosoma.

Es decir que el cromosoma pasa por muchas conformaciones, configuraciones y densidades a través del ciclo celular. Además de que el ciclo es diferente en una célula de la línea germinal, o en una célula hepática o en una célula de un hongo, o en una célula de una planta. Es todo muy diverso. Los cromosomas son bastante heterogéneos aún en eucariotas.

En la interfase entonces tenemos un núcleo con una arquitectura difícil de analizar. Eso es porque los cromosomas están activos, los genes expresandose en parte, ciertas partes están más condensadas que otras, etc.

En condiciones normales, en regiones del núcleo muy descondensadas tenemos la fibra con histonas compactada en la fibra de 30 nm. Aún así ese es el estado más descondensado que encontraremos en células que estén en condiciones fisiológicas. Lo normal es tener la fibra de bucles de media micra.

Sabemos como se compacta el DNA eucariota. Hay unas histonas, la H2A, la H2B, la H3 y la H4 que forman un tetrámero. Dos tetrámeros forman un barrilcito octamérico alrededor de los cuales se asocia la doble hélice. Son ricas en aminoácidos básicos. Tienen una afinidad extraordinaria con el DNA que tiene muchas cargas eléctricas. Las histonas interaccionan de una manera tan natural que con poner un poco en una muestra de DNA aislado, se forman fibras de 10 nm automáticamente. El DNA da dos vueltas aproximadamente alrededor de cada uno de los octámeros. En cada octámero caben entre 150 (hongos) y 260 nucleótidos (erizos de mar). La unión del octámero más ADN se denomina nucleosoma.

La fibra va desde nucleosoma a nucleosoma. Entre uno y otro, el DNA está aparentemente desprotegido. La histona H1 se ocupa de proteger ese DNA internucleosómico estabilizandolo y además rotando la fibra para permitir la interacción entre H1s y otras proteínas no histónicas construyendo así el solenoide de 30 nm.

Esas histonas están en todos los eucariontes. Es una evidencia clara de que los eucariotas somos polifiléticos. Solo triunfo la forma de vida eucariota actual, evidentemente. Compartimos la química del carbono, la química de los AN y estructuras tan básicas como las fibras de DNA+histonas. Son genes entonces muy conservados. Además aparecen copiados muchas veces. Lo que está altamente repetido siempre es más importante que lo que está menos repetido. Hay genes tan importantes entre ellos como las histonas. Sin histonas no hay cromosomas. Si no hay histonas entonces no hay replicación efectiva y el individuo no puede vivir, desde el cigoto. Esos genes son un seguro de vida entonces. El hecho de que estén copiados nos da una rueda de auxilio. Los genes se pueden permitir llevar 4 o 5 o 20 ruedas de repuesto para asegurarse que vamos a tener suficientes histonas.

Las histonas son muy susceptibles de modificarse. Se modifican sobre todo por metilación, acetilación, fosforilación y ubiquitinización. Pero también por demetilación, deacetilación, defosforilación y deubiquitinización. La ubiquitina es una proteína muy abundante en la cromatina. Está en todos lados en las células. Se incorpora y se desincorpora en otras proteínas con mucha frecuencia. Es “ubicua” de ahí el nombre. Mediante esas modificaciones de las histonas se pueden modificar los niveles de compactación nuclear. En función de esas modifiaciones tendré más o menos expresión debido a la mayor o menor compactación del DNA en esas regiones. Es por eso que las histonas son muy especiales para las células.

Esas metilaciones, acetilaciones, etc. son llamadas cambios epigenéticos. La epigenética es todo lo que acompaña por fuera a la genética. Son todos los cambios que influyen en la expresión y replicación y la herencia del DNA indirectamente. Modificando a la histona conseguimos cambios epigenéticos que tienen una importancia extraordinaria en la genética. Algunos rasgos epigenéticos se improntan (imprinting), es decir se heredan. Entonces un gen no solo puede estropearse en su secuencia sino que también puede modificarse epigenéticamente.

Cuando se empezó a usar el microscopio de fuerza atómica hace unos 10 años, se empezaron a ver cosas como colas de aminoácidos en las histonas. En esos aminoácidos aparecían las metilaciones, etc.

A partir de eso se ha empezado a trabajar en algo así como un código de señales histónicas que servirían a la maquinaria de expresión genética. Se está descubriendo que esas colas son como banderitas de señales. Se cree que podría haber un código superpuesto al código genético. Ese código sería de secuencias de modificaciones químicas en las histonas. Pero como las histonas se replican y se pasan a las generaciones….se piensa que sería posible.

La topoisomerasa I es la proteína que introduce o libera superdominios de torsión en la cromatina haciendo que la cromatina esté más o menos compactada. Esa topoisomerasa es una proteína que aparece únicamente en el nivel de superenrrollamiento de Scaffold. Es una llamada Scaffold Protein. También están la SCA, SCB, SC… todas Scaffold Proteins. Permiten formar un andamio para la sujeción de los loops de las fibras de 30nm.

También hay dentro del núcleo RNA pol y DNA pol. También están las HMG proteins - High Mobility Group proteins. Tienen bajo peso molecular y una mobilidad electroforética alta. Forman parte estructural del núcleo pero se sabe poco. Se sabe que hay proteínas de centrómeros y de telómeros de los cromosomas. Luego están las regiones SAR (Scaffold Attachment R) y las MAR (Matriz Attachment R) que son lugares donde se engancha la cromatina. La cromatina se engancha al Scaffold con ayuda de esas proteínas del escaffold y por unas regiones que son las SAR. A la matriz también la cromatina se agarra por unas zonas específicas que son las MAR a los microtúbulos de la matriz para la división. También lo hacen mediante unas proteínas.

Un caso especial es el SV40 que tiene nucleosomas en su cápsida. Roba las histonas del huésped dado que no las tiene codificadas en su microcromosoma.

CROMATINA: EUCROMATINA Y HETEROCROMATINA

Ambas son importantes. La eucromatina está menos condensada y se tiñe de un color más claro. La heterocromatina está mucho más condensada y se tiñe de un color oscuro. Hay heterocromatina constitutiva y facultativa. La constitutiva es la fracción de la heterocromatina que está permanentemente condensada a lo largo de todo el ciclo celular. Siempre está teñida muy oscura. La facultativa puede aparecer como heterocromatina o eucromatina dependiendo del momento en que esté en el ciclo celular.

Se dice en general que la eucromatina tiene las funciones génicas más basales y generales. También tiene por supuesto la función genética.

Mientras tanto, a la heterocromatina se les reservan funciones genéticas casi exclusivamente.

En la eucromatina están la mayoría de los genes que se expresan. En la heterocromatina hay muy pocos genes que se expresen. Sin embargo las dos se transmiten a la descendencia, es decir ambas tienen función genética. Esas secuencias altamente repetidas, espaciadoras, centro y teloméricas, etc. sirven para la genética pero no sirven para expresarse. Entonces es un auténtico disparate decir que lo único importante es la eucromatina o decir que la heterocromatina es DNA basura o sobrante.

Pero siempre ha sido más fácil descubrir y estudiar la eucromatina. LA heterocromatina es muy heterogénea, variada y con funciones, muchas de ellas, desconocidas.

La mayor parte de la cromatina es eucromatina.

Heterocromatina está fundamentalmente en regiones pericentroméricas, en regiones teloméricas y bandas intersticiales. Tienen funciones muy importantes. Muchas evidencias indican que está implicada en el reconocimiento de los cromosomas homólogos y en su apareamiento. Ningun par de cromosomas que no sean homólogos tendrán heterocromatina en las mismas regiones exactamente.

Se distribuye además con patrones especie-específicos en los mismos cromosomas y en los mismos organismos. La distribución de la cromatina nos permite entonces establecer filogenias e identificar organismos.

Hay fracciones de la heterocromatina que es especie-polimórfica y que aparece en alternadamente (on-off) o que aparece con diferentes amplitudes de banda (digamos que a veces crece una región en algún individuo). Digamos….todos los individuos de una especie no tendrán los mismos patrones de heterocromatina.

CARIOTIPO

Es el número de cromosomas, su forma y la distribución de la heterocromatina en ellos. El número más bajo es 2 que lo presentan las hormigas. El más alto es 260 que tiene un helecho. Entre medias cualquier número es posible. Es especie-específico excepto alteraciones graves o mutaciones graves que generalmente acarrean variaciones fenotípicas severas.

La distribución de la cromatina con respecto al centrómero nos determina varios tipos de cromosomas. Para pintarlos metafísicos, podemos distinguir de la siguiente forma:

• Metacéntricos (centrómero en el medio)

• Submetacénticos (centrómero algo desplazados a un extremo)

• Acrocéntricos (centrómero claramente desplazado hacia un extremo)

• telocéntricos (centrómero en la punta)

Los extremos de las puntas son llamados telómeros y todos los cromosomas tienen 2. Todas las evidencias moleculares dicen que ningún cromosoma puede terminar en centrómero. Por eso muchos geneticistas apuntan con eso a que los telocéntricos no existan conceptualmente. O sea que como mucho los telocéntricos son los que tienen prácticamente solo el telómero después del centrómero. Está mal indicar que solo tienen 1 telómero.

La distribución de la heterocromatina puede ser muy variable e indica donde está la heterocromatina pericentromérica,t elomérica y las bandas intersticiales.

La representación gráfica de un cariotipo es un ideograma. Cuando dibujamos entonces un cariotipo tenemos que poner la cantidad de cromosomas que tiene una especie, indicando su morfología correctamente y poniendo su distribución heterocromática correcta.

Cada fragmento de cromatina que está entre un telómero y un centrómero se denomina brazo. Un cromosoma replicado está formado por dos cromátidas hermanas. El estado normal es tener una sola cromátida. Cuando el cromosoma está en mitosis, en metafase suelen tener dos cromátidas hermanas y por lo tanto cuatro brazos. Las cromátidas de dos cromosomas homólogos se denominan cromátidas homólogas. Las hermanas son siempre idénticas. Las homólogas son diferentes entre sí, pero se parecen bastante. De hecho una es de papá y una es de mamá.

CENTROMERO

Es una estructura que determina la morfología del cromosoma. Es denominado también constricción primaria. Aloja en su interior el cinetocoro (“núcleo del movimiento”). El centrómero es un gen extraordinariamente importante. Está compuesto por ADN y proteínas. No tiene una funciónj génica ya que no se expresa. Simplemente tiene una función genética muy importante.

Esa función es por un lado mantener las cromátidas hermanas unidas. La última región por la que las cromátidas se separan es el centrómero. Al alojar el cinetocoro, es también esencial en la inserción de los microtúbulos del uso. El cinetocoro de cada centrómero apunta a un lado y por lo tanto las fibras del uso llevarán una hermana para cada célula hija.

Alrededor de los centrómeros hay una cromatina densa que le da la estructura necesaria. Sin heterocromatina el centrómero no funciona bien.

En organismos modelo se sabe más o menos bien lo que hay en ellos. En Saccharomyces cereviseae, tenemos 120 pb de heterocromatina y algunas proteínas. Eso está distribuido en tres regiones que llamaremos CDE I (una región de 9 pb muy conservada en todos los centrómeros de levaduras), una región central CDE II (de 80 a 90 pb muy rica en pares AT en todas las levaduras) y una región periférica CDE III (11 pb también muy conservados).

Evidentemente las regiones conservadas son las CDE I y III y algo estructural que es el tamaño enorme y la configuración de la región CDE II debido a la cantidad de bases AT. Lo que difiere entre los distintos cromosomas es la secuencia CDE II. El par 1 tiene una secuencia distinta que el par 2, que el par 3….etc.

A esta estructura se le acoplan las proteínas CENP (centromeric proteins). En Saccharomyces se las llama en concreto CBF 1, CBF 2, etc. El número que se estima ya supera las 20 proteínas diferentes que participan en el centrómero en algún momento. Hay algunas estructurales y muchas otras que solo se pegan al centrómero en el momento en que se debe establecer el cinetocoro por ejemplo, o que solo están cuando el centrómero se pega a la membrana nuclear interna.

También se sabe algo del centrómero de ratón. Y se sabe bastante, aunque menos, del centrómero de humanos. Pero como tenemos tantos cromosomas, se sabe poco en general.

Sabemos que hay unas secuencias repetidas satelitales como el satélite alfa que están en todos los centrómeros humanos. Se determinaron unas 15 proteínas específicas de centrómero en humanos.

TELOMEROS

Son muy importantes dado que son las estructuras que sellan los cromosomas por los extremos. Es importante que finalizen en unas estructuras concretas. Si se pierde el telómero el cromosoma puede tener muchos problemas: se fusiona a otro cromosoma y tenemos engendros o bien comienza a degradarse y se pierde toda su información. Así esa célula lo puede pasar muy mal. O sea que tienen una importancia estructural importante.

Además permiten el anclaje a la membrana nuclear por dentro. Los cromosomas están pegaditos a la membrana mediante el telómero. Eso es porque si estuvieran flotando las enzimas no podrían funcionar correctamente.

En los telómeros obviamente tendremos DNA y proteínas. Todos los telómeros responden a una fórmula general y sencilla que es otra evidencia de que no somos tan lejanos todos los eucariontes.

En los telómeros siempre hay un estructura en la que tenemos un número variable de citosinas que siempre es mayor que 1, seguido de un número de 1 a 4 pares AT siendo ese oligonucleótido repetido N veces.

Ese anclaje permitirá que en cada replicación celular el telómero no se vaya perdiendo. En los telómeros hay unas proteínas teloméricas que en el caso de los humanos se llaman TRFs y están también numeradas 1, 2, etc. Hay también unas proteínas TIN. Los telómeros tienen función genética, pero no estructural.

ORGANIZACIÓN DEL GENOMA EUCARIONTE

Tendremos secuencias únicas: 30-75% (en humanos el 50 y en drosophila el 70)

Secuencias altamente repetidas: las que constituirán satélites en la sedimentación de DNA (5 al 45%)

Secuencias medianamente repetidas (del 1 al 30%)

Tenemos también ADN espaciador y ADN de intrones que no se expresará.

Las secuencias repetidas podrán ser codificantes o no codificantes.

Entre las codificantes tendremos familias génicas dispersas (histonas, globulinas) y familias genéticas en tandem (rRNA, tRNA, etc.)

Dentro de las no codificantes tendremos los minisatélites, los microsatélites, la heterocromatina y otras regiones altamente repetidas.

BANDEADO CROMOSOMICO

Es la presencia de regiones en los cromosomas que se pueden diferenciar. En éste sentido diferenciaremos el bandeado natural del bandeado inducido.

En las naturales tendremos los cromosomas politénicos (“muchas bandas”) que son especiales y que aparecen en determinados organismos. Son característicos de las glándulas salivales de Drosophila pero que también aparecen en colémbolos y otros organismos.

Son cromosomas que sin ninguna alteración nos aparecen llenos de bandas y de interbandas con patrones especie-cromosoma-específicos. Además nos permiten asignar funciones génicas y genéticas a regiones con bandeados específicos. Si a lo largo del cromosoma hay genes y bandas e interbandas podemos y rastreando y asignando a cada región bandeada un cromosoma.

BANDEADOS INDUCIDOS

Los más conocidos son las bandas G que se inducen con tratamientos salinos suaves o con tratamientos proteolíticos suaves. Salen una serie de bandas e interbandas a lo largo del cromosoma que no son naturales. Hay que usar un colorante que suele ser GIEMSA. Sale un bandeado que también nos permite identificar individuos, cromosomas, especies, etc. Esas bandas G marcadas son las que son ricas en pares AT. El patrón que indican es fundamental. Hay unas de alta resolución que son las que se usan en la genética clínica de todos los hospitales. Cuando se hace una amniocentesis previa para determinar si hay aborto o no, cuando se analizan recien nacidos por si tienen anomalías, o si se precisa un consejo genético, lo primero que se hace es un bandeado G. Se analizan esas secuencias y muchas enfermedades y genes se diagnostican primero así. Se ve si están todas en su sitio. Si alguna no lo está se puede diagnosticar preventivamente los problemas.

Las bandas R son las reversas de las bandas G o sea que dan un patrón especular y así aportan muy poco. Serán más ricas en GC, se obtienen con otros colorantes pero generalmente se usan las bandas G dado que son más sencillas de obtener y más útiles y tradicionales.

Las bandas N marcan nucleolos, las T marcan telómeros, pero no han triunfado mucho.

Las bandas C nos determinan la heterocromatina de los cromosomas. Esa heterocromatina que se ve mal con una tinción normal se puede ver bien con un tratamiento con sales y calor haciéndo que destaquen mucho más en los cromosomas la heterocromatina que aparece marcada con buena resolución.

Más recientemente se usan muchísimo las bandas obtenidas por hibridación “in situ” que no es más que la utilización de la complementariedad natural de las secuencias. Se hacen marcados químicos en un nucleótido y se hace hibridación por calor y frío en el cromosoma a estudiar. Luego se mapea el cromosoma y luego se pueden ver las bandas de fluorescencia que es donde estará el gen. Si no aparece la banda correcta entonces se puede decir que el gen no está y que por tanto eso podría ocasionar tal o cual problema.

Variantes de esta hibridación es el pintado cromosómico (chromosome painting) que es el pintado entero de un cromosoma usando una batería de oligonucleótidos.

El SKY es una variante del pintado cromosómico. Es el cariotipado de espectro.

Una vez determinado como es un cromosoma, sus telómeros, sus centrómeros y sus brazos, es bastante fácil construir cromosomas artificiales. No es más que meter los fragmentos correspondientes a los brazos a los que añadimos las secuencias centroméricas y las secuencias teloméricas. Así se construyen, por ingeniería genética, cromosomas que funcionarán bien y que sevirán bien para rastrear el funcionamiento de genes, etc. Es un arma poderosísima para llegar a donde queremos en la genética clínica. Se han construido con éxito en levaduras (YAC) y se han realizado y se utilizan en bacterias (BAC) y también en humanos (HAC). En la terapia génica, los HAC son una de las grandes esperanzas. El principio es sencillo, cualquier fragmento de DNA al que le pongas los telómeros y los centrómeros correctos funcionará bien.

TEMA 9: REPLICACION DEL MATERIAL HEREDITARIO

Es uno de los temas fundamentales en el ámbito de la genética puesto que garantiza una de nuestras funciones fundamentales que es la transmisión de información genética de una generación a la siguiente. Es extraordinariamente importante.

Es un proceso muy coordinado en el ciclo celular. Admite muy pocos fallos dado que no nos podemos permitir el lujo de transmitir errores. Algo de error siempre se transmite ya que pertenece al juego de la variabilidad, pero si queremos pasar la información genética, no podemos tener errores muy serios.

Eso es además porque las divisiones se dan constantemente en nuestro cuerpo y esas replicaciones se producen en millones de veces. Si tuvieramos tasas de error de 1 por millón, en unas cuantas millones de divisiones (no es raro dado que somos seres multicelulares y provenimos de una célula sola - el zigoto) nuestro genoma sería alterado enormemente!!

Recordemos que el material antes de dividirse requiere una síntesis. Una vez que se divide debe sintetizarse para volver a dividirse. Entonces esos ciclos celulares están muy controlados. El descontrol de estos ciclos celulares se debe al fallo de vigilantes y sistemas de control (checkpoints) en el ciclo celular. Esta es la aproximación más clara que tiene por ahora el ataque de enfermedades como los carcinomas.

La replicación del ADN fue propuesta también por Watson y Crick (1953). Eso fue porque recién ahí se descubrió y se propuso la estructura del ADN. Se suponía ya le existencia del código genético.

Ellos proponían que la replicación era semiconservativa. Efectivamente acertaron, aunque surgieron alternativas que se mantuvieron hasta que el modelo de Watson y Crick fue demostrado experimentalmente. La conservativa decía que la original se mantenía y que la nueva se sintetizaba entera de novo. La hipótesis dispersiva decía que las hebras que se le pasaban a las hijas con trozos de síntesis nueva y trozos de la antigua hebra.

La primera demostración de que la replicación era semiconservativa llegó en un experimento hecho por Taylor y colaboradores con la planta de la judía. Eso fue en el 57. Miraron mitosis en plantas en germinación.

Suministraban un marcador radiactivo (Timidina tritiada) y colchicina. La Timidina iba al ácido nucleico ya que era un nucleótido y así hacían un seguimiento de los cromosomas. Se había inventado ya la autoradiografía con lo cual la tecnología estaba dispuesta para poder seguir los cromosomas radiactivos. La colchicina inhibía la formación del huso con lo cual los cromosomas no se separaban y quedaban en con sus dos cromátidas. Los cromosomas tenían tritio por todos lados. Si luego añadían un ciclo de divisiones con colchicina y sin tritio, podían ver cromosomas que tenían dos cromátidas, una con tritio y una sin tritio. Eso era clarísima evidencia de que una de las cromátida se había dado a partir de una hebra y la otra cromátida a partir de la otra hebra.

En el experimento de Messelsohn y Stahl, usando E-coli. Usan un gradiente de densidad en cloruro de cesio. Metían un precursor nitrogenado radiactivo (isótopo 15 pesado). Si se extraía el ADN del cultivo normal, en condiciones normales la banda estaba por arriba. Si se hacía con el cultivo radiactivo, la banda era más inferior (pesaba más el DNA).

Lo que hacen es hacer un cultivo con N15 y luego centrifugar y añadir el N14. Obtenían una banda intermedia a las dos posiciones. Eso daba a entender que el DNA tenía la mitad de sus nucleótidos con N15 y la mitad con N14.

Si luego metíamos N14 nuevamente y centrifugábamos se obtenía evidencia de la 2ª replicación. Aparecía una banda más superior que la de N14-15. Si luego se seguía dejando el cultivo con N14... la banda de DNA de N14 seguía creciendo mientras que la de N14-15 era siempre constante.

Estaba claro… por replicación semiconservativa, las hebras N15 se iban a “perder” con las consecuentes replicaciones con N14.

EL REPLICON

Es la unidad de replicación. Se caracteriza por tener como poco un origen de replicación.

Tienen horquillas de replicación. Una horquilla de replicación es un punto por donde las dos hebras se abren y se van sintetizando las hebras complementarias. Las hebras no se abren en su totalidad y extensión y luego se copia. Eso sería muy frágil. Se abre secuencialmente. Las horquillas tendrán dos cadenas desapareadas que irán apareandose con los nucleótidos nuevos.

Encontramos distintos tipos de replicones. La forma más sencilla de catalogarlos es la siguiente:

• Lineales:

• Por los extremos: cuando la molécula de DNA es lineal abierta. Eso podría ser que el origen de replicación esté en los extremos. Potencialmente podría haber dos horquillas de replicación una en cada extremo. Esto no es muy normal.

• Burbujas unidireccionales: un origen y una horquilla que replica la molécula en una sola dirección. Dan lugar a burbujas de replicación, aperturas internas donde me quedan las hebras desapareadas.

• Burbujas bidireccionales: un origen de replicación y dos horquillas en la burbuja de replicación. El crecimiento se daría hacia las dos direcciones.

• Circular: un origen o varios orígenes de replicación que crecen en burbujas de replicación que se expanden hasta tocarse y fusionarse… Es típico en mitocondrias, plastos, algunas bacterias y virus y muchos plásmidos.

• Control de copia en los plásmidos: Habrá un plásmido por cromosoma bacteriano. Un replicón se puede sincronizar con otro replicón de manera que cada vez que se replica el cromosoma de la bacteria se replica el plásmido garantizando que las hijas de la bacteria tengan todas ellas el plásmido y así no se pierda.

• Sistemas multicopia en los plásmidos y los plastos y las mitocondrias: Puede haber más de un plásmido por cromosoma bacteriano dado que se replican descoordinadamente. En el caso de los plastos y las mitocondrias también hay varios cromosomas dentro de un solo plasto o mitocondria.

Los replicones circulares también pueden ser de varios tipos

Los humanos deberíamos tener al menos 46 replicones…en nuestro caso tenemos replicones lineales bidireccionales, pero más de un origen de replicación. O sea que tenemos muchísimos origenes de replicación y replicones. Todas esas burbujas se acompasan y controlan dado que el cromosoma debe ser replicado íntegramente y sin que haya regiones que están más replicadas que otras.

En el caso de los virus RNA, algunos pasan por DNA y son retrovirus. Tienen una replicación mazo de compleja. En el caso de los virus de DNA, tenemos tanto lineales como circulares. Sin embargo hay de cadena sencilla y de cadena doble. La replicación entonces es muy compleja. Casi cada orden diferente de virus tiene un sistema de replicación diferente. Generalmente no hay más de un origen de replicación.

PROBLEMAS DE LA REPLICACION

Es un proceso extremadamente conservado en casi todos los organismos. Eso confirma el origen único de la vida. Casi seguro que prosperó solo un modo de vida por evolución. Compartimos por lo menos un tronco común en cuanto a replicación.
El problema más complicado es el que veremos a continuación:

La INICIACION:

Primero tiene que haber suficientes nutrientes y elementos para ello. No se puede echar para atrás en la replicación con lo cual iniciarla tiene que ser un interruptor con muchos controles previos. Eso además conduce a la duplicación y la división consecuente. Si las cosas se duplican o se dividen mal… termina todo muy mal para la célula.

Hay unas secuencias ori que codifican para esos origenes de replicación. Son genes por donde se abre primero la molécula de DNA. Muchas enzimas regulan y actúan sobre esos genes que además son puntos de control clave del proceso.

Hay complejos de iniciación llamados en general PRIMOSOMAS, y comprenden los cuerpos enzimáticos que inician esa replicación.

La ELONGACION:

Es un proceso muy mecánico que es alongar la molécula de DNA. La molécula corta del principio deberá irse alargando. Las enzimas que son responsables de esto también forman un complejo que recorre la molécula de DNA siempre por la horquilla… se llama REPLISOMA. En él no solo están las polimerasas, sino también enzimas estabilizadoras, enzimas que van deshaciendo torsión del DNA, etc.

Las polimerasas de DNA solo añaden nucleótidos en el extremo 3'. Y eso es otro problema, porque sobre una hebra se añade siempre sobre el extremo 3', pero la otra hebra es antiparalela y por lo tanto deberé colocar sobre ella siempre los extremos 5'…

Es importante destacar que siempre las polimerasas añaden SOBRE ALGO… ese algo es una molécula inciadora llamada PRIMER o CEBADOR. Es un oligonucleótido sobre el cual se añadirán los nucleótidos. En el caso de la hebra antiparalela entonces tendré que polimerizar de una manera especial. Esa manera especial todavía no está bien elucidada. Hace tiempo que ya se propuso la síntesis a partir de los fragmentos de Okazaki, pero aún así, la síntesis de DNA a partir de pequeños primers requiere una torsión de la hebra antiparalela que se va abriendo en sentido 5'-3'.

La hebra de síntesis contínua es llamada LEADING, adelantada o líder. La hebra de síntesis discontínua es la llamada LAGGING o retrasada.

Hasta ahora resulta muy sospechoso desde el punto de vista evolutivo dado que todas las polimerasas polimerizan en sentido 5-3. O sea que se supone que una sola polimerasa dio origen a todas.

Otro problema también importante para resaltar es que la elongación es un proceso constante y que puede tener error. Cuanto más largo tiempo dura la elongación más probabilidad de error habrá. Además también más frágil será cuanto más tarde la replicación.

Sabemos también que el proceso es rapidísimo. En bacterias llega a ser tan rápido como 20 minutos. Por ello debemos comprender que esto debe darse de una manera para que sea todo tan rápido y sin errores excesivos.

La TERMINACION:

Hay secuencias TER. Todo debe replicarse solo una vez por lo que es necesario que haya secuencias que me digan donde paro. Los replicones se fusionan al chocar. Los fragmentos se unen mediante ligasas y finalmente tendré la molécula acabada. Esas enzimas responsables de la terminación correcta también son importantes.

Es esencial entender que la célula luego de replicarse debe comenzar con la división. Además mientras se replica la célula no debe detenerse ninguno de los procesos vitales de la célula como la síntesis de RNA, proteínas, etc.

PRIMERS: oligonucleótidos de unos 10 nucleótidos de RNA

FRAGMENTOS DE OKAZAKI: 1500 nt de largo en eucariontes mientras que en procariontes solo tienen 200 nt.

VELOCIDAD DE LA REPLICACION:

La replicación debe ser rápida para que se pueda continuar con el ciclo celular…

800-1500 pares de base por segundo en E. coli

10 a 100 pares de bases por segundo en eucariontes. La diferencia yace en que la cromatina es más compleja en eucariontes y por lo tanto hay más impedimento estérico para poder desarmar y ensamblar nuevamente las hebras…

FIDELIDAD DE LA REPLICACION:

Esperable (in Vitro): 1 error cada 1000 pares de bases

Observado (in Vivo): 1 error por cada 100 millones o 10 mil millones de bases… Eso es porque hay reparación de ADN dentro de las células in vivo.

Es más alta la fidelidad en eucariontes multicelulares. En los unicelulares se pueden permitir menos fidelidad obteniendo la misma cantidad de variabilidad.

No somos capaces nosotros los humanos de generar procesos tan fieles. Eso implica que en el genoma habrá un error de cada 1000 bacterias que se dividan. Eso es nada en un cultivo de bacterias. O sea que habrá una tasa de mutación bastante alta…. Más o menos un millón de mutaciones por gen y por generación…

O sea que la fuente principal de variabilidad es la mutación normal y no corregible que se genera a través de errores por replicación. Esos cambios se irán transmitiendo (ya que es difícil que a lo largo de 2 generaciones una mutación se genere y se corrija)

ENZIMAS DE LA REPLICACION

Proteínas Estabilizadoras de DNA de cadena simple (SSDNABP o simplemente proteínas SSB). Cuando detectan DNA de cadena sencilla se acoplan a él para estabilizarlo. Son proteínas muy bien conservadas a lo largo de la evolución. Tienen la peculiaridad de que cada una cubre unos 4 nucleótidos. Su producción está muy controlada. Cada vez que hay una horquilla se generan exactamente la cantidad de SSBPs para cubrir los 1500 nucleótidos de cada cadena. El cálculo es sencillo. Si cada una cubre 4 nt, y necesito cubrir 3000 nucleótidos, necesitaré unas 750 por horquilla.

Además actúan de forma cooperativa. Al unirse la primera, facilita la unión de la segunda, que a su vez facilita la unión de la tercera.

Helicasas

Siempre actúan abriendo los puentes de hidrógeno que mantienen la doble hélice sujeta. Son enzimas que utilizan ATP y un gasto de energía muy grande para poder abrirla. Algunas actúan en dirección 5'-3' y otras en dirección 3'-5'. Algunas son incluso capaces de moverse en los dos sentidos. Solo en E.coli se han aislado alrededor de 15 Helicasas “distintas”. Tienen motivos estructurales muy similares, pero son verdaderamente distintas en algunas cosas.

Topoisomerasas

Nos hacen también mucha falta. Se conocen a veces como girasas. Cuando se habla de bacterias se suele hablar de girasas… aunque hacen lo mismo. Resuelven las torsiones que ocurren en la molécula de ADN en cualquier proceso dinámico como la replicación. Van cortando y pegando la molécula de DNA haciéndola girar permitiendo liberar las presiones y tensiones de torsión en la molécula. Así se impide que la molécula de DNA sufra daños irreversibles por fracturación. Hay dos grandes familias. Las topoisomerasas de tipo I y las de tipo II. Las de tipo I son monoméricas y las de tipo II son diméricas. Las de tipo I cortan en una de las dos hebras para lograr soltar la torsión. Necesitan, para ello, la acción de una Helicasa. Las de tipo II tienen una manera de actuación diferente. Lo que hacen es introducir dos cortes en la doble hélice. Están físicamente rompiendo la molécula en 2 y por lo tanto es muy arriesgado. Muchas veces, si se tienen helicasas mutadas, se puede destrozar todo el DNA!!! Usan Ligasas para finalmente restaurar los enlaces fosfodiéster.

Liberando tensiones, permiten entrar a otras proteínas para procesos como la transcripción y la replicación.

Primasas

Enzimas responsables de sintetizar los primers de RNA. Con lo cual tienen actividad RNA polimerasa. Los primers ofrecen el extremo 3' para la DNA polimerasa. En procariontes, la función primasa la hace directamente una enzima que es una RNA polimerasa normal denominada DNA-G. Sintetiza esos prímers de entre 8 y 12 nt de RNA. Tienen su colita 3' para permitir la polimerización por la DNA pol. La primasa de eucariontes es algo diferente. Es la es la llamada DNA polimerasa Alfa. Hay involucrados RNA pequeños y nucleares. Las Alfa los alarga un poquito y los modifica para que funcionen.

Polimerasas

Son las responsables de la polimerización. Son muy abundantes y están muy estudiadas. Muchas tienen funciones diversas. Aunque comparten motivos estructurales y funciones. Con eso se supone que todas deriven de una molécula inicial. Tienen todas la peculiaridad de añadir en el extremo 3'.

Están las DNA polimerasas de la replicación y las que no forman parte de procesos de replicación (las que hacen recombinación y reparación fundamentalmente). Realmente luego veremos que la recombinación y la reparación comparten muchas cosas… sobre todo a nivel enzimático y de regulación.

La I es la de Corberg. Es extremadamente abundante en E coli. Pero no es la que realiza la replicación aunque así se pensó cuando se descubrió. Además complicó mucho el estudio ya que dificulta mucho el estudio del resto de las polimerasas por ser tan abundante… Todas polimerizan en el sentido 5-3. Todas tienen también la capacidad de digerir y eliminar nucleótidos en el sentido 3'-5' sobre la cadena sencilla que va sintetizando (actividad exonucleasa). Eso le permite eliminar nucleótidos que ella misma colocó incorrectamente. Se llama capacidad de corrección de copia (al igual que se le dá Backspace en el ordenador cuando le pifiamos a la letra).

La capacidad exonucleasa 5'-3' solo la tiene la Dna pol I (la de Corberg). Eso le permite ser una polimerasa de corrección y reparación sobre todo. Está involucrada sobre todo en la eliminación de los primers de RNA de los fragmentos de Okazaki en la hebra retardada (lagging). Luego de eliminarlo los rellena.

Ninguna es capaz de sintetizar DNA a partir de nucleótidos de la nada. Todas necesitan un cebador. Excepto la DNA pol I que necesita solo un fragmento de primer de cadena sencilla. La DNA pol I y la III pueden sintetizar a partir de prímeres jungo con SSBPs. La velocidad de la III es mucho mayor a la de la DNA I. Eso es una evidencia clara de que a esa velocidad nunca podría ser la DNA pol I la responsable de la replicación. La DNA pol III sí…

Por cada 400 de la I tenemos unas 10 o 20 de la III.

Eso se explica con que coli tiene solamente 1 ori. Eso quiere decir que requerirá pocas DNA pol III. En ambos casos, si se mutan los genes de la I y la III no puede sobrevivir la bacteria (no puede replicar).

La II se supone que participa en procesos de reparación durante la síntesis y la replicación. O sea que aunque la DNA pol II esté jodida…la bacteria sigue funcionando….aunque derivará más errores a su progenie.

También hay pol IV y pol V. En algunos sitios la pol IV se la llama dim B (nombre con que se aisló el mutante defectivo para esa proteína). En otros, la pol V se detalla como umv D'2C. Ambas participan en la respuesta SOS a las mutaciones. Es una respuesta desesperada que hacen las bacterias cuando su genoma se ve muy dañado y con peligros de muerte. Es entonces cuando activan el programa de reparación genómico SOS. Parace ser que ahí actúan las Pol IV y V que NO SERIAN REPLICASAS!!!!

En mamíferos… tenemos 5 polimerasas claramente implicadas en replicación. Hay otras que son no replicasas.

Se las llaman con nombres griegos de letras.

De Alfa a Epsilon. Todas tienen la función de polimerización típica y la exonucleasa típica. Pero la Alfa puede polimerizar a partir de un cebador de RNA. Todas las demás pueden usar prímeres de DNA solamente. La Delta y la Epsilon también pueden usar prímeres de RNA.

Alfa está en el núcleo al igual que todo el resto excepto GAMMA!!! O sea que la que se ocupa de la síntesis de las mitocondrias es GAMMA!!!!!

Alga es esencial para el priming. Delta es la que es elongadora y es la fundamental. La Epsilon y la Beta son las que se ocupan de la reparación durante la replicación.

El mecanismo de la polimerasa Alfa es algo peculiar. Usa los hnRNA y los alarga haciendo híbridos denominados iDNA formados por RNA y DNA. La polimerasa agarra el hnRNA y le mete 4 o 5nt de DNA. Eso le permite actuar como cebador. La Alfa se quita de en medio. A partir de ahí Delta comienza a alongar ese iDNA. Hay otras 8 DNA polimerasas denominadas menores en eucariontes. Son la Zeta, Eta, Theta, Iota, Kappa, Lambda, Mu y Sigma. Están todas involucradas en recombinación y reparación.

Como vemos. Polimerasas hay muchas, pero implicadas en replicación hay pocas. Y para la elongación hay siempre una sola. O sea que la mayor parte de las polimerasas están hechas para la reparación y otros procesos.

Además tenemos que destacar que la DNA pol III de procariontes se asemeja más a la DNA pol Delta de mitocondrias eucariontes que a la Alfa nuclear.

Ligasas

Son las que restauran enlaces fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes. Requieren generalmente ATP y son extremadamente conservadas e intercambiables. También con eso dejan entender que son muy eficientes tal y como están.

De Terminación

Son proteínas que determinan en qué punto del proceso se acaba. No pueden quedar regiones sobrereplicadas y regiones sin replicar. Cuando hay muchos replicones es necesario la actividad de estas proteínas que regulen y terminen el proceso para que se haga correctamente.

EXPERIMENTO de CAIRNS

Para ver la replicación del DNA circular de bacterias se hacen autoradiografías y luego microscopía electrónica. Se petan las E-coli mientras están replicandose y se marcan con el material radiactivo. El proceso… si se hace el marcado y la fotografía secuencial se podría ver si es una horquilla sola o si son dos horquillas que avanzan en los dos sentidos. La autoradiografía lo que termina indicando en E coli es que el proceso es bidireccional y que realmente hay un ori y dos sentidos de replicación con dos horquillas que van en sentidos opuestos y que finalmente se encuentran.

Esa foto la hizo Cairns. Fue cuando se supo que el cromosomas de las bacterias era circular. Hasta entonces solo se sabían datos genéticos por cartografiados. Los cartografiados apuntaban a que el cromosoma era circular. La foto de Cairns permitió demostrar mitológicamente que el cromosoma era circular…que había un solo origen y que había dos horquillas y dos sentidos de avance. Además se confirmaba que la replicación era semiconservativa, como habían explicado Messelsson y Stahl.

REPLICACION EN E. Coli….

Hay solo una región de origen. Es el llamado Oric (origin-coli). Participa en 3 procesos. Participa en el origen de la replicación, en la regulación de la replicación (un interruptor) y participa en la segregación de los cromosomas que se han replicado. Es una región de unas 1000 pb de largo. Cuando se empieza a trabajar molecularmente sobre esa secuencia…la conclusión es que la función de verdad reside en una región de solo 245 pb que es rica en AT, perfectamente conocida y controlada. Se encuentran a la izquierda 3 secuencias de 13 nt repetidas. O sea que hay repeticiones en TANDEM!!! Esos primeros 39 de los 245 es esa secuencia completamente relevante. Es GATCTNTTNTTTT. Luego hay un segmento más irrelevante. Finalmente hay 4 cajas formadas por una secuencia que también se repite. Tienen 9 pb y están en sentido opuesto. Dos apuntan hacia las secuencias en tandem. Dos apuntan hacia el otro lado. Cualquier fragmento de DNA al que le acoplemos esa estructura se convierte en un cromosoma de E-coli. O sea que es un principio para construir BACs!!!! Es clave entender que las boxes son los sitios de unión para las proteínas de DNA que comienzan la replicación.

Además de la ori C hay una secuencia denominada Mioc que tiene otras secuencias conservadas importantes para generar cromosomas bacterianos.

Para el inicio de la síntesis, cuando se da la señal de comenzar con la replicación, las proteínas de DnaA junto con ATP se unen a las cajas. Esa unión es una señal, una banderita, que permite que la proteína DnaC arrastre a DnaB que es la que tiene la actividad Helicasa. También con ATP se consigue la unión de la Helicasa. El complejo de iniciación se forma finalmente junto con la proteína HU (una proteína estabilizadora similar a las histonas), junto con las SSB junto con la Girasa y junto con mucho más gasto de ATP se consigue finalmente abrir el OriC para que entre la primasa y la polimerasa y empiece la copia.

Es importante destacar que la síntesis y polimerización en ambas hebras es realizada por la mismo complejo polimerizante. La DNA pol III realmente es una holoenzima, un conjunto de proteínas codificadas por distintos loci. El producto proteico de esos genes se ensambla dando la capacidad de la polimerización. Es capaz de polimerizar en ambas hebras. Eso lo consigue a partir de un bucle generado en la hebra retardada. O sea que la primasa va poniendo los primeres que necesitan tanto la discontinua como la discontinua… A continuación la pol III avanzando en UN SOLO SENTIDO puede sintetizar los dos trozos de DNA que corresponden tanto al fragmento de Okazaki como a la hebra complementaria de la avanzada.

En orden de acción, la helicasa (DnaB protein) abre las hebras cerradas gastando ATP, la primasa (DnaG protein) sintetiza los primers y la DNA pol III holoenzima es la que se ocupa de polimerizar las moléculas en el sentido en el que todo el complejo avanza.

Exceptuando un grupo de subunidades que solo aparecen en el hemisferio de la hebra retardada de la holoenzima, podemos determinar un plano de simetría. De cada lado tendríamos una subunidad alfa, dos betas, una epsilon, una theta y una ro. Sobre la mitad de la hebra retardada estará el complejo gamma (tiene una gamma, dos delta, una chi y una fi). Ese complejo es el que hace viable la síntesis discontinua que hace que Beta se coloque y mantenda en su sitio la hebra retrasada. Es una gran consumidora de ATP.

El núcleo de la holoenzima está formado por la alfa, la epsilon, la theta y la ro.

La alfa es la polimerasa (codificada por DnaE). La epsilon es la exonucleasa normal correctora (codificada por DnaQ). La ro es la que une alfa y epsilon y estimula la correción “correcta”. La Theta es la que mantiene la estructura pseudo dimérica es decir las dos mitades de la holoenzima.

La Beta es la que ancla el complejo a una y otra hebra permitiendo la procesividad. Hay una proteína llamada PCNA que es una proteína equivalente en eucariontes. Tiene también la función de mantener estables a las hebras hijas.

Con respecto a la estructuración de las horquillas y las hebras… es importante remarcar que los replicones circulares….al formar las burbujas… sintetizan continuamente y discontinuamente las dos hebras, aunque en sentidos opuestos. Esto es consecuencia de que la síntesis continua solo se permita en el sentido 5'-3' mientras que las hebras van, una de ella en 5-3' y la otra en 3-5'. Es lógico que si la burbuja se da en el centro….hacia un lado del oriC, la síntesis de una hebra será contínua. Hacia el lado opuesto, la síntesis de esa misma hebra será discontinua. O sea que el concepto de HEBRA contínua es problemático. Es mejor hablar de SINTESIS contínua o discontinua.

Pero hay un problema. Las tasas de replicación que se producen a partir de un par de DNA pol III que abren un oriC, no justifican que las bacterias puedan dividirse con tal velocidad. Además, no se justificaría el hecho de que haya tanta DNA pol III por célula. Realmente lo que demuestra la evidencia microscópica es que los cromosomas en la bacteria están siempre replicándose. Y mientras se da una replicación, ya comienza la siguiente sobre las hebras hijas. Con lo cual en una misma célula nos podemos encontrar fragmentos donde tenemos muchas copias de una misma secuencia.

Eso es lo que justifica la existencia de 8 a 10 unidades de holoenzima. Además eso nos justifica la velocidad de generación de las bacterias.

Claro que demuestra que la replicación en bacterias no es nada sencilla. Todo es muy importante. Tener esa cantidad de DNA pol III es preciso para poder replicar el DNA correctamente sin impedir otras funciones vitales de la bacteria.

