Clonatge i expressió del gen de la Ribonucleasa de pancreas boví en E. coli

J. Llombart

Grup 2 de pràctiques de Biologia molecular, Universitat de Girona, Campus de Montilivi.

Resum

S'ha comparat el clonatge i expressió de la ribonucleasa de pàncreas boví (RNAasa A) recombinant expressada en E. coli BL21(DE3) i E. coli BL26. En l'estudi s'han utilitzat vectors d'expressió diferents per cada soca; E. coli BL21(DE3) ha estat transformada amb un vector d'expressió (pET22b(+)) que conté cDNA del gen de la RNAasa A situat darrera la seqüencia senyal pelB codificadora per un peptid senyal d'exportació de la proteïna heterolaga al espai periplasmàtic de la cèl.lula, mentres que E. coli BL26 ha estat transformada amb un vector (pMAL-BPR)que conté cDNA del gen de la RNAasa A darrera la seqüencia Mal E que codifica per la proteïna MBP que juntament amb la RNAasa A, formen una proteïna de fusió. La comparació de l'expressió de la RNAasa A pels dos sistemes ens mostra que l'exportació de la proteïna al espai periplasmàtic de la cèl.lula, és més eficaç que la producció de proteïnes de fusió MBP-RNAasa A.

Paraules clau: recombinant proteïn, ribonuclease A, fusion protein.

Introducció

Les ribonucleases són enzims que catalitzen la degradació dels àcids ribonucleics i són molt abundants en tots els organismes. La ribonucleasa del pàncreas boví (RNAasa A) (E.C.3.127.5) és una de les proteïnes més estudiades a tots els nivells (Richards i Wyckoff, 1971; Karpeisky i Yakouley, 1981; Blackburn i Moore, 1982; Wlodaver, 1985; Eftink i Biltonen, 1987; Beintema et al., 1988; Parés et al., 1991). Va ser estudiada per difracció de raigs X (Kunitz, 1940) i va ser una de les primeres proteïnes estudiades per ressonància magnètica nuclear tant per l'elaboració de l'estructura proteïca com per el plegament proteïc (Rico et al., 1989). La RNAasa A és una proteïna petita (13.7 Kda) formada per una única cadena polipeptídica formada per 124 residus, dels quals 8 són residus de cisteïna que formen 4 ponts de disulfur. La seva funció és catalitzar la hidrolisi dels enllaços 3'-5'-fosfodiester de les cadenes senzilles de RNA mitjançant una reacció de et al (1969) i acavat d'explicar per Usher et al (1970). Estudis recents sobre el mecanisme de la RNAasa A (Cuchillo et al, 1993; Cuchillo i Nogués, 1993) indiquen que el procés no és 2 etapes (el model més acceptat és el de Findley et al (1961,1962), modificat per Roberts seqüencial, amb la formació d'un intermediari associat al enzim, sinó que les dues etapes, transfosforilació i hidròlisi, s'haurien de considerar com 2 processos catalítics separats: l'etapa d'hidròlisi com un procés equivalent a la reacció inversa de l'etapa de transfosforilació. En la interacció de la RNAasa A amb el RNA hi participen, a més del centre catalític, altres setis de fixació del sustrat (Richards i Wyckoff, 1971; Blackburn i Moore, 1982; Eftink i Bitonen, 1987; Parés et al., 1991). L'obtenció de quantitats considerables de ribonucleases (RNAasa A o d'altres tipus) ha portat a la clonació dels gens d'aquestes ribonucleases i a buscar mètodes eficaços d'expressió de la molécula en procariotes, ja que l'obtenció a partir del teixit original dóna un rendiment molt baix. El principal problema de l'expressió del cDNA de les ribonucleases en procariotes és la potencial activitat citotòxica per a les cèl.lules transformades. En aquest treball compara l'expressió de la RNAasa A mitjançant l'exportació de la molécula al espai periplasmàtic de la cèl.lula amb la formació de complexos o proteïnes de fusió amb la RNAasa A, veient que el primer mètode dòna uns rendiments més elevats.

Material

Per l'expressió de la RNAasa A recombinant en E. coli s'ha utilitzat:

• La soca BL21(DE3)(F-,ompt, rB-,mB-,) (Studier i Moffat, 1986) de Novagen (Madison, WI, EUA). Aquesta soca té inserit el bacteriofag DE3 al gen int del genoma. Aquest fag porta una regió promotora lac U.V. 5, induible per isopropil -D-tiogalactopiranòsid (IPTG), i el gen de la RNA polimerasa de T7. El vector d'expressió utilitzat per la soca BL21(DE3) ha estat pET-22b (+) que conté una regió promotora del tipus T7 lac reconeixedor de la RNA polimerasa de T7. El cDNA de la RNAasa A s'ha situat just darrera la seqüencia senyal pelB que codifica per un pèptid senyal d'exportació, el qual permet que la proteïna heterolaga que es sintetitza surti al espai periplamàtic de la cèl.lula transformada.

• La soca BL26 és genotipicament semblant a la soca BL21(DE3) però no té un fag lisogen integrat. Aquesta soca té el gen clonat (cDNA) darrera el gen mal E d'E. coli, el qual codifica per la proteïna que s'uneix a la maltosa (MBP), donant en l'expressió una proteïna de fussió amb MBP. També hi ha una seqüencia promotora forta per estimular la traducció del gen MalE i el cDNA.

Les dissolucions d'ampicilina i d'IPTG foren esterilitzades per filtració utilitzant filtres de 0.22 mm (Millipore). El medi de cultiu utilitzat va ser LB (Brou nutritiu) i es va autoclavar.

