UNIVERSIDAD CATOLICA DEL NORTE

FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR

DEPTO. BIOLOGIA MARINA

PROYECTO DE TESIS

CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES DE Mesodesma donacium (LAMARCK, 1818).

INTRODUCCION

Para producir y explotar especies comercialmente valiosas, es necesario tener un abastecimiento permanente de gametos y de esta manera mantener un stock constante de larvas. Este abastecimiento de gametos puede ser generado por medio de la mantención de un stock de reproductores, por medio de captación natural de larvas o por medio del almacenamiento de gametos por largos períodos de tiempo, mediante la criopreservación.

La criopreservación de espermatozoides es una técnica que permite un mayor aprovechamiento de dichos gametos, al poder utilizarlos en la inseminación artificial en cualquier período del año, y sobre todo en aquellas especies que presentan desfases en la maduración gonadal entre machos y hembras. También posibilita la creación de bancos de gametos, haciendo posible el establecimiento de programas de selección genética. Desde el punto de vista de la acuacultura la disponibilidad de gametos congelados, posibilita la disminución de los costos de producción, al disminuir los costos de mantención de reproductores y su transporte de un centro de cultivo a otro; resulta más económico el transporte de un bidón de Nitrógeno Líquido (NL) con los gametos que un grupo de reproductores, evitándose a la vez el estrés derivado del transporte (Almendras, 1993).

La criopreservación está basada en la congelación en nitrógeno líquido de células, grupos celulares u organismos completos a ser tratados, ayudada por la aplicación de ciertas soluciones químicas que protegen con alta efectividad a las células del daño producido por la formación de cristales de hielo durante el proceso de congelamiento y descongelamiento, evitando posibles daños a la membrana plasmática y disminuyendo el punto de congelación. (Toyoda, 1986)

Los cristales de hielo dentro de una célula, órgano o cuerpo causan daño físico. Cuando se propagan por el espacio extracelular, ellos pueden dividir las conexiones célula-célula y dañar los capilares o causar serias consecuencias osmóticas para las células como: deshidratación y colapso celular. Dentro de la célula, el hielo destruye las estructuras internas y microcompartimentación que son vitales para las funciones metabólicas (Storey, 1990).

La eficiencia de las soluciones crioprotectantes va a depender de la permeabilidad de la membrana plasmática y de cuán tóxica sea la solución para la célula a tratar. De esta manera cada grupo de células reacciona de diferente forma frente a estas sustancias, por esto los diferentes organismos requieren crioprotectantes específicos (Renard y Cochard, 1989).

El primer criopreservante encontrado fue el glicerol (Rostand, 1949 y Polge, 1949 en Chereguini, 1992). En 1959 Lovelock y Bishop encontraron que el Dimetilsulfoxido (DMSO) era un crioprotectante más efectivo que el glicerol y el etilenglicol, que presentaba una tasa de penetración más rápida y eliminaba el tiempo de equilibrio entre espermatozoides, diluyente y crioprotectante, necesario para los otros crioprotectantes (Chereguini et al, 1992).Los agentes crioprotectantes se dividen en 2 grupos: Agentes penetrantes y no penetrantes.

1.- Agentes penetrantes, los cuales están formados por moléculas pequeñas y que a concentraciones elevadas protegen la célula viva contra daños provocados por el congelamiento lento. Estas son: Metanol, Dimetilsulfóxido (DMSO), Etilenglicol y Glicerol.

2.- Agentes no-penetrantes, formadas por moléculas de mayor tamaño que las anteriores y que protegen a la célula externamente a una concentración molar baja y que generalmente se requieren para tasas más rápidas de congelamiento y descongelamiento. Estas son: Glucosa, Sacarosa, Polivinilpirrolidona (PVP), Almidón hidreoxietilico (HES) y Proteínas (Meryman, 1971).