Final de replicación. Los replicones se podrían fusionar… pero lo cierto es que hay una región ter que en realidad está constituida por 3 secuencias llamadas TerD, TerA y TerE por un lado y TerC y TerB para el otro. Son unas secuencias de unos 23 pares de bases que están repetidas como secuencias invertidas. Con la ayuda de una proteína Ter (también llamada Tus, TBP, etc.) codificada por el gen Tus, lo que hace es impedirle el paso a la helicasa. Al desengancharse la helicasa se inactiva y todo el proceso se desensambla.

Para la separación de los cromosomas sin huso ni centrómeros se usa a la secuencia ori que actúa para la división de los cromosomas hijos. La segregación también involucra a las llamadas proteínas Xer (C y D). También participan las FtsK aunque aparecen nuevas todos los días. Cuando se lo noquea, la bacteria no se replica, con lo cual se sabe que es esencial. También la topoisomerasa IV que permite los superenrrollamientos de las zonas ya replicadas y que permiten que lo que se separa es el nucleoide. También se supone la existencia de unas proteínas motoras que se piensa que podrían estar implicadas en la tracción y anclaje del oriC promoviendo la replicación y la segregación de los cromosomas nuevos.

Para la formación del septo de división se necesitan otras proteínas Fts como la FtsZ, la FtsA, la ZipA y las proteínas C, D y E de la familia “min”. En ese septum se está produciendo el peptidoglicano de la pared bacteriana. A medida que se forma el anillo FtsZ y se van estrangulando las dos hijas (ya con los cromosomas colgados y separados) la pared se va completando. Mientras tanto igualmente los ribosomas y los RNA están traduciendo y transcribiendo las proteínas que constituyen el nucleoide (las que estabilizan el nucleoide, las que estabilizan el DNA, las que introducen enrrollamientos, etc.) y las que mantienen el metabolismo bacteriano.

Es todo muy dinámico, activo y complicado!!!

REGULACION DE LA REPLICACION EN E.coli

El OriC es nuevamente el regulador de la replicación. En los eucariotas animales tenemos los reguladores del ciclo celular. Pero en bacterias no tenemos más que el OriC. O sea que es hiperimportante!!!!

MioC es una región que está a la derecha de OriC. Cuando entra la RNA pol en MioC y se inicia la transcripción, eso produce un cambio conformacional en OriC dejándolo en CONFIGURACION ABIERTA!! Eso permite que la DnaA localice las cajas dnaA.

Si la RNA pol no entra en MioC, pues nada….

Pero ¿quién activa a MioC? Hay una cadena de señales que depende de receptores de membrana que detectan si el medio es lo suficientemente favorable para la replicación. Hay una cascada de señales intracelulares que es la que permitirá la entrada del promotor de MioC y la activación de su operón…

Esta es una forma sencilla de regular a partir de estímulos del ambiente desde un cambio conformacional en la zona más importante que tiene la secuencia genómica de E. coli para la replicación bacteriana.

De la misma forma, cualquier fallo que haya en la replicación puede ser mortal genéticamente hablando. Por ello es normal que el proceso esté tan regulado.

Sabemos entonces que hay una señal de inicio y unas proteínas de finalización. Pero como sabe la bacteria QUE ESTA REPLICADO y QUE NO LO ESTA. Eso se consigue con las llamadas secuencias GATC que están dispersas tanto en OriC (donde hay 11) como en MioC (donde hay 6) y en algunos otros lados, dispersas en regiones importantes del genoma de la bacteria. Una enzima metilasa (Dam metilasa) puede reconocer esas cajas e incorpora grupos metilo en las adeninas de esas cajas (hay dos por caja, la que está de cada lado). Ocurre que de manera constitutiva están metiladas. Al pasar por ahí la helicasa y la polimerasa, se meten las bases complementarias. Pero ahora tenemos en esa zona una falta de metilos, en concreto las cajas de las hijas estarán hemimetiladas. Por ello, luego pasa la metilasa y metila el material haciendo que se completen las metilaciones en las hebras hijas.

Esos metilos son marcadores que sirven para la cascada de procesos regulatorios que desembocan en la replicación. Cuando tenemos hemimetilaciones, es que todavía la molécula entera no terminó de replicar. Cuando ya está completamente metilado, la molécula terminó de replicar y ya se puede volver a comenzar.

También hay indicios de que parte de la replicación está controlada también por la transcripción de algunos genes reguladores. El complejo de replicación es más rápido que el complejo de transcripción. Los experimentos que hay es que cuando la horquilla de transcripción llega a una zona, se detiene y comienza la replicación. O sea que los dos procesos están sincronizados para evitar colisiones de proteínas. De hecho la replicación rebasa la transcripción y hace que las células se dividan antes de que se pueda reanudar la transcripción.

MODIFICACION EN LA REPLICACION CIRCULAR: El D-LOOP

En mitocondrias y plastos no nos podemos meter en profundidad. Sabemos que tenemos DNA similar al bacteriano. Son genomas circulares. Se replican por su propia cuenta.

Se genera el llamado bucle en D (D-loop). La D viene de “desplazamiento”.

Sobre el cromosomas se distinguen las dos hebras, la H (heavy) y la L (Light) - se llaman así porque se separan en un gradiente de densidad (o sea que hay un distinto contenido en nucleótidos). Se abre la hebra L y se queda en forma sencilla, sujeta por proteínas ssDNABP. La hebra H interna es la que se copia. Esa síntesis se va desplazando por toda la heavy.

Una vez el bucle está suficientemente abierto, las proteínas que tienen que copiar sobre la L ya pueden entrar. Las ssBP se sueltan y comienza la síntesis retardada que va sobre la L. Luego los círculos se separan y completan su síntesis separadamente.

Este es el caso general, pero se sabe que en los plastos hay más de un origen de replicación. Se sabe relativamente poco de este caso. Además hay que decir que el proceso lleva a muchos errores posibles. Es por ello que se llevan muchas copias, por las dudas.

Todavía no hay un mecanismo que garantice que el número de mitocondrias que vaya a cada célula hija sea simétrico. Además dentro de cada mitocondria, la segregación de las copias del cromosoma circular también se reparte al azar. No hay sistemas de túbulos que garanticen separaciones simétricas y equilibradas.

MODIFICACIONES EN LA REPLICACION CIRCULAR: EL CIRCULO RODANTE

Es el de los plásmidos circulares típicos. También el de los plásmidos de mitocondrias, etc.

Se da un corte en una de las dos hebras por una encima. La hebra cortada externa se va desenrollando desde el extremo 5' hacia el 3'. Sobre el extremo 3' que por ahora todavía está unido, se irá sintetizando una copia de la hebra interna, usando ese extremo como un primer. El problema que surge principalmente es que esto, si no se detuviera, generaría un ssDNA eternamente largo con secuencias plasmídicas en tandem.

Pero lo que sucede es que a cada vuelta se produce un corte en la hebra ssDNA. Mientras se van copiando y generando plásmidos ssDNA (que luego son completados por una polimerasa mediante un primer hasta dsDNA), el círculo continúa girando. Cuando terminó la copia, el ciclo se detiene.

En el plásmido F se genera una copia sola. Pero en los plásmidos multicopia y en los virus tenemos siempre muchas copias por círculo rodante en una misma bacteria.

MODIFICACION DE LA REPLICACION CIRCULAR: Los Virus ssDNA circulares

Muchas veces son la hebra funcional y transcriptora (+). Lo primero que hace es cubrirse con las ssBPs. Entonces se da la síntesis de la hebra (-) - complementaria. Así se constituye un dsDNA circular estándar que entra en el protocolo habitual del círculo rodante. Se habla de la Forma replicativa I (superenrrollada - latente - espera a la oportunidad para pasar a la forma activa) y la Forma replicativa II (extendida - activa - que ya se puede replicar - seguir con el ciclo viral típico).

La síntesis de la hebra - se da a partir de un ori viral. Se pone un primer y con la Pol III del huésped se sintetiza la dsDNA que queda en RF1 (replicative form I). A partir de ahí, lo que ocurre es que una proteína denominada A corta en un punto concreto generando un extremo 5' libre y un 3' cebador para el mecanismo de círculo rodante. La A se une al extremo 5' de la hebra suelta. La A es la que corta el cromosoma viral una vez se terminó de dar una vuelta completa. Eso lo hace porque hay secuencias que reconoce a un lado y el otro del origen para la replicación. Una vez se dio el corte y unión de la hebra (+) nueva para generar la copia viral, la A vuelve a su posición inicial. Esa A está codificada en el DNA viral.

Modelo del Fago M13 y el G4: Tienen una pequeña variación. El ADN circular se corta y se linealiza. Protegen el genoma con las ssBPs, excepto una pequeña región que se autoaparea en un bucle formando un semi-Hairpin.

Se utiliza ese bucle como cebador para autocopiarse. El G4 usa una primasa propia. El M13 la del huésped. Luego, la Pol III del huésped sintetiza la hebra (-) y finalmente por círculo rodante se obtienen las hebras (+).

MODIFICACIONES EN LA REPLICACION LINEAL: El DNAds del fago T4 y Lambda

Al entrar se circularizan. Una vez ya son circulares utilizan la estrategia de círculo rodante. En el caso de Fi29 y Adenovirus, lo que hacen es un truco que tiene vastante interés. Utilizan una nucleoproteína que es Terminal en su DNAds lineal. En el extremo 5' de cada lado se une una nucleoproteína (lleva una citidina unida). La proteína reconoce el extremo 5' con sus aminoácidos y la citidina sirve como cebador para sintetizar la copia de cada hebra.

Los Adenovirus son buenos vectores para terapia génica. El Fi29 es el más común y conocido como modelo de replicación.

MODIFICACION EN LA REPLICACION LINEAL: Los virus RNA

Hay ejemplos de casi todo… Hay utilización de RNAproteínas terminales como los poliovirus. No utilizan nunca intermediarios de DNA.

Lo más común es el uso de la Transcriptasa inversa que es una polimerasa que sabe sintetizar DNA a partir de RNA. Se forma un híbrido RNA-DNA. El RNA se elimina con la misma Transcriptasa. A partir de ese DNAss (-) que queda se genera la DNAds. Esa sirve para transcribir y sintetizar las proteínas virales y los RNA (+) que serán los que se encapsidarán (2 copias por cápsida).

MODELOS DE REPLICACION EN EUCARIONTES

Lo esencial es todo lo mismo. Pero hay algunas cositas específicas que afectan a los eucariontes. Hemos visto ya las polimerasas que intervienen y las otras proteínas. Así que solo queda saber como se inicia, como se elonga y como se termina en el preciso caso de eucariontes.

Lo clave es que los eucariontes estamos sujetos a un ciclo celular. Las fases están bien conocidas. Eso está muy visto y no hay gran cosa que destacar.

El ciclo celular en eucariontes está relativamente conservado, pero hay muchos cambios. En las células somáticas se suele dar bien, pero en algunos otros tipos celulares, en las germinales, etc. nada es tan claro.

Hay una fase G1 (2n, 2c) que es donde una célula pasa más tiempo. Ahí está la activación y el desarrollo normal de diferenciación, etc. En un unicelular debe conseguir todo en esa interfase. Pero si hablamos de una célula epidérmica hablamos de la preparación para la fase de síntesis. Debe amontonar todo para el proceso de la replicación. Como sabemos, la S no puede fallar, porque esa célula morirá. Todo debe estar muy controlado en el paso entre G1 y la replicación. Una vez que arranca la fase S (síntesis - replicación) muy pocas veces se traba la célula en G2 (la interfase corta que viene antes de la división).

El cáncer se vió que es una enfermedad relacionada con el fallo en el control de la división. Una de las aproximaciones del cáncer es NO parar las divisiones, sino parar las replicaciones o joderlas para que la célula sola evite que la célula se divida incorrectamente. El famoso guardián p53 lo que hace es regular la replicación. P53 manda a apoptosis las células que no se replican bien. Pero cuando falla… es inevitable que los cánceres puedan activarse.

INICIACION EN EUCARIONTES

Son genomas más grandes y complejos. Los cromosomas están más empaquetados y por lo tanto la replicación será más lenta. Eso es porque hay más cosas que hacer. Hablábamos del nucleosoma, del solenoide. Eso está solo en eucariontes. Entonces el material genético deberemos desempaquetar y reempaquetar. Pero la célula no puede consumir demasiada energía, con lo cual es inevitable que esto se haga con rapidez y efectividad.

Se sabía muy poco. El modelo favorito es en levaduras, unos ascomicotas eucariontes unicelulares. En levaduras se descubrió hace tiempo los ARS (Autonomous Replication Sequences). Sirven de origen. La ARS1 fue la primera que se descubrió dentro de las 400 que hoy conocemos que hay en los 17 pares de cromosomas de las levaduras. Esos 400 origenes entonces están repartidos. Ya tenemos una diferencia importante: EN EUCARIONTES SUELE HABER MUCHOS ORIGENES REPARTIDOS POR LOS CROMOSOMAS… es normal ya que los cromosomas son grandes y las moléculas son muy grandes…se necesita entonces que el tema se haga rápido.

ARS quiere decir que cualquier fragmento de ADN que tenga una de esas secuencias y que esté en el núcleo a partir de ahí se replica y sabe replicarse. Es parte de esa tecnología que ya vimos en su momento. Nos permiten formar YACs (cromosomas artificiales de levaduras). Recordemos que necesitaremos también los telómeros y el centrómero para que se de la división y para que pueda funcionar en el núcleo.

La estructura es fácil. Son 180 pb que tienen 3 cajas B (B1, B2 y B3) y una secuencia importante de 14 pb llamada región A. Dentro de la región A hay una secuencia conservada de 11 pb. Está compartida por todas las 400 ARS del genoma. Las cajas B son importantes y necesarias aunque están menos conservadas en secuencia (que no en estructura) que la A. Pero para que tengamos una ARS completa necesito TODA LA REGION, aunque haya partes más conservadas que otras.

Qué hace falta?

• ORC - MCM2 hasta MCM7 - unas proteínas de iniciación que actúan en los orígenes de replicación…

• ATP - como siempre, para TODO!!!

• CDC6

• CDT1

• RPA (ssB) - Replication Protein A

• PCNA - proteína que se ocupa de la procesividad. Lo que hace es que la polimerasa no se descuelgue durante la síntesis.

• RFC (similar al complejo Gamma de E. coli que se ocupa de la síntesis discontinua en la polimerasa de bacterias) - sin embargo en eucariontes no hay ni la más mínima indicación de que haya un bucle… en eucariontes todavía no se ha visto como se da si no es por bucle…

La iniciación ya la recordamos… Los RNA pequeños son acoplados con DNA mediante la Alfapolimerasa. El iDNA es el que sirve para hacer del primer PRIMER. La DNA pol Delta se ocupa de alongarlo. LA Alfapolimerasa desaparece y no se usa excepto para la iniciación en los ori.

El Replicón son varias burbujas de replicación en una molécula lineal. Se tienen muchas horquillas. Mediante incorporación de tritio en la timidina podemos hacer un experimento para ver eso. En el experimento se puede ver como las burbujas son bidireccionales. Eso se puede ver en autoradiogramas o mediante microscopía electrónica.

Los replicones en bacterias tenían 4200 kb. En Levaduras son solo 40kb y se tienen 500 origenes. En Drosophila tenemos 40kb y 3500 orígenes. En las plantas tenemos unas longitudes de 300 kb y unos 35000 replicones. En Ratón tenemos 150 kb por replicón y unos 25000.

En eucariontes superiores:

Alfaprimasa - la que forma el primer de iDNA

Delta - el elongador

PCNA - el mismo que estaba en levaduras

RFC - factor de replicación C

RFA - factor de replicación A

MF1 - elimina el iDNA del primer inicial (tiene actividad exonucleasa) - recientemente se le cambió el nombre por FEN1. Aparentemente no lo hace todo ella misma. En eucariontes inferiores además parece que participa una RNAasa de tipo H. En los superiores actúa una proteína llamada Dna2.

ELONGACION EN EUCARIONTES

Sabemos ya que hay síntesis discontinua y continua en ambas hebras. En cada burbuja, hacia un lado, una hebra se sintetiza continua y la otra discontinua. Hacia el otro lado, la hebra que se sintetizaba continua se sintetiza discontinua y la que iba discontinua ahora va continua.

Ya sabemos que el iDNA se quita por FEN1 junto con RNAasa H o junto con Dna2. Luego los otros primeres son quitados por una polimerasa equivalente a la I de bacterias.

TERMINACION

Las burbujas terminan encontrándose y hay una colisión real!!! Lo que chocan son las helicasas!!! Se supone que ahí participan algunas proteínas que actúan en el choque de los dos replisomas. Pero también sabemos que en todos los eucariontes hay origenes de replicación temprana y origenes de replicación tardía. Generalmente las regiones heterocromáticas son de repliación tardía. Las eucromaticas son de replicación temprana. Esto es una clasificación, porque realmente los orígenes podríamos ordenarlos desde los más tempranos hasta los más tardíos y entre medias nos quedarían algunas gamas de grises… Además la replicación modificará su velocidad dependiendo del tipo celular. O sea que una misma región en dos células diferentes podría tener tiempos de replicación diferentes!!!

O sea que no hay una sincronización perfecta. Hay una ordenación, pero no una sincronización…

TRANSCRIPCION

Está regulada junto con la replicación para que se haya transcrito lo necesario antes de la replicación. Pero aquí tenemos un problema… y es que como tengo muchos origenes de replicación y los replicones van en orden y no sincronizados…. Como hacemos!!!! Es simple… la replicación PRIMA sobre la transcripción…cuando el replisoma pasa por donde hay una RNApol…el sistema de transcripción se desensambla y tiene preferencia la replicación. Así se consigue poder transcribir DNA aún cuando tenemos replicación eucarionte.

REPLICACION DE LA CROMATINA

Se estudia el modelo del virus SV40 que es el virus de simio 40. Es un virus que tiene estructura nucleosómica, el único que es así. Es un virus de eucariontes. Nos viene muy bien para estudiar la organización del nucleosoma. Es un buen modelo, en resumen.

En la célula en G1 ya está sintetizando (mediante unas señales previas) los materiales necesarios para la replicación, entre ellos esas histones. Hay unas proteínas que se llama Nucleoplasmina y una proteína N1 que son las que se encargan de unir el octámero. La NP une las H2. La N1 une las H3 y la H4. Todas estas proteínas deben estar en una concentración adecuada para que la replicación se de correctamente.

Primero la cromatina se debe desensamblar y luego de replicado todo….el nucleosoma se debe volver a formar.

Es importante destacar que los nucleosomas, cuando se da el desensamblaje, van a un pool junto también con los de síntesis nueva. Luego los octámeros se reensamblan y se mezclan todos. Se habla de que el mecanismo es dispersivo. Eso se vio también mediante marcaje radiactivo.

Lo que sí parece cierto es que los tetrámeros de histonas no se desensamblan, sino que el pool real es de tetrámeros. Luego esos forman los octámeros y luego el nucleosoma cuando ya el DNA está replicado.

FIN DE LA REPLICACION

A partir de una molécula creo dos…pero al final me quedarán los telómeros abiertos… si las hebras se replicaran nuevamente sin completar ese extremo abierto, con cada replicación se perdería secuencia telomérica. Eso se logra de dos formas:

1) En los telómeros tenemos muchísimas copias de genes de manera que aunque se vayan perdiendo…nos la suda… O sea que cuando somos viejitos, algunas células tendrán muy poco telómero…

2) Se usa una Telomerasa en células germinales y en células muy potenciales. Los gametos para que en la descendencia no se vaya perdiendo, tendrán entonces unas proteínas que añaden otra vez unidades de genes teloméricos para evitar que se pierdan genes más importantes…

Esto es importante en relación con el envejecimiento celular y la senescencia. Mucho del envejecimiento que se produce se da en relación con la pérdida de genes a partir de la pérdida de telómeros por este proceso… Algunos tumores también se producen

GENÉTICA 2º SEMESTRE - GENETICA MOLECULAR Y GENETICA MODERNA

PARTE 1 - LA GENÉTICA MOLECULAR

Areas principales de la Genética

• Genética clásica: estudia la transmisión y localización de los genes en los cromosomas

• Genética molecular: estudia la estructura y el control de la expresión del material genético

• Genética evolutiva: estudia los procesos evolutivos

Se basa en el método científico

• Observación

• Hipótesis

• Experimentación

• Conclusión

Para el estudio hay que elegir bien el material

• Fagos: virus bacterianos

• Escherichia coli (bacteria): bacteria del colon

• Saccharomyces cerevisiae (eucariotas primitivos): levadura del pan

• Caenorhabditis elegans (invertebrados, nematodos): gusano ecdisozoo

• Drosophila melanogaster (invertebrados, insectos): mosca de la fruta

• Mus musculus (vertebrados, mamíferos): ratón doméstico típico

• Arabidopsis thaliana (plantas): mala hierba de los prados

• Danio rero (pez): pececillo

• Homo sapiens

El análisis se basa en la variación fenotípica y el cruzamiento entre individuos según el método del análisis genético…

Los avances de la genética a lo largo de su historia no hubieran sido posibles sin los conocimientos de otras disciplinas:

• Física: microscopía, sistemas de centrifugación, difracción de rayos X

• Química: análisis químico de compuestos biológicos… manipulación de DNA y biomoléculas

Relación con otras disciplinas:

• Clásicamente - medicina, ecología, agricultura, etc

• Modernamente - derecho, sociología, filosofía, ética, informática

LA EXPRESION DEL MATERIAL GENETICO y EL CODIGO GENETICO

Lo vimos en muchas asignaturas, pero veremos algunas cosas referidas a él. Es un código esencial y fundamental. Pero lo veremos por encima.

ERRORES CONGENITOS DEL METABOLISMO

El Experimento de Garrod

Garrod en 1909 (en el paradigma del redescubrimiento de Mendel), es un médico que estudia la alcaptonuria (excreción de orina de color oscuro y artrosis degenerativa de las grandes articulaciones). Garrod observó que se transmitía hereditariamente - estudio de pedigríes familiares.

Se presentaba de forma natural en 1 de cada 100000 individuos. Fue la primer enfermedad que se atribuyó a un defecto hereditario autonómico recesivo.

Ahora se sabe que el gen relacionado se encuentra en el cromosoma 3 y se sabe la ruta metabólica en que está implicado. El gen codifica para una Oxidasa que transforma el Ácido Homogentísico en MaleilAcetoacético en una de las rutas de la Tirosina-Fenilalanina para llevar los aminoácidos hasta el TCA para respirarlos. Los genes recesivos daban lugar a un error y la enzima no funcionaba. Por eso se acumulaba el Homogentisato y el Hidroxifenilpiruvato. En la excreción de orina salía el homogentisato que en contacto con el aire se oxidaba y daba el color oscuro. Se acumulaba también en las artrosis.

Trabajos con mutantes haploides para los errores del metabolismo - Rayos X en Neurospora crassa

Tenemos el fenotipo silvestre en un tubo de ensayo. Ese tubo lo irradiaremos con rayos X. En el momento que hacemos eso, se supone que algunas de las esporas serán afectadas por esa radiación y sufrirán mutaciones. Pero para separar los mutantes, deberemos separar unas esporas de otras. Se separan las esporas y se las siembra en diferentes tubos de ensayo en los que habrá otras esporas de otros individuos salvajes. Así se cruzan y se forman por un lado cuerpos fructificantes dominantes y otros recesivos. Luego se los pone en medios completos para dejar crecer las esporas del cruzamiento. Una vez crecen (y se comprueba que crecen todos, se los pasa a medios mínimos limitantes. Separamos los tubos con menor crecimiento. Esos serán los que contengan individuos recesivos mutantes. Luego esos mutantes se separan y se los analiza con medios limitantes para todos menos un factor. Ese factor (analizado) será el que se ponga en condiciones abundantes. Si los mutantes son para argnina, por ejemplo, en los medios mínimos no crecerán (les falta arginina), pero sí lo harán en medios mínimos que posean arginina. O sea que se pueden sortear probando con medios mínimos + algún aminoácido.

Experimentos de Beadle y Tatum 1941 - Las ruta de la Arginina y la Hipótesis un gen, una enzima

Ya se sabe que el DNA es la que lleva la información genética. Se sabe que está en los cromosomas. Y ahí están los genes. Pero no se sabía nada sobre dobles hélices ni estructura molecular. Trabajaban en Neurospora. Ven, fijándose en la ruta metabólica de la arginina, dan la hipótesis de que cada gen está codificando una ruta metabólica concreta. Cada enzima estaba controlada por un gen distinto.

La hipótesis de un gen-una enzima entonces es clave en el avance de la genética molecular. Básicamente lo que dicen es que el compuesto X pasa a Y mediante la Xasa, y el Y pasa a Z mediante la Yasa. La Xasa y la Yasa están codificadas por el gen X y el gen Y. Si el individuo es mutante para el gen X, la enzima Xasa no estará y por lo tanto se acumulará X. Lo mismo para el Y con la Yasa y la acumulación de la sustancia Y.

Ellos lo ven con la ruta de la Ornitina-Citrulina-Arginina. La ornitina se obtenía desde un precursor. O sea que había 3 enzimas en la ruta. Una pasaba del precursor a ornitina. Otra la pasaba a citrulina y otra a arginina.

Precursor ---(A)--- Ornitina ---(B)--- Citrulina ---(C)--- Arginina

Dijeron que el gen A, el gen B y el gen C controlaban la expresión de la enzima A, B y C respectivamente. Lo que ellos hicieron fue obtener un montón de mutantes para la Arginina. Así separaron que no todos eran iguales. Podíamos tener mutantes para el gen A, para el gen B o para el gen C (los que eran mutantes para dos o para los tres eran más raros).

Los salvajes podían crecer en todos los medios mínimos.

Pero se hacían medios mínimos también con ornitina. En esos tubos, crecían no solo los salvajes, sino también algunos tipos de mutantes. Es decir que dándoles ornitina, evidentemente podían conseguir la Arginina. Es decir que evidentemente no tenían la enzima A, pero sí tenían la B y la C.

Se repetía el tema con Citrulina y se obtenía que además de crecer los salvajes y los que crecían también con citrulina, también había otras nuevas colonias que también podían crecer ya con citrulina. Estos evidentemente llevaban la enzima C, aunque no les funcionaba la B y por eso no podían crecer con solo ornitina.

Los otros mutantes necesitaban medios mínimos con arginina directamente para crecer. Esos evidentemente no tenían la enzima C y por lo tanto, aunque les pusieramos ornitina, citrulina o precursores solo, no iban a poder crecer nunca, porque les faltaba la última enzima de la ruta metabólica.

Los genes A, B y C se llamaron Arg-1, Arg-2 y Arg-3.

Esto demostraba que evidentemente había mutantes diferentes y que realmente mutaciones en diferentes genes todas podían producir mutantes pero cada uno para diferentes enzimas. Es decir que era viable decir que un gen producía una enzima.

Otros pasos para descubrir las bases de la expresión genética

El experimento de Pauling en la Anemia falciforme en 1949.

Se dio cuenta haciendo una electroforesis de proteínas. Los individuos normales, tenían proteínas de una cierto tamaño. Para los homocigotos recesivos se veía una banda con mayor movilidad. Para los heterocigotos teníamos dos bandas (la proteína producida por el alelo falciforme y el alelo normal)

La hipótesis de la secuencia de Crick en 1958

Hay una ordenación lineal de nucleótidos. Esa ordenación está relacionada con la disposición lineal de los aminoácidos en la proteína que codifican.

En 1964, Yanofsky da el Principio de la Colinealidad

La secuencia de nucleótidos es la secuencia colinealmente de los aminoácidos que conformarán la proteína. Esto lo dice Yanofsky y se vió que era así en procariontes. Pero en eucariontes se sabe que el código no funciona igual debido a los intrones y exones haciendo que no toda la secuencia llegue a proteína. Hay un procesamiento que hace que no se de la colinealidad absoluta.

En el año 68 se ven unas enzimas importantes, que veremos mañana - ese fue el pistoletazo de salida para la genética de la expresión y la genética molecular.

TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

A partir del año 70 ya hay mejores técnicas para amplificar regiones de DNA, determinar secuencias de nucleótidos, obtener muchas copias de ella, insertarla en un organismo, etc. O sea que el estudio del DNA es más fácil molecularmente.

El principio de esta historia es en el año 73. En ese año, Stanley Cohen (Stanford) y Herbert Boyer (UCLA), manipulan genomas por primera vez. Insertaron un trozo de DNA de un plásmido en otro creando una molécula recombinante que llamaron quimera. Eso dió lugar a la tecnología del DNA recombinante.

La tecnología del DNA recombinante es un conjunto de técnicas moleculares utilizadas para localizar, aislar, alterar y estudiar segmentos de DNA.

No es más que un montón de técnicas para resolver los problemas genéticos que surgen del análisis de la herencia de los caracteres. Y eso es muy importante para considerar.

Entonces el objetivo prioritario de esta tecnología es el estudio de los genes. La localización, aislamiento y manipulación de un gen es un trabajo laborioso que requiere de la metodología apropiada.

La aplicación de estas tecnologías nos ha llevado a la biotecnología, un tipo de industria nueva, para crear productos comerciales como vacunas, cultivos, hormonas, enzimas, medicinas.

El descubrimiento de las Nucleasas

Son enzimas con capacidad de degradar el DNA. O sea que rompen los enlaces diéster fosfato que une nucleótidos.

Podemos tener exonucleasas: las que degradan el DNA desde los extremos, o endonucleasas: las que pueden cortar enlaces entre nucleótidos por cualquier lugar, excepto por los extremos.

Además, tenemos exonucleasas 3-5 o exonucleasas 5-3, dependiendo por cuál de los dos extremos de una cadena de DNA pueden empezar a digerirlo.

Las endonucleasas no necesitan empezar por ningún extremo, dado que ella cortará por el medio de la molécula y no suele degradar las cosas secuencialmente como hacen las exonucleasas.

Además tenemos RNAasas, DNAasas, RNAasas H (que degradan híbridos DNA-RNA)… y algunas que pueden degradar cualquier tipo.

Normalmente la fuente de las enzimas nucleasas que se usan en laboratorios es diversa. Pueden venir de virus, bacterias, eucariontes, etc. Tienen nombres muy diversos que suelen depender del organismo del que se aisló.

Lo que se consigue es fragmentar el DNA, acortarlo, digerirlo. Es un primer paso una vez se tiene el DNA aislado.

Las endonucleasas de Restricción

En los 60 se vió que las bacterias tenían un sistema para eliminar el DNA exógeno. Es un sistema de defensa. Lo que hace es digerir el DNA mediante unas enzimas endonucleasas.

Evidentemente debían tener un mecanismo para proteger su propio DNA y no digerirlo. Por eso cambia su DNA para que no sea reconocido por la endonucleasa. Eso lo hace mediante mutilación de bases.

Eso se vió como decíamos en los 60 y 70.

El sistema se llamó de restricción-modificación. Porque la bacteria restringe el crecimiento de bacteriófagos y porque la bacteria modifica su propio DNA para evitar restringir su propio crecimiento. En la década de los 60 lo descubrió Arber.

En el año 78 se aisla la primera endonucleasa de restricción, Hind II. Se aisló de Haemophilus influenzae.

Las endonucleasas de restricción son especiales. Son un tipo de nucleasas que se ocupan de detectar secuencias y recortar el DNA por ahí.

Cuando se descubrieron, vieron que las endonucleasas eran de tres tipos.

Las endonucleasas de tipo II reconocían la secuencia y la cortaban dentro de ella.

Las de tipo I reconocían esa secuencia pero luego recortaban en otros sitios más lejanos.

O sea que las verdaderamente interesantes son las endonucleasas de restricción tipo II. Son a las que normalmente nos referimos cuando hablamos de enzimas de restricción. Son las que utilizamos realmente en el laboratorio.

Cuales son las más famosas…

EcoRI reconoce la secuencia GAATTC…. y la corta.

HindIII reconoce AAGCTT

BamHI GGATCC

EcoRV reconoce GATATC

Normalmente las secuencias que reconocen son de 4 a 8 pares de bases. Normalmente necesitan cadena doble. Además son secuencias palindrónicas, es decir que se leen igual en sentido 5'-3' por las dos cadenas.

Siempre cuando usamos nomenclatura para secuencias de reconocimiento estamos representando el 5' a la izquierda y el 3' a la derecha. Así que evidentemente la secuencia que reconoce BamHI será GGATCC/CCTAGG.

Se habla de dianas y no de secuencias. Esas dianas serán cortadas de maneras específicas de cada enzima. Por ejemplo, BamHI localiza la diana que vimos antes. Y corta, cada cadena entre las dos G. Con lo cual nos quedarán extremos abiertos y no apareados como resultado.

Otras enzimas cortan de forma que no dejan extremos sesgados o en escalera. EcoRI y KpnI también dejan escalera, como BamHI, pero HpaI por ejemplo no deja los extremos con bases desapareadas. Es decir que cada enzima corta de una forma específica.

Cuando en las moléculas nos quedan los extremos con bases no apareadas (también llamadas extremos sesgados o en escalera)… decimos que tenemos extremos cohesivos. Se llaman así porque tienen afinidad entre ellos y podrían eventualmente (si les damos tiempo) volver a aparearse.

Cuando en las moléculas nos quedan extremos sin bases libres, decimos que tenemos extremos romos. Se llaman así porque prácticamente no hay forma de que se puedan cohesionar nuevamente.

Cuando dos endonucleasas de restricción reconocen la misma secuencia se llaman izosquizómeros. MboI y Sau3A I son dos típicos isosquizómeros.

La electroforesis y las endonucleasas de restricción

Cuando se descubrieron, existía una tecnología clave para el análisis del DNA. Para saber si las endonucleasas habían recortado efectivamente el DNA se necesitaba hacer una separación de los fragmentos de DNA. Para eso se usaba electroforesis en geles de poliacrilamida-acrilamida (mejor resolución) o en geles de agarosa (más típicos para DNA, menor resolución).

Así entonces se podía ver si las DNasas efectivamente recortaban el DNA o no.

En la electroforesis el DNA se movía y se disponía, avanzaban más las moléculas más pequeñas. Se formaban así bandas. Para la revelación, se usaba el bromuro de etidio, un fluorocromo que se asociaba al surco mayor del DNA.

Es importante entender que la electroforesis no hace más que separar secuencias por su tamaño. Las endonucleasas no hacen más que eso: recortar el DNA para obtener secuencias de tamaños diferentes.

Se compran en catálogos por unidad, una medida de la actividad de la enzima. Una unidad representaría la actividad enzimática requerida para romper completamente 1 microgramo de DNA del fago lambda en 1 atmosfera, a 37 grados centígrados en un volumen de 50 microlitros. Es una medida estándar.

Es una cosa ya muy vista. Las moléculas se separan migrando hacia la solución que presenta el electrodo positivo.

Normalmente es difícil encontrar bandas discretas. Generalmente quedan los llamados “smear”, que vendrían a representar la molécula de DNA con miles y millones de roturas al azar. Desde tamaños más grandes a tamaños muy pequeños. O sea que no se forman bandas verdaderas.

Cuando encontramos bandas discretas, es evidente que la enzima utilizada es específica y no corta en cualquier lugar al azar. Por eso se forman las bandas con grandes cantidades de DNA del mismo tamaño.

Experimentos con Tribolium confusum

Hacemos un experimento aislando, cortando y electroforando el DNA de esta especie. Diferentes enzimas cortarán el DNA en diferentes lugares o en lugares similares. Por eso nos quedan bandas diferentes.

Pasa algo similar con la variable tiempo. Las enzimas necesitan tiempo para digerir el DNA. Entonces si electroforamos DNAs+DNasas en diferentes tiempos de acción, también nos quedarán bandas diferentes. Si dejamos que actúe completamente, las bandas serán las definitivas. Si no dejamos que actúe completamente se formarían bandas de mayor peso molecular que representarían fragmentos todavía no cortados completamente.

Los experimentos de Stanley y Boyer - la primera molécula recombinante

Se les ocurrió cortar dos moléculas diferentes de DNA con la misma endonucleasa tipo II. Previeron que EcoRI generara extremos cohesivos. De manera que cuando pusieron todo el DNA cortado y le dieron el frío necesario para que consiguiese hibridizar, se formaron los enlaces. Así, a partir de DNA eucariótico y DNA de un plásmido procarionte, generaron una molécula de DNA híbrida recombinante. Luego la DNA ligasa (que también estaba aislada y se podía emplear en laboratorio), sellaba las uniones y generaba la molécula recombinante final (reacción del ligación). Pero claro… quedaban muchos plásmidos diferentes dado que EcoRI cortaba el DNA eucariótico en muchos lugares.

Evidentemente el paso siguiente era meter el plásmido recombinante dentro de una bacteria mediante clonación.

La clonación no es ni más ni menos que insertar un fragmento de DNA en un organismo dado buscando que se replique, divida, exprese, y se transmita.

Ahora la bacteria recombinante tendría el plásmido recombinante y por lo tanto expresaría genes EUCARIONTES!!!!

Cualquier molécula que permite la transferencia de una secuencia de DNA para generar moléculas recombinantes será un vector de clonación. El plásmido era el vector en el caso del experimento de Boyer.

Al final se conseguían las colonias que hubieran incorporado diversos fragmentos de DNA eucarionte mediante transformación a través de los plásmidos y que por lo tanto expresarían diversos genes eucariontes. Además habría algunas cantidades de plásmidos que se hubieran resellado entre ellos solos y entonces habría

PROBLEMAS: Los plásmidos permiten meter fragmentos pequeños. Por eso se usan muchos vectores dependiendo de lo que queremos hacer. Lo más importante es hacer los experimentos para controlar todo el tema periódicamente.

Los vectores de clonación

El primero que se utilizó, es el plásmido pBR322. Ahora casi no se utiliza ya. Es un vector que él mismo ya es recombinante dado que él mismo proviene de dos plásmidos que se fusionaron. Tiene resistencia a ampicilina y resistencia a tetracicilna, admás de un ori.

El vector siempre debería digerirse mediante una endonucleasa de restricción. O sea que habrá en su secuencia dianas de restricción, cuantas más mejor. Esos sitios de restricción además deben ser únicos dado que si digerimos un plásmido con una enzima y nos quedan miles de trozitos después de digerirlo, no podremos generar moléculas recombinantes útiles. Entonces deben tener sitios de restricción únicos para cada enzima para que sea así donde se introduzca.

Además suele ser necesario que tengan marcadores para saber si la molécula recombinante se generó o no. Eso se consigue mediante los genes de resistencia a antibióticos. Si cortamos con una endonucleasa que digiera justo en el medio de alguno de los dos genes de resistencia, entonces el gen que sea incluido estará interrumpiendo alguno de los dos genes de resistencia y por lo tanto la resistencia se perdería. En resumen así luego podemos plaquetar, etc. y descubrir cuales son las colonias que incorporaron el plásmido.

Otra cosa necesaria es obviamente el ori, para que el plásmido se replique en cada ciclo de la bacteria y así se transmita a la descendencia como elemento genético.

Tipos de vectores utilizados en E. coli

No todos los vectores pueden admitir los mismos fragmentos. Si solo admite 100 pb y yo quiero meter 100 kb, entonces deberé usar otro tipo de vectores. Evidentemente hay muchos.

• Plásmidos: los que vimos que se modifican por técnicas de DNA recombinante, son normalmente los que se utilizan dado que no se suele buscar meter más que algunos miles de pares de bases… el tamaño máximo que admiten es 15 kbp. Se mete en E.coli mediante transformación, o sea que la bacteria debe hacerse competente primero (que admita la inclusión del DNA a través de la pared bacteriana). Para ello se usa electroporación, frío, etc. La propagación es evidentemente a través de la replicación del plásmido.

• Bacteriófago Lambda: Lambda está modificado y ciertos genes están reemplazado por los fragmentos que queremos introducir. El vector recombinante entonces se empaqueta in Vitro. La propagación es con la replicación del fago. Admiten hasta 23 kbp.

• Cósmidos: híbridos entre genes del fago Lambda (secuencias cos de los extremos que le permiten circularizar) y oris y genes de plásmidos. Se pueden introducir fragmentos de hasta 45 kbp. Se replican como plásmidos.

• BACs…

En los catálogos se compran. Tienen una gran diversidad.

Rastreando los clones

Cortamos el plásmido pBR322 con SalI que corta en una diana que se encuentra en la zona de genes de resistencia a tetraciclina. Además de Sal I podríamos haber cortado con otra decena de endonucleasas que también podrían haberse escogido dado que tienen dianas en esta región. Se digiere el DNA eucarionte y se lo mezcla y liga con el DNA plasmídico digerido. Se formarán evidentemente moléculas recombinantes pero solo en algunos casos…en otros las bacterias simplemente estarán incorporando plásmidos que se autoligaron y por lo tanto recuperan el gen de resistencia a tetraciclina activo. Las colonias entonces serán Amp+/Tet+ (si no incorporaron plásmidos recombinantes) o Amp+/Tet- (los que incorporaron plásmidos recombinantes). Mediante la réplica en placa que tengan Amp solamente, y Tet solamente nos darán las colonias que estamos buscando.

El sistema es sin embargo muy rudimentario. Actualmente hoy en día hay otras cosas que nos permiten hacer las cosas más rápidamente. Serán las que en verdad usaremos nosotros en prácticas. Pero no quita que debamos saber cómo se hace de forma más básica también.

Plásmidos actuales - Los Polilinker y Los genes Lac-Z

Tienen su origen, tienen sus genes de resistencia para rastrear… y tienen un sitio donde están todas las dianas de restricción una al lado de la otra. En ese sitio entonces se darán todos los cortes. Esos sitios llamados POLILINKER (sitios de restricción múltiple) son los que tendrán entonces todas las dianas en solo 42 pares de bases. Sin embago están metidos en el medio de la Beta-galactosidasa (metaboliza el X-Gal). Entonces el plásmido es capaz de sintetizar una parte de la Beta-galactosidasa sin poder sintetizar la restante (debido que está interrumpido por el polilinker).

Una vez hecho el proceso de recombinación de DNA…. Se plaquetan las colonias en placas con Ampicilina y X-Gal. Las bacterias además tienen un plásmido F típico. Si la bacteria crece en Ampicilina entonces nos quiere decir que incorporaron el plásmido (aunque no sabemos si incorporó el plásmido recombinante o el plásmido sin el inserto). O sea que la resistencia a antibióticos nos permite hacer un control muy claro.

Las que hayan incorporado el plásmido sin el inserto además tendrán la secuencia de la beta-galactosidasa completa. Junto con otras proteínas que son parte del metabolismo de la galactosa y que aporta la bacteria, las colonias podrán sintetizar la beta galactosidasa completa. El X-Gal entonces se metabolizará y eso dará un color azul en las colonias que tengan la beta-galactosidasa completa.

Las que hayan incorporado el plásmido con el inserto tendrán la secuencia del lac-Z interrumpida. O sea que no podrán metabolizar X-Gal en ningún caso y por lo tanto no tendrán color azul. Las colonias blancas entonces serán las que tendrán el plásmido con lo que yo quería clonar.

Recupero las colonias plancas picando esas colonias y pasándolas a medios de cultivo en suspensión para que proliferen y así cada vez tengo más de mi fragmento. Eso al final servirá para estudiar otras cosas.

Cromosomas artificiales de bacterias y de levaduras

Los YAC son cromosomas manipulados. Tienen una forma circular. Tienen más o menos 11,4 kb. Admite la inclusión de kilo o megabases. O sea que permiten clonar muchas cosas. Sin embargo el proceso también es más complejo. En el vector se tienen varias cosas esenciales. Al ser un cromosoma tendremos que meterle secuencias para telómeros, origenes de replicación, centrómeros y marcadores selectivos (similar a como antes era el tema de los antibióticos).

Si cortamos el YAC circular con BamHI se logra linealizarlo. Luego SnaBI es la diana para SnaBI donde se puede insertar lo que queramos clonar.

