Resumen

Se ha estudiado la respuesta de Dunaliella Viridis Teodoresco hacia los parámetros de salinidad y fosfato. Mediante las variables de densidad celular, nefelometría, cantidad de pigmentos, pH, fotosíntesis-respiración. Los resultados más representativos nos indican que tanto la salinidad como el fosfato afectan a la microalga, el fosfato está claramente influido por la salinidad, una alta concentración de fosfato favorece la fotosíntesis y afecta a la tasa de renovación.

Introducción

Dunaliella Viridis es un alga unicelular, fotosintética verde, situada en la división Chlorophyta, esta tiene dos flagelos iguales, un cloroplasto, un núcleo anterior, una mancha ocular y un pirenoide rodeado por gránulos de almidón en el final posterior de la célula. Teodoresco (1905, 1906) divide el género en dos especies:

• D. salina, célula posee hematocromo, quistes son rojos.

• D. viridis, células y quistes son siempre verdes. (Margaret Ginzburg, 1987) (1).

M. A. Borowitzka y L. J. Borowitzka, (1988), afirman que D. viridis se encuentra en aguas hipersalinas, con un rango de 1-30% NaCl (w/v), usualmente domina en aguas con una salinidad mayor del 20%. No está distribuida homogéneamente en la columna de agua, se encuentra en la profundidad de la columna de agua y en la superficie de los sedimentos. Bajo condiciones de laboratorio, la salinidad optima es 5.8 a 8.9% (2). Es fácil de cultivar.

Nuestro objetivo es estudiar como influye las distintas condiciones de cultivo: salinidad y fosfato, en el crecimiento de D. Viridis.

Margaret Ginzburg, 1987, recoge en su libro la experiencia de McLachlan (1960) y Hellebust (1985) han encontrado que NaCl, en baja concentración, es esencial para el crecimiento. Hay un gran rango de tolerancia a la sal.

Especie	Temperatura	NaCl (mM)	División
D. viridis	26ºC	2000-4000	1 (día -1)

Los efectos de la temperatura, luz y NaCl en el crecimiento están interconectados.

Efectos de la sal en la anatomía celular: Trezzi et al. (1965) encontraron que cuando la tonicidad era baja, la célula se hinchaba. El agua había penetrado en todas las partes de la célula. Hoshaw y Malufl (1981) encontraron que en células en crecimiento con alta concentración de salinidad, el hacinamiento de los tilacoides eran más marcados que en otras de baja concentración (1).

Material y método

Medios de cultivo

• Material

Cloruro sódico

Sales de fosfato purificadas sólidas

Matraces de 3 l.

Dunaliella viridis (estas provienen de la Laguna Fuente de Piedra)

• Método

Dilución de las sales en las siguientes concentraciones:

Baja salinidad ( NaCl 1M ) + alto fosfato ( 0.26 mM ), -S+P

Baja salinidad ( NaCl 1M ) + bajo fosfato ( 0.052 mM ), -S-P

Alta salinidad ( NaCl 3M ) + bajo fosfato ( 0.052 mM ), +S-P

Alta salinidad ( NaCl 3M ) + alto fosfato ( 0.26 mM ), +S+P

Inoculamos los medios con D. Viridis

Los cultivos se mantendrán en agitación permanente, bajo luz continua de 150 moles m² s¹, y a una temperatura de 25 Cº.

Densidad celular

• Material

Eppendorf

Lugol

Pipeta

Cámara cuenta glóbulos

Cubreobjetos

Microscopio

• Método

Tomar 1 mL de cada cultivo y depositarlo en un vial Eppendorf. Añadir una gota de lugol para fijarlas y teñirlas (lugol pone de manifiesto el pirenoide). Con una pipeta, se coloca una gota en la cámara cuenta glóbulos, se le pone un cubreobjetos y observar al microscopio. El valor medio del número de células en cada cuadrado se multiplica por 160.000 para obtener la densidad en nº cél/mL. Tener en cuenta la dilución que se hace a la hora de fijar con lugol.