Las primeras investigaciones se iniciaron en semen de bóvidos y posteriormente han abarcado diversas especies de mamíferos tales como ratones, conejos y especialmente humanos (Chereguini et al, 1992). En especies de vida acuática son los peces los que han sido ampliamente estudiados, mas aún, los primeros éxitos de fecundación de huevos con espermatozoides criopreservados se realizaron en especies de agua dulce, especialmente en salmónidos (Chereguini et al, 1992), Estos estudios se han extendido a la criopreservación espermática de numerosas especies diferentes de peces (Hoyle y Idler, 1968; Graybill y Horton, 1969; Ott y Horton, 1971; Harvey, 1983; Stoss y Holtz, 1983; Baynes y Scott, 1987; Piiromen, 1987; Steyn y Van Vuren, 1987; Yoo et al, 1987; Cloud et al, 1990; Chereguini et al, 1992; Thorogood y Blackshaw, 1992; Almendras, 1993; Ciereszko et al. , 1993; Hotz, 1993; Piiromen, 1993; Murali et al. , 1994; Pillai et al, 1994; Babiak et al, 1995; Conget et al. ,1996, Richardson et al.,1999; Ritar, 1999; Yao et al. , 2000), También han sido criopreservadas las membranas de los cloroplastos de espinacas (Santarius y Geirsch, 1983), rotíferos (Toledo y Kurokura, 1990; Toledo et al, 1991), cistos de artemia (Ramlov y Hvidt, 1992), eutardigrado Adorybiotus coronifer (Ramlov y Westh, 1992), erizos de mar hemicentrotus pulcherrimus y Strongylocentrotus (Ashima y Takahashi, 1978), ostras como Crassostrea gigas ( Bougrier y Rabenomanana,1986; Kurokura et al, 1990; Renard, 1991; Yankson y Moyse, 1991; Chao et al, 1994; Chao et al. , 1997; Dupré ,1998), Crassoatrea tulipa, C. Iredalei y Saccostrea cucullata (Yankson y Moyse, 1991), Crassostrea virginica ( Zell et al., 1979 ), almeja Meretrix lusoria (Chao et al, 1997), ostión Argopectem purpuratus ( Dupré y Espinoza, 2000 ), nauplios de cirripedio Balanus amphitrite (Anil et al., 1977) y crustáceos decápodos tales como Macrobrachium rosenbergii (Chow et al, 1985) y Scyonia ingentis (Anchordoguy et al, 1988).

En este sentido los estudios en moluscos se concentran en ostras y ostiones en el ámbito mundial, siendo prácticamente nulas las investigaciones referidas a otros tipos de moluscos y ninguna en la macha, Mesodesma donacium. Este bivalvo de interés económico, presenta una distribución continua, pero no uniforme, desde la bahía de Sechura en Perú hasta el extremo sur de la isla de Chiloé (43ºS) (Osorio y Bahamondes, 1968). En estos últimos 10 años su extracción ha ido decreciendo, desde 1989 donde el desembarque artesanal fue de 17.122 ton, hasta llegar a 1999 con 1.728 ton (Sernapesca, 1999).

Por la importancia económica que reviste este bivalvo para los pescadores artesanales; más aun por ser un recurso sobreexplotado, cuya sustentabilidad actualmente se busca a través de áreas de manejo, favorecería de manera importante la disponibilidad de gametos criopreservados, en especial de espermatozoides, para la creación de un banco genético, almacenando espermatozoides de ejemplares valiosos seleccionados con características de alto valor comercial o genéticamente mejoradas, como son el crecimiento en un menor tiempo, tamaño mayor por sobre los de tamaño normal, mayor resistencia a enfermedades etc. También posibilita el almacenamiento de espermatozoides de ejemplares de poblaciones silvestres para la incorporación de nuevos genes a la población; posibilidad de realizar cruzamientos entre especies o cepas con diferentes épocas de desove.

El presente proyecto propone criopreservar en nitrógeno líquido espermatozoides de macha, Mesodesma donacium.

HIPOTESIS

OBJETIVO GENERAL

1.- Criopreservar y determinar la viabilidad post-descongelamiento de espermatozoides de Mesodessma donacium..

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1.- Determinar el tiempo y tipo de motilidad de los espermatozoides en agua de mar microfiltrada y esterilizada (AMME) antes de criopresservar.

2.- Determinar la toxicidad de cada crioprotectante, concentraciones y tiempos de exposición en el porcentaje de motilidad espermática.

3.- Determinar porcentaje de espermatozoides móviles después de ser congelados-descongelados.

4.- Determinar la viabilidad de espermatozoides criopreservados a través del porcentaje de fecundación de ovocitos inseminados con espermatozoides post descongelación.

MATERIAL Y METODOS

1.- Obtención del material biológico.

Ejemplares machos y hembras de adultos maduros de la especie Mesodesma donacium serán obtenidos por pescadores artesanales, mediante buceo autónomo, desde el área de manejo de la playa grande de Tongoy (Bahía de Tongoy). La recolección de los individuos se llevará a cabo entre los meses de enero y febrero del 2001. Dichos ejemplares serán mantenidos en el laboratorio de tesistas de la Universidad Católica del Norte, en un estanque de 100 lts con agua de mar y aireación constante. Los ejemplares serán alimentados cada 2 días con microalgas de la especie Chaetoceros gracilis e Isochrysis galvana.