Entonces el proceso es simple… primero consigo pegar todas las secuencias necesarias. Luego circularizo el cromosoma. Después lo digiero con SnaBI para insertar el clon y para replicarlo en bacterias por ejemplo (funcionando como un plásmido bacteriano). Luego con BamHI se linealiza y se incluye en las levaduras.

Al final los marcadores nos permiten ver cuales son las colonias de levaduras que incorporaron el inserto.

Enzimas utilizadas en la tecnología de DNA recombinante a través de las recetas

La DNA ligasa y las endonucleasas de restricción las nombramos. Las polimerasas también se utilizan mucho. Si no se tienen extremo cohesivos y queremos clonar extremos romos, por ejemplo se usan enzimas como la Transferasa Terminal (añade nucleótidos en un extremo romo generando extremos cohesivos) o la Exonucleasa III (se come nucleótidos en una dsDNA a partir de un extremo romo para generar extremos cohesivos). Hay muchas otras más.

Qué nos permite esta técnica?

Separar diferentes fragmentos para establecer librerías genéticas del DNA eucariota usado a través de las colonias con los clones.

Luego podemos intentar amplificar ese fragmento para luego poder responder muchas otras preguntas. Primero elijo la colonia que quiero de entre las de mi librería. Luego elijo el método para amplificar esa secuencia.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - Amplificación de DNA

Surge en los años 70. Se usan unas maquinitas. La tecnología la inventó Mullis en el 88. Se le ocurrió que de la misma forma que se puede en un tubo de ensayo replicar el DNA (metiendo todas las enzimas necesarias), se podría intentar repetir lo mismo pero a gran escala y como una reacción en cadena. Siempre que meta los nucleótidos, los primers (que se autohibridizarían en donde les corresponda) y la polimerasas. Podríamos entonces replicar esas dos cadenas. La idea fue patentada. Si el ciclo se repetía, las moléculas eran replicadas sucesivas veces y de esa manera se amplificaba la cantidad de DNA presente.

El factor determinante de qué sería replicado era precisamente los primers que se usaban.

Cuando se quería amplificar una cierta secuencia, se usaban primers para cada uno de los flancos de esa secuencia. Así la polimerasa solo polimerizaba a partir de ese primer y hasta el final de la molécula. En los ciclos sucesivos, la molécula era cada vez más corta hasta que lo que se replicaba era solo la secuencia flanqueada. En el diseño original, Mullis tomaba su tubo de ensayo y lo calentaba para desnaturalizar la molécula y permitir la entrada de los primers. Luego enfriaba para permitir la hibridación. Luego aumentaba algo más la temperatura para que se activara la polimerasa. Esto lo repetía en ciclos manualmente.

Eso hoy en día lo hace una máquina que lo que hace es establecer automáticamente los ciclos de apareamiento (hibridación) - desnaturalización. Así, con solo añadir lo necesario en la máquina y ponerle la información necesaria, establece los ciclos de cambios de temperatura automáticamente.

La temperatura de desnaturalización es alrededor de 95 grados. La temperatura de anillamiento es de unos 55 grados. Luego la temperatura de polimerización (extensión) es a los 72 grados. Los ciclos se repiten sucesivas veces. Luego de la terminación de la PCR se enfría a 4 grados para permitir la unión de los segmentos, etc.

¿Qué necesitamos? El DNA que incluya la secuencia a amplificar, los primers específicos para la secuencia que se quiere amplificar, los dNTPs (monómeros), MgCl2 (estabiliza el DNA para evitar la digestión), la Taq polimerasa (polimerasa extraida de una bacteria termófila Thermus aquaticus que aguanta las altas temperaturas de algunas fases del ciclo y no se desnaturaliza… la polimerasa suele obtenerse industrialmente mediante E. coli modificadas), buffer específico (estabilización de la Taq polimerasa).

La amplificación es exponencial con base 2. En n ciclos obtendré 2n copias. La amplificación en unos cuantos ciclos es entonces muy importante.

Sin embargo, aparte de amplificar…. No hace más.

Electroforesis de muestras amplificadas

A partir de la molécula inicial…obtenemos altas concentraciones de una secuencia de un tamaño concreto. Por lo tanto si la PCR salió bien… deben salir bandas muy concretas y concentradas, siempre discretas. Si en extractos de DNA desde diferentes personas obtenemos diferentes tamaños de muestra amplificada para los mismos primers eso evidentemente estaría indicando un polimorfismo en la población para esa secuencia.

A diferentes concentraciones de MgCl2, dNTPs o Taq, se pueden obtener resultados diferentes. Es por eso que para comprobar la “especificidad” de los primers, debemos repetir la PCR con diferentes concentraciones para garantizar así que la secuencia que se está obteniendo es la correcta y la buscada y no hay otras que me esté escondiendo.

Las aplicaciones de la PCR son diversas y todas muy útiles.

Normalmente para saber qué primers hay que usar debemos primero saber qué secuencias flanquean el inserto que yo quiero amplificar. Eso no se puede hacer directamente a partir de un fragmento recogido de una electroforesis o de un blot. Lo que suele usarse es el conocimiento del vector que me permitió meter el inserto en la colonia y sabiendo las secuencias donde se da la inserción cuando se clonó el inserto puedo crear primers para esas secuencias y de esa manera tendré los flancos del inserto que quiero amplificar!

Librerías genómicas (genotecas) y cDNA

Los genomas almacenados entonces en estas colonias son las genotecas o las librerías genómicas. Es tener todo el genoma de un individuo digerido e insertado mediante vectores en unas colonias que se tienen en las placas de petri que se mantienen. Existen fórmulas estadísticas que nos permiten averiguar cuantas clonaciones hay que hacer para garantizar la precisión de la librería.

Cuanto más secuencia pueda meter en el vector, menos me ocupará la librería del genoma.

Problema… normalmente no quiero tener TODO el genoma dado a que tenemos normalmente secuencias altamente repetidas, heterocromatina y tal y secuencias que no nos interesa conservar en una librería. Existe la posibilidad de tener solo las cosas que se transcriben. Entonces se pueden hacer librerías de cDNA (complementary DNA). O sea que primero aislo los mensajeros de un organismo. Uso la retrotranscriptasa para sintetizar el dsDNA a partir de ese mRNA (+) usando unos primers (se usa un poli T complementario al poli A de la cola de los mRNA activos). El dsDNA resultante será el que se clonará para establecer las placas con las colonias.

Qué se puede hacer a partir de las librerías?

Se puede intentar secuenciar el genoma del organismo. Pero también se puede intentar si una secuencia de un gen de un organismo es similar o parecido o está incluso conservada en el organismo del que tengo la genoteca. Para saber eso también se requieren unas técnicas que nos permiten ver si una secuencia está en alguno de los clones. El proceso se llama identificación de un clon con el fragmento de DNA deseado mediante sondas de DNA.

Sondas de DNA e hibridación de DNA radiactivo

Para la identificación de un clon con el fragmento de DNA deseado se usan sondas de DNA marcadas radiactivamente por ejemplo.

Primero se deben pasar las colonias a un filtro que suele ser de nitrocelulosa. Ese filtro que debe tener el tamaño de la placa de petri que nosotros hemos orientado. Si presionamos el filtro sobre la placa y luego retiramos y tratamos con álcali, al final tendré el DNA desnaturalizado proveniente de las bacterias. Se pone el DNA marcado que estoy buscando si existe. Se usan unas condiciones de incubación adecuadas y se deja que la sonda busque los sitios complementarios si existen. Luego se da un lavado para eliminar las sondas que no se hayan hibridada. Se usa una radiofotografía (autoradiografía) para poder revelar si las sondas se hibridaron. Además podré saber en cuales de mis colonias tenía la secuencia haciendo el rastreo en reverso.

Para la autoradiografía se impresiona en una película para rayos X.

Marcando sondas de DNA mediante diferentes técnicas

Se puede marcar de 2 formas distintas. La primera es una técnica que es la “nick translation”. Se usa desde 1977 y la diseñó Rigby y colaboradores. Es más antigua y está basada en la replicación de DNA. Usa dos enzimas, una endonucleasa (DNAasa I) y una polimerasa I (la de Corberg). Esencialmente se usa una DNAasa I para cortar el DNA dejando extremos 3' y 5' libres. La polimerasa I actúa por un lado con su actividad exonucleasa especial (5'-3') eliminando a partir del extremo 5' y sintetizando sobre el 3' una cadena de reemplazo usando los dNTPs marcados radiactivamente que agregué en mi preparado.

La otra es “random primer”. La diseñó Feinberg y Vegelstein en 1984. Se usan primers (oligonucleótidos) de síntesis in Vitro. Se sintetizan hexanucleótidos con muchas combinaciones al azar de manera que la posibilidad de encontrar los primeres del material del que quiero una sonda radiactiva sea alta. Todos esos primers (primer pool) se meten en el eppendorf y se usa la reacción de la polimerasa como si fuera una PCR para obtener así una sonda marcada amplificada. Al final obtendré de una u otra manera la sonda necesaria.

Problemas de la hibridación

No es una técnica muy específica. La hibridación puede darse con muy pocas kilobases y por lo tanto no es un método exacto. Por ejemplo, si la sonda es de 100 kb y el inserto en las colonias es de 20kb entonces podría hibridarse solo 20kb y eso sería suficiente para que se de la radiografía positiva. El problema sería que no estaríamos siendo completamente seguros…

Hibridación in situ

Usa el mismo principio pero sobre cromosomas completos (y no sobre librerías genómicas) para saber así en qué cromosoma está la secuencia rastreada mediante la sonda.

El Southern Blot

La técnica consiste en la transferencia de DNA desde un gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa. Es similar a como pasabamos el DNA de la bacteria de la placa de agar al filtro de nitrocelulosa en el rastreo con sondas de hibridación (el experimento anterior).

Tenemos primero un DNA digerido que se carga en el gel. Se hace la electroforesis y eso hará que se dispongan los fragmentos en su sitio correspondiente. Pero para trabajar mejor sobre ese DNA debemos pasar esa información a un filtro de celulosa. Lo que se hace es hacer una transferencia de DNA.

Es algo que dependiendo del dinero que se tengan en el laboratorio se puede hacer muy rápido o muy lento. Hay máquinas muy caras que lo hacen automáticamente. Pero originalmente se hacía alla povera (en italiano: a lo pobre).

Sobre el gel se pone el filtro. Sobre el filtro se ponen algunos papeles absorbentes. Debajo de todo eso se pone una esponja y eso se mete en una solución salina. La solución asciende por capilaridad y se lleva el DNA del gel pegándolo a la nitrocelulosa.

Luego del blot ya tenemos el DNA en la nitrocelulosa. Como antes, ahora podemos sobre ella usar técnicas de rastreo de secuencias mediante sondas como antes. Se pueden poner las sondas buscadas y luego todo se cierra en una bolsita sellada. Se deja que la sonda se hibride y luego se elimina el exceso de sonda. Si la sonda se unió podré ver así mediante una autoradiografía en qué banda se ha unido y por lo tanto el tamaño aproximado de la secuencia que estoy rastreando.

Si la hibridación me da una banda única, eso es una información clave. Me quiere decir que la sonda hibrida completamente en ese tamaño. Es decir que la endonucleasa de restricción no cortó por el medio la secuencia que estoy rastreando. Si hubiera dos bandas radiactivas evidentemente la nucleasa rompió la secuencia en dos trozos de tamaño diferente y por lo tanto la sonda se hibrida en ambas y aparecen dos bandas de distinta movilidad. Si corta 2 veces veré tres bandas, etc. O sea que es una información clave sobre una región del genoma.

La diploidía y el blotting

Los organismos dipoloides tienen dos cromosomas homólogos. Si se ve una sola banda, evidentemente me está indicando no solamente que no se cortó la secuencia por dentro, sino que la endonucleasa cortó por el mismo sitio en los cromosomas homólogos dado que la sonda reconoce por igual un homólogo que el otro (Es una sonda hibridante y ya sabemos que son poco específicas). O sea que obviamente el organismo será homocigoto.

Pero si tenemos un organismo heterocigoto, podríamos tener cortes y bandas a diferentes movilildades. Habría una banda radiactiva muy intensa de baja movilidad y luego dos cuyos pesos moleculares sumados darían el peso molecular de la banda intensa de baja movilidad. Es decir que esas otras dos bandas serían las originadas por un recorte dentro de la secuencia de uno de los homólogos. O sea que las bandas nos pueden indicar si un organismo es heterocigoto u homocigoto para una cierta secuencia. Tanto si tenemos 2 bandas de igual intensidad y diferente movilidad como si tenemos 3 bandas, una de intensidad grande y 2 de intensidad media con pesos moleculares bajos, tendremos organismos heterocigotos.

Obviamente entonces hay que considerar en el blot el tema de la diploidía.

Mediante blotting también se puede evaluar el polimorfismo que existe para un gen en una población…

Secuenciación de librerías - Genómica

La técnica se conoce desde el 77. Hay dos sistemas que uno puede considerar como “el europeo” (el método de Sanger) y “el americano” (el de Max Sam y Gilbert). Este último es menos utilizado. El método de Sanger del 77 es el verdaderamente usado hoy en día. Lo diseñó cuando trabajaba con Fi-X-174. Tenía 5000 pb nada más y fue el primer organismo secuenciado.

Tenemos un fragmento que queremos secuenciar. Para ellos se utilizaba la polimerización del DNA. Se usan 2, 3-dideoxinucleótidos (nucleótidos que no tienen ninguno de los hidroxilos, ni el 2 ni el 3). Es necesario el uso de un primer cuya secuencia debe sacarse de algun lado (de la PCR, del vector, etc.). El primer sirve para comenzar la polimerización. El método se basó en un pensamiento de Sanger sobre unos nucleótidos especiales que interrumpían y desensamblaban la polimerización produciendo oligonucleótidos no acabados. La reacción se hacía con un dideoxinucleótido para cada base nitrogenada, A, T, C, G. Se obtenían como resultado los oligonucleótidos detenidos en el lugar en que era añadida la base complementaria dideóxida. Al final una secuencia 5'-ATTCGCGTACT-3' que quiero secuenciar sería como lo siguiente: podríamos usar como primeres un trinucleótido AGT y dideoxiATP. La reacción de Sanger originaría los siguientes oligonucleótidos posibles (en unas proporciones intermedias cada uno): AGTA, AGTACGCGA, AGTACGCGAA, AGTACGCGAAT. En resumen, puedo saber que la base 4, 9 y 10 (desde el EXTREMO 3'!!!) serán timinas. El tamaño de los olignucleótidos producidos necesita revelarse mediante una electroforesis. Generalmente en el gel se ponen 4 pocillos, uno con la reacción con cada diferente dideoxinucleótidotrifosfato. Al final me quedarán unas bandas que distribuirán la existencia de esos oligonucleótidos. Al final podré leer desde los de mayor movilidad (los más pequeños) hasta menor movilidad la secuencia en orden 3'-5'.

Casi todos los genomas conocidos actualmente se han descubierto con este método. En 1995 se secuenció Haemophilus influenzae (el primer procarionte), en 1997 Saccharomyces cerevisiae, en 1999 Caenorhabditis elegans, en 2001 Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster y casi todo el genoma humano. Sanger y Maxam y Gilbert recibieron el Nobel de Química en 1980. Sin embargo, la secuenciación, aunque es muy útil, revela muy poco sobre la genética en sí.

Secuenciación automática

La secuenciación automática usa el mismo sistema. La única ventaja es que en lugar de hacerlo en un gel de acrilamida que luego tiene que impresionarse, etc. se usan fluorocromos de colores diferentes para rastrear cada nucleótido. La electroforesis es capilar y no la ve más que el aparato. Cada base entonces tendrá un color y al final el secuenciador recompone los colores y a nosotros nos aparece directamente la secuencia.

APLICACIONES DE LA TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

Son tan amplias que podríamos estar hablando días y días. Sí que hay algunas que son muy básicas y que debemos saber dado que se utilizan para muchas otras cosas más (son más generales y menos concretas). Estas aplicaciones de amplio espectro son fundamentales para el estudio de genética.

Los Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLPs)

Fueron de entre las primeras aplicaciones de toda esta tecnología. Los polimorfismos ya los vimos antes. Los polimorfismos son las alternativas que tiene una secuencia. Las secuencias monomórficas son las que son siempre iguales. En genética obviamente nos interesan las diferencias y los polimorfismos. Entonces lo que nos interesa en este caso el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción. Los RFs son precisamente eso, los fragmentos que se generan por cortar una molécula con una enzima de restricción.

La técnica entonces me permitirá saber cuan polimórficos serán los individuos de una población para la misma longitud de los mismos fragmentos de restricción. Evidentemente necesitaré primero el DNA de diferentes individuos. Luego necesitaré cortarlos con la misma enzima de restricción. Analizaré los fragmentos que tengan la misma longitud aproximada para ver sus polimorfismos.

Para ello utilizaré sondas de DNA que sea capaz de reconocer las roturas que en el DNA produce una endonucleasa de restricción. Como sondas se suelen usar las llamadas STS, sequence tagged sites: secuencias cortas de 100 a 500 pb que se encuentran una sola vez en el cromosoma o el genoma estudiado.

Lo que se llaman RFLPs realmente son esas imágenes en que nos comparan la movilidad electroforética de los digeridos reconocidos por estas sondas especiales. Obviamente si la secuencia es monomórfica, la movilidad de todo y las bandas serán iguales en todos los individuos. Si la secuencia es polimórfica, obviamente las movilidades podrían ser diferentes y así las bandas lo serían también, etc.

Una de las primeras aplicaciones de esto fue el clonaje posicional: saber la localización de un gen (cartografiado cromosómico) en un cromosoma.

Pero también sirven para el diagnóstico de ciertas enfermedades. Pero también sirven desde un aspecto del análisis evolutivo - divergencia genética entre poblaciones o especies distintas o relacionadas.

Además de las sondas…se pueden usar PCRs para amplificar los fragmentos diferentes generados por el digerido y así electroforarlos para dar lugar a las “RFLPs”. Sin embargo, no serían verdaderos RFLPs en el sentido estricto. Sin embago, el término RFLPs siempre se usa cada vez que se ponen de manifiesto polimorfismos a partir de fragmentos de restricción.

Las STS son más que nada interesantes por permitir la localización de un cromosoma concreto. Ya se sabe que en el cromosoma humano 1, hay una cierta secuencia (ya identificada y tal) que es su STS. Entonces son muy importantes e interesa mucho usarlas en los RFLPs para detectar polimorfismos en una especie (dado que son específicos de un cromosoma y así no hay peligro de que una sonda rastree cromosomas de diferentes tamaños y que tengan complementarios que podrían conllevar a errores).

Diagnóstico mediante RFLPs

Imaginamos que tenemos una enfermedad genética determinada que se transmite de forma dominante. Si es una enfermedad dominante, solo los homocigotos recesivos dejarán de presentar la enfermedad. Hasta que aparecieron los RFLPs, se hacían solo árboles genealógicos y ver si los árboles se ajustaban a un cierto patrón de herencia. Eso era lo único que nos permitía elucidar laposbilidad de la transmisión hereditaria de una enfermedad. Los RFLPs intrafamiliares permitieron averiguar que existían polimorfismos entre los descendientes que eran enfermos y los que no. Así se averiguó el RFLP de cada enfermedad y hoy en día se usan para rastrear esas enfermedades en la población.

En el ejemplo tenemos un padre heterocigoto enfermo y una madre homocigoto saludable. El RFLP de la madre es diferente del RFLP del padre. La RE corta de manera que genera en los cromosomas enfermos por el medio y por los costados. En los cromosomas saludables solo corta en dos sitios dejando un RF que contiene la zona de reconocimiento por la sonda. A la vez, la sonda STS reconoce tanto el fragmento 1 como el 2 en el caso del RF del cromosoma enfermo.

Al analizar el RFLP de la madre y el padre, el del padre tiene 3 bandas, una de tamaño grande (el cromosoma saludable), y dos de tamaño más pequeño (fragmentos del cromosoma enfermo). La de la madre tiene un solo framento grande (los dos fragmentos del cromosoma saludable).

Al analizar el RFLP de la descendencia, los individuos que presentan la enfermedad (heterocigotos) tienen 3 bandas como el padre y además en los mismos sitios. Los que no tienen la enfermedad tienen 1 sola banda, como la madre. Aparece sin embargo un hijo (de entre los 8 descendientes) que no presenta la enfermedad pero que es homocigoto. Ese caso más complicado lo veremos luego.

Evidentemente, estos RFLPs sirven para una cosa muy concreta. Si la segregación de mis RFLPs es igual que la segregación de la enfermedad evidentemente las secuencias reconocidas por los STS y las secuencias que regulan la enfermedad ESTAN EN UN MISMO GRUPO DE LIGAMIENTO. Y no solo eso… podemos además asegurar que es el alelo dominante (el enfermante) el que está ligado con el fragmento que produce 2 trozos.

¿Por qué entonces me aparece el hijo ese raro? PORQUE PUEDE HABER ENTRECRUZAMIENTOS EN LA GAMETOGENESIS DEL PADRE HETEROCIGOTO… eso haría que ahora, el alelo dominante pase a estar ligado al RF que produce un solo trozo en vez de estar ligado al que produce 2. Y por eso efectivamente obtendré (algunos, muy pocos) RFLPs de individuos heterocigotos que tengan una sola banda!

Esta última comprobación es resonante. Efectivamente la STS de ese cromosoma debe estar ligada al gen de la enfermedad. Así se puede rastrear enfermedades y asociarlas mediante hibridación in situ a cromosomas concretos. Luego rastrear esas secuencias por los diferentes cromosomas y de esa manera permite usar el diagnóstico de enfermedades mediante comparación de RFLPs. Además se podría comenzar a buscar las secuencias a partir del STS hasta llegar a la secuencia que representa el gen de la enfermedad. Esa es otra técnica que veremos más adelante…

DNA fingerprinting (huellas de DNA)

Sirven para poner de manifiesto los polimorfismos en las poblaciones pero a través del uso de microsatélites (secuencias pequeñas muy repetidas que aparecen como satelitales en los gradientes de CsCl2). Lo que se hace es romper el DNA de un sospechoso mediante unas endonucleasas. Se separan los fragmentos por electroforesis y luego se marcan esos microsatélites (mediante sondas para microsatélites) dándonos unos patrones de bandas MUY ESPECIFICOS. Se llaman huellas porque los microsatélites caracterizan a un individuo a nivel individuo-específico.

RFLPs mediante PCR

Es más rápido. Se saca sangre. Se aisla el DNA y se hace la PCR a partir de cebadores especiales (los mismos para todos los individuos). Al final nos saldrán RFLPs mediante la revelación de la electroforesis. Obviamente me resultarán amplificados unos microsatélites determinados. Si los individuos son monomórficos, las secuencias amplificadas serán las mismas y por lo tanto las bandas en electroforesis serán las mismas para todos. Si son polimórficos las bandas serán diferentes revelando la existencia de diferentes tamaños en las secuencias amplificadas. Eso también puede rastrearse luego mediante sondas que hibriden las regiones complementarias con los primeres y luego se pueden hacer mapas de manera similar a como los hacíamos antes con las sondas. Al final los diagnósticos y el cartografiado. son igualmente posibles mediante este método.

Marcadores cromosómicos

Los RFLPs están muy relacionados con los estudios de ligamiento cromosómico. Veremos el caso del cromosoma 1 humano.

Si nosotros tenemos una familia a la que aplicamos un RFLP y vemos un individuo recombinante podemos efectivamente comprobar que haya marcadores y loci ligados en un cromosoma. En conclusión así se puede ir localizando genes en cromosomas. Se construyen finalmente mapas genéticos humanos. Al final podemos incluso calcular a cuanto equivale un cM.

La longitud del mapa del genoma humano se estima en 3000 cM. Ya que la longitud física haploide del cromosoma humano es de 3000 . 106 pb, un cM equivaldría a 106 pb (1 Megabase).

Si por cartografía convencional se ve que un gen está a una distancia del marcador de 3 cM, entonces podemos estimar que está a 3 Mb. Al final se puede ir rastreando desde el marcador hasta el gen buscado a lo largo de esas 3 Mb.

La corea de Huntington fue investigada en el 83. Descubrieron un marcador ligado al gen de la enfermedad (ligado al cromosoma 4). 10 años después en el 1993 se pudo aislar el gen finalmente (buscando desde ese marcador). Igual que con esto se fueron buscando marcadores y enfermedades relacionadas. Ejemplos como la fibosis quística, la epilepsia miaclónica juvenil, etc. fueron descubiertos así.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov es la página del centro nacional (de EEUU) de información biotecnológica. La página tiene muchísimas posibilidades. Es una herramienta informática clave. Se pueden analizar ORFs, secuencias, bancos genéticos, etc. En el BLAST se hacen análisis de secuencias. En la sección de Genomic biology están publicados todos los genomas hasta ahora secuenciados completamente. Se puede uno incluso ir hasta cromosomas determinados, a ver marcadores determinados incluso ver y comprar los primers de esos marcadores.

Paseo cromosómico (Chromosome trace) y rastreo de secuencias

Es algo bastante ingenioso aunque algo burdo e inespecífico todavía. Lo cierto es que se puede ir paseando de secuencias más cercanas a un marcador (lo que yo conozco) hasta secuencias más cercanas al gen que estoy investigando.

Nuestro marcador no es más que una secuencia de DNA con una longitud precisa. Por un lado entonces tendremos el marcador.

Por otro lado tendremos lógicamente la librería genómica (en placas de petri y tal).

Lo primero que tenemos que hacer es obviamente localizar donde está el marcador en todas esas secuencias. Para eso ya sabemos que si lo marcamos, si lo que hacemos es una transferencia sobre un filtro de nitrocelulosa, nosotros podremos hibridarlo y saber en cual de todas esas secuencias (en cual de mis colonias) estará el marcador. Esa sería la colonia “de inicio”. Deberíamos crecerla y luego rescatar de ahí la secuencia donde está el marcador. En esa secuencia obviamente no solo estará la secuencia del marcador sino también otras secuencias que no son hibridables por el marcador. ¿Entonces qué hago con ese fragmento? Simplemente lo subclono… es decir… a partir de un fragmento de un clon, lo que a mí me interesa lo SUBCLONARÉ. Para eso lo digeriré con una endonucleasa de restricción diferente de la primera y volver a subclonar esos cachos en una nueva placa con colonias que serían muy importantes dado que en algunas estará “A” (la secuencia del marcador) y en el resto estará lo que estaba CERCA de “A”. Otra vez eso lo hibrido con la sonda marcadora y busco ahora efectivamente CUAL DE TODOS ESOS SUBCLONES TIENE LA SECUENCIA “A”. Eso sirve para comprobar… ¿qué? Pues simplemente que hice las cosas bien y por lo tanto tengo subclones del fragmento de restricción original.

Ahora aislaré y amplificaré cada uno de los subclones “no A”. Luego lo que hago con eso es irme a la placa de la genoteca y utilizarlo como marcador para repetir un experimento de sonda. Así podré ahora rastrear cada uno de esos subclones “no A” en la genoteca inicial. Lógicamente aparecerá marcada mi colonia donde estaba A. Pero a veces aparecerá también marcado con esos marcadores “no A” algunas otras colonias. Serán los clones que hayan incorporado fragmentos de restricción que estaban ligeramente desplazados (a uno u otro lado) con respecto al marcador original A y que lógicamente no lo incluyen (razón por la cual no se marcaban en la hibridación original pero sí se marcan ahora).

Las secuencias que voy obteniendo las voy secuenciando.

Así iré repitiendo este proceso, primero con el marcador A, luego con el B, luego con el C y así me voy moviendo en una dirección por la genoteca. Mientras tanto voy secuenciando y voy comparando las secuencias de todos mis subclones de manera que finalmente comparándolas podré ir reconstruyendo el genoma original.

Al final podría llegar al gen que nosotros queremos tener. Pero para finalmente comprobarlo debería hacer otros experimentos sobre sus promotores, etc.

Vectores de expresión - clonar genes sabiendo lo que llevan adentro - buscar la sobreexpresión de una proteína

Entre Boyer y Cohen, en el año 72 se inventaron la clonación de moléculas recombinantes. El señor Boyer, en el año 76 tuvo una entrevista con un licenciado en Economía americano y le propuso que todo eso lo patentara e intentara sacar dinero y así crear una compañía de biotecnología para obtener cosas que vender. Después de estar analizando el mercadeo de la cuestión de una manera lucrativa se creó y fundó la primera empresa de biotecnología que aplicara la tecnología del DNA recombinante de forma industrial. La fundaron Boyer y Swanson con 500 dólares cada uno y se llamó GENETECH.

Lo que hicieron fundamentalmente fue clonar la insulina y venderla. Con 8 millones de diabéticos en EEUU el negocio era redondo.

En 1978 en Europa se formó paralelamente BIOGEN, constituida por un consorcio de empresarios que fueron a la caza de científicos de primera fila. Las dos empresas compitieron con metodologías diferentes para ver quién llegaba primero a la patente del método de obtención industrial de insulina.

Los americanos sintetizaron químicamente las porciones exónicas para introducirlas en los plásmidos. Lo consiguieron, pero no se utiliza esta estrategia ya.

Los europeos descubren en el 70 la transcriptasa inversa. Con lo cual los europeos usaron los mRNA producidos por el gen de la insulina y usando la transcriptasa llegar al DNA puro (sin intrones). En la carrera ganaron los americanos (dado que los europeos no consiguieron nunca la insulina humana y al final no permitieron que se sintetizara nada humano por peligros en las condiciones de laboratorio). Sin embargo, aunque Genetech ganó la carrera y licenció a una empresa americana el método, ahora el que se usa es el europeo… irónico. A partir de este año, las compañías comienzan la mercantilización del conocimiento y crean el mercado de la investigación. Todas estas técnicas se patentan. Se patentan las enzimas, se patentan los métodos de aislamiento, etc. (El nuevo paradigma en la investigación - la investigación patentada - el saber privatizado y el mercado de la investigación)

GENÉTICA REVERSA EN LA GENÉTICA MOLECULAR

El gen clonado puede mutarse mediante mutagénesis dirigida. Así se puede cambiar el DNA in Vitro para determinar el efecto fenotípico. De esta forma se pueden obtener la funcionalidad de muchos ORG desconocidos hasta ahora. Así se puede partir desde la proteína hasta el gen y finalmente el fenotipo. Es la llamada genética reversa (en vez de la genética clásica en la que se va desde el fenotipo mutante hasta la proteína mediante la vía clásica).

Una forma de hacer genética reversa es mediante interrupción genética.

Mediante manipulación genética podemos introducir y crear una molécula recombinante que tenga dentro del gen que me inquieta una secuencia que podría ser un resistencia a una droga (para poder así marcar esas colonias). Ese fragmento lo introduzco y fomento que se transforme mi bacteria mediante recombinación con su cromosoma (sustitución de una secuencia por otra). Finalmente el gen A normal se me pierde y se me jode quedándome el gen A interrumpido. Esas colonias serán reveladas gracias a que si plaqueto en un cultivo con la droga antibiótica, solo crecerán las que tengan el gen interrumpido. Luego puedo analizar el gen interrumpido, el fenotipo etc.

Mutagénesis dirigida

A partir de un plásmido ssDNA (desnaturalizado) se le hibrida un oligonucleótido en una secuencia diana. Ese oligonucleótido tiene una base o varias cambiadas (de forma que constituya una mutación). Ese oligo sirve como primer y se sintetiza con una polimerasa el plásmido dsDNA que tendrá

TRANSGENICA - Años 90

Podemos meter en un organismo una secuencia de DNA de varias formas:

• Vectores víricos: meter una secuencia de DNA en una célula eucariota

• Vesícular naturales o artificiales: mediante liposomas por ejemplo. Lar metemos con secuencias de DNA dentro de manera que metamos la información directamente dentro.

• Microproyectiles de tungsteno

• Electroporación: dando choques eléctricos a la célula para hacerla más receptiva a la entrada de moléculas

Hay varios sistemas para meter DNA en la célula. Esto se puede realizar en cualquier organismo. Los objetivos son múltiples: por ejemplo para la inclusión de genes, para saber si el gen se expresa como queremos que se exprese, también se pueden excluir genes, modificar genes para que dejern funcionar (knocked out). También se pueden meter genes de resistencia, generar ratones knock out para genes específicos que nos sirve para saber si dicho gen tenía algo que ver con un determinado fenotipo

La transgénesis puede ocurrir en la línea somática o germinal. En la germina se transmitirá de generación en generación.

Para saber si un gen ha sido insertado y tiene un buen efecto, es al haber apareamiento, se extraen los óvulos de la hembra fertilizada y antes de que se fusionen los pronúcleos, en el pronúcleo masculino se mete el gen que se busca introducir en todo el organismo. Luego el zigoto se mete en una hembra y se obtiene la descendencia. A la descendencia se le corta el rabito, se coge sangre y se hace una PCR por ejemplo. Se buscarán entonces bandas que evidencien la presencia del gen insertado y así finalmente comprobamos si hubo o no transgénesis efectiva. Si en la camada hay hembras y machos, se pueden fecundar para buscar los homocigotos con el gen que metimos al principio.

DIAGNOSTICO Y TERAPIA PREIMPLANTACIONAL

Se puede quitar alguna de las células del embrión (en su etapa de 3 días). Esta célula se estudia por ejemplo mediante FISH. Se hibridan sondas de detección que me permite localizar genes en cromosomas determinados. También puedo averiguar así el genotipo de mi individuo y hasta hacer cariotipos, etc. Para saber si la célula escogida tiene algún error, se hace una PCR con los primeres del gen problema y se hacen fingerprintings para los genes de la enfermedad, etc. Al final se pueden hacer DIAGNOSTICOS AUN CON EL EMBRION DE 3 DIAS. A partir de ahí podríamos empezar a planear la terapia preimplantacional.

BIOCHIPS Y MICROARRAYS

Herramienta del tamaño de un “cubre” que es una matriz de sílice y es capaz de almacenar información de muchos tipos, por ejemplo troxzos de aminoácidos, proteínas, mRNA… Con este biochip se hibrida sobre él por ejemplo un ácido nucleico (aunque a veces se usan anticuerpos monoclonales para proteínas, etc. Se ponen secuencias de DNA/RNA en el biochip, con esta información se puede poner un ácido nucleico de una persona para saber si hibrida. Luego se ve donde ha hibridado y sabiendo donde hibrida nos dice que una información está más o menos expresada, si se expresa o no, en qué etapas, con qué intensidad, frecuencia. Sirve para diagnóstico entre otras cosas.

PROYECTO GENOMA

Conocimiento del genoma humano. Hay dos formas para conocer el genoma de un individuo.

• Establecer el genoma de una forma clásica: mediante enzimas de restricción, clonación, secuenciación…

• Por el “perdigonazo”: se rompe el genoma y con los fragmentos los aislo, los estudio y los fragmento. Finalmente las secuencias se meten en el ordenador y este ensambla todo el tema. Se usa también información del método clásico para el mismo genoma de manera que el proceso no tome demasiado.

El genoma eucariota tiene secuencias muy repetidas, otras pequeñas, pero también transposones, espaciadores, muchísimos intrones y splicing alternativo, etc. Al final es muy difícil rastrear ORFs y para colmo se hacen muchos errores que a veces pueden ser claves. Adicionalmente está el hecho de que es enorme en ciertos organismos y por lo tanto el número de errores puede ser muy serio. Además de que no se puede pretender conocer nada en eucariotas solo a partir de ORFs. En fin… que el tema es complejo para el proyecto genoma. Pero que poco a poco y sobre todo en procariontes, las cosas van saliendo más o menos bien.

PARTE 2: MUTACION Y ORIGEN DE VARIABILIDAD

El DNA es la información genética… Para poder serlo, sabemos que tenía que cumplir con unas características. La información genética debe poder replicarse, almacenarse, expresarse y variar. La variación de la información genética es lo que llamamos MUTACION.

Una de las formas posibles de mutación son los errores en la replicación (un cambio en esa secuencia de DNA por ejemplo). Pero también tenemos muchas más. Se pueden clasificar.

Clasificación más clásica:

• Mutaciones génicas

• Mutaciones cromosómicas

Hace muchos años, cuando se hizo la clasificación, las únicas mutaciones que se podían ver eran las cromosómicas. Uno en el microscopio podía ver una mutación en el cromosoma. En un cromosoma politénico, la modificación en el patrón de bandas por inversión tenía que ver con una mutación cromosómica. Obviamente que afectaba por dentro a muchos genes, pero se llamaban cromosómicas. Las génicas eran las que eran obvias mutaciones (cambios claros del fenotipo) pero que no revelaaban evidencia cromosómica.

Clasificación según la aparición:

• Mutaciones espontáneas

• Mutaciones inducidas

Clasificación según el linaje celular en que aparece:

• Mutaciones somáticas: no son heredables ya que aparecen en la línea somática del individuo

• Mutaciones germinales: son heredables ya que aparecen en la línea germinal de la cual se forman los gametos del individuo

Las mutaciones NO SON MALAS. De hecho son necesarias para que los caracteres gocen de diversidad. Si no fuera por la generación de diversidad, no se podrían dar los procesos de evolución. Y el mecanismo generador de variabilidad biológica ES LA MUTACION. El problema de la visión típica acerca de la mutación es que muchos genes mutantes son productores de enfermedades. Así se le da una visión muy negativa. Sin embargo, algunas mutaciones son mejores. Como ejemplo, la heterocigosis de la anemia falciforme es buena para ecosistemas en los que el paludismo tiene una incidencia grave.

Las mutaciones se mantendrán o se eliminarán según la selección natural como todo en la evolución.

Lo que está claro es que con la mutación tendremos dos cosas:

• origen de nuevos alelos

• una materia prima para el proceso evolutivo

• la base de la investigación genética

• la base para identificar determinados genes y así poder diagnosticar, etc…

Todas las células en un organismo son susceptibles de mutar. Además hay ciertas células que por sus características inherentes pueden mutar más que otras. O sea que la cosa puede darse en CUALQUIER MOMENTO del desarrollo, crecimiento, reproducción, etc.

La tasa de mutación. Es el número de mutaciones por cada división celular (en bacterias y eucariontes unicelulares). Es el número de mutaciones por gameto (en organismos superiores multicelulares).

La tasa de reversión es la frecuencia de retorno del FENOTIPO mutante al salvaje nuevamente.

¿CÓMO SE PRODUCEN LAS MUTACIONES?

Hay un tipo de mutaciones que ya vimos que son al azar. Hay mutaciones naturales. Normalmente se suelen dar durante la replicación del DNA. Si nos fijamos bien, lo que vimos en el caso de organismos unicelulares es el número de mutaciones por división celular. O sea esencialmente nos está diciendo que la mutación se da principalmente en la replicación. En la apertura de las dos cadenas, cuando sirven de molde, la polimerasa puede equivocarse, fallar y dar lugar a cadenas hijas mutantes. Las polimerasas tienen capacidad de reparación de errores. Pero si no lo hacen, al final quedarán nucleótidos erróneos. Se dice en procariontes que las mutaciones se producen cuando la actividad polimerasa de la enzima y la actividad exonucleasa son diferentes. Realmente entre las dos actividades hay una competencia por unirse y hacerle cosas al nucleótido (romper o ligar obviamente). Si el nucleótido incorporado 3' es el correcto, la actividad polimerasa es mayor y se da la ligación de enlaces. Si el nucleótido es el “incorrecto” entonces la actividad es menor y se da la activación mayor de la actividad exonucleasa. Al haber mutaciones, el DNA típico simple y mono, cambia tridimensionalmente de forma. Eso es lo que realmente promoverá la activación de la exonucleasa. Además hay una cadena más rápida que otra, eso ya lo sabemos. En el año 97, en bacterias también, se dieron cuenta que las dos cadenas no tenían el mismo número de mutaciones. La cadena retrasada tenía más tasa de mutación que la otra. La asimetría la atribuyeron a que como en la cadena rápida funciona la polimerasa III únicamente, la cosa es como más constante y más correcta. Pero en la cadena retrasada la polimerasa I actúa además de la III. Lo que se proponía es que la polimerasa I debía tener menos capacidad reparadora que la III. Otros pensaron que evidentemente el problema estaba en los primers de RNA. Muchas opiniones surgieron.

QuE TIPO DE MUTACIONES SE DAN DURANTE LA REPLICACION?

Pueden haber mutaciones puntuales (un cambio de un nucleótido por otro) o inserciones/deleciones (originadas por un proceso llamado “Replication slippage”, un proceso que tiene lugar cuando la replicación termina formando unos bucles… la polimerasa introduce al final más nucleótidos de lo normal o mete menos debido a estos bucles!!!). Se suelen producir en sitios del DNA donde tenemos microsatélites (secuencias pequeñas altamente repetitivas del DNA que también forman estructuras que hacen que la polimerasa se equivoque e introduzca más nucleótidos de la cuenta - replication slippage). El proceso de inserciones se produce también en la recombinación homóloga en el momento en que se da el apareamiento entre los homólogos.

El Replication slippage tiene mucho que ver con ciertos síndromes. Cuando en determinados locus en que hay microsatélites, aumenta el número de las bases (en tripletes, o dobletes de pb) se aumenta el número de aminoácidos en la proteína y eso está relacionado y asociado típicamente con ciertas enfermedades. El ejemplo está en la presencia de expansiones de poliglutamina en el gen Hdh (en todas las regiones codificantes del gen) que se encuentra asociada a la enfermedad de Huntington. Se vió en muchos síndromes además.

MUTACIONES PUNTUALES

En las mutaciones puntuales, generalmente en la primer ronda de replicación no se evidencia el cambio de base. El individuo completo mutante se da en la segunda generación cuando la cadena mutada es usada como molde y se forma finalmente una doble hélice completamente mutante.

A veces también hay mutaciones puntuales que podrían dar lugar a mutantes ya directamente en el genoma en que se dio el cambio puntual (sin tener que esperar a que se de una nueva ronda de replicación).

Las bases nitrogenadas suelen encontrarse en una situación amino o en una situación ceto. Tienen una resonancia ceto-amínica. Así es que de forma natural y espontánea pueden darse cambios tautoméricos en las bases. Si se dan (en la adenina o citosina, la única diferencia es la presencia de un hidrógeno o dos hidrógenos en un nitrógeno estructural) pueden originarse mutaciones. Como ejemplo, el tautómero de timina se une a guanina en vez de a adenina. El tautómero de G se une a T también y el tautómero de A se puede unir a C. Al final del segundo ciclo de replicación se produjo un cambio en una purina por otra y una pirimidina por otra. Ese proceso engendró finalmente una mutación llamada TRANSICION. Las transiciones no son verdaderos errores para la capacidad de reconocimiento de errores de la polimerasa. Por eso, cuando se dan en la replicación son una verdadera cagada dado que no pueden corregirse (es que los tautómeros son cosas naturales!).

Existen también las transversiones que son los cambios de una purina por una pirimidina y de la pirimidina por una purina.

AGENTES MUTAGÉNICOS

Químicos: la mayoría. Hay gran cantidad de productos y cada vez más que pueden producir mutaciones. Los más históricos son:

• los análogos de bases: el 5-bromo uracilo que es un análogo de base de la timina. En la replicación, la polimerasa puede usar nucleótidos con esta base nitrogenada tan errónea

• los agentes desaminantes: el ácido nitroso da lugar a desaminaciones de bases dando lugar a otros tipos de BN que terminan apareándose con cualquier cosa menos lo que necesitan y finalmente se dan mutaciones (a través del paso de las rondas de replicación continuas)

Físicos: entre los que destacan las radiaciones ionizantes y no ionizantes… el ejemplo más clásico es la luz ultravioleta engendra dímeros de timina, una clásica mutación debida a agentes mutagénicos muy estudiada

MUTACIONES PUNTUALES

Si son en la región extragénica, son mutaciones silenciosas. Suelen ser las más comunes y no tienen repercusión. Son también llamadas “reservorios” de mutaciones. Otras típicas son las mutaciones en microsatélites que lógicamente al ser DNA “basura” no se ven consecuencias.

