La replicación del ADN sucede según el modelo semiconservativo de W y C pero el mecanismo molecular implicado es bastante complicado. Dicho mecanismo fue estudiado por un discípulo de Severo Ochoa quien consiguió en 1956 aislar de una bacteria -Escherichia coli- una enzima capaz de fabricar ADN en un tubo de ensayo -ADN polimerasa- y en concreto en esa bacteria encontró tres ADN polimerasas -pol I, pol II y pol III-. Todas tienes las siguientes características:

Podemos distinguir dos fases, desenrollamiento y síntesis de nueva cadena

Desenrollamiento

En la duplicación del ADN la primera en actuar es una enzima -helicasa-, esta enzima desenrolla y abre una zona de la doble hélice. Esta acción crea tensiones en la zona próxima a la apertura. Para liberar estas tensiones actúan otras enzimas -topoisomerasa I y II (girasa)-. Estas enzimas cortan las cadenas de la zona en tensión, permiten que se relajen y las vuelven a unir. Por último a la zona abierta se unen unas proteínas -SSBP- que impiden que esta zona se vuelva a enrollar

Con todos estos pasos se ha conseguido abrir el ADN lo que se denomina burbuja de replicación en la que se distinguen dos horquillas de replicación. En E.coli la burbuja se forma en un punto concreto del ADN que tiene una secuencia determinada de nucleótidos y se denomina ori C.

Síntesis de nuevas cadenas

Se ha comprobado que la duplicación del ADN es bidireccional. A partir de un punto de inicio van copiándose las dos cadenas a la vez de manera que se van a necesitar dos complejos enzimáticos que avancen en las dos direcciones:

Este mecanismo de duplicación plantea dos problemas:

Por tanto durante la duplicación del ADN hay momentos en los que se forman fragmentos híbridos de ADN y ARN - fragmentos de Okazaki- posteriormente se eliminan los trozos de ARN y se rellenan con ADN. De las dos cadenas del ADN hay una que se duplica mas rápido que la otra ya que no precisa de tantos cebadores -cadena líder o conductora- y otra que si precisa de ellos - cadena retardada-. De las tres ADN polimerasas de E.coli la pol III es la que fabrica la mayor parte del ADN, la pol I es la que elimina los cebadores y rellena los huecos y la pol II actúa mas tarde detectando errores que puedan haberse cometido y corrigiéndolos.

En eucariotas el proceso es similar, la duplicación es semiconservativa y bidireccional pero presenta algunas peculiaridades:

• El proceso es mas lento, la duplicación es más lenta ya que el ADN eucariota está unido a proteínas llamadas histonas constituyendo el cromosoma, por tanto, además de duplicar el ADN hay que fabricar las histonas.

• Como el ADN eucariota es muy largo en lugar de un solo punto de origen hay muchos puntos de inicio repartidos a lo largo del cromosoma por ello, en un cromosoma que se esté duplicando se pueden observar al microscopio mas de mil burbujas de replicación.

• Las ADN polimerasas en las células eucariotas son mas complejas y se han descubierto hasta cinco ( pol I-V)

• Como el ADN eucariota es lineal, la hebra retardad perderá un fragmento en cada ciclo de replicación por este motivo, los extremos de los cromosomas (Telómeros) se van acortando en cada división celular. Este mecanismo funciona como una especie de contador que va marcando el envejecimiento de la célula. Sin embargo, existen células que no envejecen nunca, por ejemplo las células madre de la médula ósea, las células embrionarias o las cancerosas (se dividen sin parar). En todas estas células se ha activado una enzima llamada telomerasa que impide que se pierda el extremo del cromosoma.

La telomerasa es una enzima formada por proteínas y ARN. Este ARN no es el que se coloca aportando el extremo 3' para que se pueda duplicar el telómero

La duplicación del ADN es un mecanismo muy complejo en el que intervienen mas de 50 proteínas. Todas ellas están agrupadas formando un enorme complejo enzimático tan grande como un ribosoma, por eso se llama replisoma. Entre estas enzimas del Replisoma se encuentran también enzimas correctoras.