Mètodes

Electroforesi

El cDNA va ser detectat en les cèl.lules transformades (anàlisi de clonatge) en gels d'agarosa al 1% en presència de tris-acetat 40 mM, EDTA 1mM i pH 8 amb amortidor TAE×1. Per saber si tenim el cDNA dins de la cèl.lula comparem els fragments del genoma tallats pels enzims XbaI ,Sal I i Nco I amb un marcador de referència provinent del DNA del bacteriofag  digerit amb l'enzim de restricció Hind III (Boehringer Mannheim). L'inducció dels cultius d'E. coli BL21(DE3)-[pBXR] i BL26-[pMALRNAasa] és realitza amb IPTG.

L'anàlisi de l'expressió es va dur a terme amb determinacions electroforètiques en gels PAGE-SDS amb poli(c) revelats per activitat (zimogrames) (Bravo et al. 1994).

Resultats i discussió

Per tal d'assegurar-nos que s'ha insertat el cDNA de la RNAasa dintre les cèl.lules d'E. coli transformades realitzem una electroforesi en gels d'agarosa 1% tallant el DNA de les cèl.lules amb Xba I i Sal I (per pEt22-BPR) o Nco I i Sal I (per pMAL-BPR) i comparant els resultats amb marcadors estandars de referència. S'ha obtingut:

Gel d'agarosa al 1%. Tenyit amb bromur d'etidi i observat amb llum U.V.

D'esquerra a dreta: E. coli BL21(DE3)+pEt22 no digerit, E. coli BL21(DE3)+pEt22 digerit i E. coli BL26 digerit.

Comparant les bandes obtingudes de les cèl.lules transformades amb el marcador de referència veïem; a E. coli BL21(DE3)+pEt22 no digerit 3 bandes que corresponen (de dalt a baix) al DNA genòmic, al plasmidi desenrotllat i al plasmidi enrotllat. A E. coli BL21(DE3)+pEt22 digerit veiem una banda que correspon al DNA lineal i una altra més abaix, no gaire intença que correspon el gen de la RNAasa (BPR). A E. coli BL26 digerit també trobem bandes a la part superior corresponents al DNA genòmic lineal, i a sota una feble banda corresponent al gen de BPR.

Al cap d'una hora de la inducció dels cultius d'E. coli BL21(DE3) (transformat amb el vector d'expressió de la RNAasa anomenat pBXR) i del cultiu d'E. coli BL26 (transformat amb el vector d'expressió de la RNAasa descrit com pMALRNAasa) amb IPTG en un medi LB amb ampicilina (25 g/ml) a 37º C a 250 rpm es va observar que els dos cultius produien el producte desitjat:

Gel de policrilamida (15%)-SDS. Revelat per activitat (amb poli c).

D'esquerra a dreta: BL21(DE3)-[pBXR] no induït, BL21(DE3)-[pBXR] induït, BL26-[pMALRNAasa] no induït i BL26-[pMALRNAasa] induït.

L'intensitat de les bandes en el zimograma revelat per activitat es proporcional a la quantitat de RNAasa expresada per les cèl.lules transformades. La soca d'E. coli BL21(DE3) )-[pBXR] és la que presenta una banda en el zimograma més intença, el que revela que ha expressat més RNAasa . Podem concluir, que el sistema d'exportació de la proteïna heterologa de la RNAasa al espai periplasmàtic de les cèl.lules d'E. coli és un sistema més eficaç d'expressió que la formació de proteïnes de fusió MBP-BPR.

Bibliografia

ALONSO, j.,NOGUÉS,M.V. i CUCHILLO, C.M. 1986.Modification of bovine pancreatic ribonuclease A with 6-chloropurine riboside. Arch. Biochem. Biophys.246:681-689.

BEINTEMA, J.J., SCHÜLLER, C., IRIE, M. i CARSANA, A. 1988. Molecular evolution of ribonuclease superfamily. Prog. Biophys. Molec. Biol. 51:165-192.

BLACKBURN, P. i MOORE,S. 1982. Pancreatic ribonucleases. The Enzymes. Boyer P.D. (ed.) Academic Press. Nova York. 15:317-433.

BOIX, E.,NOGUÉS, M.V.,SCHEIN,C.H., BENNER,S.A. i CUCHILLO, C.M.1994. Reverse transfosforilation by ribonuclease A needs an intact p2 binding site. Point mutations at Lys-7 and Arg-10 alter the catalytic properties of the enzyme. J. Biol. Chem. 269:2529-2271.

COLL, M.G., RIBO, M., VILANOVA, M. 1996. Obtenció i caracterització de la ribonucleasa A recombinant. Scientia gerundensis, 22:5-17.

EFTINK, M.R. i BILTONEN, R.L. 1987. Pancreatic ribonuclease A: the most studied endoribonuclease. A Hydrolytic Enzimes. Elsevier Science Publishers. Amsterdam, Nova York i Oxford. 7: 333-375.

RICHARDS, F.M. i WYCKOFF, H.W.1971. Bovine Pancreatic Ribonuclease. The enzymes. Boyer P.D. (ed.) Academic Press. Nova York. 4:647-806.

RICO, M., BRUIX, M., SANTORO, J., GONZALEZ, C., NEIRA, J.L., NIETO, J. L. i HERRANZ, J.1989. Sequential H-NMR assigment and solution structure of bovine pancratic ribonuclease A. Eur. J. Biochem. 183:623-638.

Marcador

23130 pb

9416

6557

4361

2322

2027

564

125

Bandes del gen de la BPR