Si son en la región codificante pueden pasar dos cosas. Hay cambios sinónimos cuando a veces aunque cambie la última base en un triplete tenemos el mismo aminoácido (wobbling). Hay cambios no sinónimos que generan mutaciones llamadas con sentido equivocado. Eso hace que se produzcan proteínas a veces defectuosas que solo tienen un cambio en ese aminoácido. Si la mutación produce un codón de terminación inoportuno podemos tener mutaciones sin sentido (originan proteínas que no existen realmente en el genoma). El cambio puede convertir el codón de terminación en uno que especifique para un aminoácido específico.

MUTACIONES PRODUCIDAS POR INSERCIONES O DELECIONES

EFECTOS DE LAS MUTACIONES - EL TEST DE AMES

DETECTANDO MUTANTES LETALES RECESIVOS - ligados a cromosomas sexuales (el cromosoma CLB)

DETECTANDO MUTANTES LETALES RECESIVOS - ligados a autosomas

PRUEBA DE FLUCTUACION - Luria y Delbruck (año 41)

REPARACION DEL DNA

El DNA es la única molécula biológica que es reparada. Las demás son sustituidas. Se requieren más de 100 genes para la reparación de DNA. Los genes de reparación son inducibles y son redundantes (muchos y muchas copias - están muy conservados). Un mismo defecto puede ser reparado por varios sistemas de reparación.

Como se repara el DNA?

• directamente

• por escisión de nucleótidos o de bases o también por mismatch repair, MMR

• por recombinación

Qué daño se puede reparar directamente (Direct Repair Systems)?

• Dímeros de timina

• Debido a las radiaciones se producen unos enlaces covalentes entre dos timinas contiguas (generalmente en presencia de UV) - la secuencia esa cambia de conformación y distorsiona esa parte de la doble cadena… muchos procesos necesarios como la replicación, la transcripción, no pueden darse en presencia de dímeros de timina (no se puede leer la secuencia)…

• La fotoliasa es una proteína que reconoce esas distorsiones en las secuencias y gastando ATP arregla el tema…

• Roturas en las cadenas DNA ds o ss (se reparan con una ligasa + otras cositas)

• Los cortes en una cadena “cortes ss” se reparan con una ligasa simplemente

• En los de doble cadena interviene una proteína Ku que forma parte de un complejo multiproteico que reconoce y repara el daño

• La proteína Ku actúa con la proteína DNA-PKcs que es una quinasa que activa a la proteína XRCCA que interactúa con una ligasa de tipo IV (realmente la recluta)

• Se describió en mamíferos

Qué daños se pueden reparar por escisión de nucleótidos (NER)?

• un error induce la unión de una endonucleasa que corta en sitios alejados uno a cada lado de la zona donde está el error

• una exonucleasa remueve el fragmento seleccionado por la endonucleasa

• una polimerasa pone ahora los nucleótidos correctamente a partir del extremo 3' que dejó libre el corte de la endonucleasa

• una ligasa cierra todo el tema

• están muy descritos en bacterias:

• Los genes Uvr son los que codifican para las proteínas que reconocerán los errores o el daño

• En concreto la UvrA reconocer el error (por ejemplo dímeros de timina que también pueden usar este mecanismo de escisión para repararse)… al activarse secuestra UvrB y UvrC que serán las responsables de tener la actividad endonucleasa…

• Una helicasa dispondrá el tramo de la forma más linealmente posible ahora… para permitir la entrada de la exonucleasa-polimerasa

• La DNApol I es la que, con su actividad exonucleasa especial y la actividad polimerasa quitará el fragmento jodido y pondrá la secuencia nueva correctamente

• Luego la ligasa liga la cadena una vez termina la polimerización

Reparación por escisión de bases (BER)?

• Hay una base que fue cambiada o introducida incorrectamente

• Se podría dar escisión directamente de nucleótidos…

• Pero también hay otro mecanismo… una DNA glicosilasa puede eliminar solamente la base nitrogenada… al eliminarse la base ahora la distorsión molecular en esa secuencia es diferente…

• La distorsión es reconocida por una enzima específica que reconoce los sitios AP (sitios apurínicos o apirimidínicos) que se generaron por acción de la glicosilasa…

• La AP endonucleasa reconoce ese sitio y ahora se encarga de romper por escisión a ambos lados de ese sitio y ahora la DNA pol I quitará los nucleótidos AP y pondrá en su lugar los nucleótidos correspondientes correctamente

• La ligasa termina por sellar el tema…

Reparación por Separación post-replicación - Reparación por recombinación

Después de la primera ronda de replicación, si el error era un dímero de timina no reparado previamente, obtendremos una molécula normal (la que usó como molde la hebra correcta) y una molécula de DNAds (la que usó como molde la hebra con el dímero) con un hueco en la secuencia (justo en el lugar donde está el dímero de timina). Lo que sucede ahora es que la molécula normal le cederá por recombinación (a través de unas enzimas especiales) el pedacito correcto que le falta a la que tiene el hueco. El error realmente no es reparado, pero por lo menos gracias a esas enzimas la molécula de dsDNA se completó. Ahora sencillamente la molécula donante (la normal de dsDNA que es la que ahora tiene el hueco) se completará mediante una polimerasa y una ligasa (que sintetizarán y sellarán el hueco que quedó).

Qué sistema enzimático se encarga de esto?

En procariotas están codificadas por los genes Rec. La RecA es la que repara por combinación. En eucariotas son los genes Rad y de los cuales algunos codifican para unas enzimas que son homólogas clarísimas de RecA. No hay evidencia molecular o citológica verdadera de todo esto, sino que el mecanismo sigue permaneciendo como hipótesis o teoría.

Reparación en eucariontes:

• Los agentes dañantes hacen lo suyo dando lugar a un error o daño en una de las dos hebras…luego de la replicación pasa lo que pasa y tendremos una molécula rota y una molécula completa (homólogas)…

• Unas nucleasas, helicasas, etc. hacen el procesamento nucleolítico que origina extremos cohesivos ssDNA en las zonas dañadas

• Las Rad reconocen el ssDNA que se originó por culpa de estas nucleasas (que a su vez originalmente actuaron porque hubo rotura de DNA)

• Al reconocer eso, las Rad lo que hacen es tomar la cadena intacta y desplazarla hacia uno de los extremos ssDNA que se originaron … la usará de molde para alargar el extremo ssDNA

• Las Rad a su vez toman el otro extremo ssDNA y lo desplaza hacia la otra hebra de la doble cadena intacta… usando ahora a esa como molde, alargará la ssDNA mediante una polimerasa…

• Al final quedan generadas moléculas de DNA heteroduplex (DNA cuya secuencia no proviene de una sola sino de la información de 2 cadenas) - es la fuente del proceso de conversión génica (la que vimos en ascas de Sordaria en las prácticas de Genética).

Inducción de la Reparación

Respuesta SOS.

RecA codifica a la proteína RecA que es la que está implicada en el reconocimiento de ssDNA.

LexA codifica unas proteínas LexA que serán las que controlan la respuesta SOS de las bacterias.

Cuando no hay ningun tipo de error, el gen LexA producirá su proteína correspondiente que será la que se encarga por un lado de reprimir el gen recA y reprime todos los genes SOS (que son los que activan la respuesta SOS de reparación cromosómica).

Cuando hay un error, se induce la proteína RecA. En el momento que se activa, Rec comienza a expresarse masivamente y pierde la represión por LexA. Cuando ya hay muchísima proteína Rec es que tendrá una capacidad de activar vías proteolíticas que joderán y romperán proteína LexA. En falta de LexA, los otros genes SOS dejarán de estar reprimidos. Por ello los genes SOS comienzan a activarse y todo el sistema SOS se activará. ¿Hasta cuándo? Hasta que el DNA se repara y por lo tanto la expresión de Rec deje de activarse. Los niveles de Rec y por lo tanto Lex vuelven a los niveles normales y por lo tanto LexA vuelve a reprimir los genes SOS como normalmente hace.

Cuando falla el sistema de reparación SOS aparece el xeroderma pigmentoso, una enfermedad típicamente causado por este fallo.

MUTACIONES CROMOSOMICAS

Una forma de revelarlas es mediante el análisis de cariotipados en los que se analiza, por ejmplo, entre tras cosas, los patrones de bandas G en cada homólogo. Cuando los homólogos tienen cosas raras, entonces se pueden hacer diagnósticos. Estudiante cariotipos entonces puedo saber si hubo mutaciones o hay mutaciones o anomalías cromosómicas. En los cromosomas politénicos, aún sin tripsina, puedo revelar el bandeado natural que caracteriza las zonas concretas de cada cromosoma. Así, aún sin hacer bandeados, podría identificar qué es lo que le está pasando a ese cromosoma.

Lógicamente, las téncinas de bandeado cromosómico, las téncinas para detectar errores y anomalías van actualizandose. El FISH (hibridación in situ fluoresencte) es una de las más actuales que se usa hoy en día muchísimo. Se usan sondas que caracterizan regiones específicas (cromosoma-específicas o secuencia-específicas). Para detectar por ejemplo mutaciones cromosómicas se suelen usar sondas cromosoma-específicas. Así se puede determinar cromosomas concretos en una céula y ver homólogos. Lo que se puede hacer también, es ver si ha ocurrido algun tipo de reordenación de fragmentos cromosómicos. Si tenemos cromosomas que tengan dos colores, evidentemente debe haberse dado un proceso de translocación. Gracias a FISH se puede ver muy bien. Mediante el estudio de cariotipo eso se podía ver también muy bien, pero el FISH facilita las cosas muchísimo.

El SKY (spectral karyotyping) es un tipo de FISH especial. Lo que se hace (además a través de un ordenador que interpreta las señales) es que cada uno de sus cromosomas y su homólogo presenta un color diferente del resto de los pares. Así se puede identificar los cromosomas y también evidenciar todas las reordenaciones cromosómicas posibles. Se usa todo el espectro de emisiones fluorescentes, razón por la cual se llaman SKY.

Clasificación de las mutaciones:

• variaciones en la estructura

• Deleciones

• Duplicaciones

• Inversiones

• Traslocaciones

• variaciones en el número de cromosomas

• haploidía (se pierden cromosomas en un par)

• poliploidía (si se ganan cromosomas de un par)

• aneuploidía (si se pierde directamente un par)

• Cromosomas B o accesorios (cromosomas que existen como fragmentos anexos de DNA que se pueden generar por transposiciones, transfecciones, etc.)

Qué consecuencias tiene la mutación cromosómica?

Depende de donde ocurra. Cada una de ellas, en algunos casos podría no tener ningún tipo de incidencia, y en otros podría perderse la viabilidad del individuo o ser significativamente deletéreo. Podemos clasificar las consecuencias:

• afecta solo al individuo

• afecta también a la descendencia (si afecta a la linea germinal - durante el proceso meiótico)

• afecta a toda una población - muchas veces una mutación se fija en una población y se expande en ella dando lugar a que con el tiempo se de un proceso de especiación debido a eso (como ocurre realmente con todas las mutaciones)

DELECIONES Y DEFICIENCIAS:

• se pierde un trozo de un segmento cromosómico

• se pueden perder secuencias intersticiales o secuencias finales

Todas las reordenaciones cromosómicas se producen debido a muchas cosas diferentes. Muchas veces tienen que ver con otras mutaciones.

Si se tiene un cromosoma ABCD, lógicamente después de D tengo una región que es fundamental para el mantenimiento del cromosoma eucarionte, el telómero. Si se pierde una región telomérica, si efectivamente se pierde la función de estabilidad del telómero, lógicamente esa mutación llevará a una pérdida cromosómica y al final se llegue a otra anomalía (pérdida directa del cromosoma entero). Pero a veces los cromosomas logran reconstituirse (otras secuencias pueden asumir temporalmente la función del telómero). Esos cromosomas delecionados pero reconstituidos correctamente podrían ahora transmitirse con “normalidad” (siguen estando mutados sin embargo).

Analizando las bandas podríamos ver que si se pierden algunas bandas, entonces podríamos decir que se generó un cromosoma deficiente. Eso igualmente lo podemos hacer solo si lo estamos viendo en mitosis. Pero en meiosis, uno de los homólogos quedará más pequeño y por lo tanto podríamos tener un apareamiento que podría ser más o menos normal si la deleción es distal. Pero si la deleción es intersticial, el apareamiento (sinapsis) no podrá ser normal. Si queremos aparear ABCD con ACD lógicamente la secuencia B deberá hacer un bucle dado que ese no aparearía con ningúna secuencia homóloga. Ese bucle se ve durante la meiosis (en lo que es meiosis I). Igualmente en los cromosomas politénicos.

El efecto de las deleciones depende del tipo de genes que se pierdan. Si en la secuencia B perdida no había cosas muy importantes no pasa nada. Si no podría haber consecuencias muy serias, hasta mortales. En general éste tipo de mutaciones cromosómicas son deletéreas o letales. Gracias a ellas además se pueden poner de manifiesto sitios donde están los genes. Al final podemos cartografiar por deleciones.

Ejemplo: En Drosophila la deleción de parte del cromosma X produce el fenotipo NOTCH. Esa mutación tiene un típico efecto visual que es una escotadura en el ala. Es un clásico! La mutación en homocigosis recesiva es letal y en hemicigosis también. Está asociada a deleciones en una región determinada del cromosoma X. Cuando se estudian los cromosomas politénicos y se localiza la región del X donde están las bandas que típicamente se delecionan, se ve que es una región (cuyo nombre es 3C2-3C11) que incluye 10 bandas. Hay algunos Notch que tienen deleciones más variables. Sin embargo siempre se pierde la banda 3C7 en los casos en que tenemos Notch.

Ejemplo 2: En humanos, una deleción típica similar se da en el brazo pequeño del cromosoma 5 y produce un fenotipo sindrómico pero característico denominado “grito de gato” (los niños al llorar maullan).

Cartografiando con respecto a Notch…

Hacemos un cruzamiento en el que tenemos una hembra - Notch4 que tiene uno de sus cromosomas (el Notch) más pequeño. Lógicamente es heterocigótica. LA cruzamos con un macho White (otra mutación que produce ojos blancos y que ya sabemos que va en el X). La hembra produce gametos Notch4 y gametos normales, el macho: gametos white y gametos Y. En las posibles cruzas obtenemos 4 individuos posibles: un macho normal, un macho Notch que muere, una hembra Notch y heterocigoto para White y una hembra normal que es heterocigótica para el gen white. El que nosotros veamos hembras que son heterocigotos para white y que tienen fenotipo white (recesivo) nos pone en una duda muy grande: ¿cómo puede ser que yo esté observando un fenotipo white cuando tengo un heterocigoto? Evidentemente la deleción que produjo Notch en esa hembra hizo que se pierda el gen white+ salvaje que debría complementar al otro y dar lugar a ojos normales. En resumen, creamos hembras hemicigotas y pseudodominantes recesivas para ese gen debido a una pérdida cromosómica. Así puedo decir lógicamente que white está entre la región 3C2 y 3C11. Al final con mutaciones similares a notch puedo ir analizando y cartografiando genes y asociandolos a unas bandas concretas.

DUPLICACIONES CROMOSOMICAS

Parte de una secuencia dada se duplica. Se pueden dar duplicaciones en tandem. Eso es una secuencia que se duplica varias veces repetidas veces a lo largo de una molécula, por ejemplo ABCDEDEDEFG. También tenemos Tandem inverso, es decir que se duplica a continuación, pero se invierte de manera que tenemos por ejemplo ABCDEEDFG. También puede haber duplicaciones no en tandem (desplazadas) ABCDEFGDE.

Los genes que se ven duplicados se llaman clusters (baterías) de genes. Esos genes que se duplican en grupo constituyen esos clusters. Esas duplicaciones pueden aparecer de muchas maneras. Como en el caso de las deficiencias, hay muchas formas. En muchos casos se da por una recombinación desigual. Imaginamos que tenemos una región cromosómica que es homóloga. Si la sinapsis se produce de una forma incorrecta (cosa que es anormal) entonces el entrecruzamiento puede originar frutos desiguales que en vez de haber recombinado sus genes, literalmente lo que hicieron fue pasarse uno una secuencia al otro. El proceso, repetido varias veces podría dar lugar a que en un homólogo nos quede una deficiencia y en otro homólogo tengamos una duplicación! Una deleción intersticial suele originarse de esta forma por ejemplo.

En la mutación bar, la región 16A se duplica (incluso más de una vez)… normalmente hay 1 sola. Pero si encontramos dos bandas, tenemos una duplicación y el mutante es bar. Un heterocigoto bar tendrá el ojo un poco raro ya y tiene solamente una duplicación en uno de los dos homólogos (el otro tiene la secuencia 16ª monocopia). Un homocigoto bar tendrá duplicación en los dos homólogos y por lo tanto tendrá una barrita chiquitita y un ojo super deformado (o sea que el tema va según la dosis). Si encima ahora en él se da una recombinación desigual podría dar origen a un mutante que tenga uno de sus homólogos con triple secuencia 16A y un homólogo “normal” (heterocigoto bar especial). Esos individuos, llamados doble bar son los que tendrán los ojos más deformados de todos. Cuantas más veces se duplique la secuencia, menos ojo tendré hasta que directamente tenga individuos ciegos.

Los individuos heterocigotos doble bar (si la mutación es también germinal) originarán gametos de dos tipos: los que tienen el gen triplicado y los que tienen el homólogo con el gen unicopiado (normal). Lógicamente esto originará gametos normales (se lo llama “reversión de la mutación”) y por otro lado gametos mutantes con el gen triplicado.

Ahora, ¿por qué el homocigoto bar tiene el ojo mejor que el heterocigoto doble bar? Se dice que el gen tiene efecto de posición diferente. De forma que lo que importa no es realmente cuantas dosis se tengan de la secuencia, sino cuantas se tengan por cromosoma. El efecto de posición es el que se relaciona con el número de facetas y la forma del ojo.

Otra forma de “observar” las duplicaciones es en los cromosomas politénicos. Si vemos que tenemos “bucles” en uno de los lados de un politénico eso querrá decir que tenemos una duplicación en uno de los dos homólogos (recordemos que están pegados en los politénicos). El bucle lo daría aquello que está duplicado. También en los politénicos podíamos ver físicamente la pérdida de bandas, esto es similar.

Si la duplicación es muy pequeñita podemos también analizar bandas y ver si hubo duplicación de alguna de ellas.

Se cree que la evolución de muchos genes (ejemplo: hemoglobinas y mioglobinas) se produjo por duplicación (duplicación de dominios - adquisición de proteínas diméricas, triméricas, tetraméricas, etc.).

Además, están los genes altamente repetidos (los genes de las histonas, los genes del rRNA, etc.), los microsatélites, etc. que son secuencias muy repetidas lógicamente originadas en principio a partir de duplicación génica.

Evolución a partir de duplicación (Susumo Ohno - año 70 - “La evolución ha tenido lugar a base de duplicación génica”)

Pensemos que en un organismo ancestral el gen A se duplica. Los individuos descendientes tendrán el A copiado. Luego por evolución los genes A pueden divergir originándose alelos diferentes. Esos alelos por recombinación pueden mezclarse, etc. Al final puede darse un proceso de especiación en el que las especies originadas no pueden mezclar esos alelos entre sí ya.

A su vez por evolución ahora esos genes pueden modificarse autapomórficamente en cada uno de esos grupos. Al final tenemos que el gen A se transforma en el gen B en una de las ramas.

Susumo Ohno esencialmente dice que los organismos duplican sus genes para evitar que una sola mutación les joda la vida a los organismos. Pero claro, Ohno lo que dice es que aunque los organismos “se protegen” así de las mutaciones, la duplicación luego tiene otros efectos colaterales. Entre esos tenemos que los duplicados terminan originando multialelismo, etc. Finalmente cada uno de ellos puede ir cambiando, etc. Eso originará funciones con muchos genes asociados y no solo asociados en función sino agrupados cromosómicamente en clústers multialélicos y más o menos polimórficos.

Una familia génica es un grupo de genes cuyos exones están relacionados. Lo normal es que deriven de un gen ancestral. Hay ejemplos clásicos como las globinas - hemoglobinas. Pero no solo. Hay muchos genes en los que la evolución ha decidido tajantemente.

Genes de las globinas - Evolución genómica

La hemoglobina es un tetrámero con dos moléculas tipo alfa y 2 tipo beta-globinas. Tenemos una familia de las beta-globinas y otra familia que es la de las alfa-globinas.

Al final entre las dos familias construyen la molécula de hemoglobina.

Realmente ambas provienen de un gen ancestral que se duplicó y translocó. De hecho, las Beta están en el cromosoma 11. Las Alfa están en el 16.

Organización de genes importantes:

La disposición especial de los genes a lo largo del cromosoma es interesante dado que su localización esta directamente relacionada. Los genes menos repetido se expresarán menos. Todos los genes activos tienen 3 exones (aunque hoy en día no son todos iguales), desde el punto de vista profesional.

Los clusters están organizados de forma especial. Además hay pseudogenes (llevan la letra Phi antes), genes que al ser duplicados pierden su actividad/funcionalidad.

En el cromosoma 11 de humanos tenemos el Zeta seguido de un Phi-Zeta, varios Phi-Alfa y luego el Alfa2. En el embrión, en vez de alfa, es Zeta quién está activo para formar la hemoglobina juvenil.

En el feto ya se cambia la Zeta por la Alfa-2.

O sea que se puede relacionar funcionalidad-desarrollo y

Evolución de los genes Hox por duplicación

Son los genes que se ocupan de que las estructuras propias de una especie estén en el lugar correcto a lo largo de un eje. Mirando en conjunto y filogenéticamente analizando los complejos HOX se ve como desde los Metazoa ha habido duplicación y evolución de originalmente un solo gen Hox.

No solo eso, sino que normalmente los genes HOX más primitivos son los que están relacionados con el desarrollo de las partes anteriores, mientras que los genes más nuevos (dentro de los clústers HOX) son los que se ocupan del desarrollo de las partes posteriores.

La evolución de los genes Hox por duplicación se ven desde los primeros animales hasta los humanos.

Lo más heavy de todo esto es que si analizamos comparativamente la expresión del clúster Hox en ratón y Drosophila vemos que hay una similitud asombrosa en cuanto a qué genes (los más primitivos o los más nuevos) se van activando en cada parte del organismo.

INVERSIONES CROMOSOMICAS

Si nosotros tenemos una secuencia como ABC-centromero-DEFGH, lo que puede ocurrir es que haya una rotura en dos puntos dando lugar a un fragmento que puede girar y religarse con la secuencia invertida. Eso puede ocurrir (de hecho vemos que pueden ocurrir muchas cosas en el genoma). Pero es difícil pensar que se produzca sencillamente por cortes. Aunque no se descarta, veremos más adelante que es más frecuente que transposones y otros mecanismso que veremos después, serán los que tal vez originen más inversiones.

Si la inversión incluye al centrómero se llama pericéntrica (ABED-centromero-CFGH). Si la inversión no incluye al centrómero (ocurre en un brazo), se llaman paracéntricas (ABC-centromero-DGFEH). Las primeras, que incluyen al centrómero originan modificaciones cromosómicas en su morfología. Es una de las consecuencias más triviales. Está claro que además pueden interrumpirse genes (en las secuencias cortadas por ejemplo). Además se llaman inversiones simples (hay otras llamadas complejas).

Las inversiones pueden ser muy importantes en cuanto que tienen conclusiones a nivel del comportamiento meiótico de los cromosomas. No solo ya si cambian de conformación, sino también en lo que respecta al apareamiento correcto de los homólogos por ejemplo (no podría haber sinapsis, lógicamente, si el segmento invertido es muy grande o es crucial - por ejemplo si es inversión pericéntrica).

Si las inversiones son muy grandes, podría ser que el cromosoma que tiene la secuencia invertida forme un bucle de inversión para así afinar su secuencia y permitir la sinapsis con el homólogo. Si encima se produce un quiasma en algún punto del bucle, se origina un caos. Dos de las 4 cromátidas del bivalente terminarán normales, pero las dos que entrecruzaron en el bucle darán lugar por un lado a una cromátida que tiene 2 centrómeros (va y vuelve con el bucle) y una cromátida que no tendrá ningún centrómero. Al tirar de sí en la meiosis, el bivalente se partirá por la cromátida que tiene 2 centrómeros. Así se originarán dos homólogos que tienen cada uno una cromátida normal wild y una cromátida que al haber intentado recombinar se cortó y por lo tanto le falta gran parte de los genes. Lógicamente estas cromátidas recombinantes no serán viables y por lo tanto los gametos serán delecionados y finalmente no habrá frecuencia de recombinantes posibles para el bucle.

Es así que normalmente se dice que las inversiones grandes reducen la frecuencia de recombinantes. Así, el CLB que usabamos para rastrear genes letales en Drosophila llevaba a propósito esa inversión para así permitirnos buscar mutantes letales recesivos sin que exista la posibilidad de que aparezcan individuos recombinantes.

Además, por ejemplo, los cromosomas politénicos no podrían darse correctamente dado que no podrían aparearse con normalidad.

Se llaman supergenes a los grupos de genes que se transmiten juntos casi siempre. No se pueden formar gametos que sean recombinantes para esos genes nunca.

Qué pasa cuando el bucle de inversión se resuelve con 2 entrecruzamientos en la misma zona del bucle? - (inversiones siempre paracéntricas)

Si hay dos quiasmas en el bucle de inversión (2 quiasmas entre dos cromátidas), lo que obtenemos es algo completamente diferente al caso anterior. De hecho, en éste caso se genera 1 cromátida normal (sin la inversión), 1 cromátida normal recombinante, 1 cromátida recombinante que permanece con la inversión y 1 cromátida parental que permanece con la inversión.

Si los dos quiasmas se dan entre 4 cromátidas, el resultado es otro. Se originan 1 homólogo con 2 cromátidas con 2 centrómeros y 1 homólogo con 2 cromátidas sin centrómero. El resultado es rarísimo

Inversiones pericéntricas

El bucle de inversión se da justo donde está el centrómero. El quiasma se da a un lado. Se pueden producir deleciones por este mecanismo (es un mecanismo generador de deleciones). 2 de las 4 cromátidas generadas son las parentales normales. Pero las 2 recombinantes hacen cosas raras. Cada una tendrá una duplicación de un gen y una deleción de otro. Si los homólogos fueran ABCD y el otro fuera abad entonces los 4 gametos originados serían: ABCD, abad, ABCa y dbcD. Estos últimos son los recombinantes peculiares.

Las inversiones

Efecto de posición y variegación

Si se produce una inversión y el gen White queda colocado cerca de una región de heterocromatina, una de las cosas que puede ocurrir es que en el ojo se produzca un efecto de variegación. Es decir que el ojo no tiene todo él un mismo color, sino que tiene patrones de blanco en el medio del rojo del ojo normal. Este efecto variegado que se vió desde el principio, al principio no se sabía bien a qué se debía. Muchas veces la expresión del gen estaba siendo modificado sin que el gen en sí cambiara. El efecto de posición lo vimos en las duplicaciones, aquí no es diferente. Realmente lo que sucede es que la posición de un gen determina en parte el grado de expresión que pueda tener. Cuanto más cerca esté un gen de la heterocromatina (que normalmente no trancribe, inactiva genes, etc.) el gen estará más inactivado. En principio no se sabía muy bien el por qué de todo esto. Si el gen queda dentro de la heterocromatina es lógico que ese gen no se exprese, pero el problema de la variegación es que ese gen se inhibe de manera gradual cuanto más cerca estés de la heterocromatina.

Realmente la idea es que la heterocromatina cambiaría tal vez de tamaño en el desarrollo. Esa heterocromatina (región mucho más condensada y que no siempre tiene el mismo tamaño) podía modificarse. Si la heterocromatina se extendía hacia donde estaba el gen, lógicamente lo cubría y entonces no se expresaba correctamente. Si el gen estaba cada vez más cerca, más era posible que la heterocromatina pudiera cubrir el gen al extenderse.

Ya se ha descubierto todo el mecanismo de extensión de la heterocromatina y sus causas y genes que lo regulan. Es muy compleja la vía, pero ya se conoce. Es relativamente inespecífica.

TRANSLOCACIONES

Tiene que haber rotura y luego hay intercambio. Pero normalmente lo que supone es rotura de dos cromosomas que en principio no tienen nada que ver. Esos cromosomas se unen y por lo tanto se da origen a muchas cosas curiosas. Si se da entre 2 cromosomas acrocéntricos, un corte en el brazo corto y el corte en el otro en el brazo largo, se produce por fusión un cromosoma metacéntrico y uno minipequeñito. Esto se llama normalmente Fusión robertsoniana (Robertson las vió por primera vez).

Si se da translocación entre uno metacéntrico y otro cromosoma pequeñito, se originan lógicamente cromosomas acrocéntricos (el brazo largo de cada uno de ellos corresponde al aporte del metacéntrico y el brazo corto tiene sobre todo material del cromosoma pequeñito). Se suele llamar disociación.

Si un metacéntrico se rompe por el centrómero, se da una fisión, el origen de dos cromosomas telocéntricos. Cada uno se queda con la mitad del centrómero que puede rellenarse para corregirse.

Son una fuente invaluable de especiación.

Hay cantidad de ejemplos en los que el cariotipo de los organismos se ha estudiado y se ve que ha evolucionado en base a estas fusiones robertsonianas. Esto se ve muy bien en la cabra y la oveja. La cabra tiene 29+XY mientra que la oveja tiene 29 +XY también. Pero no hay metacéntricos en la cabra y sí los hay en la oveja. Está clarísimo que esto se dio por fusión cromosómica robertsoniana.

El ortóptero Arcyptera fusca tiene n=11+X cromosomas acrocéntricos (todos acrocéntricos), el macho.

Chorthippus parallelus es otro ortóptero bastante hermanado con Arcyptera. Tiene n=8+X en los machos. Tiene 3 de esos 8 que son metacéntricos. Evidentemente son fruto de 3 fusiones céntricas.

Las translocaciones dan lugar a homólogos que no son verdaderos homólogos. Es así que luego de la translocación se producen tetravalentes que implican 4 cromosomas. Estas estructuras se forman así como cruces durante la meiosis. Lógicamente en ellos tendremos 4 centrómeros.

A la hora de la segregación existen 2 tipos de segregaciones:

La alternada

La adyacente

Dependiendo de los tipos de segregación los gametos serán lógicamente diferentes.

Además, si encima de translocación se producen quiasmas y entrecruzamientos hay miles de variables posibles. Las estructuras que se forman son complicadísimas. Es algo que a la hora de producirse la segregación, si existen entrecruzamientos, la información que llevará cada gameto será muy diferente. Así es aún rarísimo que entre dos gametos originados a partir de un homólogo original haya similitudes significativas.

Las traslocaciones son importantes sobre todo porque muchos genes silenciados pueden activarse o unirse (efectos de posición, etc.) por traslocación. Así se forman muchos síndromes. La leucemia mieloide crónica se produce por ejemplo por la translocación de 9 y el 18. El síndrome de Down, aparte de por trisomía del par 21, se produce por translocación entre el 14 y el 21. El de Burkitt es por traslocación entre el 8 y el 14.

Síndrome de down por translocación

Si ocurre la translocación entre el 14 y el 21, el problema está en el momento que hay que producir los gametos. Tenemos un cromosoma de fusión 14/21 que se unirá con sus partes correspondientes al 21 y al 14. A la hora de la meiosis tenemos un tetravalente lógicamente. A la hora de la meiosis, puede ocurrir, por ejemplo que el 14/21 fusionados en la separación vaya a un polo, mientras que el 14 y 21 (los que no translocaron) vayan al otro - que quedará lógicamente normal. En el primero, dotación genética realmente no se perdió mucho, pero desde el punto de vista centromérico se perdió un centrómero y lógicamente se “perdió” 1 cromosoma en uno de los gametos (aunque la información no se haya perdido realmente).

En otro caso posible, uno de los gametos podría quedarse con el 14/21 y el 14 mientras que el otro gameto se queda solo con el 21. En el último caso posible, un gameto podría quedarse con el 14/21 y el 21 y el otro gameto se quedaría solo con el 14.

En éste último caso, si el gameto que lleva dos dosis de 21 se fusiona con un gameto normal (que lleva una dosis normal de 21) se formaría un embrión que no tendría realmente la trisomía, pero que tiene 3 dosis de cromosoma 21 y por lo tanto tendrá el Síndrome de Down. En las amniocentesis esto no sale dado que normalmente uno espera ver trisomía. Además el 21 es muy difícil de visualizar.

Leucemia mieloide crónica por translocación

La translocación hace que se forme un encogen por translocación. El encogen es el BCR-ABL y se crea por translocación desde el 9 (fragmento ABL) y desde el 14 (fragmento BCR). El encogen ahora activado sufrirá leucemia mieloide crónica.

Efecto de las translocaciones en el cariotipo

Se va viendo en diferentes especies de roedores.

El ejemplo más espectacular es la comparación entre el Muntjac chino y el Munjac indio (el cariotipo más pequeño en mamíferos). Se ve que en el indio, tenemos megacromosomas meta y acrocéntricos tochísimos. En el chino tenemos todos acrocéntricos normalitos. Si medimos todo el tema podemos ver como los megacromosomas del indio se formó por translocación a partir de los otros cromosomas pequeñitos.

MECANISMOS POR SOBRECRUZAMIENTO

Las deleciones pueden darse por sobrecruzamiento entre dos secuencias duplicadas en el mismo cromosoma. Se originan moléculas de dsDNA circular que pueden perderse (elementos extracromosómicos). Esos pueden luego ir a otros lugares e insertarse por sobrecruzamiento en otras zonas que presentan homología.

Las deleciones y duplicaciones se pueden dar lógicamente por sobrecruzamiento, como es más frecuente. Vimos el caso de las recombinaciones desiguales que podían originar los famosos mutantes doble bar.

Las inversiones ya son más curiosas. Si tenemos dos secuencias homólogas, pero en sentido contrario (por ejemplo originadas por duplicación e inversión previa). Esas secuencias homólogas podrían aparearse y podrían producirse entrecruzamientos en ellas. Al resolver el tema, el fragmento que estaba entre las dos secuencias, directamente se invierten gracias a la resolución del entrecruzamiento. Esta situación de inversión es el mecanismo generador de inversiones más frecuente (es raro que se de por cortes como lo vimos antes).

La translocación recíproca puede darse por recombinación de dos regiones que son homólogas en dos diferentes cromosomas. Al resolverse el entrecruzamiento lógicamente se generan cromosomas heteroduplex. Esto también es bastante más frecuente que el caso de que un gen se pierda de un cromosoma y que luego se meta en otro así sin más.

VARIACIONES EN EL NUMERO CROMOSOMICO

Al hablar de mutaciones cromosómicas hablabamos de que se clasificaban en estructurales y no estructurales. Entre las no estructurales están las que afectan al número cromosómico.

Hay dos tipos básicos de variaciones en el número cromosómico (ploidías).

• Aumento o disminución del juego completo de cromosomas - Haploidías o poliploidías

• Aumento o disminución en el número de cromosomas de un par concreto - Aneuploidía

Hay que entender para esto los parámetros que regulan el número cromosómico de una especie:

X = número básico = número de cromosomas de una especie - indica el nivel de ploidía de una especie

N = número haploide = número de cromosomas que lleva el gameto

X = N en muchos casos, pero no siempre. X y N suelen diferenciarse cuando en una determinada especie, evolutivamente la especie actual ha derivado de otras. Si una especie ancestral tuviera X=4, pero esa especie a lo largo de la evolución ha originado una especie que es N=16. Si nosotros sabemos que N actual es 16 y sabemos todo lo que ha ocurrido con esa especie y cuál es su ancestro, nos daríamos cuenta que desde N=16 eso podría haber venido porque el X=4 del ancestro se ha ido duplicando a lo largo de la evolución. En muchos casos, y sobre todo si no sabemos nada de una especie determinada, lo que deberíamos estudiar es el número cromosómico que tiene, ya que generalmente no se puede saber el número básico de todas las especies (sobre todo sobre una especie que no conocemos mucho).

Si a partir del número básico nosotros vemos que el N = 2X entonces el individuo es DIPLOIDE. Si N = 3X es TRIPLOIDE. Así tetraploide, hexaploide, etc. La producción de poliploides (aumento del número básico) puede ser de esta forma - por duplicación, triplicación, etc. El aumento del número básico puede producirse mediante 2 formas:

• autopoliploidías: el aumento se produce a partir de una misma especie originándose individuos autodiploides, autotriploides, etc.

• alopoliploidías: el aumento se produce a partir de dos o más especies originándose individuos alodiploides, alotriploides, etc.

Todas estas duplicaciones, triplicaciones, etc. pueden conllevar problemas a la hora de la meiosis.

Los vegetales son los organismos en que se da con mayor frecuencia la poliploidización. Muchas plantas no tienen reproducción sexual, sino vegetativa, por lo cual el aumento del número cromosómico no tiene problemas dado que no harán meiosis.

En muchos animales también hay reproducción asexual, pero suele ser sexual. Es por eso que entonces es raro que se de poliploidización de células sobre todo de células germinales.

El aumento del número de ploidía suele conllevar mayor producción de todo, mayor metabolismo, etc. y un aumento generalizado del tamaño.

MONOPLOIDES

No presentan cromosomas homólogos. En plantas, los individuos haploides son generalmente más débiles comparados con sus respectivas. Los monoploides suelen ser organismos que tienen el número básico. Pero nosotros también podemos crear organismos que tengan número cromosómicos duplicados y que tengan 1 solo juego cromosómico determinado, con lo cual no podemos inferirlo simplemente a partir de contar cromosomas.

Por qué interesan? En plantas se suelen producir y utilizar para seleccionar individuos resistentes o determinadas condiciones y producir, posteriormente la duplicación para la obtención de homocigotos para esos genes. Gracias al hecho de que expresan todos sus genes (y todos los que le metamos) son muy útiles para estudiar. Suele convenir obtener individuos monoploides a partir de plantas diploides, etc. Una vez ya ponemos el monoploide luego podemos diploidizarlos para originar los individuos ya comerciales.

Para producir los monoploides hay varias formas. En cebada, un método para obtener haploides consiste en la polinización de plantas de una especie con plantas de otra (del mismo género). La fecundación ocurre, pero durante una de las primeras divisiones del cigoto híbrido, los cromosomas de una de las dos plantas se pierden, formándose un embrión con solo cromosomas de la otra, en condición haploide. Es algo similar a lo que se hacía para mapear cromosomas humanos fusionando lineas de ratón y lineas de humano (los cromosomas de humano se perdían en el híbrido en gran parte).

Otra de las formas posibles es a partir de los sitios de una planta donde tenemos una constitución haploide. Ya sabemos que en las plantas, los granos de polen son haploides. Ahora mismo existe la tecnología para a partir de granos de polen, poniéndolos en medios nutritivos con hormonas, el grano de polen producirá unas plántulas que luego pueden incubarse para originar plantas monoploides derivadas del grano de polen.

Una vez tenemos el individuo monoploide, y si lo que nos interesa es seleccionar homocigotos que tengan genes de resistencia, genes de sequía, genes de frío, etc. activos completos, lógicamente para tener los individuos comerciales, interesa hacerlos ahora diploides, para que ahora tenga una meiosis normal, y pueda distribuir esa mutación y esos genes de resistencia como nos convenga a nosotros.

La diploidización se da mediante el método de duplicación de haploides. Se usa la droga colchicina, algo que suele usarse para bloquear cromosomas en metafase. Lo que hace la colchicina es inhibir la polimerización de las fibras MT del huso. El cultivo celular avanza con colchicina, pero cuando los cromosomas se laineen en la placa metafásica, al inhibirse las fibras del huso, llegarán a la placa los cromosomas, pero no podrá iniciarse la metafase. En esa situación se recogen células que se han ido acumulando en metafase mitótica. Así las células no se dividen y quedarán con cromosomas duplicados. Las células somáticas se plantan en el medio de cultivo con colchicina. Si nos salen brotes, estaremos tratando con organismos resistentes y que encima tienen su número cromosómico duplicado. Ahora tendremos plantas que son homocigotos para los genes de resistencia (resistieron el medio!). Replantamos y ahora ya tenemos el individuo.

Autopoliploidía

Se multiplica el número básico. El triploide implica que nosotros tenemos 3 cromosomas iguales por cada par. Ahora no hay un cromosoma y su homólogo sino 3 homólogos. Cuando llega la meiosis, estos tres cromosomas pueden hacer cosas muy raras. A nivel teórico podría haber una unión entre los 3 y que forman por sinapsis un trivalente o podría ser que se forman bivalentes y que uno quede como univalente suelto por ahí. Esto sucede además para el cromosoma 1, 2, 3, etc. todos los cromosomas de la célula. Además cuando se da la anafase, la migración polar puede ser un caos!!!

Si tenemos en vez de un triploide un tetraploide, entonces las posibilidades de apareamiento son múltiples, podrían formarse tetravalentes (cuadrivalentes), dos bivalentes o un univalente y un bivalente.

Alopoliploidía

Si tenemos una especie que es 2n = 6 y otra 2n = 4. Podría ser que fueran las ancestrales, por lo que una sería X = 3 y la otra sería X = 2.

Los gametos de la primera serían ABC y los gametos de la segunda serían MN. Esos gametos son por definición N.

Si se fecundan ambos gametos por cruzamiento se generan híbridos que tendrán ABCMN y que son potencialmente estériles. Ese híbrido sería en principio 2n dado que viene por la mezcla de un gameto N y otro gameto N. El individuo híbrido es 2n pero es raro. Lo que pasa con este híbrido es que no tiene cromosomas homólogos, son todos cromosomas distintos. El híbrido no tendrá meiosis normal y por eso es potencialmente estéril.

Su solución para seguir adelante con su reproducción sexual deberá duplicar su material genético. La duplicación se da de forma natural y espontánea en algunos organismos muy raros. Lo que obtenemos ahora es una planta híbrida especial que tiene un aumento del número cromosómico y será 4n. Esta especie será AABBCCMMNN. Este individuo 4n es lamado anfiploide o anfidiploide. Se llaman así debido que no son tetraploides (como los que se producían por autopoliploidía).

El tipo que investigó esto fue Karpachenko quien en el año 1928 veía que si mezclaba Brassica (repollo) con Raphanus (rábano) obtenía una planta híbrida totalmente estéril. Ni siquiera tenía un tamaño más grande que cualquiera de sus padres (como él esperaba obtener). Cuando estudió sus cromosomas vio que la planta era de dotación n+n = 9+9. De manera espontánea un día se encontró que cuando hacía una cierta cantidad de cruzamientos, obtenía una planta totalmente nueva, también híbrida. Esa planta era especial, 2n+2n = 18+18 y sí era más grandota que cualquiera de las otras dos. La llamó Raphanusbrassica.

Hay otros ejemplos de anfidiploidía. El ejemplo se ve mucho más en plantas que en animales. La alopoliploidía está casi circunscrita a vegetales únicamente. Uno de los ejemplos de los libros es como se ha conseguido la evolución de plantas comerciales como el trigo que se fue mejorando a partir de hibridos y alopoliploidías.

El trigo actual es un alohexaploide, AABBDD. Viene en un principio del Triticum monococcum (aporta el genoma A) y del Triticum searsii (aporta el genoma B). Estas dos forman un híbrido AB que lógicamente proviene de la fusión de la X del monococcum y del otro X del searsii. Cuando por reproducción vegetativa se produce la duplicación se obtiene a partir del organismo original estéril un organismo alotetraploide, 2N=4X, AABB que se supone que es el Triticum turgidum. Esa especie se cultivó durante más de 10000 años hasta que en algún otro momento se hicieron hibridos de ese turgidum con Triticum tauschii que aportó el genoma D. Eso originó un individuo 2N=6.X estéril e híbrido ABD. A partir de ese estéril se consiguieron individuos con genoma duplicado por reproducción vegetativa. Así se originó el alohexaploide Triticum aestivum.

Realmente X = 7 en los Triticum monococcum, Triticum searsii y Triticum tauschii. En el alotetraploide Triticum turgidum teníamos 2N = 4.X por lo cual lógicamente 2N=28. El alohexaploide Triticum aestivum es 2N = 6. X = 42.

¿Cómo se descubrió esto?