La pol I y la III tienen también cierta capacidad correctora ya que son capaces de “mirar hacia atrás”, comprobar si el nucleótido que han colocado es el correcto y si no lo es colocar el correcto. A pesar de ello suelen cometer errores, uno por cada millón de apareamientos que son detectados por otra enzima que recorre constantemente el ADN buscándolos, cuando encuentra un error, quita el nucleótido y posteriormente la pol I rellena el hueco.

La transcripción consiste en formar una molécula de ARN complementaria a un fragmento de una de las 2 cadenas de ADN. El ARN formado puede ser: ribosómico, transferente o mensajero. La enzima que fabrica este ARN se llama ARN polimerasa. El mecanismo es el siguiente:

La ARN polimerasa detecta la existencia de centros promotores en el ARN. Los centros promotores de ARN son determinadas secuencias de ADN que indican a la ARN polimerasa el lugar y la cadena que debe copiar. Existen diversos tipos de centros promotores pero todos tienen en común lo siguiente:

0 Es el punto de inicio de la transcripción (a partir de aquí empieza a formarse ARN). Todos los promotores tienen en común ciertas secuencias de bases que aparecen en las posiciones -10 y -30.

A menudo, varias ARN polimerasas están transcribiendo diferentes fragmentos de ADN al mismo tiempo. Cuando sucede esto puede observarse al microscopio todo el proceso ya que aparecen cromosomas con aspecto de pluma.

Finalmente tiene lugar el proceso de maduración. En las células procariotas el ARN mensajero no necesita maduración y es leído directamente por los ribosomas. Los ARN ribosómicos y los ARN transferentes si precisan maduración. Esta consiste en realizar algunos cortes y añadir nucleótidos en los extremos

En eucariotas la transcripción presenta las siguientes peculiaridades:

• ARN polimerasa I que produce algunos ARNr (ribosómico)

• ARN polimerasa II produce los ARNm (mensajero)

• ARN polimerasa III produce los ARNt (transferente) y algún ribosómico

• Los promotores son distintos. El mas frecuente es lo que se llama -box TATA- situado en la posición -25




Pero además de que se inicie la transcripción es necesario también que se unan al promotor ciertas proteínas llamadas factores de transcripción

• La terminación o fin de la transcripción es similar a las procariotas, la secuencia mas común que indica fin es la siguiente: TTATTT

Finalmente cuando el ARN mensajero se separa, una enzima añade al extremo 3' una cola de poli adeninas, esto servirá para facilitar el transporte del núcleo al citoplasma. La misma enzima coloca en el extremo 5'una caperuza de

metil - guanosina que sirve para que los ribosomas reconozcan este extremo y se inicie por aquí la síntesis de proteínas.

• En los procariotas los ARN mensajero son policistiónicos, es decir, contienen la información de varios genes y por tanto cuando se traducen dan lugar a varias proteínas.

En eucariotas los ARN mensajero son monocistiónicos, es decir, cuando se traducen dan lugar a una sola proteína pero precisan un proceso de maduración y según se haga este la proteína que se produce será diferente. Da lugar a un solo gen




La maduración consiste en cortar y eliminar ciertas secuencias que se llaman intrones y empalmar las secuencias que quedan llamadas exones. Tras este proceso el ARNm puede ser leído por los ribosomas. Según el orden en el que se hayan unidos los exones la proteína será diferente.

• Traducción en procariotas

La transcripción (fabricación de los ARN) es un proceso en el que no se cambia de idioma ya que convertimos el ADN que son nucleótidos en ARN que sigue siendo nucleótido. La traducción consiste en convertir los ARN en proteínas por lo tanto, hay un cambio de “idioma” ya que tenemos que pasar de nucleótidos a aa. El “diccionario” que utilizaremos para hacer esta traducción es el código genético.

Se conoce con todo detalle como es el proceso de traducción en procariotas y en el podemos distinguir tres fases:

• Iniciación: la traducción se hace siempre en dirección 5'- 3'. El extremo 5' del ARNm contiene un secuencia de nucleótidos que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos del ARNr de la subunidad menor del ribosoma. Por tanto el primer paso será siempre la unión de la subunidad menor de un ribosoma al extremo 5' de un ARNm.