Nefelometría

• Material

Espectrofotómetro

Cubetas

Medio de cultivo

• Método

Tomar el cultivo “in vivo”, disponer 2 mL en una cubeta de espectrofotómetro y medir la absorbancia a 750 nm. Para el blanco usar medio de cultivo. Se construirá una gráfica en la que se enfrente la densidad celular y la absorbancia a 750 nm.

Extracción de pigmentos fotosintéticos

• Material

Centrífuga de mesa

Tubos

Acetona

Agua destilada

Espectrofotómetro

• Método

Tomar 5 mL de muestra y centrifugar durante 5 min. a 4000-4500 rpm. Resuspender el pellet en 4 mL de acetona (primero echamos 1 mL y después 3mL) para extraer los pigmentos. Mezclar y enrasar a 5 mL con agua destilada. Centrifugar de nuevo 1 min. Medir la absorbancia en el sobrenadante resultante:

750 nm (turbidez del medio)

664 nm (máximo de absorción de la clorofila a)

480 nm (máximo de absorción de los pigmentos carotenoides)

Realizar los cálculos de concentración pigmentaria, restando la absorbancia a 750 nm a las obtenidas a 664 y 480 nm, multiplicando por un factor. Tened en cuenta las diluciones.

Cl A (mg L) = 10.3 (Abs664 - Abs750)

Carotenos (unidades mL-1) = 10 (Abs480 - Abs750)

Medida de fosfato

• Material

Filtros GF/C

Tubos

Reactivo verde malaquita

Espectrofotómetro

Agua desionizada

Soluciones de fosfato: 2.5, 5, 10, 15 y 25 moles L ¹.

• Método

Usar el sobrenadante de la extracción de pigmentos. Se filtran 3 mL de cultivo y se toman 2 mL. Mezclar en un tubo 1 mL de muestra y 2 mL de reactivo de verde malaquita. Hacer dos réplicas. Transcurridos 5 minutos. Medir la absorbancia a 660 nm. El blanco de medida es el reactivo con 1 mL de agua desionizada. Hacer una recta patrón con las soluciones de fosfato conocidas, para el cálculo de las concentraciones problema. Las muestras de alto fosfato deben diluirse 10 veces. Las de bajo fosfato deben diluirse 2 veces.

Medida de pH

• Material

Electrodo

• Método

Medir los cultivos con un electrodo.

Medida de la tasa de fotosíntesis y de la tasa de respiración en oscuridad

• Material

Electrodo

Matraz de 125 mL

Parafina

Papel de aluminio

Cámara incubadora

• Método

Se harán incubaciones de unos 10 minutos en luz y oscuridad. Midiendo el oxígeno inicial y el oxígeno final con el electrodo de oxígeno. Los matraces deben estar correctamente precintados con parafina para evitar burbujas de aire. En el caso de la muestra en oscuridad debe envolverse el matraz en papel de aluminio.

Cálculo de las tasas respectivas de producción o respiración:

Se calcula la diferencia de concentración de oxígeno después de los 10 minutos de incubación. Ese valor de oxígeno tiene unidades de mg/L. El volumen de cultivo que introducimos en el matraz para realizar las incubaciones es de 0.125 L. Con la ayuda de los resultados de la densidad celular conoceremos el número de células que hay por ml, por tanto multiplicando por 125 sabremos el número de células totales que hemos usado para las incubaciones. Dividiremos entre 10, que es la duración de la incubación.

Resultados

Densidad celular

Figura 1. Curva de crecimiento y ajuste exponencial del tratamiento S+P+. Comparamos el número de células por mililitro en los cinco días de experimentación, en nuestros cuatro tratamientos. El máximo de la curva nos da el valor de K (capacidad de carga del medio).

El tratamiento por el cual alcanzamos una mayor densidad celular corresponde a S-P+ y con el que se alcanza menor densidad es S+P-. La cinética de crecimiento es intermedia en los tratamientos más extremos, S-P- y S+P+. Todos los tratamientos se ajustan a una ecuación exponencial, por lo que podemos decir, que la cinética de crecimiento es exponencial. A partir de esta ecuación calculamos r (tasa de crecimiento) y le aplicaremos un análisis de la varianza.