Se estudiaron los cariotipos en conjunto de toda la familia de los trigos. Se llegó así a la conclusión que los 2N=42 del Triticum aestivum provenían de la fusión de 3 genomas X=7.

Se pueden hacer también hibridaciones con centeno (Secale spp). Se llaman triticales. El centeno 2N=2X=14 es diploide y cuando se cruza con trigo se obtiene un triticale alooctoploide AABBDDRR. Si lo cruzamos con Triticum turgidum en vez de Triticum aestivum entonces obtendríamos un alohexaploide AABBRR.

Esta capacidad de las plantas ha hecho que se utilicen estos mecanismos para propósitos industriales. La hibridación entre especies comestibles ha hecho que se produzcan especies que tienen un mayor tamaño (típica consecuencia de la poliploidía). Eso interesa mucho en el caso de las plantas lógicamente (más producto!). Eso además de la generación de híbridos que pueden ser o más vendibles, más resistentes, más sustanciosos, mejores para el crecimiento, más rápidos, etc.

Recordemos que el paso clave en la generación de alopoliploidías es la duplicación del genoma en el híbrido estéril. ¿Qué es lo que ocurre en la meiosis de los anfidiploides que permite la duplicación del genoma?

Si las especies que están interviniendo están muy próximas filogenéticamente entonces lo que puede ocurrir es que los cromosomas y genomas, aunque distintos, sean cromosomas casi homólogos. Se llaman homeólogos. Eso haría que el híbrido tuviera algun tipo de afinidad entre los cromosomas homeólogos, pero aún así no hay suficiente para que se de la sinapsis y la meiosis correctamente. Al duplicarse el genoma deberían originarse los homólogos de los homeólogos. Pero el problema es que en el momento en que el alotetraploide tiene que hacer la meiosis, los homeólogos comienzan a relacionarse entre sí mientras están en bivalencia sus homólogos. Se forman algunas zonas de trivalencia, etc. Al final resultan meiosis algo aberrantes. Si la homeología es muy alta, porque realmente las especies estaban muy emparentadas podrían producirse aloploides segmentales, individuos que provienen de dos especies muy emparentadas (cromosomas muy homeólogos). En ellos los híbridos duplicados (alotetraploides) son casi estériles también debido a la interacción entre homólogos.

¿Qué es mejor a la hora de producirse la meiosis - que las especies estén muy relacionadas filogenéticamente o que estén lo menos relacionado posible?

Lo mejor es que sean muy distintas. Por qué? Porque de esa forma el híbrido anfidiploide será perfectamente estéril y cuando se duplique el genoma, cada uno de los cromosomas tendrá un homeólogo (único con el que puede hacer sinapsis) y por lo tanto todo cursará correctamente a partir de ahí.

ANEUPLOIDIAS

Aumento o disminución de uno o varios cromosomas. Si se pierde uno de los homólogos tenemos individuos monosómicos para ese cromosoma. Si se pierden los dos homólogos entonces tenemos individuos nulisómicos. Si aumenta en 1 el número de cromosomas de un par tenemos individuos trisómicos. Si aumenta en 2 tenemos individuos tetrasómicos.

¿Cómo se producen las aneuploidías?

En general se producen:

• por el proceso de no disyunción mitótica o meiótica

• por asinapsis entre los cromosomas homólogos en meiosis

• retraso de los cromosomas en la segregación

Por no disyunción en la primera división meiótica podría darme dos gametos que serán disómicos y dos gametos nulisómicos. La fusión de los disómicos con óvulos monosómicos darán cigotos trisómicos.

Por no disyunción en la segunda división meiótica podría darse dos gametos que serán monosómicos, un gameto nulisómico y uno disómico.

Recordamos los experimentos con Datura stramonium. Tenía n=12. Con trisomías en alguno de sus 12 pares cambiaba notablemente la forma de la cápsula (el fruto de la planta). Las trisomías en general son aneuploidías que generan fenotipos muy conspicuos.

En humanos la trisomía del par 21 produce el síndrome de down. Al hacerles un cariotipo se observan

También, como vimos, se pueden producir por traslocación 14-21. Eso hace que tenga varias dosis del cromosoma 21 y por lo tanto se produce el fenotipo.

Es fácil el saber por el fenotipo el síndrome que se tiene. Otros síndromes también están asociados. El de Pataun está asociado al cromosoma 13. Todo el mundo ya sabe que la edad materna influye muchísimo.

Hay aneuploidías en los cromosomas sexuales y eso conlleva fenotipos característicos. Antiguamente para averiguar las aneuploidías en estos cromosomas se usaban técnicas bastante sencillas. Es la visualización del corpúsculo de Barr. Barr desarrolló una técnica para saber el número de cromosomas sexuales del individuo. En el humano las hembras son XX y los machos XY normalmente. Lo que se veía es la heterocromatinización del cromosoma X en forma de corpúsculo. Se raspaba un poquito la mucosa bucal y se ponía con orceína en un porta. Se observaban células somáticas. Las chicas tenían un corpúsculo en las células. Los chicos como solo tienen un X no había heterocromatinización. Si había dos manchitas, lógicamente la chica era XXX y por lo tanto tenía 2 corpúsculos. Esto es muy fácil y se hizo mucho tiempo en las prácticas dado que es fácil y sale normalmente bien. Pero siempre pasan cosas raras y en las células normalmente hay cosas que se heterocromatinizan y de hecho como el tema falla bastante ya no se usa como diagnóstico para nada…

Con respecto a las aneuploidías de cromosomas sexuales hay dos síndromes super conocidos.

Se producen por no disyunción de los cromosomas sexuales. Cada síndrome tiene un fenotipo muy característico.

Los chicos XXY sufren del síndrome de Klinefelter. La anomalía XO dá hembras (claramente, no tienen el SRY que hace a la diferenciación del macho durante el desarrollo) que sufren el síndrome de Turner. Tiene unas manifestaciones fenotípicas. Lo más caracterítico es que los brazos se desvían hacia el exeriior, no menstruan y tienen estructuras gonadales no desarrolladas.

Un solo cromosoma como es estas trisomías conllevan manifestaciones fenotípicas bastante fuertes y visibles, mientras que cuando veíamos casos anteriores que técnicamente como estamos aumentando todo el número cromosómico debería haber manifestaciones más drásticas. Esto se debe a que el aumento de todo el complemento cromosómico no es tan desequilibrante en el genoma como el aumento de la dotación de algunos genes en concreto y no de todos. O sea que el aumento de un cromosoma muchas veces es más visible sobre todo por el desequilibrio del producto proveniente de cada cromosoma.

MOSAICISMO

Todas estas trisomías que vimos se producían a la hora de la meiosis, pero también pueden darse en la mitosis (sobre todo en las primeras mitosis del individuo que son rápidas, aceleradas y casi descontroladas).

El mosaicismo son individuos que tienen partes diferentes del cuerpo con diferente ploidía. El caso se ve muschísmo en Drosophila.

Si en la primera mitosis del cigoto se produjera la pérdida de uno de los cromosomas X que lleva la mutación white. Lo que sucede es que se gneran dos células hijas, una XwO y una Xw+Xw+Xw. Como es lógico, se genera un individuo que tendrá la mitad de su cuerpo XwO (macho) y la mitad de su cuerpo XXX (hembra). El ojo del lado macho será de color blanco dado que el organismo tendrá la mitad de su cuerpo con la mutación white hemicigótica.

Pero esto puede ocurrir en diversos momentos del desarrollo y así se producen manchas en el cuerpo en las que tendremos como mosaicos genéticos.

DISOMIA UNIPARENTAL

Desde el punto de vista cromosómico la mitad provienen de nuestro padre y la mitad de nuestra madre. Nosotros podemos hacer un estudio y ver los cromosomas que provienen de nuestra madre y los que provienen de nuestro padre gracias a técnicas de citogenética molecular.

En muchos casos se ve que los dos cromosomas de un par entero provienen del mismo parental dandose lo que llamamos disomía uniparental. En ellas, un gameto que era disómico para un cromosoma se fusiona con un gameto monosómico normal. Lógicamente las disomías uniparentales requieren que se pierda un cromosoma entero (que suele ser el normal) y es por ello que no se produzcan individuos trisómicos para el cromosoma.

Muchos síndromes se producen cuando se dan casos de disomía uniparental para alguno de los cromosomas.

La fibrosis quística es una mutación recesiva (por lo que los individuos paternales que dan los dos cromosomas tienen que ser homocigotos recesivos). Se veía que si el padre y la madre eran heterocigotos para la fibrosis, un cuarto de los individuos hijos eran homocigotos recesivos y presentaban fibrosis quística.

Pero en algunos casos se veía que algunos individuos con fibrosis quística podían producirse a partir de un padre homocigoto recesivo y un padre homocigoto dominante. Lógicamente se había producido porque el padre recesivo había otorgado sus dos cromosomas al hijo y entonces se daba la disomía uniparental.

El síndrome de Prader-Willi. Muchas personas con este síndrome presentan una deleción en el brazo largo del cromosoma 15 paterno. Ese mismo 15 si proviene de la madre el síndrome no se llama Prader-Willi ya que fenotípicamente se producen otras cosas. Eso hace que el síndrome cambie de nombre dependiendo de qué 15 tiene el brazo largo delecionado y se llame síndrome de Angelman.

Sin embargo, por disomía uniparental materna, un 20-30% de individuos con Prader-Willi se originan cuando ambas copias del cromosoma 15 delecionado se heredan de la madre y ninguna del padre. O sea que la disomía uniparental materna, en vez de originar Angelman origina Prader-Willi.

Esto realmente es consecuencia de que en las primeras fases del desarrollo hay una sobreproducción de genes maternos y por lo tanto es muy importante para el producto fenotípico final la expresión en esas fases tempranas del cromosoma 15.

LOS CROMOSOMAS B - cromosomas extra (Langley 1927, en plantas de maíz)

Existen en casi todas las especies pero se sabe muy poco. No se pueden considerar como aneuploidías dado que el número cromosómico aumenta pero no a partir de los cromosomas que tenemos por duplicación sinó porque aparecen como accesorios. Se llaman de hecho así. Son cromosomas extra en el complemento específico.

White en 1973 define los cromosomas B como aquellos que se unen al cariotipo normal y que no son homólogos o parcialmente homólogos de miembros del complemento. También son llamados accesorios o supernuméricos.

Incluso han sido descritos en la especie humana.

Su presencia en el genoma ha generado muchas preguntas:

• efecto sobre el individuo que lo lleva

• papel que puede desempeñar en la célula

• forma de transmisión

• origen

SE SABE MUCHO (se han estudiado mucho) Y MUY POCO (pocas respuestas han salido) DE ELLOS

Qué se sabe?

• son dispensables

• variabilidad e inestabilidad numérica (en un mismo individuo puede existir distinto número de cromosomas B - en prácticas lo veíamos en los folículos del saltamontes (¡gran variabilidad incluso en un mismo individuo!)

• acumulación (no siguen las reglas mendelianas de la transmisión) - se acumulan en el genoma constantemente aunque un número elevado resulta desfavorable - siempre hay un número máximo en la especie (por lo tanto debe haber alguna forma de regular su número en las células - deben tener algún sistema para que nunca se supere el número máximo)

• aislamiento meiótico con respecto a los autosomas - No se produce sinapsis ni entrecruzamiento entre cromosomas B y autosomas o entre cromosomas sexuales

• meiosis totalmente diferente dependiendo de su número - más estable cuando su número es par - si el número es impar, la actuación meiótica de los cromosomas es imprevisible

• información obtenida sobre los cromosomas B en un organismo no refleja lo que ocurre en otros organismos

Algunos autores los consideran parásitos o egoístas incluso hoy en día. Aunque no siguen reglas normales de segregación sí intentan transmitirse a la descendencia. En un cóccido Pseudococcus affinis, solo forman gametos funcionales las espermátidas que llevan cromosomas maternos. Los paternos suelen degenerar. Los cromosomas B solo se introducen en las espermátidas con cromosomas maternos. Es como si supieran en qué gameto meterse para pasar a la generación siguiente.

Todavía nadie dijo que los cromosomas provengan de algún lugar en concreto. Aparentemente el origen podría ser diferente según la especie. En algunos casos sondas para esos cromosomas B se ve que hibridan además de en los cromosomas B también en algunos autosomas, incluso a veces en los cromosomas sexuales. Eso indicaría que podrían tener origen en el complemento normal del organismo. En algunos casos se piensa que podrían provenir de deleciones cromosómicas, de fusión robertsoniana, y otros procesos re reordenación cromosómica. Todavía no hay consenso.

Arcyptera fusca

Lo que se ve al estudiar su meiosis es que puede encontrar 1 o 2 o 3 o 4 cromosomas accesorios. En anafase 1 se ve que hay 2 cromosomas B muy pequeños, pero muy bien determinados. En la metafase se forman bivalentes que se separan en la meiosis I. Se han encontrado hasta 5 cromosomas B. El comportamiento es diferente y depende del número. Los número pares facilitan que los cromosomas estén ahí. Y lo que parece es que no hay una perturbación entre esos cromosomas y el resto. En plantas sí hay perturbaciones descritas, pero también en ellas suele haber decenas de cromosomas B posibles. Pero no es el caso de Arcyptera.

PARTE 3: LA RECOMBINACION

RECOMBINACION BACTERIANA

Desde que comenzó la genética microbiana, todo el mundo se está planteando si existe recombinación de material genético entre bacterias.

LEderberg y Tatum experimentan. Ponían unas bacterias a crecer en medios mínimos. Las bacterias eran de dos cepas. Una cepa era leu+, thr+, ile+ y phe- cys- his-. La otra cepa era leu-, thr-, ile- y phe+, cys+ his+. Cuando mezclaban las cepas en un medio leu-, thr-, ile-, phe-, cys-, his- veían que aparecían bacterias (unas pocas). Las colonias que crecían debían ser + para los 6 aminoácidos. Lógicamente la deducción estaba clara… las cepas debían haberse mezclado genéticamente originando una cepa nueva, recombinante, que poseía genes de las dos cepas y era + para los aminoácidos y por lo tanto podía crecer.

CONJUGACION:

La conjugación o paso de material genético desde una cepa a otra requiere por una parte contacto físico entre las bacterias (tal y como demostró Bernard Davis en 1950 con el experimento de crecimiento de bacterias con las cepas separadas mediante un filtro de vidrio).

El segundo requisito es la existencia del factor F, un plásmido llamado factor de fertilidad bacteriana. Las bacterias que lo llevan pueden producir los Pili, unos pelos para transferir genes. Sin factor F no pueden producirlos. Uno de los Pili, al tomar contacto permite pasar el material genético a través de él hasta la otra bacteria.

La transferencia de genes no es recíproca a través del Pili. Las bacterias que llevan factor F se denominan F+. Las que no lo llevan se llaman F-. Se transfieren los genes desde las bacterias F+ a las F-, siempre en ese sentido.

El Factor F de Fertilidad bacteriana

Es un plásmido de 94,5 Kb (2% del DNA bacteriano). Puede actuar también integrado como un Hfr en el cromosoma bacteriano. Es el que codifica para la producción de los Pili. Es el que es responsable de la transferencia del material genético desde una bacteria hasta otra. Requiere de una región que es donde se encuentran los genes de transferencia, el regulón TRA de 35 Kb (unos 40 genes encargados de que se produzca el Pili y la transferencia).

Aparte de los genes de transferencia tiene un origen de replicación de trasnferencia (un ori T). Gracias a eso podrá pasar de una bacteria a otra.

Los genes de transferencia se llaman tra. Además de estar los que se encargan de producir el Pili (unos 12), hay unos genes que codifican para la exclusión de superficie (codifican proteínas que impiden la posibilidad de que una bacterias F+ reciba pilis). Además hay otros que están encargados del paso de DNA de una célula a otra desde el extremo 5' (en el mecanismo de replicación por círculo rodante).

Las células se denominan de diversas formas en relación al estado en que se encuentra el factor F dentro de ellas:

• Células F- : Estas células no tienen el factor F ni transfieren ni genes F ni genes bacterianos. Son eficientes células receptoras durante la conjugación.

• Células F+ : Estas células contienen al factor F en el citoplasma. Este puede ser transferido eficientemente a una célula mediante la conjugación. Pero no puede recibir.

• Células Hfr: Son células que contienen el factor F integrado en el cromosoma. Pueden transferir marcadores cromosómicos con alta eficiencia desde un punto fijo del cromosoma (donde hay ISs, insertion sequences).

• Células F': Son células que contienen el factor F en forma extracromosómica después de haber pasado por un estado Hfr en cuya escisión

El factor F lleva transposones (elementos de inserción, IEs). En la conjugación una bacteria F+ puede producir un Pili que pone en contacto con una bacteria F-. Por círculo rodante corta una cadena de DNA y ese extremo 5' comenzará a pasar por el Pili hasta la otra célula. A medida que va pasando, en el extremo 5' se le pega un primer y se polimeriza una cadena complementaria. El plásmido F que quedó en la F+ donante se va a su vez completando por polimerización de una cadena complementaria con la misma secuencia que la cadena que se está donando. Al final todo el plásmido ha pasado a la célula receptora que ya será F+.

Una vez allí, el factor F puede integrarse. Para ello debe tener reconocimiento entre los segmentos de inserción que existen en el cromosoma bacteriano (ISs) y los que existen en el factor F. Por recombinación puede darse una integración. Podría ocurrir que solo existiera un fragmento IS en el factor F y que ese fragmento estuviera repetido 3 veces en el cromosoma bacteriano. O sea que el plásmido podrá integrarse en cualquiera de los 3 sitios del cromosoma bacteriano. Pero siempre debe existir un reconocimiento. ¿Qué supone esto? Que si se integra en un lugar determinado, tendrá como vecinos por un lado y por otro a determinados genes. Si se integra en otro sitio, los genes vecinos serán otros completamente diferentes. La integración siempre pasa por este reconocimiento.

El elemento de inserción son secuencias muy pequeñitas y que tienen unas características muy peculiares. Son los elementos transponibles más pequeños que existen. Se pueden reconocer porque estos IEs tienen TSs (Terminal sequences) muy características. El IS1 tiene 30 pares de bases. El IS2 tiene 40 pbs. El IS4 tiene 18. Aunque los extremos finales son particulares, en los elementos de inserción varía mucho el número de pares de bases.

Tienen aproximadamente 2000 pb.

La dirección del plásmido en el cromosoma bacteriano es diferente dependiendo de cómo se inserte. Dependiendo de la orientación que tenga el F insertado también se pasarán algunos genes u otros en el momento de la transferencia del cromosoma. Por ello es muy importante la dirección en que esté dispuesto.

El hecho de que haya transferencia entre bacterias de una misma especie podría darse el caso de que una bacteria F- súbitamente al hacerse F' tenga una situación de diploidía para algunos genes. Incluso se podría dar entrecruzamiento entre esos genes homólogos.

Cuando una bacteria Hfr intenta pasar el factor F mediante un Pili a una F- pueden pasar dos cosas.

que primero se escinda el episoma y ahora el factor F se replique por círculo rodante para pasarse a la F-

que directamente todo el cromosoma bacteriano con el episoma insertado comience a replicarse por círculo rodante e intente pasar todo el cromosoma Hfr a la F-.

Comenzaremos por el ultimo caso - la exconjugación

Este último caso no suele evidenciarse porque nunca pasa todo el Hfr a la célula receptora. Normalmente el cromosoma no pasa completo y se corta el Pili antes. Lo que sucede es que al final la receptora queda como F- aunque con fragmentos del F y algunos fragmentos del cromosoma bacteriano que además podrían recombinar. La receptora podría quedar con una situación de diploidía para algunos genes. Lógicamente en la descendencia luego esos fragmentos se perderán, pero si los genes se recombinaran, podría haber alternativas alélicas en la descendencia de esa población. Se obtienen bacterias recombinantes.

Cada vez que el factor F se pasa de una bacteria Hfr a otra F- es siempre más frecuente que se pasen junto con el F los genes que estén más cercanos y lógicamente los que estén en la dirección correcta. Este hecho fue aprovechado por gente que intentó cartografiar el factor F de E. coli. A través del cálculo de la frecuencia que tenía el paso de un determinado gen a una bacteria F- podía estimarse la distancia relativa de los determinados genes.

El factor F además tenía el beneficio de que codificaba sobre todo para genes de resistencia a ciertos antibióticos y para genes que permitían el aprovechamiento de ciertos nutrientes.

O sea que podía calcularse la frecuencia de recombinación de esos genes simplemente sembrando un volumen constante de bacterias Hfr en una placa junto con bacterias F-. Se ponían placas que tuvieran solamente uno de los factores de selección. Por ejemplo, si las Hfr eran consumidoras selectivas de nutrientes A, B, C y D y además tenían resistencia a Estreptomicina. Entonces se usaban placas que fueran A-, otras placas B-, otras C-, otras D- y otras con Estreptomicina. Se sembraban las Hfr sobre las F- y se esperaba que aparecieran colonias. Para ello se analizaba a diferentes tiempos, 5', 10', 15', 30', etc. cada placa. A 5' solo había colonias en la A, a 10' aparecían además colonias en la B', a 15' aparecían también en la D, a 30' aparecían también en la de Estreptomicina y a 45' aparecían también en la C. Lógicamente el orden de los genes era A B D Str C.

Analizando diferentes cepas Hfr y repitiendo el experimento veían que sin embargo el orden de los genes era diferente (se establecieron cepas Hfr1, HfrB, etc. Realmente eso era por culpa de que el F no se integraba en el cromosoma de las Hfr de la misma forma. En algunas se integraba de una forma y en otras de otra y en diferentes direcciones. Sin embargo, cartografiando veían que en todos los casos los genes tenían los mismos genes “vecinos”. Esto era una evidencia clara de que el cromosoma bacteriano debía ser un cromosoma circular. Fue una de las primeras veces que se cartografió un cromosoma bacteriano.

Veremos ahora el caso a) - la Sexducción

Al escindirse el factor F integrado en forma de episoma se forma un factor F pero no igual al que se insertó por primera vez. No es igual porque suele llevarse algunos genes. El factor F es ahora llamado F' y la bacteria se llama F'+. Sin embargo el factor F' puede conjugar y pasarse a una bacteria. Si la bacteria Hfr original era lacZ+ y el factor F' se lleva el gen lacZ al escindirse podría pasarse ese alelo lacZ+ mediante conjugación a una bacteria que fuera F- lacZ-. Esa bacteria ahora será un diploide parcial o merocigoto. Esa bacteria será ahora F+ lacZ+/lacZ- y podrá digerir galactosa.

Pero no solamente podría darse con genes del metabolismo sino también con genes de resistencia. Este es uno de los grandes problemas de la biomedicina actual. Los factores F son grandes acumuladores de genes de resistencias y por lo tanto pueden llegar a recombinarse y conjugarse a muchas poblaciones de bacterias que lo van compartiendo por ahí. Al final a partir de una mutante resistente se obtienen poblaciones enteras recombinantes mediante este proceso de sexducción.

LA TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

Gracias a los experimentos de Griffith en el 28 se inicia el estudio para ver que el DNA era la que llevaba la información genética. Griffith experimentó con ratones y S. aureus. El hecho de que se pueda producir transformación en bacterias ha hecho de que se apliquen mucho para biología molecular. La transformación bacteriana hace posible que algo externo (como un plásmido) se introdujera dentro de una bacteria y a partir de ahí podría expresarse. Es algo que naturalmente ocurre muchísimo.

Lo que tenemos es una bacteria que recibe DNA exógeno y lo incluye dando pié a que se pueda producir la recombinación. Lo que tenemos es entonces un cultivo bacteriano y DNA exógeno. Ni siquiera tiene que ser de la propia especie sinó que podría ser de otra especie bacteriana o incluso de arqueobacterias o eucariontes. Las bacterias que son susceptibles entonces pueden recibir DNA exógeno de varias fuentes.

Es el mecanismo por el cual un DNA exógeno se incorpora dentro de la bacteria. Pero la bacteria debe ser “competente”. Si la bacteria no está en estado de competencia es incapaz de que incorpore el DNA. El estado de competencia ocurre de forma natural pero no en todas las bacterias de la misma manera. Unas veces se da por ejemplo durante fases de proliferación masiva, otras veces por electrocución (un rayo que cae sobre el suelo y mantiene electricidad y un potencial negativo en el suelo), otras veces por choques térmicos (aumento de la temperatura súbito en determinados ambientes más o menos extremos).

También se puede producir artificialmente.

La transformación puede dividirse en etapas:

• desarrollo de la competencia

• unión del DNA con la bacteria (proteínas que lo captan en la MP)

• Procesado y captación del DNA

• Integración del DNA por recombinación y expresión

Desarrollo de la competencia:

La competencia requiere complejos cambios fisiológicos que ocurren en determinadas etapas de crecimiento.

En S. pneumoniae el estado se logra al alcanzar una cierta densidad celular. En B. subtilis la competencia se produce en fase estacionaria cuando la síntesis de DNA disminuye. En otras es de forma diferente.

Griffith calentaba las bacterias (para “degradar el DNA”) y luego las ponía en contacto con las cepas no patógenas.

Unión del DNA

La célula mediante un receptor que se encuentra en su superficie principalmente DNA de doble cadena. La especificidad es variable.

Procesado y captación del DNA

El DNA es degradado hasta estar en forma de doble cadena. En bacterias Gram negativas, el DNA es incorporado a unas vesículas llamadas transformasonas. En su interior una de las cadenas es degradad. Además las vesículas protegen al DNA de las DNAsas y de enzimas de restricción celulares.

En otras bacterias hay una nucleasa al lado de la proteína de unión de la MP que a medida que el DNA pasa adentro va degradando una cadena. A veces la proteína accesoria no es una nucleasa sino una enzima parecida a una helicasa que lo que hace es separar las cadenas y dejar entrar solo a una.

Recombinación

NO es normal. Lógico, la molécula es de cadena sencilla. O sea que el proceso debe ser más complejo. De hecho, la proteína que hace todo esto es la RecA. La Rec A tenía la capacidad de localizar DNA de cadena sencilla y lo llevaba a un DNA de cadena doble desplazando una de las cadenas (lo vimos cuando vimos la reparación de las mutaciones). Ese DNA de cadena sencilla podría ser el exógeno que se introdujo por transformación. Entonces la RecA, gastando ATP podría intentar “reparar” el DNAds del cromosoma bacteriano con el DNAss. Gracias a este proceso se forma a partir del DNA donante y el DNA receptor una molécula de DNA heterodúplex (una de las cadenas de la hélice es diferente de la otra; la doble hélice es heterogénea!).

TRANSDUCCION BACTERIANA

Es la tercera vía. Está mediada por fagos. Un fago Lambda típico infecta una bacteria y tiene dos opciones. Una es ir por la vía de la replicación lítica. La otra es entrar en fase lisogénica. La vía lítica es la más común. El fago lambda se expresa y replica circularmente como si fuera un plásmido. Al final se expresan los genes tardíos y se ensamblan y liberan los fagos nuevos. Se produce la lisis bacteriana y esos fagos salen al medio externo. Se producen placas de lisis (calvas en la siembra extendida).

En la vía lisogénica, debido a la presencia de secuencias de inserción (IS) en el genoma lambda, el cromosoma de Lambda puede incorporarse al cromosoma bacteriano como un episoma. Ahí la expresión de sus genes se inhibe y se queda como latente. En cada replicación bacteriana, el lambda lógicamente se irá replicando junto con ella. Al cambiar las condiciones ambientales podría producirse la inducción de la escisión y expresión de genes tardíos. Ahí súbitamente pasan al ciclo lítico y destruyen ahora a la bacteria.

Un fago se puede mantener en lisogenia mucho o poco tiempo, dependiendo de las condiciones ambientales.

Claro… pero como puede haber paso de material de una bacteria a otra? ¿Cómo se generan las recombinantes?

Las recombinantes podrían originarse por cualquiera de los dos métodos. En el caso de la lisogenia podría darse que al activarse el ciclo lítico, el Lambda episómico se escinda llevándose algunos genes bacterianos. Así ahora se replicaría por ejemplo llevando lacZ+. Se formarían las cápsulas y ahora podrían ir e infectar a una bacteria que fuera lacZ-. Lógicamente si en esa bacteria entra en lisogenia, ahora esa bacteria será diploide parcial para ese gen.

Pero también podría ser que en la fase de lisis, al producirse la fragmentación del genoma bacteriano, algo de ese genoma pudiera encapsidarse en algunas cápsidas vacías y así viajar e “infectar” otros individuos. Esos individuos no recibirán DNA viral como el resto sinó que recibirán DNA de otra bacteria. Ese DNA podría recombinar, etc. Lo veremos todo mejor mañana.

Se descubrió en 1952 por Joshua Lederberg y Norton Zinder. Siguieron el mismo esquema experimental que habían utilizado Lederberg y Tatum para descubrir la conjugación bacteriana.

Se tenían dos cepas de Salmonella typhimurium.

• una cepa, LA-22, era phe-, trp- y met+ y his+

• la otra cepa, LA-2, era phe+, trp+, met-, his-

Mezclaban en un cultivo líquido las dos cepas y luego sembraban en un medio limitante. Aproximadamente cada 100000 bacterias sembradas apareció una colonia en la placa petri. Esa colonia debía tener los alelos + para los cuatro aminoácidos, lógicamente. Siguiendo el razonamiento de antes, podían pensar que estaba ocurriendo una conjugación. Pero ¿dónde estaba la diferencia?

Ahora lo que hicieron fue comprobar que si entre las dos cepas no había contacto no había conjugación. Sin embargo los resultados que obtuvieron en este segundo experimento fue diferente. Pusieron un tubo en U con un filtro en el medio. Las cepas se sembraron una a cada lado del tubo. Luego cada mitad del tubo se sembró en una placa de petri con medio mínimo. Mientras que la siembra a partir de LA-2 no daba colonias (como era esperable), la siembra a partir de LA-22 sí tenía algunas colonias. Evidentemente había sucedido una recombinación pero no por conjugación o por lo menos no por contacto directo entre bacterias. La hipótesis que plantearon es que algo en la cepa LA-2 era capaz de pasar genes a la cepa LA-22 a través del filtro.

El experimento siguiente que hicieron fue cambiar el filtro. Encontraron que el agente era capaz de pasar por filtros de hasta 0,1 mm de diámetro. Concluyeron que el agente filtrable era un bacteriófago. Estos fagos eran estos “comebacterias” y estaban en la cepa LA-2 de forma latente (lisogénesis). Esos fagos eran capaces de pasar por los poros llevando material genético de la cepa LA-2 hasta la LA-22, infectarla y en ella debía dar lugar por lisogénesis a cepas estables y recombinantes que pudieran sobrevivir en un medio mínimo. Hay que darse cuenta de que esto lo pudieron deducir gracias a que ya existía suficiente conocimiento sobre fagos en esta época y el grupo PHAGE de Delbrook estaba en pleno auge (pensemos que en el 52 se dan precisamente los resultados de Hershey y Chase sobre el DNA).

Según ellos, la cepa LA-2 contenía en su genoma un profago (el profago P22) que entró en ciclo lítico en el momento de hacer el experimento. Empaquetaba un segmento de DNA bacteriano de la cepa que contenía los genes phe+ y trp+ y pasó por el filtro e inyectó el DNA en la cepa LA-22.

El proceso fue bautizado como Transducción (el material pasaba por los poros del filtro - transducia).

Existe un tamaño máximo del DNA que puede ser empaquetado durante la transducción. P1 puede empaquetar alrededor del 2 o 2,5% del cromosoma de E. coli. El P22 podía empaquetar alrededor del 1% de S. typhimurium.

La cotransducción se refiere al empaquetamiento y transferencia de más de 1 gen que lógicamente deben ir ligados. Se utiliza para determinar el orden y la distancia que se encuentran juntos. Las bacterias se denominan cotransductantes. Lógicamente también sirve para cartografiar (relacionar los genes que están más o menos juntos que lógicamente serán los que tengan mayor frecuencia de incorporación en la bacteria).

Hay dos procesos de transducción. La primera es la transducción generalizada.

Transducción generalizada

El cromosoma bacteriano tiene los genes a+ y b+ por ejemplo. Un fago se incorpora al interior y produce ciclo lítico. Si se produce un ciclo los fagos proliferarán dentro de la bacteria, se sintetizan las proteínas de ensamblaje y se lisa el DNA del cromosoma bacteriano. Si al seguir el ciclo lítico parte del cromosoma bacteriano es encapsulado en una de las cápsidas se obtendrán unos fagos que tendrán dentro un DNA normal viral y otros, pseudos-fagos que tendrán dentro DNA bacteriano. Podría entrar a+, b+ o también (si se puede) a+ y b+. Cuando se tiene otra bacteria que en este caso es a- b- entonces si el pseudos-fago infecta en ellas, introducirá un fragmento de DNA bacteriano que es por ejemplo a+ y b+. En el interior de esa bacteria receptora tendremos el cromosoma bacteriano y el trozo de DNA lineal. Esas dos moléculas pueden entrecruzar y puede haber recombinación. Al final podrían hacer sinapsis el gen bacteriano y el gen que fue transducido. El cromosoma resultante es un cromosoma recombinante que es a+ b+. A partir de ahora esa cepa es a+ b+.

Se podría lógicamente cartografiar y determinar la posición relativa de los genes. Si la frecuencia de obtener bacterias a+ b+ es más o menos alta, mientras que la de obtener bacterias a+ b- y a- b+ es menor, entonces a y b están bastante cerca. Si la frecuencia de bacterias a+ b+ es muy baja entonces a y b están lejos.

En la transformación pasaba más o menos lo mismo, dos genes muy próximos tendrán más posibilidades de transformarse juntos.

Transducción especializada

Ya no es cualquier fragmento de DNA lo que entra a la bacteria para recombinar. Se llama especializada porque es más frecuente que un determinado DNA (el que está cerca de los Attachment Sites donde se integra en lisogénesis un fago como Lambda). El fago lambda tiene una secuencia att que sirve para reconocer y entrecruzar con un sitio att que se encuentra en E. coli entre los genes gal y bio. Al entrecruzar puede integrarse el cromosoma viral.

Si luego se produce la inducción, el fago lambda podría salir (tal cual sucedía con el factor F). Al inducirse el ciclo lítico entonces puede ocurrir lo siguiente:

que las mismas secuencias que permitieron la inserción le permitan la escisión y se produzca correctamente

que la escisión se dé desplazadamente incorporandose una cierta cantidad de DNA de la bacteria junto con el cromosoma de Lambda. Pero lógicamente para eso deberá dejarse algunos genes en la bacteria (no puede entrar en la cápsida cualquier número). Como ejemplo podría ser que una parte del Lambda se quede mientras que el gen gal se meta dentro del cromosoma Lambda nuevo. Estos fagos se dice que son Lambda-Gal-Defectivos (lambda-d-gal)ya que carecen de algunos genes fágicos.

Los fagos Lambda-d-gal pueden infectar bacterias pero ya no integrarse… Pero tampoco podría ser capaz de seguir un ciclo lítico muy normal. Para ello necesitan la ayuda de otro fago llamado cooperador que debe introducirse por coinfección (doble infección)… El fago cooperador permitiría que se incluya un cromosoma lambda completo al lado del lambda d-gal. Ahora, el producto de ese cooperador será el que ayude a mantener el ciclo viral. Si el fago cooperador entre en lisogénesis, lógicamente se originarían transductantes estables.

Otra opción para originar transductantes estables es que el lambda d-gal intercambie (se reconocen, se aparean los genes homólogos y se intercambia el material por doble entrecruzamiento) el gen gal+ con el gen gal- del genoma de la receptora. Eso da origen a transductantes denominados transductantes por recombinación.

RECOMBINACION VIRAL

Tanto bacterias como virus no se sabía muy bien si podía existir recombinación entre ellos o no. Mucha gente pensaba que podían tener DNA o RNA pero desde luego nadie pensaba que podían tener recombinación. Lo cierto es que luego de descubrirse la recombinación en bacterias se inició la carrera para descubrir la recombinación en virus también.

Una de las cosas que más cuesta distinguir es que el fenotipo cada vez es un término más difícil de determinar. En Drosophila era fácil, ojos, colores, quetas… en E. coli era más difícil… dependía del medio donde crecían, si había resistencia a antibióticos, etc. … en virus es aún más chungo…

Se tenían unas placas sobre las que se sembraba un césped bacteriano. Se ponía un fago y comenzaba la lisis de bacterias. Infectaba a bacterias alrededor y al final, en la placa de petri de repente tenemos placas de lisis. Cada placa de lisis indica que 1 fago inicialmente infectó una bacteria y que sus descendientes produjeron el resto de la calva. Contando el número de calvas de placas que tengan la misma forma (tamaño, radio, etc.) podemos determinar cuantos fagos había por microlitro de la solución que utilizamos para infectar nuestro césped.

Pero muchas veces, infectando con una muestra desconocida, se tiene infección por varios fagos de cepas distintas y con fenotipos distintos. Una de las formas de determinar sería porque se vería que las calvas de lisis en este caso diferirían morfológicamente (tamaño, radio, borde, etc.).

Todo comienza cuando comienza el grupo PHAGE (gran parte de los experimentos realmente fueron llevados a cabo a partir de fagos…).

. Hershey lo que hizo fue con el fago T2 (que era capaz de lisar bacterias) inocular un césped bacteriano. Se producía la infección y una serie de halos. Cuando hizo eso, observó que no todos los halos eran iguales. Algunas calvas eran pequeñas y otras más grandes. Lo que hizo fue picar las placas de lisis y dejarlas crecer por separado. Las puso en un tubo de ensayo. Lo único que había en esa placa era DNA viral de un fenotipo único. Cuando cultivaban cada aislado de esas placas de lisis en medios líquidos y luego sembraban nuevamente, veían que todas las placas que aparecían ahora eran grandes, o todas eran pequeñas. Es decir que el fenotipo se transmitía genotípicamente. O sea que los fagos que teníamos en las placas de lisis pequeñas y las placas grandes tenían genotipos y fenotipos distintos.

Los mutantes que tenían placas grandes se llamaron mutantes de lisis rápida (T2r). Lógicamente los otros eran de lisis normal o salvaje (T2r+).

Salvador Luria encontró otros mutantes y los llamó de “huésped distinto” o h. Normalmente E. coli es sensible al fago T2 y por lo tanto se suele denominar E. coli TtoS. Ese tipo de bacterias sensibles se suelen llamar también de tipo B. Las E. coli resistentes se denominaban TtoR.

Las bacterias sensibles TtoS podían mutar y hacerse resistentes TtoR. Pero el fago también podía mutar y cambiar sus órganos de fijación a la bacteria para lisar también a las TtoR. Esos fagos mutados que cambiaron para lisar a las E. coli resistentes son los que se denominan T2h.

Si se pone un gran número de fagos, alguno de ellos puede cambiar sus órganos de fijación para lisar bacterias resistentes y transformarse en T2h.

Qué fenotipos tenemos nosotros en resumen?

• T2r+: que es de lisis normal

• T2r: que es de lisis rápida

• T2h : que puede lisar a las TtoR además de las TtoS - lisis más intensa (calvas casi totalmente vacías)

• T2h+: las que pueden lisar solo a las TtoS - lisis menos intensa (calvas algo oscuritas)

Podemos tener 4 combinaciones posibles:

• T2r+, T2h

• T2r+, T2h+

• T2r, T2h

• T2r, T2h+

Para estudiar la recombinación debemos seleccionar fagos que tengan dos caracteres diferentes. Esos “caracteres” serán los que podrán recombinar y solo podré darme cuenta de ESOS recombinantes (por selección).

Ponemos gran cantidad de fagos T2r+, T2h (lisis pequeña incluso contra TtoR) junto con fagos T2r, T2h+ (lisis grande solo contra TtoS). Si los mezclamos y plaquetamos en una placa con E. coli TtoR se ve lo siguiente. Aparecen gran cantidad de placas pequeñas y unas muy pocas de calva grande. Las de calva grande necesariamente debe ser T2r, T2h. Debía haber sucedido una recombinación!!!

Esa recombinación debía haberse producido por una coinfección celular de dos fagos, uno r/h+ y otro r+/h.

Se podía poner una placa con TtoR y TtoS y metert una mezcla de los dos parentales… luego se podía contar las calvas de cada tipo. Ese es el experimento de Hershey y Delbruck, quienes independientemente observan lo siguiente:

• Calvas pequeñas sobre TtoR - T2hr+ - 42

• Calvas grandes sobre TtoS únicamente - T2h+r - 34

• Calvas pequeñas sobre TtoS únicamente - T2h+r+ - 12

• Calvas grandes sobre TtoR incluso - T2hr - 12

Lógicamente había 76 fenotipos parentales y 24 recombinantes. Se podía calcular una frecuencia de recombinación viral. Habría un 24 % de individuos recombinantes. Esto además se podía usar para cartografiar los genes virales.

Pero Hershey comienza a dudar. Veía que la distancia entre algunos genes cambiaba. Eso le dio pié a plantear otros experimentos. Seleccionó distintos mutantes r. Consideró a todos como r, pero los diferenció desde r1 hasta rn. Lo que hizo fue repetir la selección de marcadores como antes y volver a hacer cruzamientos. Lo que encontró fue que cuando lo hacía todo con el mutante r1 aparecían los 4 fenotipos y la frecuencia de recombinación era del 24%. Si utilizaba otro mutante, la frecuencia de recombinación cambiaba mucho. Si utilizaba otro la frecuencia era cada vez menor. La pregunta era obvia, la respuesta no tanto. Estaba claro que lo que se debía tener (aunque el fenotipo siempre fuera el mismo) diferentes mutantes. Los diferentes mutantes r estaban separados del h en diferentes distancias. En resumen… no podía localizarse un locus genérico para r… Es más …. ¿era r un gen?

Seymour Benzer en 1953-63 se planteó antes esos resultados que el gen, como concepto clásico, debía revisarse. El gen normalmente se consideraba una unidad de función (se expresaba como proteína), una unidad de recombinación (podía recombinarse él con otros homólogos) y una unidad de mutación.

Pero él se plantéa si no sería que había algo más en el gen… si no podía haber una .

En el año 53, se postula que el DNA era la molécula transportadora de genes de forma lineal y que era una doble hélice, que se replicaba de una cierta forma, etc.

Benzer toma el fago T4 y se fijó en unos fenotipos muy claros. Se fijó en una región que llamó los mutantes rII. Los r+`eran capaz de crecer en E. coli K12 (una cepa lisogénica para lambda y típica de laboratorio - es inerte). Los mutantes r no-II (no pertenecientes a rII) eran los que crecían en TtoS (E. coli B) además de poder crecer en E. coli K12. Los mutantes rII se determinaban porque crecen solo en E. coli B y no pueden lisar E. coli K12 (infecta, replica pero no lisa - lisogénesis?).

Lo primero que hizo fue acumular miles de mutantes del locus rII que hubieran surgido espontáneamente.

Para ello tomaba placas que tenían placas de lisis de diversos tipos. Veía que tenía placas grandes (r) y placas pequeñas (r+). Aislaba mutantes r (picaba individualmente placas de lisis grandes) y luego sembraba diferentes mutantes r en placas B y K12. Las que crecían tanto en B como en K12 eran lógicamente r no-II. Las que crecían en B y no en K12 eran consideradas rII y ya a partir de ahí las aislaba.

Separó y acumuló miles de mutantes rII.

Recordando la complementación…

Imaginamos que tenemos dos mutaciones, m1 y m2 de las que podemos sospechar que están en el mismo gen. Una de las cosas que me puedo preguntar es entonces si están en el mismo gen o están en genes distintos. Para eso se hacen las llamadas pruebas de complementación.

Las dos mutaciones pueden estar en un mismo cromosoma o pueden estar en dos cromosomas diferentes. Si hay una mutación en cada molécula, entonces los individuos son trans. Si las dos mutaciones están en la misma molécula es cis.