A continuación dicha unidad se mueve en dirección 5'-3' buscando el primer codón AUG que encuentre ya que dicho codón significa inicio de la proteína.

Seguidamente el ribosoma “lee” el codón AUG, en respuesta a esta lectura se acerca una molécula de ARNt que tiene el anticodón correspondiente y que viene cargada con el aa formil-metionina. Todas las proteínas por tanto, empezaran con este aa, lo que sucede es que después suele eliminarse. Una vez se ha colocado bien este ARNt llega la subunidad mayor del ribosoma y se coloca completando el ribosoma, aquí acaba la iniciación aunque en realidad el proceso es mas complejo ya que se necesitan una serie de proteínas que se llaman factores de iniciación.

• Elongación: Dentro de un ribosoma caben 6 nucleótidos, es decir, 2 cadenas de manera que el ribosoma lee ahora el segundo codón y en respuesta a esta lectura se acerca un ARNt con el anticodón y el aa correspondientes. El ribosoma está ahora completo, ya que no cabe más, cuando sucede esto, una enzima llamada peptidil-transferasa forma un enlace peptídico entre los dos aa que han llegado al ribosoma, además se libera el primer ARNt que llegó pero no se lleva el aa porque ha quedado unido mediante un enlace peptídico a otro aa. A continuación el ribosoma avanza 3 nucleótidos sobre el ARNm (dirección 5'-3'), este movimiento se llama translocación y como consecuencia un nuevo codón entra en el ribosoma, el ribosoma lee este nuevo codón y el mismo proceso se repite varias veces.

• Terminación: la terminación sucede cuando entra en el ribosoma alguno de los tres codones que significan fin. Cuando el ribosoma lee alguno de estos tres codones, en lugar de un ARNt quien se introduce en el ribosoma es una proteína llamada factor de liberación, cuando esto sucede se desmontan las dos subunidades del ribosoma y se libera la proteína.

La traducción de una molécula de ARNm puede ser llevada a cabo por varios ribosomas al mismo tiempo formando lo que se llama un polisoma o poli ribosoma.




En las células eucariotas el proceso es similar, aunque los ribosomas utilizados tienen un tamaño mayor.

• REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

• INTRODUCCIÓN

Las células no están constantemente fabricando todas las proteínas para las que tienen información, ya que, sino, el interior de la célula sería un caos. Existen mecanismos que indican que genes y en que momento deben expresarse y originar proteínas, estos se basan en regular la síntesis de ARNm, ya que, si no se fabrica ARNm no se fabrica la proteína y además, los ARNm tienen una vida media muy corta, es decir, se destruyen muy rápidamente. El primer mecanismo de regulación de la expresión génica descubierto fue el denominado modelo del operón.

• OPERÓN LAC

En 1961 Jacob y Manod descubrieron el siguiente modelo de regulación en E. coli. Según este modelo, en el ADN podemos distinguir regiones que comprenden los siguientes genes:




Este conjunto de genes se llama Operón y contiene:

• Genes estructurales: Son aquellos genes cuya expresión queremos regular

• Gen regulador: su expresión da lugar a una proteína que reprime la expresión de los genes estructurales

• Promotor: Lugar del ADN al que debe unirse la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de los genes estructurales (síntesis del ARNm)

• Operador: Zona del ADN situada a continuación del promotor a la que puede unirse la proteína represora bloqueando el paso a la ARN polimerasa

Jacob y Monod estudiaron el operón Lac (lactosa). Este operón regula la síntesis de tres proteínas que son necesarias para que E. coli pueda alimentarse de Lactosa. Estas tres proteínas son:

• Una ß-galactosa que rompe la lactosa dando lugar a glucosa y galactosa.

• Una permeasa que permite transportar la lactosa al interior de la célula.

• Una acetil-transferasa cuya función no esta aun muy bien conocida pero es necesaria.

