ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN DEL

AZUL DE METILENO Y DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA

• FUNDAMENTO

Cuando se pretende determinar, espectrofotométricamente la concentración de un soluto de una disolución, es imprescindible conocer las longitudes de onda a las que se produce la máxima absorción. Lo ideal es hacer incidir sobre la solución un haz de luz con la longitud de onda que se produce la máxima absorción; para descubrir la capacidad de absorción de una sustancia a distintas longitudes de onda, se hace un barrido de longitudes de onda.

Cada sustancia tiene su espectro característico, por lo que podemos indentificarla en una solución cuya composición desconocemos, y esto se suele emplear en la determinación de tóxicos en líquidos biológicos.

Existen dos formas de llevar a cabo los espectros de absorción:

• Manualmente: se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz simple, se coloca en la cubeta la solución y vamos midiendo las absorbancias a distintas longitudes de onda.

• Automáticamente: se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz doble, en el que se sitúa la cubeta con el blanco en una de sus celdas y en la otra la solución problema, se programa el aparato para q haga incidir distintas longitudes de onda y este hace el barrido.

• AZUL DE METILENO

• Papel de filtro

• Vaso de precipitado

• Matraz

• Pipeta de 5 ml

• Pipeta pasteur

• Tubo de ensayo

• Cubetas

• Espectrofotómetro

• Servilletas

• Preparar la solución, 25 ml de una disolución de 0.1% de concentración de azul de metileno, a partir de una de 1%; para lo cual se pipetea 2.5 ml de azul de metileno y se le añade agua destilada hasta los 25 ml.

Dispensar en un tubo de ensayo 5 ml.

• En una cubeta del espectrofotómetro vertemos la solución de azul de

metileno.

• Vamos a medir distintas longitudes de onda: 340, 405, 500, 546, 578 y

630.

• Preparamos el espectrofotómetro, vamos a realizar esta práctica de forma manual.

• Lo enchufamos y conectamos

• Código 100 + enter

• Utilidad 1 + enter

• Código (nº que le vayamos a poner a nuestra técnica : X) + enter

• Identificación (print) 0 (relativo a la absorbancia) + enter

• Modo (print) 0 (relativo a la absorbancia) + enter

• WL1 (1ª longitud de onda) + enter

• WL2 no me hace falta + enter

• Temperatura 37º + enter

• Retardo de lectura 1 seg + enter

• Terminado esto saldrán impresas todas las condiciones descritas y la técnica ya está programada.

• Ejecución de la técnica

• Stop + código (X) + enter

• Nos pedirá que metamos un blanco, q será en este caso agua destilada + read.

• A continuación nos pedirá q metamos la muestra + read.

• Stop + código (X) + enter

• Identificación 0 + enter...... igual q antes hacemos todos los pasos otra vez, lo único q cambia es que la longitud de onda va variando.

• A continuación vamos a realizar la misma técnica pero de una forma

automática.

• Ya tenemos conectado el espectrofotómetro

• Colocamos dos blancos en sus cubetas, que van a seguir siendo agua destilada y le damos a “Medida autocero”.

• Sacamos una de las cubetas de blanco, la de abajo, y en su lugar colocamos la muestra.

• Le hemos metido los parámetros de longitudes de onda a la que queremos que nos mida las absorbancias. (700 - 200 nm)

• El espectrofotómetro comienza a leer las absorbancias y hace la gráfica.