Para responder la pregunta de si pertenecen o no al mismo gen hacemos la prueba…

• si pertenecen a genes distintos, lógicamente tendríamos que un individuo mutante para los dos genes en cis, sería heterocigótico para los dos genes y tendría fenotipo salvaje (existiría complementación…)

• si pertenecen a genes distintos, y el individuo es trans, también los genes se complementan y por lo tanto el individuo sigue siendo heterocigótico para los dos genes y de fenotipo salvaje…

• pero si pertenecen al mismo gen, si el individuo tiene las mutaciones en cis, puede haber complementación y entonces el fenotipo seguir siendo salvaje…

• pero si las dos mutaciones están en trans dentro del mismo gen ahí ya no puede haber complementación entre la dotación de los dos cromosomas, porque el gen en cada cromosoma está mutado (aunque en sitios distintos). Ninguna de las dos moléculas puede producir una proteína normal y por lo tanto no puede haber complementación… Total que el fenotipo es mutante…

Haciendo pruebas de complementariedad entonces nos permite saber si tenemos las dos mutaciones en el mismo gen o en genes distintos.

Volvemos a los experimentos de Benzer…

Lo que hace es plantearse si todos esos mutantes distintos pertenecen a distintos genes o si pertenecen a un mismo gen en diferentes lugares de ese gen… Es decir… había un gen que regulara el tamaño de la calva de lisis/la especificidad de la infección? O había varios?

Aplica la prueba Cis-Trans, una variante de la prueba de complementación…

Enfrenta de dos en dos a los mutantes infectando E. coli K12 (“medio restrictivo”). Obviamente los virus, al ser mutantes rII normalmente no podían infectar y no eran activos en esas placas. Pero infectando de dos en dos, si hubiera complementariedad, podría ser que el coinfectado recombinante resultante fuera activo!

En trans lo que hizo fue enfrentar mutante1 + mutante2 … mutante 2 + mutante 3 y así las combinaciones. Lo que sucedía es que en algunos no había complementación (las coinfecciones sobre K12 daban lugar a placas inactivos - no había lisis) mientras que con otros sí había complementación (daban lugar a individuos activos - había lisis). Eso ya no es estaba diciendo que no todos los mutantes rII eran iguales. O sea que diversos mutantes podía ser que correspondieran a genes distintos!!!

Estudió miles de casos y finalmente se decidió por dividir funcionalmente el locus rII en dos unidades que llamó cistrones (por lo de cis-trans).

Hoy ya se sabe que hay genes monocistrónicos, pero que muchos también son di, tri, policistrónicos.

Complementación en Drosophila

Ya vimos el tema de la complementación en Drosophila. En Drosophila tenemos que de dos individuos que presentan el mismo fenotipo (cuerpo negro) mutante, la descendencia puede ser salvaje (cuerpo normal). Eso en su momento lo llamamos prueba del alelismo dado que realmente la complementación es verdaderamente una prueba para comprobar si dos genes son realmente alelos o no, es decir, una prueba de alelismo.

El cistrón, la unidad funcional del gen…

Detrás de un fenotipo puede haber más de una unidad funcional. El locus rII realmente tenía dos cistrones. Sin embargo, aún hoy, normalmente no se le suele llamar cistrón y se sigue usando el término gen, pero hay que entender que este uso es laxo.

Cuando las dos partes de un gen no se comportan de la misma forma, como Benzer comprobó, entonces tenemos dos cistrones.

Los experimentos de Benzer, parte II - coinfecciones de Benzer con fagos en los que la mutación se encontraba en la misma unidad funcional

Coinfectó una bacteria con dos fagos en los que la mutación se encontraba en la misma unidad funcional pero en sitios distintos. Esperaba, como era lógico para mutaciones en el mismo cistrón, que no hubiera complementación y que por lo tanto no aparecieran halos de lisis en las placas. Sin embargo veía que había, aunque en una proporción ínfima, una cierta cantidad de placas de lisis. La hipótesis era fácil: las moléculas de DNA de los dos fagos debían haber entrecruzado originando DNA recombinante. Resolviendo el modelo, a partir del entrecruzamiento quedaban dos moléculas, una que tenía dos mutaciones en el mismo cistrón y una que no tenía mutaciones en ninguno de los dos cistrones.

Qué es lo que nos dice esto? Que efectivamente hay una distancia entre un mutante y otro en la que se pueden producir entrecruzamientos. No habría recombinación cuando los dos mutantes se encontraran en el mismo sitio. Pero si tenemos un mutante en cualquier lugar fuera del sitio que ocupa la mutación en el otro, entonces en cualquiera de esos casos podríamos encontrar entrecruzamientos.

Gracias al hecho de que estamos trabajando con fagos, esto lo podemos ver.

Llegó a la conclusión de que dos moléculas que no sean la misma siempre podrán recombinar en zonas homólogos. Crea el término recón, la unidad mínima de recombinación que puede existir entre dos moléculas de DNA.

Establece en ese momento su objetivo final: averiguar y cartografiar con exactitud el gen rII con sus dos cistrones.

A medida que comenzó a analizar experimentos encontró unos virus que eran mutantes especiales que nunca retromutaban en ningún porcentaje. Cuando los sometía con otros mutantes esos nunca recombinaban. Parecía que su dogma no se cumplía para ellos! Su hipótesis es que tenían parte del rII delecionado. Además dijo que la longitud de la deleción era variable. Eso le sirvió para seguir viendo donde estaban situados los mutantes rII.

Su hipótesis era la siguiente: solo podían originar recombinantes los mutantes de deleción que tuvieran la deleción fuera de la zona donde estaba la mutación en la molécula de DNA completa. Así podía establecer para cada una de sus mutaciones una serie de delecionados y los clasificaba según recombinaban o con sus mutantes. Así cada vez iba acortando mucho más el rango de búsqueda. De esta forma rastreó mediante mutantes de deleción a los mutantes rII. Eso lo repitió con cada mutación que había almacenado para cada uno de sus cistrones.

Al final una vez rastreó todas las mutaciones pudo establecer el mapa completo de todo el gen rII. Fue la primera vez que se cartografió un gen por dentro estableciendo cada mutación en cada punto del gen qué fenotipo daba.

Una de las primeras conclusiones que elaboró fue la siguiente: Las mutaciones no ocurren a lo largo de las moléculas de dNA con la misma frecuencia. Existen lugares aún dentro de un locus que son más lábiles (puntos calientes o hot spots). Eso lo vio cuando comprobó que se acumulaban muchos más mutantes en ciertos puntos del gen que en otros. Hoy en día se sabe que esto sucede en todos los genes. Los sitios calientes es donde más frecuentemente se produce una mutación dentro de un gen.

Qué otras cosas aportó con sus experimentos?

• la existencia de la mutación puntual - un cambio de una sola base daba un mutante rII

• identificación de la deleción como mutación

• desarrollo de los mapas genéticos por deleción

• sentó las bases de la utilización de la complementación para ver la funcionalidad de los genes - la prueba cis-trans nos permite saber aún todavía hoy en día si los mutantes pertenecen a un gen o a más de un cistrón

• demostró la recombinación a un nivel insospechado en la época (aún DENTRO de un gen - aún DENTRO DE UN CISTRON!!!) - todavía hasta esta época a nadie se le había ocurrido que podía haber recombinación intragénica (además de la clásica intergénica)

• localizó los puntos calientes de un locus

• demostró la estructura interna de un gen - el primero que lo vió

Hay que saber diferenciar bien las consecuencias de la complementación y la recombinación

Mientras que la recombinación son cambios que son heredables, la complementación de dos mutantes es algo que no es heredable.

LOS MECANISMOS MOLECULARES DE LA RECOMBINACION GENERAL

La recombinación y el entrecruzamiento se produce en muchos niveles. La genética se trata siempre de transmitir caracteres. Y al transmitirse el DNA, lógicamente se producen intercambios y se originan recombinantes.

EN la paquitene es donde se produce el entrecruzamiento. Después de la paquitene el material que en paquitene está como cordones desorganizados y relajados, se irá condensando e intentará separarse. Ahí se verán los quiasmas (sitios donde se produjo el entrecruzamiento). En los sitios donde se producen los entrecruzamientos pasarán muchas cosas que irán arreglándose con el tiempo. Los cromosomas se separan donde no ha ocurrido nada, pero se mantienen sujetos los bivalentes por las zonas de quiasma.

Cuando se produce en la paquitene un entrecruzamiento y se tiene un marcador citológico se puede hacer un seguimiento y saber como se produce ese entrecruzamiento (y donde se produjo, cerca o lejos del centrómero, etc.). Las figuras que se irán a producir nos dan una idea espacial de los cambios que ocurren en los dos cromosomas homólogos. Se ven así las famosas formas de cruz, ochos, circulos, etc. Nadie vio todavía in situ lo que ocurre a nivel molecular. Siempre se habla de modelos, de que debe existir un entrecruzamiento, de que sabemos el sitio donde se produce porque se ve en la diplotene el quiasma, pero todavía nadie a microscopio pudo ver que aquello está ocurriendo realmente. Lógicamente cuando uno intenta explicar todo molecularmente se debe tirar de modelos pre-empíricos que se inventan a partir de unos datos previos y que en ningún momento se pueden más que comprobar mediante consecuencias secundarias. Así, la participación de ciertas proteínas, la existencia de complejos y estructuras, etc. son todos procesos que se analizaron por separados y se metieron en el modelo de acuerdo con datos previos.

Cuando comienza la meiosis se tienen cuatro moléculas de DNA, un cromosoma y su homólogo replicados en forma de cuatro cromátidas. Esas cromátidas se aparean y hacen sinapsis. El complejo sinaptonémico se forma siempre entre dos cromátidas. El entrecruzamiento siempre se da entre dos cromátidas. El complejo sinaptonémico tiene el elemento central y los elementos laterales. Hay unas regiones bastante localizadas que es lo que se denomina nódulo de recombinación que parece ser el sitio donde se producirá a nivel molecular el entrecruzamiento. Parece ser que la localización es entonces a ese nivel. Si nos fijamos en general lo que ocurre en él, en leptotene (etapas muy tempranas de la meiosis) todavía no tenemos la sinapsis. En paquitene se organiza el complejo y una vez ocurre ya el entrecruzamiento, en diplotene, diacinesis, solamente quedan sitios y residuos de lo que debería ser un complejo sinaptonémico desarmado.

Una de las primeras demostraciones de la recombinación fue en el experimento de Barbara McClintock, en 1931. Ya lo vimos. Ella trabajaba con maíz. Hizo un expeirmento muy limpio en el que se podía ver que debía existir esa rotura de moléculas de DNA y ese intercambio entre ellas porque realmente lo vió. El experimento fue el siguiente. El maíz, en el cromosoma 9 podemos encontrar por un lado heterocromatina constitutiva distal (como la de Arcyptera en el heterocigoto) y otro marcador natural importante que es un nódulo de heterocromatina centromérico. O sea que nosotros podemos tener cromosomas que llevan dos marcadores citológicos (el bloque distal, BD y el bloque centromérico, BC). Podemos tener un heterocigoto (en un cromosoma tenemos los dos y en el homólogo ninguno). Pero además en su experimento lo que ella hizo fue combinar los marcadores citológicos con otros genéticos. En el cromosoma que tenía los dos marcadores tenía el gen C y el gen wx, mientras que el homólogo que no tenía ningún bloque era c y WX. Es decir que analizaría el entrecruzamiento con los dos marcadores. Si se producía recombinación entre los dos genes debían además recombinar los marcadores citológicos generando polen que fuera BC-C-WX- y polen que fuera -c-wx-BD. Analizando el polen vio como siempre que la mayor proporción era de parentales que eran BC-C-wx-BD o -c-WX-. Pero los recombinantes también existían.

Cruzando individuos heterocigotos con individuos doble recesivos y que no tenían marcadores encontraba descendientes que tenían como era lógico, uno de los homólogos sin bloques de Heterocromatina y uno de los homólogos que era de cuatro tipos diferentes: parentales (BC-C-wx-BD o -c-WX-) y recombinantes (BC-C-WX- o -c-wx-BD).

Mediante marcaje de cromosomas con bromuro se puede intentar analizar por iluminación de preparados con UV los cromosomas. Si marco uno de los parentales y analizo la F2 puedo ver el intercambio entre cromátidas hermanas. Se forman los llamados cromosomas arlequines que están pintados de dos colores (porque vienen de dos individuos, uno con cromátidas de recombinación y uno con cromátidas normales). Se utiliza este test para analizar el efecto de una sustancia experimental en el humano. Se observa en cultivos celulares si el número de intercambios entre cromátidas hermanas es muy grande para comprobar si una sustancia es perjudicial - si induce recombinación excesiva es porque la molécula se está inestabilizando!!!

Como realmente es muy difícil de visualizar lo que sucede, todo el sistema ha tirado hasta ahora de modelos.

La recombinación puede suceder a varios niveles

Cuando el factor F se introducía en el cromosoma bacteriano había un reconocimiento de segmentos de inserción. En ese momento había una recombinación para la inserción. Eso se denomina recombinación de sitio específico. A nivel enzimático no tiene nada que ver con la recombinación homóloga. Son recombinaciones que sirven generalmente para escisión o inserción. La inclusión del fago lambda también era por reconocimiento y recombinación de sitio específico. La escisión también se daba por reconocimiento y recombinación. En cualquiera de los dos casos eso es lo que se llama recombinación de sitio específico.

La recombinación ilegítima se da cuando no hay ningún tipo de reconocimiento. Los trasposones saltan de una parte a otra del genoma. Lo logran muchas veces sin reconocimiento, es decir de forma ilegítima.

Otro tipo de recombinación es la homóloga, es decir por reconocimiento de secuencias similares, pero no específicas o iguales. Se produce un entrecruzamiento y eso origina moléculas recombinantes. Es en la que prestaremos mayor interés.

Recombinación homóloga

Para que se de tiene que haber una rotura y una unión de moléculas diferentes. Eso ahora es muy obvio, pero sin embargo, incluso en la actualidad se piensa que no ocurre de esa manera sino que se establece un sistema denominado elección de copia. Eso es como una forma alternativa a como se puede establecer el proceso de recombinación. Tenemos bastantes pruebas que dicen que debe haber una rotura y una reunión (experimento de McClintock) pero también bastantes evidencias de lo segundo.

Como la recombinación no se ve a nivel molecular, solo se pueden hacer modelos.

Tenemos una molécula de DNA y otra molécula que tiene una secuencia homóloga. Tenemos enzimas. Y tenemos el producto que son las moléculas recombinantes.

Normalmente se han pensado modelos para la recombinación molecular. Pero esos modelos no pueden inventarse. Tiene que responder a cosas que sabemos que ocurren en la recombinación. Una de las cosas que sabemos que deben explicar es la rotura y la reunión. La segunda cosa que debe explicar es la conversión génica. Cuando nosotros vimos en prácticas que se formaban ascas recombinantes muy raras que no tenían la proporción 1:1 de fenotipos temíamos la existencia de mutaciones. Si la conversión génica es algo que se produce durante la recombinación, los modelos deben explicarla también para que pueda ser válido. Son las dos cosas a explicar: la rotura y reunión y la conversión.

El primer modelo lo propone Robin Holliday en 1964. En él hay dos cosas que son muy importantes que veremos luego más detenidamente. Una de las cosas es algo que se llama el DNA heteroduplex, una molécula de DNA que tiene sus dos cadenas antiparalelas de secuencia no exactamente complementaria. Lo que ocurre durante el proceso es que se dan formas que no son completamente complementarias en secuencia. Esas moléculas se llaman heteroduplex.

La segunda cosa que piensa Holiday es que se formaban unos cruces entre las cadenas que eran resueltos por rotación. El cruce se denominó Holliday Junction o conjunción de Holliday.

En el año 64, cuando se propuso el modelo se conocía bastante poco de todo lo que era la maquinaria enzimática necesaria para que se produzca la recombinación. Si efectivamente había roturas, intercambios, etc. debía haber enzimas que rompieran y repararan el DNA facilitando la recombinación. Poco a poco se fueron conociendo las enzimas involucradas en recombinación y reparación. Una de ellas era la famosa RecA (la que va a donde hay ssDNA y se une y lo repara usando como molde algun extremo libre).

Alternativas al modelo de Holliday, una de ellas es en el año 1975. El modelo actualizado, propuesto por Messelson y Radding, introducía algunos cambios apoyándose en el modelo de Holliday. Tanto uno como otro se basaron en recombinación en bacterias y virus.

En el año 1986, Szostak y colaboradores proponen el modelo de rotura de doble cadena. Este es sí un modelo más alternativo. Algo más raro estaba sucediendo en levaduras evidentemente y eso estaba apoyado por gran cantidad de evidencia.

Todos los modelos necesitaban mucho apoyo de investigación y por lo tanto mucha experimentación. En materiales muy difíciles de estudiar elaborar un modelo era muy difícil. Así se elegían animales, plantas, organismos modelo para facilitar la recombinación. En el caso de la recombinación molecular el caso fue E. coli y las Levaduras (Saccharomyces cereviseae).

En el proceso de recombinación se vio que se requerían unas ciertas enzimas básicas. En E. coli era RecA (su homólogo estaba en las levaduras donde se denominaba RAD 51). Las otras eran RecB, RecC, RecD (complejo RecBCD) y otro grupo de enzimas que son las Ruv (A, B, C). Estos tres grupos de enzimas actúan en momentos clave en la recombinación.

La elección de copia

En la replicación del DNA si hay dos moléculas diferentes, podría empezar la replicación con una molécula y luego usar de molde una segunda molécula de DNA. Eso originaría una molécula recombinante que llevaría información de secuencia de las dos. En eucariotas los experimentos apoyan que esto no ocurre. No hay elección de copia en la replicación del DNA eucarionte. Eso solo se produce en un momento en eucariotas, en la meiosis.

Otra prueba de que incluso en los virus no se da o se da muy poco es la demostración del modelo de rotura-reunión en virus bacteriófagos. Si en virus tenemos dos marcadores como A y B y lo hacemos crecer en un medio con carbono 14 y tenemos otros virus que son a y b y que se crecen en un medio más pesado como nitrógeno 15. Si tenemos esas dos poblaciones de virus distinguibles en gradiente de cesio y con marcadores genéticos distintos. Si esos virus hacemos que se repliquen y recombinen en una placa con césped bacteriano. Cuando eso ocurre y se estudian los lisados en un gradiente de cloruro de cesio, se encuentra que se tiene por un lado los dos extremos (virus pesados y virus ligeros - parentales) y por otro en el medio tenemos los virus recombinantes (peso intermedio). Si analizamos los genes manifestados en esa banda intermedia se ve que son Ab o aB. En los extremos tenemos las parentales, AB y ab. En ese experimento, incluso con fagos podemos ver que las moléculas de DNA se han roto y reunido de otra manera.

Conversión génica

Como consecuencia de la formación de DNA heteroduplex, podría ser que el DNA de esa zona fuera reparado por la maquinaria luego de la formación de la molécula recombinante. Una de las cosas que podría suceder es que las dos se reparen hacia el mismo gen. Otra sería que se repare una hacia un gen, pero que la otra no se repare hacia el mismo. Así podría haber combinaciones dependiendo de la reparación de ese DNA heteroduplex. En las ascosporas de Sordaria teníamos por ejemplo dos cromátidas negras y dos blancas. Al recombinar eso daba una cromátida negra, una blanca, otra negra y otra blanca. Pero si una de las recombinantes (la negra o la blanca) o ambas (mientras están en forma heteroduplex) se repara hacia el gen opuesto, entonces la blanca puede volver a ser negra y viceversa. En resumen, un caos.

El modelo de Holliday - año 64

Se parte de dos moléculas de DNA distintas pero homólogas. Lo primero que sucede es que se produce un corte en una de las hebras de cada doble-hélice. Los dos cortes se producen en el mismo sitio en las dos moléculas. Se generan así extremos 3' y 5'. Esas dos cadenas se reunirán pero el 3' de una molécula se pega al 5' de la molécula homóloga y viceversa. Esa unión luego se sella mediante una ligación. A partir de este momento tenemos dos moléculas de DNA que están entrelazadas. Siguiendo con lo que propone el modelo lo siguiente que ocurre es la migración. Una vez que se estableció el cruce de hebras hay un estiramiento para que se vaya sustituyendo una por otra y producirse así el DNA heteroduplex. Una vez que se produce el heteroduplex, espacialmente esas dos moléculas están unidas por ese entrecruzamiento y si queremos separarlas, lo que tendríamos sería una figura en forma de X. De qué forma podemos hacer que deje de haber un cruce, pues si se produce una rotación (twist) de una de las cadenas sobre la otra. Así logramos resolver la cruz dando como resultado una nueva figura en la que cada cadena está apareada correctamente. Esas dos moléculas unidas en algún momento se deben cortar. En la resolución pueden ocurrir dos cosas, o bien que se corten cadenas opuestas, o que se corte sobre una misma cadena. Si los cortes se dan sobre cadenas iguales entonces se forman dos moléculas de DNA heteroduplex pero que todavía no hubo recombinación. Sin embargo, si el fragmento heteroduplex estuviera sobre nuestro marcador génico y ese fragmento se reparara (mismatch-repair) y hubiera conversión génica, entonces sí podría darnos una molécula pseudo-recombinante (realmente no es recombinante, pero es raro, lo vimos en la práctica). Si los cortes se dan sobre cadenas opuestas entonces las dos moléculas originadas después del resellamiento da lugar a dos moléculas recombinantes. Es decir que el modelo de Holliday se ajustaba bastante a lo que se veía en hongos como el caso de Sordaria. Se explicaba tanto la rotura-reunión como la conversión génica.

Modelo de Meselson y Radding de 1975

La diferencia principal con el modelo de Holiday es fundamentalmente que los cortes (roturas) no se daban al mismo tiempo en las dos moléculas homólogas.

Lo que hacen es introducir a RecA (ya descubierta para el año 70). RecA se unía a ssDNA, lo reconocía y llevaba esa hebra sencilla a invadir otra estructura para “repararla”. Introduciendo RecA en el sistema de Holiday se inventaron un nuevo y actualizado modelo.

Se producía inicialmente un solo corte, en una de las cadenas de una de las moléculas. Al producirse ese corte, todo un complejo enzimático separaba un poco esa cadena cortada formándose el ssDNA. Ese ssDNA era reconocido por la RecA y era llevado a invadir la molécula homóloga (que no había sufrido ningún corte). La molécula intacta invadida comenzará a hibridar con la molécula de cadena sencilla y se formará un triplete de DNA (heterotriplex) en esa secuencia homóloga. Como de la naturaleza se habían aislado DNA triplex de muchos individuos la hipótesis podía ser válida. Lo que ocurre a continuación es que se rompe la cadena desplazada de la molécula intacta que está formando el triplex. Esa cadena desplazada ahora hibrida con la molécula donante. Es decir que se están formando dos heteroduplex. Como en el caso del modelo anterior luego había ligación y migración por rama (Branch migration). Luego se da la resolución de la figura de Holiday. La resolución lógicamente se podía dar de dos formas como siempre. Dependiendo de cómo se cortara la cruz se obtenían o bien moléculas en las que no se formaron recombinantes o bien moléculas recombinantes. A grosso modo el modelo era muy similar al de Holiday, pero como RecA se sabía que estaba interviniendo entonces debía haber invasión de ssDNA en algún momento.

Pero no solo ya se sabía de la existencia de RecA. También se conocían otras enzimas cuya acción también estaba explicada en el modelo. Se usaron levaduras y E. coli para analizar lo mismo y de hecho se encontraron homólogos para muchas enzimas. Hay básicamente tres grupos de enzimas que intervienen en E. coli.

Un grupo es el Rec BCD que tenía la acción endonucleasa (que produce el primer corte) y la acción helicasa (que desenhebraba el ssDNA haciendo disponible la cadena para RecA). El segundo grupo es el de la RecA (que se une a ssDNA e invade cadena doble).

El tercero es el grupo de las Ruv, A y B que intervienen en la migración de las cadenas (importante para conseguir DNA heteroduplex). Desplazan a la proteina RecA. La migración de las cadenas no parece ser al azar sino que se detiene preferentemente en sitios A/T- T-T-G/C (es decir que hay sitios de terminación de la migración).

El último grupo es el de la enzima RuvC que se encarga de resolver (cortar) la estructura de Holliday. Desplaza al Ruv A y B y realiza un corte siempre entre una timina seguida de una guanina o citosina (sitio de reconocimiento).

En levaduras la RecA está sustituida por la Rad51 o la Dcm1. Luego existe una MRX o Rad50-58-60 que son las que son homólogas de Rec BCD. No se conocen enzimas que hagan lo que el complejo Ruv AB. Mus81 y muchos otros posibles candidatos son los que producen los cortes que resuelven las figuras de cruz (como lo hace RuvC en E. coli).

Mientras que en procariotas no hay ninguna enzima nucleasa de doble cadena implicada. Pero en eucariotas se ve que sí hay DSB (double strand breaking). Lo lleva a cabo la Spo11.

El sitio Chi está solamente en una de las dos cadenas de la molécula homóloga que será rota. Cuando el complejo BCD llega a ese sitio produce la rotura. En E. coli se sabe que existe un sitio chi cada 6000 pb aproximadamente. Es decir que cada 6 kb se podría establecer un entrecruzamiento perfectamente. El sitio Chi tiene una secuencia extremadamente conservada que es GCTGGTGG en sentido 5-3.

El modelo de eucariotas - modelo de DSB (rotura de doble cadena)

En lugar de haber una sola cruz hay dos cruces. Lo vimos también cuando veíamos la reparación. Lo que lo diferencia de los anteriores es que se produce rotura en las dos cadenas de una única molécula de DNA. En el de Holliday había dos roturas en dos cadenas pero dos cadenas homólogas. En el modelo de Meselson Radding había una rotura en una y finalmente una rotura en otra para finalmente dar la Holliday junction. Pero en este modelo las cruces de Holliday se forman por rotura de una molécula de las dos homólogas, pero una rotura en las dos cadenas. Es lógicamente la recombinación aparentemente más inestable.

Una vez que se genera el corte por endonucleasas (que genera extremos cohesivos) en las dos cadenas lo que se produce es cadena sencilla en cada una de las dos cadenas (sencilla 3'). Una de esas invade por acción de Rad51 a la molécula intacta. Pero esa cadena que invadió se elongará ahora usando como molde el D-loop desplazado de manera que se forman fragmentos recombinantes. Al final esa cadena se elonga pero se forma otra estructura de Holliday. La cadena vuelve a invadir y se liga con el extremo 5' libre de una de las dos cortadas. Las dos estructuras de Holiday pueden resolverse de las típicas dos formas que ya conocemos (cortes en la misma doble hélice o cortes en diferentes dobles hélices). Pero ahora lógicamente tenemos más de 2 conformaciones posibles. De hecho se forma un caos considerable. Si a eso añadimos que hay Branch migration entonces se hace realmente muy complejo.

Es de destacar que al final de la resolución las moléculas formadas, una parte del fragmento que recombinó quedará como heteroduplex, pero una parte quedará como ssDNA y tendrá puntas libres. Ese hueco deberá repararse por una polimerasa que usará como molde la hebra que invadió y por ello lógicamente en esa región no quedará DNA heteroduplex. Esto es lo que hace al mecanismo viable para lo que es la reparación (de hecho es un mecanismo de reparación que vimos).

Integración de plásmidos, factores y fagos - Enzimas de reconocimiento

Debe haber un reconocimiento de las regiones homólogas y también debe haber un sistema enzimático que rompa ambas moléculas y las enlace de forma que la integración sea posible pero que no imposibilite la escisión. La recombinación es distinta que en el caso anterior y las enzimas vistas anteriormente no son las que intervienen. Son otras. Básicamente las enzimas son las llamadas recombinasas de tirosina y de serina. Las recombinasas de tirosina y serina se conocen hace relativamente poco. Establecen cortes en ambas moléculas para que pueda ligarse el DNA o escisionarse. Pueden enlazarlas o separarlas. Son completamente distintas del sistema de Rec-Ruv. Se llaman Serin recombinasas o tirosin recombinasas porque usan residuos con grupos hidroxilos como las serinas y tirosinas para unir y estabilizar los grupos fosfatos 3'.

LOS ELEMENTOS TRANSPONIBLES - EL GENOMA DINÁMICO

Desde el descubrimiento de las leyes de Mendel hasta el experimento clave de McClintock podemos denominar el punto de vista de la ciencia sobre la genética como la visión estática del genoma. La teoría cromosómica de la herencia, la recombinación, las interacciones entre genes y los fenotipos, la herencia cuantitativa y multigénica pertenecen a este período. Al parecer solamente el fenotipo era lo dinámico y eso se determinaba solo por el “ambiente” sensu lato.

Pero a partir de la hipótesis de Watson y Crick comienza la visión dinámica del genoma. Las mutaciones, la fina estructura del gen (cistrones), las mutaciones génicas, las secuencias repetidas del gen y la replicación y expresión del gen pertenecen a este período. Pero sin duda el descubrimiento clave de esto es el trabajo de Barbara McClintock sobre Zea mays. En sus experimentos no solo contribuyó a la genética del maíz sino también a los conocimientos sobre recombinación y todo lo que vio sobre fragmentos transponibles.

Normalmente todos los granos de maíz en las mazorcas son uniformes. Pero a veces polen de otro genotipo puede fecundar algunas de las flores de la mazorca dando algunos granos de otro color.

Sin embargo, lo que vio McClintock fue variegación de color en el mismo grano de maíz. Interpretaron los datos que obtuvieron de la siguiente forma. Debía haber genes que saltaban. Debía haber elementos del genoma que se movían. Al moverse producían un efecto distinto en la coloración del grano. Cuando lo dijo en los años 40 la gente se rió de ella y pensó que se había vuelto loca. Pasaron más de 40 años para que alguien se lo reconociera. Una vez se instauró la genética molecular, vieron evidencia molecular sobre eso y no tuvieron más remedio que darle el premio Nobel, en 1983 (¡¡¡¡más de 40 años después de descubrir los transposones ella!!!!)

DEFINICION Y TIPOS

Son secuencias DNA que pueden cambiar de posición en una molécula que los lleva. Pueden escindirse e integrarse en otra secuencia de DNA. Ese movimiento es lo que se llama una transposición sin homología. Lo que quiere decir a diferencia de otras situaciones que vimos en reordenamientos cromosómicos, lo que ocurre aquí es que una secuencia se transpone sin que haya necesariamente homología entre la secuencia de salida y la de entrada.

Su importancia es enorme y cada día más. Cada vez se ven más características, más variabilidad, más implicaciones en los procesos de desarrollo de los seres vivos. Su estudio arranca desde Barbara McClintock, como ya lo vimos, en Zea mays. Fue un hipótesis lanzada en una época en la que el cartografiado génico, apoyado por los descubrimientos en el laboratorio de Morgan, indicaba que los genes estaban dispuestos linealmente. Es así que la hipótesis de la existencia de elementos transponibles, genes que se movían no linealmente, fue enormemente rechazada hasta que se comprobó molecularmente en los años 80.

Son muy diversos y complejos. Hay miles de clasificaciones. La mayoría de los elementos son casi imposibles de clasificar. Si fueramos honrados podríamos decir que hay tantas clases de elementos transponibles como elementos transponibles.

Una clasificación demasiado general y con muchos agujeros es la que sigue:

TIPO 1 - RETROELEMENTOS

• utilizan la transcriptasa inversa aunque no todos la codifican

• se transponen por transcripción inversa de un RNA intermedio

• retrotransposones: tienen genes LTRs y genes GAG y POL (como los retrovirus, aunque no tienen el gen env que codifica para la envoltura)

• no retrotransposones: llevan genes GAG y POL pero no LTRs (long Terminal repeats)… tienen POLI-A 3'

TIPO 2 - ELEMENTOS de DNA

• codifican una transposasa que utilizan para movilizarse

• se transponen directamente de DNA a DNA

• tienen SITRs (small inverted Terminal repeats)

No es correcto hablar en ningún caso de transposones debido a que solo son transposones unos elementos muy concretos dentro de todos los elementos transponibles.

Pero la pregunta clave es ¿cuán importantes fueron en la evolución y qué efectos han tenido?

Los efectos podemos dividirlos en inmediatos y evolutivos. Esto es fundamental, porque tenemos la muy mala costumbre de que los elementos transponibles están constantemente moviéndose. Pero eso no es la realidad. Si nos imaginamos que efectivamente todos los elementos están constantemente transponiéndose llevamos muy mal camino.

Si miramos en tiempo evolutivo, en escala prácticamente geológica, los elementos transponibles tienen una enorme importancia y eso explica que estén presentes en casi todos los organismos, que en algunos organismos presenten una proporción enorme del genoma, etc. Son elementos potencialmente transponibles. Estamos seguros, porque les vemos, de que esos elementos, ha habido momentos evolutivos en los que esos elementos se han movilizado un montón, han aumentado su número y han tenido un efecto importantísimo. Pero en muchos otros no.

Si miramos en el tiempo actual, los elementos transponibles no se transponen. Se movilizan con una tasa bajísima y es excepcional que se pongan en marcha, mucho más que los cambios que introduzcan sean viables. Hoy en día no estamos en un momento de “efervescencia”. Sin embargo sí pueden tener en algunos casos muy escasos un efecto individual, que como decíamos, suelen ser negativos.

Cuando comprobemos lo que saben hacer veremos que pueden producir duplicaciones, inserciones, roturas, anulación de genes, etc. Si eso estuviera ocurriendo muy frecuentemente, algo no funcionaría. Por un lado no funcionarían los individuos. La genostasis obliga a que todo esté en su sitio y funcionando. Cualquier organismo soporta mal los grandes cambios. Además, si mis elementos estuvieran constantemente cambiando, eso me haría incompatible con el genoma de mi misma especie. Si nuestros genomas intraespecíficos están constantemente cambiando debido a los elementos transponibles, sería imposible la compatibilidad, tanto meiótica (sexual) como fisiológica (sistémica).

EFECTOS DE LOS ELEMENTOS TRANSPONIBLES

• Inactivar genes

Si un elemento se inserta dentro de un gen, eso será una inserción, una mutación que podría dar lugar a la no-funcionalidad del gen.

• Modificar la expresión - el fenotipo

No siempre el efecto será inactivar, sino que ahora se cambien unas cuantas bases dando lugar a cambios de fase que den lugar a proteínas diferentes, a fallos en la funcionalidad, etc. La expresión de la proteína se puede ver modificada.

Además, cambios en la secuencia reguladora de un gen lógicamente también implicarán modificación en la expresión de ese gen. Es decir que los cambios en la expresión de los genes se dan muy frecuentemente, más que la inactivación.

• Reordenaciones

Inversiones, deleciones, duplicaciones, translocaciones. Todas las reordenaciones génicas o cromosómicas pueden darse mediante transposones. Muchas de hecho están mediadas por esos elementos transponibles. Imaginamos que se intercala justo en una de las señales que controla el splicing de un gen… eso puede hacer que un intrón pase a exón y un exón a intrón. Además si se intercala en uno de los genes “maestros” que controlan la expresión de un puñado de genes (operones, etc.). Si se intercala encima en una caja homeótica (homeobox) el desbarajuste puede ser caótico. Ciertos hechos y saltos evolutivos podrían explicarse en parte debido a elementos transponibles que se han intercalado en homeoboxes importantes y en genes maestros.

• Consecuencias de los efectos inmediatos

Ya decíamos que esas transposiciones y movimientos generalmente son mutaciones con efectos deletéreos. En tiempo evolutivo veíamos que los efectos daban lugar a cambios de planes biológicos, variabilidad, etc. Pero en tiempo real es muy difícil que una mutación termine siendo seleccionada y por lo tanto esa mutación termine siendo wild-type. Lo normal es que a una mutación le vaya muy mal. Tan mal como que el organismo se muere.

En organismos pluricelulares, que se movilice un transposón en una célula sola del bazo parece poco importante. Pero si va y el transposón jode la secuencia de p53 va y te sale un cáncer esplénico acojonante. Además pueden inducir apoptosis en ciertas células. Modular la expresión de proteínas importantes. Pueden originar tumores, etc. Pero mientras eso sea en línea somática no pasa nada. La mierda pasa cuando la línea germinal tiene problemas. Eso mete otra dimensión mucho más importante. No solo porque en la célula de ese individuo se de una rotura cromosómica y las células peten. Sino porque en un solo gameto que un elemento origine una variación, si ese gameto da lugar a un descendiente, todas las células de un descendiente tendrán esa mutación. Es decir que el papel de los elementos transponibles pueden tener efecto en línea germinal para que esos efectos puedan cambiar. Además esos efectos serán jodidos o beneficiosos para el descendiente que será quien padezca.

ELEMENTOS TRANSPONIBLES PROCARIONTES - LAS SECUENCIAS DE INSERCION

Hablaremos fundamentalmente de las IS (insertion sequences), de los tranposones y del fago Mu.

Las secuencias de inserción son los elementos móviles más sencillos. Aparecen fundamentalmente en bacterias, en procariontes, aunque no son exclusivos de ellas porque hay cosas más o menos parecidas en otros organismos, incluso en organismos superiores como el maíz. Lo que Barbara McClintock descubrió en origen eran realmente muy parecidas a . En los años 60 se da un rebrote de los descubrimientos de Barbara McClintock. Se hacen experimentos de transducción y se trabajaba con fagos Lambda transductantes del gen Gal. Es un ejemplo de recombinación específica. Se metía siempre en el mismo punto en E. coli, cerca del gen Gal. Cuando se escindía podía llevarse un pedazo de Gal que era encapsidado y transducido hacia otras bacterias. Se hacían entonces experimentos con fagos lambda Gal+ y con fagos lambda mutantes con el gen Gal mutado. Cuando hacían gradientes del DNA de los dos tipos de fagos, había una diferencia enorme en el gradiente de cesio. El inactivado era más denso y tenía algo más, algo adicional, algo insertado que no tenía el gen Gal+. Hipótesis, las bacterias de donde Lambda había sacado Gal mutado tenían ese gen con una inserción. El material vírico que tenía la inserción era más pesado que el material sin la inserción. Se sabía que la diferencia estaba en unas 800 pares de bases que era precisamente el elemento de inserción.

A partir de entonces comienzan a estudiarse casos similares y se vieron un montón de ejemplos en los que se inactivaba un gen por inserción de una secuencia generalmente de 800 pb y que compartían características concretas.

En un plásmido también podían darse estas inserciones. Cuando se vieron elementos de inserción en plásmidos los estudios ya fueron más rápido. Se vio que tenían una secuencia que cambiaba de sitio y esa secuencia estaba flanqueada por unas secuencias terminales invertidas repetidas (ITRS). En las secuencias de inserción entonces tenemos unos genes, unas secuencias invertidas repetidas terminales de entre 15 y 25 pb y todavía más hacia fuera unas repeticiones directas, DR (unas secuencias más cortas, de 9 pb, que tienen la misma secuencia y están EN EL MISMO ORDEN - no invertidas). Las secuencias invertidas terminales de la IS podían aparearse cuando estaban en forma de cadena simple (es decir luego de que se diera una separación de las dos cadenas del plásmido por calor) dando lugar a la formación de un hairpin.

Ese Harpin ahora podía cortarse y originar un IS suelto.

• ¿Cómo se inserta?

Una transposasa podía cortar originando extremos abiertos. En ellos se intercalaba la IS. Luego una polimerasa completaba los extremos abiertos dando lugar a los ITRs (invertid Terminal repeats). La resolvasa, una proteína encargada de resolver ciertas estructuras intermedias que se formaban también era importante.

Las tasas de transposición en bacterias son del número siguiente. En un cultivo, si te fijas en una de esas secuencias, de cada 1000 a 10000 bacterias descendientes de una colonia el elementos transponible ha cambiado de sitio. Pero esa inserción tiene una cierta tasa de reversión también (escisión y generalmente pérdida - no es escisión y retorno al sitio original - debido a que pierde su oportunidad de insertarse). La tasa de reversión es de 1 por cada 1000000 o 10000000. Cuando una bacteria tiene muchas secuencias de inserción todo se vuelve un caos. En conjunto sí ya podemos decir que hay más movilidad.

En cada grupo de bacterias se descubren unas secuencias de inserción. Algunas son muy específicas, incluso de cepa, mientras que otras son muy generales y universales. Pero en todos los casos son muchísimas. Se numera, desde la IS1 (la primera descubierta - la que se insertaba en Gal de E. coli) hasta la n.

Papel en la recombinación de bacterias - la conjugación

Cada bacteria tiene en su cromosoma y en el factor F un cierto número de ISs ya insertadas que pueden escindirse y reinsertarse. Pero si sumamos hay una gran cantidad de ISs distribuidas y en distintos puntos del cromosoma. Cada cepa tendrá las ISs en puntos diferentes. Por otra parte también tenemos en el factor F una cierta cantidad de secuencias repartidas. Lo que decíamos es que el factor F se puede integrar en el cromosoma bacteriano por determinadas secuencias que aportan homología, como por ejemplo las ISs! Como tiene unas ciertas en él y otras cuantas en el cromosoma bacteriano eso aporta la homología necesaria para dar lugar a cepas Hfr, etc. Además como los factores se cambian de sitio tanto en el factor F como en el cromosoma. Eso hace que el factor F en la cepa Hfr1 se inserte de una forma y en la cepa Hfr2 se haya insertado de otra. Además como hay varias ISs compartidas la variabilidad de inserción es enorme. Es una de las claves de esa conjugación de factores F y toda esa variabilidad que generaba. En el fondo es algo en lo que participan las ISs.

No sabemos hoy en día qué podría suceder si no hubiera ISs dado que forman parte del genoma de las bacterias. No sabemos si son dispensables. No existen bacterias sin ISs por lo cual no podemos saber si son dispensables.

Los transposones

Los transposones o elementos Tn, a parte de llevar los genes que les permiten su transposición suelen llevar entre las IRSs unos genes adicionales que suelen aportar alguna capacidad extra a la bacteria que lo tiene activo. Qué tipo de capacidades? Resistencia a antibióticos, resistencia a sistemas de defensa, etc. son algunos de los genes típicos. En estos elementos transponibles suelen ir genes de esos que confieren resistencia.

Las ventajas de las ISs eran fundamentalmente de facilitar variabilidad, conjugación, recombinación, etc. Pero estos, además de tener esas ventajas, tienen la ventaja de poseer resistencias a cosas en concreto. Es decir que las ventajas biológicas de las bacterias que los poseen son múltiples.

Hay muchísimos descritos y se denominan Tn1 hasta Tn1721….1722… Cada uno tiene resistencias a un grupo de antibióticos característica. La longitud es extremadamente variable dependiendo de lo que llleven, desde 2000 hasta 20000 pb. Las ITRSs suelen aparecer, exactamente igual que en el caso de los ISs, pero hay transposones que no tienen ITRSs y que usan otras cosas para escindirse. Pero básicamente suelen necesitar las enzimas que codifican para la transposasa y la resolvasa además de los genes de resistencia, etc. No hay un patrón único de transposones. Es decir que es un poco cajón desastre. Algunos están incluso flanqueados por ISs que les permiten su escisión e inserción… Además pueden saltar de unas especies a otras!!! Por transformación podría darse que los fragmentos con el elemento transponible tranforme bacterias de diferentes estirpes. Esos elementos transponibles entonces son muy promiscuos y pueden pasar de una especie a otra. Eso genera muchísimos problemas de resistencia a nivel clínico sobre todo en el que se utilizan muchos antibióticos. Estos son entonces problemas graves dado que están en una infección de garganta y con la flora habitual de la garganta de repente originan especies resistentes y patógenas. Las bacterias pueden así cambiar y hacerse cada vez más chungas. Como llevan lo que llevan se van generando cepas de bacterias cada vez más resistentes y que se generan donde las presiones selectivas más intensas para las bacterias (hospitales, clínicas). Además, como se pueden tener infecciones múltiples (convivencia de diferentes patógenos) se originan cepas horrorosas y resistentes a todo. Pero el plásmido en sí no lleva la resistencia, sino que eso lo llevan los transposones. Es así que son muy importantes!!!!