Cuando E. coli esta viviendo en un medio en el que no hay Lactosa. La proteína represora está unida al operador y el sistema está bloqueado. Cuando aparece la Lactosa, esta se le une a la proteína represora impidiendo que se una al operador con lo que el sistema deja de estar reprimido.

Este tipo de operón que normalmente está reprimido y que deja de estarlo cuando aparece una sustancia se denomina operón inducible.

• OPERÓN TRP

Este operón regula la síntesis de una serie de proteínas necesarias para fabricar el aa triptófano (TRP). El funcionamiento es similar al anterior pero la proteína represora que se fabrica es inactiva. De manera que normalmente el operón no esta reprimido y la bacteria tiene todo lo necesario para fabricar el aa triptófano. Si en el medio en el que vive la bacteria aparece el aa triptófano este se une a la proteína represora activándola con lo cual el sistema pasa a estar reprimido. Por eso este tipo de operón se llama reprimible.

• OTROS MECANISMOS DE REGULACIÓN EN EUCARIOTAS

En eucariotas también se han descubierto formas de regulación semejantes al operón pero además existen otros tipos de regulación mas complicados como son:

• Inactivación del ADN por condensación: en cada célula solo se expresa una pequeña cantidad de los genes que hay en su ADN (aquellos necesarios para que la célula realice las funciones para las que está especializada). El resto de los genes permanecen inactivos porque el ADNB que los contiene esta tan condensado(súper enrollado) que a la ARN polimerasa le es imposible acceder a ellos

• Secuencias intersificadoras: la clave de la regulación en eucariotas se basa en secuencias de ADN denominadas secuencias intersificadoras que si se activan, activan a su vez la transcripción de ciertos genes distribuidos por el ADN. El mecanismo de actuación de ciertas hormonas se basa precisamente en activar dichas secuencias intersificadoras

• MUTACIONES

• Introducción

Las mutaciones son alteraciones del ADN que pueden aparecer de forma espontánea (errores durante la duplicación, reacciones con sustancias naturales de la célula, etc.) o pueden ser provocadas por ciertos compuestos químicos y radiaciones.

Las mutaciones pueden producirse en células somáticas o afectar a los gametos. En el primer caso, no tiene mayor trascendencia salvo que como consecuencia de dicha mutación, la célula se vuelva cancerosa y el individuo muera, pero incluso así, tampoco es muy trascendente porque la mutación no pasa a la siguiente generación. Las mutaciones que afectan a los gametos si son importantes porque esta mutación estará presente en todas las células del nuevo individuo.

Espontáneamente, en la especie humana, se produce una mutación por gametos, por tanto, en cada cigoto habrá dos mutaciones como mínimo. Si consideramos toda la población mundial, en cada generación aparecen millones de mutaciones nuevas. Las mutaciones pueden afectar a fragmentos de cromosomas, a cromosomas enteros o a un solo gen. En el primer caso se llaman mutaciones cromosómicas y en el segundo mutaciones génicas.

2. Mutaciones génicas

Son las mas frecuentes, afectan a un solo gen en su secuencia de nucleótidos y pueden consistir en:

• Sustitución de una base por otra base, estas a su vez se dividen en:

• Transiciones: si se sustituye una base púrica o pirimidínica por otra también púrica o pirimidínica

• Transversiones: si se sustituye una púrica por una pirimidínica o al revés.

Los efectos de este tipo de mutaciones pueden ser muy variados:

• Que no suceda nada (mutación silenciosa) debido a que por ejemplo la mutación a tenido lugar en un intrón o también debido a que la mutación ha originado un nuevo codón pero con el mismo significado




• Que tenga un efecto pero sea poco significativo. Puede ser debido a que al cambiar el codón, el nuevo aa es muy similar al anterior

• Que tenga un efecto importante porque el nuevo aa es muy diferente al anterior lo que hace que la proteína se pliegue mal y su funcionamiento sea defectuoso.

• Un efecto desastroso, muy grave. Si la mutación afecta a un codón que pasa a significar fin de la proteína, con lo cual la proteína se fabrica incompleta. También el caso contrario, que la mutación afecte a la señal de fin o al promotor.