Al ser el tiempo de experimentación relativamente corto, no se observa el fenómeno de densodependencia, que tiene lugar por el aumento de individuos del sistema y la escasez de nutrientes. Como consecuencia de esto, las células ralentizan su tasa crecimiento, llegando incluso al descenso, cuando r < 0, dN / dt < 0, la población disminuye.

Nefelometría

Figura 2. Medida de la turbidez. La absorbancia a 750 nm es proporcional al número de células que hay en el cultivo. Es una medida eficaz porque ningún pigmento absorbe a 750 nm.

Trat.	Recta	R 2
S-P+	Abs750 = 0.08 + 3.22·10-8 Densidad celular	0.66
S-P-	Abs750 = -0.06 + 4.84·10-8 Densidad celular	0.86
S+P-	Abs750 = 3.85·10-3 + 1.63·10-8Densidad celular	0.98
S+P+	Abs750 = -0.07 + 4.94·10-8Densidad celular	0.88

Tabla 1. Rectas obtenidas de la regresión lineal.

Pendientes muy similares en los casos S-P+, S-P-, y S+P+. El tratamiento S+P- tiene una pendiente menor. Se admite un factor de regresión de hasta 0.8, por lo que la ecuación de la recta es lineal, excepto para S-P+.

Pigmentos fotosintéticos

• Clorofila a

Figura 3. Concentración de clorofila por célula.

En los tratamientos S-P+, S-P- y S+P+ hay un aumento de clorofila por microalga, pero este último es menor. En el cultivo S+P-, hay gran diferencia entre la réplica A y B, por lo que deducimos que hay un error de experimentación y omitimos el dato de la réplica B, del quinto día.

El aumento en la concentración de clorofila no es de tipo lineal, sino que, llegada a una cierta concentración en las células, y cuando estas llegan a su nivel de K, la concentración de este pigmento no sigue aumentando.

• Carotenoides totales

Figura 4. Concentración de carotenos.

La tendencia es que aumenta el pigmento celular, aunque en el tratamiento S+P-, lo hace en menor medida.

Fosfatos

Figura 5. Concentración de fosfato a lo largo del tiempo.

En todos los tratamientos hay una incorporación de fosfato por parte de las células, pero no con la misma tasa. Los casos de alta salinidad agotan el fosfato del medio con mayor eficacia.

Trat.	Recta	R 2
S-P+	PO4- = 3·10-5 - 2.5·10-6 t	0.75
S-P-	PO4- = 1.7·10-5 - 3.6·10-6 t	0.75
S+P-	PO4- = 1.5·10-4 - 2.7·10-5 t	0.98
S+P+	PO4- = 1.4·10-4 - 2.4·10-5 t	0.92

Tabla 2. Rectas obtenidas de la regresión lineal para la réplica A y B.

Rectas de pendiente negativa, con una clara diferencia entre cultivos de alta salinidad y de baja. Observando el coeficiente de regresión se deduce que S-P+ y S-P- no siguen un ajuste lineal.

Debido a un error de experimentación, no podemos calcular la tasa de fosfato.

pH

Figura 6. Seguimiento del pH a lo largo del experimento.

En los tratamientos S-P+, S-P- y S+P- hay un incremento de pH de 0.5 aproximadamente. En el caso de S+P+, debemos omitir el resultado del día 5, ya que se debe a un error de experimentación.

Esta alga, mediante la fotosíntesis retira dióxido de carbono del medio, de forma que según el sistema carbónico-carbonato, la reacción se desplaza para producir CO2, gastando HCO3-, Co32- y H+. Esta disminución de protones induce un aumento del pH. Por el contrario la respiración acidifica el medio.

Medida de la tasa de fotosíntesis y de la tasa de respiración en oscuridad

Figura 7. Tasa de fotosíntesis y respiración para S-P+.

La tasa de fotosíntesis aumenta y la tasa de respiración es baja y constante.

Figura 8. Tasa de fotosíntesis y respiración para S-P-.

La fotosíntesis disminuye e inversamente la respiración aumenta. El punto en el que se iguala fotosíntesis y respiración la fijación neta del carbono es cero.

Figura 9. Tasa de fotosíntesis y respiración para S+P-.

La tasa fotosintética disminuye y la tasa de respiración sufre pocas variaciones.

Figura 10. Tasa de fotosíntesis y respiración para S+P+.