Vemos ejemplos. Un plásmido de resistencia a tetraciclina que lleva un transposón que tiene resistencia a kanamicina y un plásmido que lleva un transposón que tiene resistencia ampicilina conviven en una bacteria de una cierta cepa. Si en alguno de los descendientes de esa cepa hay transposición podrían surgir plásmidos de resistencia a dos o tres antibióticos!!! La bacteria cada vez se hace más grande y tiene cada vez más cosas y es más resistente!!!

El fago Mu

Como tantos otros bacteriófagos puede vivir en forma libre (independiente, con su propia cápsida) o como profago (insertado en algún punto del cromosoma). Cuando uno estudia la estructura de este fago resulta extraordinariamente similar a un elemento transponible. Está a caballo entre los transposones y las ISs. Al igual que unos y otros, cuando se inserta en ciclo lisogénico desarrolla DRs como todos. Los genes que le permiten integrarse recuerdan mucho a los de la resolvasa y la transposasa y los lleva él en su genoma, tal como los ISs y los transposones. Tiene un tamaño de algunos miles de pb (36000 pb) y suele llevar trozos de DNA de la última bacteria donde estuvo en la que haya desarrollado lisis (tal y como lo hacía Lambda en la transducción). Lo que sí es que tiene cabeza y cola como todos los fagos, pero sin embargo, su genoma parece el de un elemento transponible. Hay mucho debate.

Algunos opinan que los transposones son fagos que han perdido la capacidad de independizarse, con lo cual lo único que hacen es estar en lisogénesis constantemente (es decir que no pueden iniciar el ciclo infectivo lítico). Lógicamente, si se pierda la capacidad de formar cápsidas y de petar bacterias, te convertiste en un elemento transponible. Los genes de resistencia, los transposones los podrían haber adquirido por este mecanismo de llevarse DNA de bacterias anteriores.

Esto explicaría por qué algunos elementos transponibles actuales son similares a fagos actuales. Los elementos transponibles que no recuerdan a nada podrían corresponder a fagos ya extinguidos.

Existe una hipótesis contraria. Los elementos móviles son combinaciones afortunadas de genes que la evolución ha ido poniendo cerca y que en algún momento esas secuencias adquieren además la capacidad de independizarse. Así los virus serían elementos transponibles que adquirieron una capacidad adicional, la de independizarse y recorrer el mundo haciendo putadas a las bacterias.

El profe cree que la primera es mucho más lógica. Pero sin embargo ninguna de las dos puede descartarse. Sin embargo todo apunta mucho más a la primera, sobre todo por parsimonia (una hipótesis más parsimoniosa es la más simple, la que tiene más entropía en su proceso, etc. típico en ciencia que lo más simple es lo más cierto, sobre todo porque es lo más barato y lo que es más fácil que sobreviva… no es siempre así, pero suele ser así… importante recordar eso para el futuro… PARSIMONIA!).

En su ciclo lisogénico, Mu desarrolla varias copias de él por replicación. Así va insertando múltiples copias de él por todo el genoma. Cuando ya hay dos muy cercanas, Mu puede aparearse consigo mismo por homología y se produce un entrecruzamiento escindiéndose un fragmento que tiene un Mu completo (el otro Mu quedaría todavía dentro del genoma bacteriano). Esa secuencia es muy improbable que eso se replique de manera que ese fragmento suele perderse y se genera de esa manera una deleción, a menos de que vaya por ahí y vuelva a insertarse antes de que se de la replicación. Esto podría explicar el origen de plásmidos por ejemplo.

Pero si en lugar de disponerse en el mismo orden, lso fagos Mu contiguos se disponen en sentido opuesto, al aparearse y darse el entrecruzamiento se forma una inversión. Y de la misma forma es posible generar duplicaciones y translocaciones.

Es así que el fago Mu, antes de que se conocieran los elementos transponibles ya se le atribuían estas capacidades “mágicas”. Los elementos transponibles, de esta misma manera generan esas reordenaciones cromosómicas en procariontes. Es exactamente igual que como pasa con Mu!!!! Pero en eucariontes pasará otro tanto, siempre que haya múltiples secuencias muy homólogas en regiones apartadas como en este caso.

Hay una secuencia transponible que no se transpone que está en el cromosoma 7 y otra secuencia no transponible en el cromosoma 9. No se transponen porque su expresión está reprimida. Pero esas secuencias aportan homología y cada vez que se equivocan recombinan por ese punto dando lugar a translocaciones del 9 al 7 super comunes. Es decir que los elementos transponibles repetidos por todo el cromosoma aportan esas homologías raras que al igual que microsatélites dan lugar a que esas reordenaciones se den más frecuentemente de lo normal.

En los años 40 se hacían cartografiados por muitaciones polares. Un solo cambio inactivaba muchos genes. Todavía no habían descubierto el operón, no hasta los años 60 (Jacob, Monob). Lo que hacían los panchos era que tenían un elemento transponible que se insertaba en el promotor del operón. Ese operón entonces actuaba coordinadamente controlados por ese mismo regulador. Los elementos transponibles, al meterse, inactivaban todos los genes solo mutando el promotor. Pero como todas las mutaciones tenían una tasa de reversión. Alucinaban los pibes porque los mutantes inactivaban una sarta de genes y los revertidos reactivaban los mismos genes. Los pibes flipaban. Como la frecuencia de mutación Mu y la frecuencia de mutación V eran enormes en esas bacterias para ese grupo de genes es así que los llamaron mutantes polares.

El mecanismo general de la transposición

Hay dos variantes. ¿Cómo se movilizan estas partes semi-estables del genoma? Hay dos mecanismos, la tranposición conservadora (como la del Tn10) y la transposición replicativa (el Tn 3 o el fago Mu).

Muchos elementos transponibles pueden hacerlo de las dos maneras.

Conservador quiere decir que se conserva lo que hay, no hay cambios, no cambia el número de elementos transponibles de ese genoma. El Tn10 hace transposición conservadora porque induce cambios de sitio sin que ahora haya 2 transposones. La transposición replicativa hace que aumente el número de copias. Es lo que veíamos para Mu, que también se da, como ya sabemos, en muchos otros elementos (como Tn3). Lógicamente los elementos que darán lugar a reordenamientos y mutaciones múltiples serán los que utilicen la transposición replicativa (ya que se necesitan múltiples secuencias para que haya homología).

Puede haber Dianas (elementos transponibles cuya transposasa reconoce dianas concretas siempre constantes - es decir que es una endonucleasa de restricción) o no (elementos cuya tramposaza corta donde le da la gana).

En la conservativa, al cortar, la secuencia se abre. El transposón va y se inserta y se rellenan los huecos. Pero de donde salió el transposón queda una rotura que puede ser reparada de formas diversas… o se suelda (el gen se restaura - la mutación revierte) o se suelda pero el transposón se llevó un pedazo (el gen se ha modificado y podría seguir funcional o no… dependiendo de cómo se repare luego esa rotura… y de si la rotura fue en una región codificante o no… y si se cambió la fase o no, etc.) o se repara por mecanismos de emergencia, etc. Es decir que hay muchas posibilidades… variabilidad.

Si es replicativa, se replica la secuencia originando un DNA que va y se inserta en algún punto del cromosoma. La transposasa produce el corte donde se da la inserción, como siempre. Lógicamente el número de copias ha aumentado.

En la retrotransposición, la transcriptasa inversa genera un cDNA a partir de un mRNA del transposón. El cDNA se inserta. Como se ve, la retrotransposición es también replicativa debido a que se duplica el número de copias del elemento transponible - el retrotransposón.

Existen múltiples modelos para los mecanismos descritos. Uno es el propuesto para la recombinación no homóloga de moléculas circulares. Entre un transposón insertado en un plásmido insertado y un cromosoma por ejemplo podría haber este tipo de recombinación. La transposasa corta una hebra de un lado del transposón y la otra hebra al otro lado del transposón. También la transposasa corta, pero ahora en el cromosoma sobre la diana (si la hay). Se da la invasión de la secuencia del transposón que se coloca entre los extremos cortados en el cromosoma. Se forman círculos cointegrados dando lugar a la recombinación de las dos moléculas circulares. En la resolución podría haber

Control de los elementos transponibles

Dos mecanismos que funcionan aunque cada elemento tiene el suyo…

En la replicación conservativa el número de elementos no crece y es siempre el mismo. En la replicativa el número crece… pero por qué no crece hasta el infinito? Porque hay mecanismos de autocontrol (feedback) o de metilación-hemimetilación.

El autocontrol es fácil… la transposasa produce su mRNA y su proteína. Igual con la resolvasa. Con todo eso el transposón va y genera copias. Pero cuando la cantidad de resolvasa es demasiado alta, la propia resolvasa inhibe, se acopla y pega a una secuencia reguladora que está entre el gen de ella y el de la transposasa. Es así que bloqueado el regulón ya no se produce la suficiente proteína como para que haya más transposición. Eso funciona así debido a que el gen de la resolvasa y el de la transposasa comparten una secuencia reguladora (son genes que realmente están situados en sentidos opuestos y con una secuencia que hacia un lado funciona como reguladora del gen de la transposasa y hacia el otro como reguladora de la resolvasa). Con lo cual, con una sola unión, con una sola interacción, se inhiben dos proteínas.

La ampicilina a todo esto está al margen y con su mismo regulador de manera que la enzima que da lugar a la resistencia se mantiene intacta y por tanto no hay problemas y aunque el transposón pierda expresión la resistencia no se pierde.

Esto no es solo un modelo… es como se regula efectivamente el Tn3 (un famoso transposón de bacterias que tiene el gen de resistencia a ampicilina además de las dos proteínas clásicas).

La metilación-hemimetilación es simple. Ya vimos como las bacterias, al tener DNA hemimetilado se cuenta como que no está replicado y lo replican naturalmente. Los elementos se movilizan (se replican) cuando están hemimetilados… al insertarse se metilan por la metilasa y lógicamente al estar metilados ya no se replican…

ELEMENTOS TRANSPONIBLES EN EUCARIOTAS

Hay dos tipos de elementos, unos que son de DNA, muy similares a los transposones de procariotas y otros que son los llamados retroelementos. Los libros suelen denominar estos retroelementos de una forma muy específica dependiendo de sus características. Pero nosotros haremos una aproximación muy simple.

Los elementos de DNA tienen lógicamente ITR (invertid Terminal repeats) en los flancos y están insertados entre dos secuencias repetidas directas (direct repeats). En el medio tienen el elemento con la transposasa codificada.

Los “nuevos” son los retroelementos. Se llaman así porque (no todos) pero sí algunos provienen de virus RNA que utilizan una retrotranscriptasa para generar el cDNA que es el que se inserta. Existen dos tipos de retroelementos, los retrovirales y los retrotransposones poly-A.

Los primeros son típicos retrovirus (solo que no tienen encapsidación, etc.). Tienen una secuencia que codifica la integrasa y la retrotrancriptasa y que está flanqueada por los LTR (long Terminal repeats).

La mayor parte de retroelementos funciona igual que los retrovirus. Pero los retrovirus suelen tener los genes gag, pol y env que codifican para enzimas de la encapsidación, empaquetamiento, proteínas de superficie viral, etc. En concreto gag codifica para enzimas empaquetadoras de RNA y forman la cápsida del virus. El gen pol codifica la integrasa, la transcriptasa inversa y una enzima de acción proteasa que sirve también para el ensamblamiento final. El env es el que codifica moléculas de superficie viral. El pol estará casi completamente conservado en la mayor parte de retrotransposones y codificará para la integrasa, la retrotranscriptasa y la proteasa. Pero otros retroelementos no tendrán estos genes y al no seguir el mismo esquema no se los relaciona con retrovirus.

Hay ejemplos muy típicos como es un grupo que se llama grupo copia (un grupo de retroelementos de Drosophila). Ese grupo copia tiene el gen pol, el gen gag pero no el env. Otro ejemplo es el Ty1 (transposition in yeasts - transposón de levaduras) que tiene el gen gag y pol también y le falta el env. En los dos casos se asemejan a un retrovirus típico como MoMLV.

Pero los retroelementos poly-A no se asemejan a un retrovirus. Tiene dos ORFs (dos sitios donde hay Stara/stop) seguidos de un polyA. Algunos de este grupo parecen que provienen de retrovirus y otros parece que no tienen nada que ver con virus. Es un grupo tan amplio que cabe la posibilidad de que algunos no provengan en concreto de retrovirus, sino que hayan obtenido los genes similares a pol de otra forma.

Transposición de elementos con LTRs en Eucariotas

Los retroelementos típicos tienen LTRs, uno a cada flanco. Como siempre tenemos que destacar que la frecuencia de transposición no es enorme. El proceso no está ocurriendo contínuamente dado que si fuera así, podría ser deletéreo.

Los LTRs son unas secuencias repetidas en los flancos. Esas secuencias repetidas caracteriza a un grupo grande de elementos retrotransponibles. La forma que tienen para transponerse es a partir de que producen un RNA. El RNA utiliza transcripción reversa para dar lugar al cDNA que posee flancos de LTRs. Parte de esos LTRs, mediante la actividad exonucleasa 3' de una enzima codificada por el mismo RNA (la integrasa), es eliminada desde los extremos 3' a cada flanco. Las hebras se cortan en el sitio diana también por la integrasa y se transfiere el DNA uniéndose los extremos libres 3' a los libres 5' de la molécula objetivo. Una vez ya insertado el cDNA la secuencia se repara y se religa mediante actividad de RecA, etc. La integrasa ya no participará. Finalmente se ha integrado una nueva copia.

Como vemos, este mecanismo es replicativo debido a que cada vez que se da una “transposición” se genera una nueva copia del retrotransposón que es insertada en un nuevo lugar.

Retrotranscripción

En la secuencia de RNA tenemos las siguientes secuencias… en un flanco tenemos la secuencia R, una secuencia repetida en los flancos. Además luego de R y hacia dentro de la molécula tenemos una secuencia U5 (una secuencia única no repetida y que se tiene solo en el extremo 5') y una secuencia U3 (una secuencia única no repetida que está al lado de la secuencia R 3'). La última región importante es la PBS (primer-binding-site), el sitio donde se unirá el primer que permitirá la transcripción inversa. Lo que nosotros necesitamos es un primer que nos ofrezca un extremo 3' OH libre a partir del cual se añadirán los desoxirribonucleótidos. Luego están los genes que codifican (el más importante el pol - trancriptasa/integrasa).

A partir de ese RNA tenemos que conseguir un DNA. Eso se consigue a partir de un primer y polimerizando. Pero el primer es un poco más complicado.

Las dos bases del proceso son:

• siempre dejar extremos 3' libre

• la transcriptasa inversa no solo puede añadir y complementar DNTPs sobre RNTs, sino que además puede eliminar con actividad exonucleasa los RNTs que están hibridados con DNA.

El primer que se pega es un tRNA que se une al PBS del mRNA dejando un sitio 3' libre hacia el flanco que contiene la secuencia R y U5. Lo que ocurre es que se copia mediante la transcriptasa inversa una cadena de DNA hacia el extremo para copiar primero la secuencia U5 y luego la secuencia R hasta que finaliza el molde. Ahora lo que sucede es que la retrotranscriptasa elimina el RNA molde con lo que estaba hibridado el DNA de nueva síntesis.

A continuación hay un “salto” o desplazamiento del primer tRNA con la secuencia R-U5 de DNA hacia el extremo 3' del RNA. Ahora el primer se une a la secuencia R 3' del RNA molde y deja un extremo 3' libre hacia el otro lado. La transcriptasa inversa ahora utiliza el resto del molde y sintetiza sobre el 3' libre del primer todo el DNA hasta terminar el molde. A la vez va eliminando el RNA molde excepto en los sitios PPT (polypurinas) que se quedan hibridados ahora a toda la hebra de ssDNA que todavía se encuentra unida al primer. El PPT de RNA sirve para ofrecer un segmento 3' libre que sirve para que se sintetice DNA ahora ya mediante una polimerasa normal complementario al molde de ssDNA. Se sintetizan hacia el extremo de 5' del molde primero el U3, luego el R, el U5 y finalmente el PBS complementario al tRNA. La transcriptasa inversa elimina el RNA de la zona híbrida y elimina el tRNA primer.

Este es el momento clave… en este momento tenemos una molécula de ssDNA molde que tiene la secuencia PBS, luego los genes, luego la secuencia U3, la secuencia PBS nuevamente y la secuencia U5. Sobre ese extremo 5' molde tenemos hibridada una hebra de nueva síntesis de DNA que tiene el U3, el R, el U5 y el PBS. Es entonces que se produce el segundo salto. Este fragmento salta hacia el extremo 3' del molde ahora y provee un extremo 3' para copiar ahora el molde desde el PBS hasta el final… Eso hace que finalmente se produzca una molécula de dsDNA que tiene los genes desados flanqueados por dos secuencias largas repetidas que están formadas por U5, PBS y U3. Esos serán los LTR y esa molécula entera es el cDNA.

Transposición de elementos No-LTR

ORF1 y 2 son capaces de producir las proteínas del ORF1 y ORF2 que se unen al producto de RNA del transposón que son las que reconocen la diana, rompen los sitios donde se introducirá el RNA desplazando una de las hebras. Una vez que cortan comienzan a copiar el cDNA apartir del extremo 3' que ofrece la molécula diana del propio sitio de inserción. Una vez se produce la molécula de cDNA ahí mismo se inserta.

Para resumir, la diferencia principal con respecto a los elementos LTR es que los elementos LTR forma el cDNA off-site y luego se inserta mientras que los no-LTR forman el cDNA in situ y ahí mismo se insertan.

Más teoría sobre retroelementos

Generalmente provienen de retrovirus. Todos deben tener intermediarios de RNA. Los elementos que llevan secuencias LTR (esas secuencias originadas cuando el RNA intermediario pasaba a cDNA) son los retrotransposones y los retrovirus. Una cosa importante es que no todos los retroelementos llevan esas secuencias. En ese sentido, si buscamos, sobre todo la clasificación de retroelementos suele ser LTR+ o LTR-. Los que nos las presentan son los retrotransposones. En eucariontes, son de dos tipos, el SINE o el LINE. Llevan siempre un extremo Terminal de poli A. La transposición no es a través de cDNA. Es más, los SINE ni siquiera usan retrotranscriptasa para replicarse-trasponerse.

Todo el grupo SINE-LINE constituye en humanos una gran parte del genoma (son los retroposones). Los SINES son las Short interspersed sequences. No presentan dentro codificada la RT. Los LINES son las Long interpersed sequences. Esas sí tienen la RT dentro. En humanos, las SINES presentan 300 pb aproximadamente. Existen 500.000 copias en el genoma… son una décima parte del total de DNA de humanos. No se transcriben generalmente. Para replicarse insertarse-delecionarse deben usar transposición usando la transcriptasa inversa de OTROS retroelementos.

Es importante la familia Alu que presenta 300.000 copias en cada genoma haploide. En ratón hay una secuencia relacionada llamada B1. Todas ellas tienen una diana de restricción para la enzima AluI. Son clave en el apareamiento y suelen originar recombinación desigual. Los homólogos con secuencias Alu en sitios dispersos pueden reconocerse mediante esas secuencias y recombinar dando lugar a mutaciones. También pueden producirse traslocaciones, inversiones, duplicaciones, deleciones, etc. Estas secuencias Alu son de las más frecuentes generadoras de reordenamientos genéticos y cromosómicos en humanos.

Si nos vamos a la familia LINES ya encontramos secuencias de unas 5 kpb. Están en mucho menor número, unas 10000 copias. Pero aún así representan del 1 al 2 % del DNA total!!! Sí se transcriben y por lo tanto producen gran parte de la retrotranscriptasa del núcleo. Line-1 presenta dos ORFs, el ORF1 y el ORF2. El sistema de transposición ya lo conocemos - es el sistema que no usa LTRs o de replicación-retrotranscripción in situ.

Los elementos LTR+ forman sus extremos usando la retrotranscriptasa y se dá la reacción off-site. Existen dos tipos. Los que poseen envoltura (poseen gen env) se llaman retrovirus. Los que no presentan envoltura se denominan retrotransposones. Entre los que no tienen envoltura encontramos los elementos Ty1 de levaduras y los elementos copia de Drosophila.

Transposones y su función en los telómeros

Los elementos que ocupan una parte considerable del genoma los hemos ido viendo en diferentes momentos del curso. Una función celular que podría estar originada por elementos transponibles es el mantenimiento de los extremos cromosómicos de los eucariotas. La telomerasa es una transcriptasa inversa y utiliza como molde RNA. La telomerasa está relacionada con las transcriptasas inversas codificadas por otros retrotransposones. Los telómeros curiosamente, aquello organismos que tienen telomerasa, si nos fijamos en ella, no es ni más ni menos que una transcriptasa inversa. El RNA de la proteína es el molde para sintetizar el cDNA en el extremo. Es así que la actividad de la telomerasa y la actividad de las retrotranscriptasas son similares. Drosophila no tiene telomerasa, sin embargo sí tiene síntesis de telómeros. En ella, los telómeros son alongados gracias a que poseen en su final un número de retroelementos como HeT-A y TART que son precisamente LINES (secuencias largas interdispersas) que no presentan LTR. De tal forma que por medio de la transposición de esos elementos es como se consigue que los telómeros se completen en cada replicación.

Ejemplos de Retroelementos eucariotas - Retrotransposones de LEVADURAS y DROSOPHILA

El ejemplo típico son los Elementos Ty. En el caso de Drosophila, se llaman Copia. Los elementos Ty constituyen una familia muy común en levaduras. Su tamaño aproximado es de 6,3 kbp. Muchas células tienen alrededor de 30 copias. Sus secuencias LTR se denominan secuencias Delta. Recordemos que el elemento LTR se origina como tal cuando se termina la retrotranscripción. Hasta entonces no están completamente generados (y de hecho no poseen LTRs). Las secuencias LTR de Ty tienen 334 pb. Muchos elementos Ty son defectuosos y ya perdieron la capacidad de transposición.

Generalmente los LTR de un retrotransposón suelen tener entre 250 y 600 pb mientras que la región codificadora es de unas 4 a 7 kpb dando un total de 5 a 8 kpb.

Verdaderamente están interdispersos numerosas veces copiados en los cromosomas.

Ejemplos de Transposones DNA en eucariotas - Elementos P de DROSOPHILA

Tienen un tamaño de unas 2,9 kb con cuatro exones. Son transposones de DNA. Presentan repeticiones invertidas (IRS) en su exremo de 31 pb. Generan cuando se insertan repeticiones directas de 8pb en el sitio diana. Son muy similares a los de procariontes (casi iguales).

El mecanismo de transposición no es replicativo. El número de elementos P en los individuos varía de 50 en algunos individuos a unos pocos en otros.

Interés importante: Las moscas capturadas en el campo para hacer los experimentos antes de 1945 no presentaban estos elementos. Mientras que moscas capturadas con posterioridad sí presentaban. Luego se vió que eso ocurría debido a que había una transferencia horizontal de esos transposones desde otras especies del género hasta Drosophila melanogaster. Dependiendo de determinados cruzamientos, si es el macho o la hembra el que lleva el elemento, en unos casos el cruzamiento es normal y en otros casos la descendencia es toda ella estéril.

Imaginamos un cruzamiento del tipo Hembra noP y Macho P. En ese caso concreto, la progenie es normal de apariencia. Pero las moscas son estériles debido a disgénesis de híbridos. No hay progenie en F2.

Si cruzamos Hembras P con Machos noP la progenie que aparece es normal, pero además son normales en su línea germinal también… las moscas son fértiles.

Cuando esto se observó, a el tipo de cruzamiento Hembra noP/Macho P se dice que lo que hay es disgénesis híbrida (los problemas que causa este elemento P en esos individuos). Una cosa que les llevó a preguntarse eso es por qué hay individuos con línea somática correcta y línea germinal incorrectamente desarrollada. Evidentemnte el transposón era específico de un tejido - solo producía anomalías en la línea germinal. Para eso debemos volver a la transparencia en la que nosotros llamaremos a las moscas que llevan el elemento P en el citoplasma MOSCAS DE CITOTIPO P. Si no lo llevan es de CITOTIPO M.

Cuando las hembras eran de citotipo P en un caso, las hembras eran de citotipo M en el otro. Los espermatozoides entran en el óvulo de una hembra con un citotipo dado. Si el esperma macho (de tipo P o M) entraba en una hembra con citotipo P, en ese citoplasma se tienen los elementos para inactivarlo. Es así que se inactiva y no produce fenotipo. Pero si el esperma macho entraba en una hembra con citotipo M, en ese citoplasma no hay elementos de inactivación. Es así que todo el elemento P aportado por el macho se verá descontrolado y causará problemas en la línea germinal.

El elemento P tiene los exones 0, 1, 2 y 3 y los intrones correspondientes. Estaba flanqueado por 31 pb directos en cada extremo. Pero hay una diferencia de transcripción en la línea germinal y la línea somática. En la línea germinal se transcribía todo el elemento. Pero en la línea somática el splicing hacía que el intron 3 no se eleminiara y que un codón de terminación incluido en él se leyera como tal dando lugar a un mRNA más pequeño que es el que actúa para inhibir el elemento P en las células de citotipo P. En la línea somática precisamente se da así. Pero el splicing en la línea germinal no se daba y por tanto no había inhibición.

Las células germinales no tienen la proteína que origina el splicing alternativo y es por eso que es la línea germinal la que es afectada en esos cruzamientos siempre que hay disgénesis híbrida.

Estos elementos interesantes desde este punto de vista es otra de las cosas tan interesantes que tenemos que tomar en cuenta para explicar por qué un cruzamiento podría no dar lugar a descendencia o dar lugar a descendencia estéril. Es así que en determinados cruzamientos con dotaciones genéticas y citotipos diferentes se podrían dar estos tipos de disgénesis. No se sabe la relación exacta entre los niveles de splicing alternativo y las barreras inter-específicas. Pero se intuye que tenga que ver con esto.

Elementos transponibles en el maíz

Al igual que Drosophila para animales, el maíz se había transformado a principio de los años 30 en el modelo vegetal para la genética. Era un organismo fácilmente manejable (dentro de unos ciertos límites) y sobre todo interesante desde el punto de vista de la economía de cereales. El maíz contribuyó de forma decisiva en muchos descubrimientos.

El valor clave es que se pueden obtener los cromosomas de una forma rápida y facil (fácil aislamiento). Además son pocos y grandes. Drosophila solo tenía para ello los politénicos, los cromosomas mitóticos eran de difícil aislamiento y además escasos. Las preparaciones eran dificultosas.

Es así que mucha de la citogenética se estudió en maíz antes que en Drosophila. Barbara McClintock fue la geneticista del maíz por excelencia. La genética de ese momento es clásica, en base a cruzamientos y análisis de fenotipos y cromosomas. Con ello sepretendía hacer mapas de localización de genes. McClintock creó el primer mapa cromosómico de los genes del maíz.

En base a todos sus experimentos clásicos de cruzamientos-mutantes, etc. ella llegó a la conclusión de que algunos de los caracteres que estaba estudiando se debían a genes que no eran normales. Llegó a pensar que realmente esos genes saltaban y así los llamó “bouncing genes”. En los años 40 eso generó como ya sabemos mucha controversia. Muller, que trabajó en Drosophila había trabajado previamente en maíz. Usando rayos X inducía mutaciones tanto puntuales como reordenaciones. Stadler aplica rayos para obtener mutantes, aislarlos y obtener mutantes para varios loci. En los años 30 McClintock estudia los mutantes observando que las mutaciones que había producido Stadler no eran puntuales. Los mutantes presentaban deleciones que llevabn los alelos salvajes. La conclusión fue la existencia de roturas cromosómicas y la fusión posterior de los extremos rotos.

Si la estructura telomérica de un brazo de un cromosoma se pierde, esos cromosomas podían replicarse y producirse una replicación normal, pero como ambas hermanas tenían regiones teloméricas ausentes, se fusionaban por ese brazo generándose unos homólogos mutantes. Los extremos teloméricos los llamó “pegajosos”. Los cromosomas mitóticos anómalos se separaban en mitosis. Pero al separarse los dos centrómeros se producía un cromosoma dicéntrico que tenía en el medio los dos brazo fusionados con secuencia invertida. La secuencia podía cortarse al azar en cualquier punto de esos brazos fusionados. Así se formaban 2 cromosomas, los dos con sticky ende y con duplicaciones o deleciones muy factibles (obvio… el corte rara vez daba lugar a una segregación simétrica).

Es lo llamó rotura fusión puente. Este ciclo podía repetirse n veces y así se formaban mutaciones muy interesantes.

El ciclo lo llevó acompañado y se dio cuenta de que no solamente estudiando los cromosomas desde el punto de vista citogenética sino que esos cromosomas tenían marcadores fenotípicos, ella podía hacer un seguimiento fenotípico de los eventos que estaban sucediendo genotípicamente.

Una vez conseguidos los mutantes intentó cartografiarlos. Esos mutantes en principio le producían todo este proceso. Pero algunos de esos no los podía cartografiar. Los experimentos al llevarlos a cabo daban unas conclusiones raras. Los genes no eran normales. No podían localizarse en ningún cromosoma. Eso le hizo pensar que los genes podían ser saltarines.

Los cromosomas anómalos generados por ciclo rotura-fusión-puente podían luego hacer cosas raras con sus homólogos. Entre ellas cambios en la estructura cromosómica entre un cromosoma con duplicación y un cromosoma homólogo sin la duplicación. Al recombinar entre ellos podían originarse cromosomas dicéntricos recombinantes entre los homólogos. El dicéntrico se resolvía y se rompía dando lugar a un cromosoma con sticky ende nuevamente que ahora podía replicarse y dar origen a una fusión de telómeros. Eso sucedería en la anafase I. Pero podía ocurrir que en la anafase I la recombinación fuera entre las hermanas del cromosoma con la duplicación. Lógicamente, en la anafase I no sucedería nada. Pero en la anafase II, cuando las cromátidas hermanas deban separarse se generarán cromosomas dicéntricos que se cortarán y darán lugar a cromosomas con sticky telomeres que podrán fusionar esos telómeros y originar cromosomas con fusión.

Es clave notar que en el momento de darse la recombinación entre el cromosoma con la duplicación y el cromosoma normal se genera por un lado un cromosoma dicéntrico y por otro lado un cromosoma acéntrico. Ese cromosoma se pierde en la anafase I debido a que no tiene centrómero y no es arrastrado.

En los estudios del maíz una cosa llamaba mucho la atención. Al hacer una serie de experimentos, dependiendo de los marcadores que se estén utilizando uno espera que la descendencia sea de un fenotipo determinado. McClintock estudiaba la coloración de los granos de maíz. Cruzaba mazorcas blancas y veía que aparecía un número de descendientes que eran mazorcas de color e incluso algunos granos eran mosaicos genéticos. Y mientras que podía explicar todos el resto de fenotipos, no podía explicar este fenotipo tan extraño. Lo que sucedía es que en los descendientes de una mazorca blanca aparecían algunos granos blancos, otros rojos (genes silenciados?) y otros variegados. Es decir que algunos granos tenían manchas rojas en patrones blancos. Esos manchurrones evidentemente podían estar dándose por no-disyunción cromosómica. Pero también por deleciones, etc. Pero cómo podía ser que los mosaicos se estuvieran dando en una proporción como la que observaba. Ella pensó como decimos en genes silenciados (genes que existían pero cuya expresión estaba reprimida).

La idea es que podía haber unos genes que podían insertarse en un gen e inactivarlo.

Hoy en día ya se descubrió la interacción de dos transposones, Ac y Ds. Ac es autónomo. Pero Ds necesita de Ac para trasponerse. Ac es el activador de la transposición de Ds.

Si se tenía el gen del color C, si Ds se encuentra alejado o fuera del gen de color, el fenotipo será de color. Pero cuando Ac activa y desplaza a Ds, uno de los sitios donde puede relocalizarse es dentro del gen C. En su inserción se inactiva la expresión del color y el grano resultante es blanco. Ac luego actuab para hacer salir a Ds de su inserción para moverlo hacia otro lado. Es así que era completamente posible encontrar variegados de células, algunas con el Ds metido y otras con el Ac lo suficientemente cerca del gen C como para que Ds se vea “expulsado”. En los años 50 se comprobó que podía estar sucediendo esto. Cuando Barbara McClintock los dejó nadie los retomó, pero sin embargo son los que existen y más se conocen en maíz.

Transposición de elementos en HUMANOS - MAMIFEROS

Una cosa que siempre llamó mucho la atención es que hay una gran diversidad de anticuerpos. Hay todo un sistema de reconocimiento de lo que es propio y lo que es extraño que funciona con mucha precisión. Forma parte del sistema inmune y nos permite defendernos. La forma que tenemos es creando moléculas de inmunoglobulinas muy variadas. La capacidad antigénica que nos puede llegar es elevada. De la misma forma, la capacidad de reconocimiento es muy elevada. Tienen una forma de Y acortada. Tiene unas regiones variables y otras constantes. En lapunta de las regiones variables están las zonas hipervariables que son las que interaccionan. Se pensaba que los genes que debían hacer esto eran muchísimos y muy largos. Pero se vió que no. Lo que sí los genes están organizados de una forma muy particular. Las moléculas de la Ig están producidas por genes muy distintos, pero la variabilidad la generan las diversas formas que pueden darse por combinación de los segmentos V, J y D de la región hipervariable. Esta reorganización se produce con algo que ya vimos que es la recombinación mitótica. Esa recombinación mitótica es la que permite organizar las diferentes moléculas para transcribir a las proteínas correspondientes. Al principio se pensaba que la recombinación daba todas las posibilidades. Dependiendo de qué parte se metiera, las diferentes combinaciones daban toda la variabilidad. Efectivamente era así. Pero el hecho es que eran elementos móviles (restos de transposones) lo que permitía las reordenaciones que generaban el DNA de la célula B que daría lugar a un anticuerpo en concreto. Lógicamente el origen de las células B era monoclonal debía haber una célula B por cada antígeno. Así en el proceso de maduración de cada célula B se producía por reordenación (debido a estos elementos móviles) la secuencia del anticuerpo que luego producirían luego de ya estar maduras.

El número de elementos totales en el genoma de humanos es el 44,8% del genoma!!!! Además de estar copiados cientos de miles de veces. En humano hay más de 263 familias!!!! Pero claro… afortunadamente están “tranquilos” y no están saltando todo el tiempo…

Qué papel desempeñan en el genoma?

Contribuyen en procesos de metabolismo celular, producción de hipervariabilidad somática, etc. Aunque algunos son ya clásicos, aparecen transposones nuevos que todavía son poco conocidos como los MITES (miniatura invertid repeats) de 100 a 400 pb sin capacidad de codificar y con mecanismo de transposición desconocido todavía…

Inducen como sabemos variación genética al insertare… todos deben tener alguna repercusión genómica…

Es así que son fundamentales tanto desde el punto de vista evolutivo como desde el punto de vista de enfermedades y generación-relación con síndromes concretos, mutaciones o reordenaciones típicas, etc. El ejemplo de prácticas es el retroelemento Alu que origina inserciones-deleciones en el gen DCP de la ACE-1.

HERENCIA NO MENDELIANA - HERENCIA EXTRANUCLEAR

El fenotipo normalmente se producía y dependía de un genotipo que se encontraba en el núcleo. Estuvimos viendo que realmente los genes que están en el núcleo son muy importantes pero que no solamente son ellos los que dirigen todo. Hay muchos factores que determinan la expresión. El fenotipo está modulado por multitud de factores, genes nucleares + ambiente extranuclear. Todo lo que vimos hasta ahora correspondía a la interacción esa. Sin embargo, todo se refería básicamente al genotipo nuclear. Pero además hay un genotipo citoplasmático. Ese genotipo es el de las mitocondrias, cloroplastos, elementos citoplásmicos con DNA, etc. Los mRNA maternos que se almacenan y determinan ciertas cosas en el desarrollo son un ejemplo, el genoma mitocondrial de herencia materna, etc.

Todo esto se empezó a ver hace tiempo pero sin comprender realmente qué estaba ocurriendo. No se pensaba que los genes estuvieran en otro lugar que en el núcleo. Más tarde ya se vió que no, había DNA mitocondrial y DNA plastídico. Además muchas veces el citoplasma modulaba pero ya no tanto por los orgánulos sino porque genes nucleares tienen efecto sobre el citoplasma y él contribuye a la expresión fenotípica. Es decir que había múltiples evidencias de que no era solo el núcleo.

HERENCIA CITOPLASMATICA: está controlada por todos los orgánulos y genomas no nucleares (normalmente mitocondriales y plastídicos o de agentes infecciosos)

EFECTO MATERNO: es la influencia de mRNAs maternos que se almacenan en el citoplasma en el momento de formación del óvulo… es la influencia del genotipo materno sobre el fenotipo de la descendencia

En general es el resultado de la contribución asimétrica del progenitor femenino en el desarrollo del cigoto. Recordemos que el espermatozoide solo aporta núcleo. Los fenotipos determinados por efecto materno suelen ser de herencia uniparental. Además como las mitocondrias solo las aporta la madre, la herencia citoplásmica en animales superiores es también generalmente uniparental femenina.

El resultado de los cruzamientos recíprocos es diferente cuando la herencia es no nuclear. Es así que los cruzamientos recíprocos son la prueba clave para determinar el tipo de herencia!

Efecto materno: pigmentación de las polillas

El modelo es Ephestia kuniella. Tiene en su núcleo una serie de genes. A produce quinurenina, un precursor de un pigmento. En el tipo salvaje, las larvas son pigmentadas y los ojos son marrones.
Cuando tenemos el tipo mutante, aa, las larvas no son pigmentadas porque no se produce el precursor y los ojos son rojos. Lo que se ve es que en los cruzamientos recíprocos al cruzar un macho Aa y una hembra aa se obtiene una descendencia la mitad heterocigotos y la mitad homocigotos recesivos.

Pero cuando cruzamos un macho aa con una hembra Aa, el fenotipo es que en la fase juvenil larvaria es que todas las larvas están pigmentadas. Eso se debe a que la hembra está contribuyendo en su citoplasma con mRNA dominante del precursor del pigmento. Cuando continúa la madurez ahora sí los individuos son la mitad con ojos marrones y la mitad con ojos rojos.

Casos de estos se han visto en muchos muchos muchísimos organismos. Pero en muchos es totalmente transitorio debido a que la larva continúa su desarrollo, agota lo que tiene en el citoplasma materno y luego toma ya sí el fenotipo de determinación nuclear.

Otro super clásico es el caso de la orientación de la concha en los caracoles. En ese caso en concreto, la descendencia tiene la orientación del genotipo materno. Nos fijamos en el primer cruzamiento. La concha de la hembra es dextrógira +/+ mientras que el macho es levógiro s/s. En el segundo cruzamiento se hace el recíproco, entre un macho +/+ y una hembra s/s. El primer cruzamiento da lugar a una descendencia heterocigota +/s y todas las conchas son dextrógiras. Pero en el segundo cruzamiento, los descendientes heterocigotos +/s tienen conchas levógiras como su madre. Es así que evidentemente algún gen en el desarrollo que determinó las direcciones de las divisiones celulares en la segmentación embrionaria fue aportado por mRNA maternos que tenían el fenotipo materno. Es de notar que en este caso la herencia continua debido a que su influencia fue en la morfogénesis. Pero como decíamos antes, generalmente esto no es así y el fenotipo materno se acaba cuando la larva ya se desarrolla como adulta.

Estos cruzamientos son las formas más fáciles de detectar si la herencia es mendeliana o no mendeliana.

Herencia citoplasmática y Herencia infectiva de la madre

La herencia citoplásmica es la herencia organular. La herencia infectiva es la herencia de bacterias-agentes infecciosos que tenía la madre en sus óvulos y que siguen después de la fecundación y el cruzamiento.

Los genomas mitocondriales ya se conocen, pero es desde hace poco que se han podido conseguir. El problema central era de aislar mitocondrias y cloroplastos y aislar en concreto su DNA.

Al principio no se sabía por qué al realizar los cruzamientos recíprocos no se obtienen los mismos resultdos. Se vió en mutantes de crecimiento lento tipo poky de Neurospora crassa. Carecen de citocromo A y B y tienen un exceso de citocromo C. Los experimentos en su época eran cruces recíprocos. Cuando cruzaban hembras poky con machos silvestres, toda la descendencia era poky. Pero cuando cruzaban hembras silvestres con machos poky la descendencia era toda silvestre. Efectivamente había una herencia uniparental materna debida al citoplasma. Si estos individuos con esa deficiencia además nosotros al hacer los cruzamientos usamos genes nucleares, cuando observamos la descendencia es que los genes nucleares presentan una descendencia mendeliana. La única diferencia es que los genes del orgánulo mitocondrial fueran diferentes. Esto normalmente se lo suele llamar descendencia uniparental dado que predomina uno de los dos parentales.

Hay muchos ejemplos y de estos en muchos organismos. Pero los más estudiados fueron en Hongos y Levaduras, sobre todo por su facilidad a la hora de cultivos. Tenemos casos por ejemplo en la levadura del pan. Las deficiencias-diferencias están relacionados con genes de resistencia o no a Eritromicina. El cruzamiento planteado es un núcleo haploide que tiene en el núcleo el alelo A que es mitocondrial-EryR, con un núcleo haploide a y que tiene el gen mitocondrial sensible a Erytromycin. Lo primero que ocurre es que los núcleos se fusionan y se produce un heteroplasmonte o heterocarionte. Los núcleos se fusionan dando lugar a un núcleo 2n con sus marcadores A y a. Pero en el citoplasma las mitocondrias no se fusionan. Así tendremos mitocondrias EryR y mitocondrias EryS. Cuando las tenemos juntas en un mismo citoplasma se denomina HETEROPLASMIA (citoplasmas y orgánulos de dos orígenes diferentes). HOMOPLASMIA es que todas las mitocondrias del citoplasma son iguales.

En ese caso, lo que ocurría es que ese heteroplasmonte, antes de comenzar las meiosis produce una proliferación mitótica. En ella las mitocondrias se van repartiendo dando lugar a diploides homoplásmicos. Una vez producida ya comienza la meiosis y se forman 4 ascas. Pero se vió que aunque se parte de un núcleo heterocigoto y un citoplasma heteroplástico, desde el punto de vista nuclear la segregación es normal. Se forman ascas A y ascas a. Pero la segregación mitocondrial es parental. Las mitocondrias se van junto con los núcleos con los que antes estaban. Es decir que las ascas A se quedan con las EryR y las ascas a se quedan con las EryS. Muy pocas ascas terminan con genes mitocondriales no correspondientes.

Pero sí puede haber recombinación entre genes mitocondriales cuando mezclamos mitocondrias en el heterocarionte.

Si hacemos el mismo experimento, pero ahora usamos dos marcadores mitocondriales, ery y spi, vemos que se forman ascas que son recombinantes. Las mitocondrias así se agrupan mayormente entre los fenotipos parentales, pero algunas se “equivocan” y recombinan apareciendo ascas que mitocondrialmente son eryR-spiS y ascas que mitocondrialmente son eryS-spiR.

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FALTA CUARTO DE HORA

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HERENCIA MITOCONDRIAL

Las mitocondrias se heredan siempre por la vía materna aunque existen excepciones. En ratón se vió que una de cada mil mitocondrias es de origen paterno. Hay casos en que eso ocurre pero el heterocigoto luego tiene capacidad de eliminar las mitocondrias paternas quedándose en todos los casos siempre con la madre. En algunos casos las mitocondrias que se transmiten son las paternas (Sequoia spp). En el mejillón la herencia es biparental (como el resto de la herencia normal). Pero todas son excepciones a lo que es “normal”, que la madre aporte las mitocondrias.

En el caso humano, lógicamente una de las cosas que siempre se estudia mucho es si hay síndromes asociados a deficiencias en el DNA mitocondrial. Se vienen estudiando desde hace mucho tiempo. ¿Desde cuándo se pensó que podía haber herencia mitocondrial de enferemedades? Desde 1988 se vio esto en humanos. Wallace describe la Atrofia óptica de Leber y se estudió que había sustituciones de unas bases por otras en 3 sitios del DNA mitocondrial. En esas tres mutaciones sustitucionales puntuales en el nucleótido 3460, el 11778 y 14484 estaba la clave (1994). Otras mutaciones en el DNAmt… deleciones senicllas, múltiples, duplicaciones, deleciones y duplicaciones. Es decir que se comporta como cualquier molécula de DNA. Hoy en día se conocen muchas más enfermedades relacionadas con las mitocondrias humanas. Un tipo de Diabaetes melitus ocurre por este mismo fallo. Fallos endocrinos, Miopatías, cardiopatías hipertróficas… Hay muchas conocidas hoy en día.