• Pérdida (delecciones) o inserción de nucleótidos, este tipo de mutaciones son siempre graves ya que provocan un desplazamiento en el orden de lectura de los nucleótidos y se alteran todos los codones siguientes a la mutación.

3. Consecuencias

Las mutaciones normalmente suponen una deficiencia, un fallo, e incluso a veces pueden res letales, pero normalmente son recesivas y permanecen ocultas. A veces, puede ocurrir que la mutación mejore un gen porque la proteína que origine sea más eficiente en este caso, los individuos que presentan esta mutación se adaptan mejor al medio ambiente y las posibilidades de llegar a reproducirse son mayores. Después de varias generaciones este nuevo gen mutado puede llegar a sustituir al gen original en la población. Este es el mecanismo de la evolución.

El que una mutación sea ventajosa o no para el individuo depende mayoritariamente del ambiente. Así, mutaciones que pueden pasar desapercibidas se convertirían en ventajosas si el ambiente cambia. Cuanto mayor sea el acervo génico de una población (variedad de genes) mayor será la posibilidad de sobrevivir para dicha población.

• Agente mutágenos

Las mutaciones pueden ser espontáneas o pueden ser provocadas por ciertas sustancias que se llaman agentes mutágenos, entre estos se encuentran:

• Análogos de bases: como por ejemplo: el 5 bromuracilo, esta es una sustancia que se parece a la timina pero que se une a la guanina. Otro ejemplo es la 2 amino purina, una sustancia que se parece a la adenina pero que se une a la citosina.

• Modificadores de bases: como por ejemplo los agentes alquilantes (hidroxilamina). Esta sustancia al reaccionar con ciertas bases, las modifica y provoca apareamientos erróneos.

• Agentes intercalantes: son moléculas planas que imitan pares de bases y son capaces de intercalarse en el ADN provocando inserciones

• Radiaciones: un ejemplo es la radiación ultravioleta. Las radiaciones ultravioletas unen nucleótidos que contengan Pirimidínicas y que estén próximos, estos dímeros de pirimidina no pueden unirse a sus bases complementarias




La principal consecuencia de este daño en el ADN es que cuando se esta duplicando y la ADN polimerasa llega a esta zona no sabe continuar y se para. Si la ADN polimerasa se para y el ADN no se duplica, la célula muere. Para que no suceda esto, en la mayoría de las células existen enzimas foto reactivas (se activan por la luz) que se encargan de romper los dímeros de pirimidina. No obstante, si la radiación ultravioleta es muy intensa, no da tiempo a reparar todos los dímeros de pirimidina. Entonces se pone en marcha un mecanismo especial de reparación que se llama SOS. Este mecanismo introduce en el lugar del dímero dos nucleótidos cualesquiera para que nos se pare la duplicación del ADN. Por tanto, provoca mutaciones cualquier sustancia que ponga en marcha el sistema SOS será también mutagénica.

• GENETICA APLICADA

Actualmente un gen se define como un fragmento de ADN que tiene la información para fabricar un polipéptido. La ingeniería genética es una técnica que permite introducir genes en las células de un individuo que carece de ellos o que los tiene no funcionales. El ADN formado tras la inserción se llama ADN recombinante. Los pasos a seguir son:

• Cortar los ADN (tanto del donante como del receptor) con enzimas especiales llamas endonucleasas de restricción. Estas enzimas reconocen ciertas sustancias y las cortan creando extremos pegajosos:




• Separar los distintos fragmentos obtenidos mediante electroforesis

• Identificar el fragmento del gen que queremos insertar

• Insertar el fragmento deseado en un vector plásmidos o virus

• El vector se encarga de transferirlo al organismo receptor

La inserción de genes en bacterias es relativamente sencilla, los plísmidos y los virus facilitan mucho el trabajo. La inserción en células eucariotas tanto animales como vegetales en mas complicada, en el caso de las células vegetales se han conseguido buenos resultados usando una bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens usada como vector, ya que esta bacteria es capaz de infectar a las células vegetales e inocular el ADN. También se han conseguido buenos resultados uniendo el fragmento de ADN a partículas metálicas y bombardeando el núcleo de la célula. En células animales, se han conseguido buenos resultados con el bombardeo de genes u usando además un tipo de virus como vector como son los retrovirus.