La fotosíntesis experimenta un aumento notable y respiración un descenso inversamente proporcional.

Índice P/B

Figura 11. Tasa de renovación.

Mide la rapidez del sistema. En el cultivo S-P+ y S+P+ hay un aumento, aunque no en la misma medida. En cambio en los otros cultivos hay un descenso.

Análisis de la varianza (ANOVA)

• Tasa de crecimiento, r

Ecuación de crecimiento exponencial continuo:

Nt = N0 · ert

De la cual deducimos:

r = Ln (Nt/N0) / t

r (d-1)	+P	-P
+S	0.63	0.28
		0.64	0.28
	-S	1.07	0.79
		0.88	0.79

Tabla 3. Valores de la tasa de crecimiento de los ajustes de Ln Nt frente al tiempo. Obtenidos a partir de la ecuación anterior, N0 tiene el valor de 120000 o 300000 cél/ml dependiendo del tipo de tratamiento, -S o +S, respectivamente. Nt he considerado cuando el número de células por mililitro es máximo, que corresponde con el valor de t = 5, excepto en el tratamiento -S+P que el valor máximo se da en t = 4. El número de réplicas (n) es 2.

Hipótesis que se contrastan:

Existen tres hipótesis nulas, que suponen ausencia de efectos de los niveles de cada factor y la ausencia de interacciones entre los niveles.

La primera, H0, afirma que no hay diferencias entre los efectos de los distintos niveles del factor fosfato, A.

La segunda, H0', afirma que no hay diferencias entre los efectos de los distintos niveles del factor salinidad, B.

La tercera, H0'', afirma que no existen interacciones, A·B.

Cada hipótesis alternativa afirma que al menos falla una de las afirmaciones de la correspondiente hipótesis nula.

En cada uno de estos contrastes, se rechazará la hipótesis nula al nivel 0.05 () cuando el respectivo valor observado del estadístico de contraste, sea superior o igual al valor crítico correspondiente a ese nivel.

Tras calcular los estadísticos auxiliares necesarios para efectuar este ANOVA obtenemos la siguiente tabla:

Fuente de variación	Grados de libertad	Sumas de cuadrados	Medias de cuadrados	Valor de Fexp	Valor de Fteo
Factor A	1	0.1458	0.1458	32.22	F0.05= 7.71
Factor B	1	0.36125	0.36125	79.83	F0.05=7.71
Interacción A·B	1	0.01445	0.01445	3.19	F0.05=7.71
Error	4	0.0181	0.004525

Tabla 4. ANOVA de dos criterios con 2 réplicas.

Conclusiones de cada uno de los contrastes:

Se rechazan las hipótesis de igualdad de efectos en ambos factores, fosfato y salinidad, H0 y H0'. Se acepta la hipótesis de falta de interacción, H0''.

• Capacidad de carga, K

De la curva de crecimiento deducimos el valor de K, ya que se corresponde al valor máximo de número de células por mililitro, N.

K (millones cél/ml)	+P	-P
+S	7.2	1.225
		7.56	1.245
	-S	8.712	6.425
		10.016	6.425

Tabla 5. Valores de la capacidad de carga. Obtenidos a partir de la gráfica de crecimiento celular. El número de réplicas (n) es 2.

Hipótesis que se contrastan:

La primera, H0, afirma que no hay diferencias entre los efectos de los distintos niveles del factor fosfato, A.

La segunda, H0', afirma que no hay diferencias entre los efectos de los distintos niveles del factor salinidad, B.

La tercera, H0'', afirma que no existen interacciones, A·B.

Cada hipótesis alternativa afirma que al menos falla una de las afirmaciones de la correspondiente hipótesis nula.

En cada uno de estos contrastes, se rechazará la hipótesis nula al nivel 0.05 () cuando el respectivo valor observado del estadístico de contraste, sea superior o igual al valor crítico correspondiente a ese nivel.

El cálculo de los estadísticos de contraste se resume en la siguiente tabla:

Fuente de variación	Grados de libertad	Sumas de cuadrados	Medias de cuadrados	Valor de Fexp	Valor de Fteo
Factor A	1	41.25953	41.25953	180.32	F0.05=7.71
Factor B	1	25.73314	25.73314	112.46	F0.05=7.71
Interacción A·B	1	5.13921	5.13921	22.46	F0.05=7.71
Error	4	0.91521	0.2288025

Tabla 6. ANOVA de dos criterios con 2 réplicas.