Al ir avanzando las técnicas moleculares se han conseguido muchas secuencias de DNAmt (mitomapa o mitoma). Se tienen muy bien localizados prácticamente donde están todos los genes que no son realmente todos los que necesitan para cumplir sus funciones, pero sí que tiene algunos de los más importantes.

Una cosa interesante es que no todas las mitocondrias tienen el mismo tamaño. Los mitomas de los diferentes organismos han ido evolucionando junto a estos y presentan tamaños distintos.

Se piensa que las mitocondrias provienen de una bacteria (endosimbiosis). Hay una gran complementariedad entre el DNA de Rickettsia prowazekii y los DNAmt de la mayor parte de las mitocondrias animales.

En humano se sabe que tiene un tamaño no demasiado grande comparado con el tamaño del genoma nuclear. Tiene unas 16kb y es lógicamente circular. Contiene un pequeño número de genes distribuidos entre la cadena H y la L. En el mitomapa se sitúan los 37 genes. 13 genes son de mRNAs y por tanto 13 proteínas. Cada una de las cadenas presenta un peso diferente (dependiendo de la cantidad de G+C de CADA CADENA por separado). La cadena L pesa 5 megadaltons y la H 5,17 megadaltons y es la que codifica 12 de las 13 proteínas.

El resto de información son 22 tRNAs y 2 genes que codifican para rRNA mitocondrial. Los tRNA están repartidos, 14 en la H y 8 en la cadena L. El rRNA está todo él en la H.

Es bastante curioso que las dos cadenas, tanto la H (heavy) como la L (Light) codifiquen para tantas cosas.

Cada cadena tiene su propio origen de replicación y de transcripción. La zona de DNA circular conocida como D-loop o lazo D, aloja el origen de replicación de la cadena H, el origen de transcripción de la cadena H y el origen de transcripción de la cadena L. El mecanismo de replicación ya lo vimos. Cuando la replicación de la cadena H llega a un cierto punto (el origen de replicación L) comienza recién ahí a replicarse la cadena L.

En las mitocondrias, cuando se analizó la proteómica de su expresión… se vio que los codones del DNA mitocondrial eran diferentes de los codones del DNA nuclear. Mientras que UGA era STOP en el DNA nuclear, era Triptófano en mitocondrias. Esto puso en entredicho lo típico del CODIGO GENETICO UNIVERSAL. El tema es que realmente no hay nada “universal”. Siempre hay cosas que son las que ocurren normalmente y luego están las excepciones. Es decir que las mitocondrias es un ejemplo en el que el código genético se ve diferentemente.

Estudios evolutivos sobre el DNAmt

Está relacionada con muchas cosas vistas. La molécula se usa mucho actualmente para estudios evolutivos. Hace mucho tiempo la morfometría se usaba para los árboles filogenéticos. Pero con el estudio de genética molecular permite elaborar filogenias con el DNAmt muy precisas. Qué ventajas tiene? Lo vimos en algunos de los seminarios. Es una molécula relativamente pequeña en comparación con el DNA nuclear y es más fácil de secuenciar. Es bastante abundante en la célula con lo cual se purifica bastante bien y de una forma sencilla.

Una cosa interesante es que como DNA que es, independientemente de su procedencia podemos usarlo como el nuclear, hacer PCR, hacer digestiones, etc. La manipulación de ese DNA es igual… blots, etc. Solo que es más manejable. Además tiene una tasa de mutación bastante mayor. Se hereda de un solo parental en los animales con lo cual al haber menos recombinación se dificulta menos el estudio filogenético. Con todo esto, se usa para filogenética.

El que se estudie el DNA nuclear o mitocondrial es interesante pero realmente no se ha visto que aporte una revolución al mundo de la filogenia. Lo que se hacía hace tiempo se corrobora a lo largo del tiempo. Es decir que no todo se ha hecho tan mal como para que estas técnicas ahora vengan y pongan todo patas para arriba.

Uno puede secuenciar y comparar DNA pero también se puede hacer amplificación de determinadas secuencias (los genes de los citocromos son los que más se usan) y se comparan esas secuencias. Con programas informáticos nos permiten construir árboles filogenéticos de los citocromos para los grupos estudiados. Hace unos años el estudio de poblaciones humanas llegó a lo que sería un árbol filogenético en la base de la cual estaría la Eva mitocondrial (la mitocondria madre de todos nosotros) a partir de la cual surgirían diferencias, etc. Sin embargo, muchas poblaciones recientemente encontradas en África están muy relacionadas con la base del árbol. Es decir que conservaron más proximidad en su secuencia mitocondrial con la secuencia ancestral.

HERENCIA CITOPLASMÁTICA MEDIADA POR CLOROPLASTOS

Hay muchos ejemplos clásicos. Uno de los más conocidos es en Chlamydomonas. Lo vimos para la segregación mendeliana de la herencia. Son organismos haploides que en un momento determinado constituyen un individuo fusionado, un zigoto 2n. El sexo no lo tienen como tal pero sí tiene cada una un tipo de apareamiento. Solo pueden aparearse mat+ con mat-. Para que se produzca el heterocigoto correctamente deben aparearse así. Luego el cigoto hace meiosis y da lugar a las esporas que serán, la mitad mat+ y la mitad mat-. Pero se puede hacer un estudio analizando además un segundo loci que codifica para la resistencia a streptomicina. Aunque no hay sexo masculino y femenino, se puede pensar en una asociación de un determinado tipo de apareamiento con un sexo. Así, los cruzamientos que se hacían entre un resistente mat+ y un sensible mat- la descendencia era toda resistente. Cuando se cruzaban resistentes mat- y sensibles mat +, todos los descendientes eran sensibles. Es decir que el mat+ era el que donaba el gen de resistencia. Se vio que lo que mat+ aportaba eran los cloroplastos (cuyo DNA contenía el dichoso gen de la resistencia). Además se sabía ya de antes que el DNAmt también se heredaba de forma uniparental. Es decir que tanto el DNAcp como el DNAmt se heredan de forma uniparental, pero de forma diferente. El que predomina para las mitocondrias es mat- mientras que el que aporta los cloroplastos es el mat+.

En plantas se estudió el fenotipo de plantas analizando la pigmentación de las partes masculinas y femeninas. Cuando el huevo femenino era verde, la descendencia era verde. Cuando el huevo era blanco las partes salían todas blancas (ambos casos de homoplasmia). Cuando la planta era un variegado podían darse plantas con partes blancas, partes verdes y partes variegadas también. Lo que ocurría es que el DNA de los cloroplastos se replica y al segregar a las células, dependiendo de cómo se produzca esa segregación podemos encontrar o zonas con un solo tipo de cloroplastos o zonas en que coexisten ambos tipos de cloroplastos. El fenotipo variegado se debía a los dos tipos de cloroplastos.

El DNA de cloroplastos está bastante menos estudiado. Así como el de las mitocondrias se estudió mucho, el de los cloroplastos es bastante más difícil. Sobre todo porque en plantas es difícil estudiar porque hay tanto mitocondrias como clorplastos. Además que cuando se extrae DNA

Hay una gran variación en cuanto al DNA nuclear. Hay bastantes moléculas de DNA dentro del cloroplasto. Tiene genes que codifican para proteínas. También hay dos cadenas que ambas son capaces de transcribir (cosa que ocurría también en mitocondrias). Lo interesante es que además de tener 4 rRNA y 30 tRNA tiene 50 proteínas entre las que hay una RNA polimerasa y proteínas ribos´moicas además de las proteínas de los tilacoides. Presentan secuencias repetidas, presentan intrones, splicing en genes, etc. Eso es muy curioso.

TEORIA ENDOSIMBIOTICA

Los cloroplastos y las mitocondrias son similares en muchos aspectos. LA teoría simbiótica postula que las mitocondrias y cloroplastos en algún momento fueron bacterias de vida libre que se transformaron en endosimbiontes de las células eucarióticas primitivas. Lee Margoulis fue buscando pruebas y evidencias de que tanto cloroplastos como mitocondrias tenían genomas similares a los de bacterias. En algún momento determinado entraron en el hospedador eucarionte primitivo y en ellas hicieron su papel y se quedaron. El hecho de que se tengan cloroplastos y mitocondrias.

Los cloroplastos y mitocondrias tienen organización mucho más similar a la de bacterias. Los ribosomas se parecen mucho más a los ribosomas bacterianos. Antibióticos que inhiben la síntesis proteica en las bacterias también inhibe la síntesis de proteínas en mitocondrias y cloroplastos pero no la síntesis nuclear. Es decir que la idea es que vendrían de alguna bacterias, en concreto se piensa que de una alfa-proteobacteria muy similar a una Rickettsia. Las mitocondrias de la células eucariota vegetal sin embargo son bastante diferentes. El tema es muy apasionante pero nadie nos contó demasiado sobre la teoría endosimbiótica en los seminarios, así que dejaremos el tema por ahora.

HERENCIA INFECCIOSA

Si la madre tiene un virus o alguna infección de algún patógeno, podría ser que ese patógeno atravesara la barrera placentaria y llegase al descendiente.

Un ejemplo clásico es el de los paramecios. Los paramecios presentan dos tipos de núcleos: macronúcleo (funciones vegetativas) y micronúcleo (funciones sexuales - determina su condición de reproducción). Es poliploide. Los paramecios presentan dos tipos de reorganizaciones nucleares: la conjugación y la autogamia.

Conjugación de Paramecios

Los paramecios se unen y se establece un puente (similar a un Pili) entre las dos bacterias. El macronúcleo de cada parmecio se degradará y se perderá con lo cual nos quedamos solo con los micronúcleos 2n. El paso siguiente es que ocurre una meiosis de los micronúcleos. Por cada uno obtendremos 4 productos haploides. Con lo cual al final lo que se tendrá son 8 núcleos haploides. Siete núcleos se desintegran y queda uno por paramecio. Posteriormente, ese micronúcleo haploide que queda sufre una mitosis. En ese momento, en cada uno de los paramecios pasaremos a tener dos micronúcleos haploides. Una cosa que puede producirse es que uno de los micronúcleos se intercambia de cada paramecio. Lo que se tiene al final es un micronúcleo N de un paramecio y un micronúcleo n del otro paramecio. Con marcadores genéticos nucleares, veríamos un micronúcleo con un gen y un micronúcleo con el alelo del compañero. Es así que podrían darse situaciones de heterocigosis. Posteriormente los paramecios se separan y los micronúcleos se fusionan creándose ahora un núcleo 2n. Desde el punto de vista genético, ese núcleo es heterocigoto. Se producen a continuación 2 mitosis generándose 4 micronúcleos 2n heterocigotos. Al final dos permanecen independientes y 2 forman macronúcleos. Cada paramecio que conjugó ahora se divide, pero solo replican los micronúcleos, los macronúcleos solo se separan. De modo que nos quedan ahora 4 descendientes de la conjugación cada uno con 2 micronúcleos (uno de cada “padre”) y 1 macronúcleo.

Autogamia en Paramecios

Los macronúcleos se rompen otra vez y los micronúcleos hacen meiosis dándo lugar a 8 micronúcleos haploides tal y como antes. 7 se joden y 1 persiste. Se da una mitosis, luego los núcleos se fusionan en uno y ese núcleo heterocigoto 2n ahora hace 2 mitosis más dando lugar a 4 micronúcleos 2n. Dos se hacen macronúcleos y 2 se hacen micronúcleos. El Paramecio se separa y otra vez solo replican los micronúcleos. El resultado es que por cada padre se forman 2 paramecios, cada uno con un macronúcleo derivado de uno de los micronúcleos de la meiosis y dos micronúcleos.

Paramecios asesinos

Tenían la particularidad de que cuando se producía la congujación con otro, podían liberar paramecina, una sustancia capaz de producirle la muerte al otro paramecio. Al descubrirse esto se investigó el fenómeno.

En el proceso de conjugación hay un intercambio de núcleos, pero puede existir o no intercambio de citoplasma. Si ponemos dos paramecios a conjugar, puede que compartan solo núcleos, pero podría ser que la unión perdurara algo más en el tiempo y compartieran también citoplasma.

Los paramecios asesinos, para matar, siempre debían intercambiar material citoplasmático. En los casos en que esto se daba toda la descendencia también era de tipo killer. Debía haber algo en el citoplasma que estaba induciendo a que los fenotipos que se estaban produciendo fueran así. Se vio que las particulas kappa eran las responsables, unas particulas densas a microscopía electrónica. Esas partículas kappa al final se identificaron como bacterias. Sin embargo, en muchos casos se confirmaron cosas muy raras. Normalmente cuando no había intercambio de material la mitad de los descendientes eran killer y la mitad normales. Cuando había intercambio todos eran killer.

Pero lo que se veía ahora es que cuando no había intercambio, algunos de los descendientes de killer eran normales. Además la proporción era 1:1. Una proporción 1:1 nos daba una idea de una segregación nuclear más que una segregación citoplasmática. Se repitió todo muchas veces y se apunto la posibilidad de que algo nuclear debía ocurrir al tiempo que la herencia citoplasmática. Se vio que se comprobaba. Pero además se vio que para que la bacteria pudiera mantener a kappa, el núcleo debía ser K_. Lo que teníamos era un citoplasmática pero que dependía del núcleo. Para que se produjera la conversión de un paramecio normal a uno asesino, debía existir el gen K dentro del paramecio normal para que pudiera mantener las kappa. Evidentemente la cepa usada en los últimos experimentos era recesiva doble para el alelo K de manera que no saba pie a que se pudiera producir la conersión.

Hoy se sabe que es una bacteria de la especie Caedobacter taeniospiralis. Últimamente no se sabe si lo que produce la sustancia que mata a los paramecios es la bacteria kappa o algún fago que está metido en la bacteria. De hecho hay como dos cepas de bacterias, una llamada N que no confiere especificidad asesina a las células que infecta (pero que puede ser infectable por un fago que la convierte a la forma B) y la llamada forma B que sí es asesina.

INFECCION POR WOLBACHIA

Wolbachia podría ser la superestrella de aquí en unos años. Tiene una herencia citoplasmática y unos efectos muy curiosos. Se conoce desde hace mucho, pero recién desde los 70 que empezó a estudiarse en serio.

Se descubrió porque aproximadamente en los 50 se estaban haciendo cruzamientos de mosquito y que cuando se hacían recíprocos no se obtenían los resultados esperables. Esto podía deberse a elementos P, a una herencia citoplasmática, a herencia ligada al sexo, etc. Pero lo cierto es que pasaron 20 años para que dos personas apuntaran la posibilidad de que lo que ocurría es que en los cruzamientos mediaba una bacteria, Wolbachia. Es una alfa-proteobacteria del grupo de las Rickettsiales. Es un endoparásito obligado que no puede crecer en cultivo. Se vio en artrópodos pero también en nematodos. Hasta la fecha en humanos no se vio. Hay diferentes cepas de la bacteria, cepa A, B, … Infecta a la línea germinal de los individuos. Sigue un patrón de herencia materna e induce alteraciones reproductivas en su huésped. Qué tipo se pueden dar? Partenogénesis inductiva (las hembras infectadas se reproducen asexualmente), muerte selectiva de los machos (machos infectados mueren), feminización de los machos (los machos infectados se harían hembras funcionales. Se daba el problema de la incompatibilidad citoplasmática que afectaba sobre todo a los cruzamientos. Si los machos están infectados y la hembra no, hay problemas reproductivos (número limitado de descendientes). En el recíproco, una hembra infectada con un macho no da todos normales.

Macho A x Hembra B - no descendencia

Macho A x Hembra A - descendencia normal

Macho B x Hembra A - descendencia normal

Macho B x Hembra B - descendencia normal

En lo de herencia con incompatibilidad citoplasmática se estudió y vio muchísimo. En las especies con IC completa no se produce descendencia viable alguna, mientras que en las especies con CI parcial se produce una descendencia viable de número muy limitado.

Si el macho está infectado y la hembra no, no hay descendencia (incompatibilidad unidireccional). Si el macho está infectado con la cepa A y la hembra con la cepa B, la incompatibilidad se da en ambas direcciones (incompatibilidad bidireccional)… no solo A no es compatible con B sino que B es incompatible con A de forma que tampoco hay descendencia.

Donde más se estudió Wolbachia hasta ahora es en las Nasonia vitripennis, una avispa que prácticamente no se ve. Es una avispa que se alimenta de huevos de otros organismos. Es milimétrica. En este caso además, la IC puede producir el efecto masculinizante sobre los descendientes. Si los huevos son haploides son machos. Si están fecundados son hembras. Cuando se fusionan los dos núcleos, se degrada el genoma paterno y queda solo el genoma materno con lo cual el insecto se queda como haploide (tiene un solo X) y por tanto se convierte en un macho.

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LA GENETICA DE POBLACIONES

Estuvimos viendo un montón de elementos que alteran el genotipo. Pero lo que no vimos casi nada (excepto herencia cuantitativa) es ver todo esto de la relación genotipo-fenotipo desde el punto de vista de complejos de genes, poblaciones.

Hay que cambiar un poco el chip. Ya no se pueden ver los individuos por separado, sino frecuencias fenotípicas, frecuencias genotípicas, y como esas frecuencias van modificándose y caracterizan a una población en concreto.

GENETICA DE POBLACIONES

Es la rama de la genética relacionada con la herencia en un grupo de individuos de una especie que comparten un espacio-tiempo. Estudia la constitución genética de las poblaciones y su cambio de generación en generación.

Tópicos:

• la población

• cambio generacional

La genética de poblaciones surge más o menos simultáneamente al redescubrimiento de las leyes de Mendel. Surge también porque hay teorías evolutivas, principalmente las de Darwin que de alguna forma necesitaban un tratamiento. Estamos en el momento en que había que explicar la caja negra de Darwin.

En ese momento se están estudiando las capacidades de recombinación meiótica en una población. Unos señores se dedican a estudiar estas poblaciones desde el punto de vista mendeliano.

La genética de poblaciones tiene mucho de modelos matemáticos. A partir de ellos se pueden predecir muchos cambios en las poblaciones. Eso es casi seguro lo más importante.

Qué es una población?

Un conjunto de individuos. En el año 1974 se define una población como una comunidad de individuos fértiles entre sí. Es una cosa importante. Lógicamente porque en eso de la fertilidad y la reproducción entra la meiosis y la recombinación. Es decir que una población es un montón de genes, un pool que además debe poder recombinar entre sí.

Wright define las poblaciones como poblaciones mendelianas, una población con individuos fértiles entre sí pero que se cruzan al azar (todos con la misma posibilidad de reproducción entre ellos) y que comparten EL MISMO NUMERO DE GENES. Es decir que los individuos de la población tienen en común el mismo número de genes. Es así que se habla de un pool génico, un grupo de genes que presentan todos los individuos de una población.

Qué es una especie?

Cuando nos fijamos en una población podemos confundirnos con el concepto de especie. Es precisamente algo muy similar. Una población sería un grupo de individuos de una misma especie.

Clásicamente la agrupación de individuos por rasgos tipológicos y morfológicos similares llevó a la creación de un concepto morfológico de especies. Un conjunto de individuos suficientemente parecidos entre sí y suficientemente diferentes de otros. Pero claro… y si tenemos metamorfosis? Digamos que el concepto de especies es difícil de aplicar…

Meir define las especies como grupos que no pueden cruzarse y tener descendencia entre ellos.

Dobzhansky redefine la especie en los años 60… Las especies biológicas son grupos de poblaciones entre los cuales el intercambio de genes en la naturaleza no se puede dar, o si se da, está muy limitado por una serie de mecanismos de aislamiento.

Evidentemente son conceptos muy relacionados con el concepto de genética de poblaciones.

Para poder manejar genética de poblaciones se debe conocer mucho de genética previa. Es así que hay que ver todo lo anterior como para poder explicar lo que ocurre en una población. Es una disciplina complicada de controlar porque se requiere mucho conocimiento de muchas disciplinas.

LAS BASES

La genética de poblaciones estudia precisamente la variabilidad genética generación tras generación en una población. No hay más que mirarnos a nosotros mismos para saber que cada uno de nosotros tiene un carácter diferente y variable. Para cualquier carácter prácticamente todos somos variables en algún punto. Una especie de coleópteros de las más variables descritas en la naturaleza, en algunas zonas, el polimorfismo (variabilidad genética) se fija en algunos sitios… el color de caparazón negro que se fija en la zona de Siberia. Pero en otras poblaciones, más cerca de China, aparecen ya polimorfismos con diferentes patrones de amarillo.

Los polimorfismos nos permiten tener una selección de alelos variable que nos permitan sobrevivir en medios determinados. Si lo que tenemos es una gran variabilidad, podremos adaptarnos como población de una forma mejor a esas posibles condiciones desfavorables que puedan surgir. Esa variabilidad entonces no solo nos permite adaptarnos sino también mantenernos adaptados.

El aumento de variabilidad génica se debe a dos cosas:

• flujo génico: migración de individuos entre poblaciones (el pool génico de una población recibe flujo de otro pool génico)

• mutaciones

En algún momento podríamos pensar que la recombinación aumenta la variabilidad génica. Pero la recombinación no la aumenta… lo que sí que hace es que cada vez los genes puedan recombinarse y surjan nuevos complejos individuales. En resumen, la recombinación permite que exista variabilidad intergénica y no intragénica.

Si todos los individuos son iguales para el gen A, eso quiere decir que todos los individuos de esa población son homocigotos para el gen A. Es una población monomórfica. Esa población en la que todos los individuos son iguales, lógicamente esa población no cambiará con el tiempo… a menos que se den mutaciones o flujo génico. Es decir… a menos que el gen A mute y se originen alelos a o a menos que entren individuos a de otra población nunca tendremos cambios, variabilidad.

En el momento en que el evento de variabilidad se produzca entonces tendremos ahora 3 genotipos distintos. Esa población ahora irá avanzando, evolucionando.

Pero está claro que en una población tenemos muchísimos genes y esos encimas suelen ser multialélicos, multiples loci, etc. Hay mucha intrarrecombinación mitótica, interrecombinación meiótica, etc.

La teoría de Darwin parte de la variación que existe entre organiosmos de una misma especie. Los principios generales de la teoría son:

• principio de la variación

• principio de la herencia

• principio de la selección (alguna selección genética tiene más éxito que otras para sobrevivir y reproducirse en un ambiente dado)

Darwin vio que en conjunto… el proceso evolutivo de especiación en los pinzones de las galápagos se había dado gradualmente. Darwin no sabía nada de genética. Su caja negra era el principio de la herencia… cómo podía ser que los rasgos se heredaran, variaran y pudieran recombinarse? La solución la daría la genética posteriormente como sabemos.

ESTUDIOS DE POLIMORFISMOS

Vimos muchas técnicas que permiten determinar polimorfismos. Se hacen MLEE sobre agarosa. Podemos determinar de todos los individuos cuales son homocigotos, cuales son heterocigotos y cuantificarlos. Cuantificando la variabilidad a nivel poblacional podemos determinar entonces cuán polimórfico es un gen en una población (frecuencia).

Se calculan frecuencias de fenotipos, genotipos y en un caso de mayor resolución frecuencias de alelos. Nosotros hablamos de una población considerándola como algo muy grande. Pero generalmente se recurre a un número lo suficientemente representativo de una población. Así se realizan muestreos (se hace una extracción de una serie de individuos). Cuanto mayor sea N, mayor será el nivel de confianza que podremos dar. Lo ideal sería que la muestra fuera tan grande como la población pero eso es difícil.

Una cosa que también es importante es que cuando elegimos un sistema a analizar como los grupos sanguíneos ABO, cada individuo lleva un solo grupo. Como genotipo la cosa cambia. Un determinado grupo puede tener 2 genotipos disintos. Pero desde el punto de vista del pool genético tenemos 3 alelos, el alelo A, el B y el O. Es así que tenemos que calcular las frecuencias de cada alelo.

CALCULO DE FRECUENCIAS

Imaginamos para un locus determinado que presente dos alelos, al A y el a. Genotipos posibles para encontrar serían el AA, el aa y el Aa. Los individuos observados serían 96 AA, 36 Aa y 2 aa. Es lógico que si la frecuencia AA es 96/134, la frecuencia de Aa será 36/134 y la de aa será 2/134. Una cosa importante es que la suma de esas frecuencias debe dar 1.

Lo que podemos calcular ahora es la frecuencia de los alelos. Cuantos alelos hay en 134 individuos? Hay 268 alelos. Cada individuo homocigoto recesivo representará 2 alelos recesivos. Cada individuo homocigoto dominante representará 2 alelos dominantes. Cada individuo heterocigoto representará 1 alelo de cada tipo.

Es así que si tenemos 96 individuos homocigotos dominantes, 36 heterocigotos y 2 recesivos, tendremos 192+36 alelos dominantes y 36+4 alelos recesivos. Habrá entonces 228 alelos dominantes A en un total de 268 alelos totales. La frecuencia A será 228/268 = 0,85. La frecuencia de a sería de 40/268 = 0,15. También podemos calcularla porque la frecuencia de A y la frecuencia de a sumadas deben dar siempre 1 (tenemos una situación dialélica así que es siempre o uno u otro).

p = f (A) = 0,85

q = f (a) = 0,15

Podemos calcular las frecuencias alélicas a partir de las frecuencias genotípicas. El alelo A está en todos los homocigotos y en la mitad de los heterocigotos.

f (A) = f (AA) . 2 + f (Aa)

f (a) = f (aa) . 2 + f (Aa)

Pero a partir de las frecuencias alélicas también podemos calcular las frecuencias genotípicas esperables.

LOCI CON ALELOS CODOMINANTES

En genética de poblaciones podemos estudiar todos los procesos genéticos aplicándolos siempre al cálculo de las frecuencias. El caso de la codominancia es un ejemplo, pero también podríamos hacerlo para todas las pleiotropías, etc. En este caso lo peculiar es que las frecuencias genotípicas de los 3 casos coinciden con las frecuencias de los 3 fenotipos (el homocigoto dominante, el heterocigoto codominante y el homocigoto recesivo).

LOCI CON ALELOS MULTIPLES

Es otro caso típico. Si consideramos un locus con tres alelos 1, 2, 3 podremos encontrar en la población 6 genotipos. Las frecuencias de los alelos serán p, q y r. Así es que las 3 frecuencias alélicas podrán calcularse a partir de las 6 frecuencias genotípicas. Lógicamente aquí el estudio debería emplear estudios de polimorfismos moleculares y no simplemente un análisis de de inmunoprecipitación (como era para el caso de ABO) para determinar los genotipos y fenotipos.

LOCI LIGADOS AL CROMOSOMA X (genes ligados al sexo)

Por esa condición que tienen, las hembras presentan 2 cromosomas X, el macho solo 1 y lógicamente en el cálculo de las frecuencias debemos tener en cuenta que las hembras contendrán 2 cromosomas X y por lo tanto 2 alelos mientras que los machos solamente llevarán 1 alelo. Es decir que ahora nuestra población debemos separarla en machos dominantes, machos recesivos, hembras homocigotos dominantes, hembras homocigotas recesivas y hembras heterocigóticas.

En este caso entonces la frecuencia de un alelo sería la siguiente:

F (A) = 2 f (XAXA) + f (XAXa) + f (XA)

F (a) = 2 f (XaXa) + f (XAXa) + f (Xa)

LA LEY DE HARDY y WEINBERG

Es una ley clásica en genética de poblaciones. La postularon dos personas por separaron. Hardy, un inglés y Weinberg, un alemán, dieron lugar a un modelo matemático que permite calcular las frecuencias .

Pero no es algo que se pueda cumplir en la naturaleza. Es algo así como la piedra basal para comenzar a pensar lo que ocurre realmente en una población real. Es fundamental en genética de poblaciones. Lo que ve con el modelo es el efecto de la reproducción en las frecuencias genotípicas y alélicas a lo largo de las generaciones.

Supuestos de la Ley:

• la población tiene que ser suficientemente grande

• el apareamiento es al azar entre los individuos que componen la población

• no hay ninguna ventaja selectiva para ninguno de los caracteres de esa población (todos los genotipos tienen igual eficacia biológica)

• no deben ser afectados por mutación, migración o selección natural

Como vemos, es un supuesto difícil de ocurrir en una población natural. Pero la ley se cumple en algunos casos en los que estos supuestos se cumplen.

Podemos predecir que:

• las frecuencias de los alelos permanecen constantes de generación en generación

• las frecuencias genotípicas se estabilizan después de una generación en unas determinadas proporciones

• p2 = f (AA) = f (A) . f (A)

• 2pq = f (Aa) = f (A) . f (a) . 2

• q2 = f (aa) = f (a) . f (a)

• p2 + 2 p q + q2 = 1

• p + q = 1

Una población en equilibrio sera la que tenga estas proporciones en el equilibrio Hardy-Weinberg. Una cosa que es importante es que cuando una población está en ese equilibrio, hay una relación matemática entre las frecuencias genotípicas y las frecuencias alélicas y viceversa. Es decir que en el equilibrio podemos predecir una frecuencia a partir de otras. En base a ella entonces, estudiando una población podemos saber si está en equilibrio o si ese equilibrio está alterado por algo. Así se puede estudiar la dinámica de los genes en esa población, imaginar o predecir cuál está siendo seleccionado, sobre qué genotipos/alelos hay más presión, etc.

Imaginamos una población con las siguientes frecuencias:

p = 0,6 y q = 0,4

Lógicamente la frecuencia de los genotipos podrá deducirse a partir de la ley si suponemos el equilibrio…

p2 = 0,6 . 0,6 = 0,36 = f (AA)

p q = 0,6 . 0,4 = 0,24 = f (Aa)

p q = 0,6 . 0,4 = 0,24 = f (aA)

q2 = 0,4 . 0,4 = 0,16 = f (aa)

0,36 + 0,48 + 0,16 = 1

Si conocemos frecuencias y suponemos el equilibrio entonces la ley nos da mucha información. Si sabemos que la frecuencia de albinos es de 1 en 10000, y sabemos que esos son homocigotos recesivos, entonces podemos saber que q2 = 0,0001 y por lo tanto ya sabemos cuánto es la frecuencia del alelo albino q.

q = 0,01

Pero sabemos por la ley que p + q =1 por lo cual p = 0,99

Pero si ya tenemos las frecuencias de cada alelo entonces ahora podemos calcular la frecuencia de todos los genotipos…

p2 = 0,99 . 0,99 = f (AA) = 0,9801 = frecuencia de homocigotos dominantes

2 p q = 2 . 0,99 . 0,01 = f (Aa) = 0,0198 = frecuencia de heterocigotos

q2 = 0,01 . 0,01 = f (aa) = 0,0001 = frecuencia de albinos

PERO COMO HACEMOS SI TENEMOS 3 ALELOS? - el sistema ABO

En alelos múltiples como en el sistema ABO sabemos que podemos tener 3 tipos de alelos, cada uno con su frecuencia:

p = f (IA)

q = f (IB)

r = f (iO)

La frecuencia genotípica puede calcularse a partir de la ley de Hardy-Weinberg…

f (IA IA) = p2

f (IA iO) = 2 . p . r

f (IB IA) = q2

f (IB iO) = 2 . q . r

f (iO iO) = r2

f (IA IB) = 2 . p . q

La frecuencia fenotípica ahora puede calcularse a partir de los resultados…

f (A) = p2 + 2 p r

f (B) = q2 + 2 q r

f (O) = r2

f (AB) = 2 p q

Sabiendo cuántos individuos O y cuantos individuos B y A tenemos, podríamos calcular el temita…

Imaginemos que sobre 200 individuos 5 son O. Eso sería una frecuencia de 5/200 = 1/40 = 0,025

Es así que r2 = 0,025 por lo que r = 0,05

Pero sabemos que p + q + r = 1 por lo que p + q = 0,95 de forma que p = 0,95 - q

Imaginemos que sobre 200 individuos 10 son B. Eso sería una frecuencia de 10/200 = 0,05

Es así que 0,05 = 2 (0,95 - q) q

Calculamos q y ahora ya tenemos otro valor…

Continuamos haciendo esto hasta que tengamos p y q y finalmente ya tenemos todas las proporciones…

CÓMO HACEMOS CALCULOS EN EL CASO DE GENES LIGADOS AL SEXO?

Si la frecuencia de un alelo es q, la frecuencia genotípica en macho será q y en hembras q2. La relación entre una y otra será 1/q. Cuanto más pequeño sea q mayor será la relación entre machos y hembras que muestran el fenotipo recesivo. Cuanto mayor sea q, muchos más machos que hembras padecerán del alelo recesivo.

LOS PROBLEMAS DE LAS SUPOSICIONES DE HARDY y WEINBERG

Ya desde el supuesto de la panmixia (cruzamientos todos al azar) tenemos unos problemas. Además, suponer que en una población natural la selección natural no actúa es virtualmente imposible. El caso de las migraciones es otro imposible. Es más… dijimos que la dinámica de poblaciones precisamente estaba reflejada a partir de las mutaciones Y LOS FLUJOS GENICOS.

APAREAMIENTO NO ALEATORIO: ENDOGAMIA

El apareamiento no es aleatorio en una población. Eso quiere decir que hay unos genes, unos alelos, que se prefieran sobre otros. La endogamia es el apareamiento preferente entre individuos que están relacionados. La endogamia aumenta la frecuencia de homocigotos y disminuye la población de heterocigotos. Una población con muchos homocigotos todos igualitos se denominan poblaciones endogámicas (se supone que la endogamia ha tenido un papel importante). Una población de todos individuos heterocigotos, después de una generación ya tiene la mitad de homocigotos (AA o aa) y la mitad de heterocigotos (Aa o aA). Pero ahora, los homocigotos irán también reproduciéndose y generando cada vez más homocigotos.

El coeficiente de endogamia (F) se calcula haciendo la diferencia entre la Heterocigosis esperada según Hardy-Weinberg (es decir 2 p q) y el número real de heterocigotos en la población partido todo por 2pq.

F es una forma de medir la probabilidad de que dos alelos sean “idénticos por ascendencia”. Un individuo homocigoto podría serlo porque recibió el mismo alelo a partir de un solo tronco (tronco común) o porque recibió el mismo alelo a partir de dos troncos. El verdadero que está indicando la endogamia es el caso de alelos idénticos por ascendencia y no el caso de idénticos por estado.

Los coeficientes varían de 0 a 1. El 0 indica que la reproducción es al azar. Está claro… si Hesp = Hobs entonces He-Ho = 0 y por lo tanto F será 0. Estaríamos en un equilibrio de Hardy-Weinberg.

El valor 1 indica que los alelos de la población son todos idénticos por ascendencia.

El que haya endogamia altera las frecuencias!

f (AA) = p2 + F p q (se están ganando homocigotos, tantos como endogamia esté habiendo)

f (Aa) = 2 p q - 2 F p q (se están perdiendo heterocigotos, tantos como endogamia esté habiendo)

f (aa) = q2 + F p q (se están ganando homocigotos, tanto como endogamia esté habiendo)

De donde salen esas frecuencias alteradas?

Fe = He - Ho / He siendo He = 2pq

He . F = He - Ho y ahora debemos despejar Ho

He - He . F = Ho He (1-F) = Ho

2pq - 2Fpq = Ho = f (Aa)

En una población dada p (frecuencia del alelo A) = f (AA) + ½ Ho

f (AA) = p - ½ Ho

Pero Ho = 2pq - 2Fpq

f (AA) = p - ½ (2pq - 2Fpq)

f (AA) = p - pq + Fpq pero q = 1-p

f (AA) = p - p (1-p) + Fpq

f (AA) = p - p + p2 + Fpq

f (AA) = p2 + Fpq

f (AA) = p - ½ Ho

Para q se hace el mismo desarrollo….

f (aa) = q - ½ Ho

Pero Ho = 2pq - 2Fpq

f (aa) = q - ½ (2pq - 2Fpq)

f (aa) = q - pq + Fpq pero p = 1-q

f (aa) = q - q (1-q) + Fpq

f (aa) = q - q + q2 + Fpq

f (aa) = q2 + Fpq

Veamos un ejemplo

q = 0,01 y p = 0,99

Si F=0; f (aa) = q2 = 0,012 = 0,0001. Solo 1 de cada 10000 tendrá la enfermedad…

Si F=0,25; f (aa) = q2 + Fpq = 0,012 + 0,25 . 0,01 . 0,99 = 0,0026. Ahora 26 de cada 10000 tendrá la enfermedad

La aparición aumentada de rasgos letales o deletéreos debidos a la endogamia se denomina DEPRESION POR ENDOGAMIA (eliminación de individuos debida a la endogamia).

Otra cosa que altera la Ley es la siguiente…

CAMBIOS ES LAS FRECUENCIAS ALELICAS POR MUTACION

El alelo G1 tiene una incidencia de 45 copias (p = 0,9) y el otro es G2 que existe en 5 copias (q = 0,1). Si hay mutación directa, entonces alguno de los 45 podría transformarse en G2 y por lo tanto p habrá disminuido en beneficio de la frecuencia de q. Con que solo ocurra una vez esa mutación, en una generación ahora p = 0,88 y q = 0,12. Es decir que las frecuencias varían, la ley no se cumple.

De qué depende todo esto?

Por un lado dependerá lógicamente de la tasa de mutación de esos alelos. Y la otra será la tasa de reversión, porque la mutación inversa lógicamente hará que reviertan los mutantes G2. La otra cosa que está interviniendo es la frecuencia de los alelos G1. Es decir… si la frecuencia de mutación es µ y la frecuencia de G1 es p, entonces podemos calcular la variación en q. Si la tasa de reversión es  y la frecuencia de G2 es q, entonces…

q = p . µ

p = q . 

ALTERACIONES DEL EQUILIBRIO HARDY-WEINBERG POR MIGRACION

Imaginamos que tenemos dos poblaciones de las que conocemos sus frecuencias alélicas previas al evento de migración. En una de ellas tenemos p1 y en la otra p2 para los alelos dominantes. Para los recesivos tenemos q1 y q2. Si se da una migración desde la población 1 a la población 2. Imaginamos que una serie de esos alelos se trasladan y son capaces encima de reproducirse y recombinarse con los otros individuos. Lógicamente si no hay descendencia no pasa nada. Si tenemos la migración de esos individuos, lógicamente obtendremos una población combinada de la población 2 y los migrantes que han ido desde la población 1. Así podemos establecer un factor de migración (m) que es fácilmente calculable. Solo con saber el número de inmigrantes en la población nueva podemos saber cuál es m (número de migrantes sobre el total de individuos de las población 2 después del evento de la migración). Los residentes de la población 2 será 1 - m (lógico…). Conclusión: la frecuencia del alelo a en la población 2 después de la migración será

q2' = q1 m1-2 + q2 (1-m1-2)

q = m1-2 (q1 - q2)

OTRO FACTOR QUE AFECTA A LA FRECUENCIA - LA DERIVA GENETICA

Las poblaciones son finitas. En una población, ciertos alelos raros pueden ponerse de manifiesto y ser comunes. Generalmente se denominan “errores de muestreo poblacional”. Es lo típico de que esperás al tirar una moneda al aire la f(cara) = f (cruz) = 50%

Pero eso se ve solo con muchos muchos lanzamientos (poblaciones grandes).

Pero en pocos lanzamientos habrá un sesgo (poblaciones pequeñas).

El error de muestreo puede hacer que la frecuencia esperada no sea la observada.

En la deriva, como la población no es infinita, el azar produzca poblaciones con frecuencias no iguales a las esperables. Si se sigue una frecuencia alélica durante 20 generaciones en una población de tamaño reducido se ve que desde la generación 0 que tiene una cierta frecuencia, hasta 20 generaciones, la frecuencia puede terminar en cualquier lado. La diferencia entre las dos gráficas es que en la de arriba (mucho más derivada) tenemos 2N = 18 mientras que en la de abajo tenemos 2N = 100. En una población mucho mayor, la deriva, aunque errática no se pira demasiado. Fischer lo denominó deriva genética porque realmente la frecuencia va “navegando” por un espacio de combinaciones numéricas posibles y es un proceso azaroso, como la deriva de un barco en alta mar. El tamaño de la población es entonces lo crucial.

El efecto cuello de botella

Se puede tener una población heterogénea en los genotipos. Pero por diversas perturbaciones morir gran cantidad de individuos quedando una población muy pequeña con unos ciertos alelos representados. A partir de ahí la población crecerá pero por la gran deriva genética que presentará esa población, las frecuencias podrán variar muchísimo e incluso muchos genotipos, muchos alelos desaparecerán.

El efecto fundador.

Es algo parecido, solo que en este caso no hubo una perturbación. Se parte de que la población migra y coloniza un lugar. Al trasladarse una serie de individuos con unos genotipos determinados, lógicamente la población que migró es más pequeña que la población inicial. Esas frecuencias ahora sufrirán un enorme proceso de deriva génica también. El resultado es el mismo que en el cuello de botella.

Es lo que teóricamente produce las radiaciones adaptativas en el momento en que los organismos terrestres colonizan las islas a las que migran.

EL PROCESO DE LA SELECCIÓN NATURAL sobre el equilibrio…

Consiste en la reproducción diferencial de genotipos. Debido a una cierta presión

Realmente ocurre cuando algunos alelos están más adaptados y los individuos que los poseen presentan mayor eficacia biológica. Los individuos que están adaptados y pueden heredar sus rasgos adaptados, lógicamente la frecuencia de esos alelos aumentará en detrimento de los alelos que no proveen adaptación. La selección natural entonces favorece a los individuos capaces de dejar mayor descendencia (dejan mucho más genes para las generaciones venideras).

W es el fitness, el éxito reproductivo relativo de un genotipo. No todos los individuos tienen el mismo W. El que tenga mayor fitness tendrá mayor W y dejará mayor descendencia. Hay una forma de calcularlo que es tomando el número de descendientes producido por un genotipo u otro y lo dividimos por la descendencia producida por el genotipo más prolífico. Así W se varía entre 0 y 1. Una variable relacionada es el coeficiente de selección (s), el complementario. S = 1 - W.

La selección natural actúa durante toda la vida del individuo y existen dos momentos clave donde se eliminan los genes de la población:

• las épocas de reproducción

• las épocas de crecimiento (desarrollo juvenil)

LA HISTORIA DE TRISTAN DA CUNHA

En el otoño de 1993 Noé Zamel, un investigador de Canadá llegó a unas islas del Atlántico Sur que se llaman Tristán Da Cunha (a la altura del pico de Africa pero hacia el Atlántico). Llegó buscando un gen que producía el asma. Los habitantes de la isla tenían la incidencia más alta del mundo de asma. Lo que buscaba era ese gen. Más de la mitad de los isleños son asmáticos. Preguntándole a los isleños pudo seguir el rastro de la historia de los habitantes de la isla. Lo que rastreó fue lo siguiente. William Glass fue un escocés que se trasladó allí con su familia en 1817. Unos náufragos, etc (efecto fundador)

La población permaneció aislada (endogamia) durante mucho tiempo. La famila de Glass y los colonos comenzaron a reproducirse enre sí. En 1855 había unas 100 personas. Pero la población disminuyó después de la muerte de Glass en 1856. En 1857 solo 33 personas permanecían y después la población creció con lentitud (efecto de cuello de botella).

En 1885 un barco pequeño que transportaba a 15 hombres de la isla se ahogaron. La población disminuyó de 106 a 59. En 1961 una erupción volcánica amenazó al poblado principal, pero los rescataron y los llevaron a Inglaterra.
En la actualidad viven unas 300 personas muy religiosas que rezan día y noche porque parece que vivir en la isla es una condena o una maldición…jajaja

Estos isleños tienen muchos genes en común. Esa comunidad presenta más del 50% de incidencia de alelos homocigotos para el asma. Evidentemente no es una población con alelos equilibrados como es esperable.