Toso este proceso de ingeniería genética sólo es útil cuando se hace en células embrionarias y en organismos que se reproducen asexualmente. En reproducción sexual se producen mecanismos de recombinación génica de manera que resulta difícil asegurar que la descendencia de un organismo herede el gen inoculado.

• APLICACIONES

• MEDICAS:

• Obtención de vacunas mas eficaces y exentas de riesgos

• Obtención de hormonas humanas

• Diagnostico de enfermedades genéticas

• Terapia génica: introducir genes en enfermos que poseen un gen defectuoso o que carecen de él. Sólo tiene sentido cuando el gen se expresa en una célula que se reproduce activamente en el cuerpo humano, como las células madre de la medula ósea

• INDUSTRIALES:

• Producción masiva de antibiótico

• Obtención de microorganismos capaces de degradar residuos tóxicos

• Obtención de plantas transgénicas que sean resistentes a las plagas o que estén enriquecidas en algún nutriente

• GENES Y CÁNCER

El cáncer aparece cuando una célula sufre alteraciones en los genes que regulan la mitosis, dicha célula pierde el control de la división y se divide sin parar originando un tumor. Esto genes que cuando se alteran dan lugar a tumores se llaman protooncogenes y el gen mutado oncogen. En realidad, para que se produzca un cáncer no basta con la alteración de un único gen, sino que es necesaria la alteración de varios genes a la vez, de ahí que la probabilidad de padecer cáncer aumente con la edad (más años acumulando mutaciones). También hay algunos tipos de cáncer debidos a una infección vírica ya que el virus seria portador de un encogen y al infectarnos, lo integra en nuestro en alguna célula.

Existen también en nuestra célula genes supresores de tumores, son genes que se activan cuando una célula se vuelve tumoral, dichos genes activan a su vez el mecanismo de la apostosis o suicidio celular. Una mutación en alguno de estos genes supresores de tumores favorece la aparición de un cáncer.

El tabaco, el alcohol y la dieta son los responsables de las 2/3 partes de canceres. Los más frecuentes son: pulmón, próstata, mama, hígado, estómago y colon. Últimamente están aumentando los melanomas o cáncer de piel

• EL PROYECTO GENOMA HUMANO

En 1984 el instituto de la energía en EEUU decidió hacer un enorme esfuerzo para secuenciar el ADN humano.

En 1988 Watson fue nombrado director de la oficina de investigación de este proyecto, financiado con fondos públicos y que pretendía finalizar la secuenciación en el 2005

En 1990 Craig Venter que trabajaba con Watson fundó un instituto de financiación mixta y posteriormente una empresa totalmente privada llamada CELERA GENOMIX para secuenciar el ADN humano. Se estableció una carrera entre la empresa pública y la privada por ver quien acababa primero la secuenciación. A la empresa pública se le sumaron muchos países del mundo. Venter consiguió adelantarse gracias a que inventaron secuenciadores automáticos de ADN. A partir de 1990 se empezaron a publicar los genomas de ciertos organismos: E. coli, Sacharomyces cervisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster…

En el 2000 se publicaron las completas de los cromosomas 21, 5, 16 y 19

El 12 de febrero de 2001 Venter anuncio que había acabado de secuenciar el ADN humano y al día siguiente la empresa pública también. Del estudio del genoma humano se han sacado las siguientes conclusiones:

• El genoma humano tiene unos 30.000genes (se esperaban 200.000) resulta sorprendente ya que el gusano tiene 19.000 y la mosca 12.000

• El 95% del ADN humano es “basura” probablemente restos de bacterias y virus

• Los chimpancés comparten un 99% de su genoma con el nuestro

• Las diferencias entre las distintas razas son menores del 0.01%

Craig venter ha presentado patentes de ciertas secuencias del genoma humano lo que ha obligado a que ciertos mandatarios como el presidente de los EEUU lo lleven a juicio ya que se considera que no se pueden patentar los genes.

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