Se rechazan las dos hipótesis de igualdad de efectos en ambos factores, H0 y H0', fosfato y salinidad. Se rechaza la hipótesis de falta de interacción, H0''.

Discusión

De los resultados expuestos anteriormente, deducimos:

• La salinidad y el fosfato afectan a la microalga.

La población presentó una cinética de crecimiento exponencial, lo que quiere decir, que no experimentaron limitación de nutrientes.

La salinidad afectó negativamente al crecimiento de D. viridis y el fosfato produjo un aumento en el crecimiento del alga. Cuando se dieron tratamientos extremos (S-P- y S+P+) hubo un crecimiento intermedio.

El tratamiento más desfavorable para D. viridis fue 3M de salinidad y 0.052mM de fosfato, porque es en este caso donde desciende la velocidad de crecimiento. En los otros tratamientos la cinética de crecimiento es muy similar.

Según el trabajo realizado por Gibor (1956), y recogido por Margaret Ginzburg (1987), encontró que concentraciones de KH2PO4 alrededor de 0.15 mM son inhibidoras para D. viridis (1).

• Los pigmentos no nos dan información sobre la interacción de la salinidad o el fosfato.

La Cl a es un estimador indirecto de la biomasa, por lo que esta aumentará conforme lo hace la población. En nuestro experimento lo hizo de forma exponencial. Consideramos que el cultivo S+P-, supone una situación de estrés para nuestra alga, porque se obtuvo una baja producción de Cl a en este caso.

La producción de carotenos es de gran interés económico, por ello es conveniente conocer las condiciones más favorables para ello. Los carotenos aumentaron en todos los cultivos, aunque en menor medida en S+P-, la alta salinidad pudo provocar un descenso, aunque esto es una especulación.

• El fosfato está claramente influido por la salinidad.

La incorporación de fosfato fue más acusada en los tratamientos de alta salinidad. El requerimiento de fosfato a baja salinidad fue pequeño. Es el elemento limitante en el crecimiento de D. viridis.

• Los procesos fotosintéticos basifican el medio.

Se observó un incremento de iones hidroxilo, lo que indica una disminución en la actividad de la anhidrasa carbónica. Ya que su efecto es acidificar el medio por la retirada de OH-. Dunaliella está marcada por la habilidad de producir grandes cantidades de anhidrasa carbónica, la cantidad incrementa con la concentración de NaCl en el medio (1).

• Alto fosfato favorece la fotosíntesis.

Tras medir la tasa de fotosíntesis, se dedujo que esta depende del fosfato, de tal forma que alta concentración de fosfato provocó una tasa de fotosíntesis alta. Las condiciones favorables para que se de una alta fotosíntesis es S+P+ y para que tenga lugar una alta tasa de respiración es S-P-. Con los otros tratamientos se obtuvieron tasas intermedias.

• La tasa de renovación está influida por el fosfato.

A bajas concentraciones de fosfato, la disipación de energía disminuyó en el tiempo. Pasamos de una población r-estratega, porque hay mayor concentración de nutrientes, en el inicio del sistema, a una k-estratega, al final del sistema, porque hay un descenso en los nutrientes.

En el caso de alta concentración de fosfato, aumenta el valor P/B, por lo que se da el caso contrario.

Conclusión de los resultados del análisis de la varianza:

Existe efecto significativo del fosfato y salinidad en la tasa de crecimiento. No existen diferencias significativas en la interacción de ambos.

En la capacidad de carga existe efecto significativo para el fosfato, la salinidad y la interacción de ambos.

Bibliografía

Margaret Ginzburg, 1987, Dunaliella: a Green Alga Adapted to Salt, Advances In Botanical Research, Vol. 14, Israel, página 95, 103, 106, 108, 117, 123 y 125.

Michael A. Borowitzka y Lesley J. Borowitzka, 1988, Microa-Algal Biotechnology, Ed. Press, Cambridge, página 31, 32.

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