El glifosato actúa inhibiendo la 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS), enzima responsable de la formación de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano. 
El shiquimato (anión del ácido shiquímico) es el precursor clave y común en la biosíntesis de todos los aminoácidos aromáticos y del triptófano que resulta de la ciclación de un ácido heptónico. 
La EPSPS cataliza la reacción entre shiquimato-3-fosfato (S3P) y fosfoenolpiruvato (PEP) para formar ESP y fosfato. Los aminoácidos aromáticos se utilizan también para formar metabolitos secundarios como los folatos, las ubiquinonas y las naftoquinas. La ruta del proceso bioquímico del shiquimato no se encuentra en animales. 
Adicionalmente se utiliza en la lucha contra el cultivo de la amapola, la coca y otras plantas usadas en el desarrollo de estupefacientes. Y también como herbicida en los cultivos de soja, que ha sido manipulada genéticamente para no ser afectada por esta sustancia. 
Fórmulas y nombres registrados 
Aunque la marca registrada Roundup sigue existiendo en los registros de la US Patent Office, la patente ya ha expirado. Así el glifosato se vende en EE.UU. y mundialmente en diferentes soluciones bajo muchos nombres registrados. Roundup, Buccaneer, Razor Pro (41%), Genesis Extra II (41% + surfactante), Roundup® Pro Concentrate (50,2 %), Rodeo (51,2%), Aquaneat (53,8%), Aquamaster (53,5%). Tales productos pueden contener otros ingredientes, causando diferentes efectos. Por ejemplo, Roundup tiene efectos agregados al propio glifosato , ya que es una solución acuosa de glifosato, un surfactante y otras sustancias. 
El glifosato se provee en varias formulaciones para diferentes usos: 
• Sal de amonio 
• Sal amina isopropil 
• Glifosato ácido - standalone, tanto como sal amoniacal o sal isopropil 
• Sal potásica 
Los productos pueden formularse con 120, 240, 360, 480, 680 g de ingrediente activo por litro. La formulación más común en agricultura es 360 g/L, tanto sola como con surfactantes catiónicos. 
Para las formulaciones de 360 g/L, las regulaciones europeas pemiten aplicaciones a campo de hasta 12 L/ha para el control de maleza perenne (como Elytrigia repens). Lo más comunmente empleado, es no más de 3 L/ha para los habituales controles de malezas anuales entre cultivos.[ 
La Agencia de Protección Ambiental (EPA), así como la Organización Mundial de la Salud clasificaron los herbicidas con glifosato como levemente tóxicos en la "Clase III" para exposiciones oral e inhalación, pero recientes estudios sugieren que IV sería más apropiado para exposiciones oral, dermal, e inhalatoria. Sin embargo, sigue en Clase I (severa) para exposición ocular. La revisión en 2000 concluyó que "bajo las condiciones de uso presente y esperado, no hay potencial riesgo del herbicida Roundup en poner en riesgo de salud a humanos". 
Sin embargo, un estudio reciente, ha mostrado que las formulaciones y productos metabólicos de Roundup causarían la muerte de embriones, placentas, y células umbilicales humanos in vitro aún en bajas concentraciones (1 x 10-5 veces la concentración recomendada para el uso). Los efectos no son proporcionales a las concentraciones de Glifosato sino que dependen de la naturaleza de los adyuvantes usados en la formulación. El subproducto de la degradación del glifosato AMPA y el principal adyuvante POEA dañan separados y sinérgicamente las membranas celulares como el RoundUp pero a diferentes concentraciones. Sus mezclas con Glifosato serían aún más dañinas según este estudio.