2.-Obtención de gametos

Dado que la macha es una especie dioica, que no posee dimorfismo sexual (Fuentes, 1988), la determinación del sexo será realizada a través de la obtención de gametos desde la gónada mediante un corte lateral, permitiendo que los gametos extruyan al exterior, los cuales serán puestos en un portaobjetos y observados bajo un microscopío de luz, con un aumento de 40x. La madurez de los gametos estará dada por la fluidez rápida y limpia de éstos al realizar el corte en la gónada, a diferencia de los adultos inmaduros, de los cuales sólo se obtiene un escaso fluido. Inmediatamente después de la salida de los gametos, serán extraídos suavemente con una pipeta Pasteur esterilizada, para ser empleados en las siguientes experiencias.

3.- Motilidad espermática en agua de mar.

Con el propósito de determinar el tiempo que los espermatozoides permanecen móviles después de diluirlos en Agua de Mar se pondrá una gota de espermatozoides (0,002 L), en cápsulas de Petri con 50 ml de AMMFE. Se determinará la concentración espermática en dichas cápsulas mediante hematocitómetro. Se evaluará la motilidad extrayendo cada 5 minutos una gota de espermatozoides, por un período de 90 min. La motilidad será clasificada en 3 categorías:

Motilidad 1: Espermatozoides sin movimiento

Motilidad 2: Espermatozoides con movimiento de flagelo lento y movimiento zigzagueante.

Motilidad 3: Espermatozoides con movimiento de flagelo rápido y desplazamiento efectivo hacia adelante.

Para contabilizar el número de espermatozoide en las diferentes categorías se empleará un hematocitómetro.

4.- Toxicidad de los crioprotectante, concentración y tiempo de exposición

Los espermatozoides recién extraídos (0,002 L) serán depositados en una cápsula de Petri y luego se les adicionará 1 ml de AMMFE Posteriormente se les adicionará 1 ml de los siguientes crioprotectantes: DMSO y Metanol (Romol Chemical) y Propilenglicol (Sigma), en concentraciones de 0,5 M; 1,0 M y 1,5 M. El período de exposición al crioprotectante corresponderá a 5, 10 y 15 minutos, a una temperatura ambiental de 16-17. Una vez que los espermatozoides completen el tiempo de exposición antes mencionado, serán diluidos en 50 ml de AMMFE y permanecerán por un periodo de 15 minutos, al final del cual se extraerá una alícuota de dicha solución y se colocará en un hematocitómetro para determinar el número de espermatozoides con diferente motilidades, bajo microscopia de luz, con un aumento de 40x.

5.- Procedimiento de congelación-descongelación

• Congelación

Para la congelación se utilizará un sistema de congelación manual fabricado en el laboratorio de criopreservación de la Universidad Católica del Norte, el que comprende un soporte universal en el cual van articuladas 2 poleas que sostienen una lámina de acrílico perforada, que cumple la función de porta muestras, en cuyas perforaciones se ubican los tubos de eppendorf que contienen las muestras que luego serán introducidas a diferentes velocidades en un termo, que contiene nitrógeno líquido en el fondo hasta sumergirlas totalmente en él. Una de las poleas está graduada, lo cual permite determinar las velocidades de descenso de las muestras en vapor de nítrogeno líquido. Tubos de Eppendorf conteniendo 0.5 ml de uno de los crioprotectantes ensayados y a una temperatura de 5º, serán mantenidos por 15 min, despues de adicionarles 0.5 ml de solución espermática también mantenida a 5º C. Se ensayarán 4 tasas de congelamiento: las 3 primeras lentas, a velocidades de 5º 10 y 15ºC/min hasta llegar -80ªC, mantenidas a esa temperatura durante 5 min y luego serán sumergidas directamente. La cuarta velocidad de congelamiento (206ºC/min) que será evaluada corresponderá al sumergimiento de las muestras directamente en nítrogeno líquido, desde la temperatura de 5ºC.

• Descongelación

El procedimiento de descongelación consistirá en retirar los tubos de ependorff con las muestras desde el nitrógeno líquido y agitarlos en el aire durante 5 seg. Y luego sumergidos en agua a diferentes temperaturas, teniendo cuidado con las tapas de los tubos ya que pueden saltar bruscamente a causa del cambio de temperatura.

Se utilizarán 2 velocidades de descongelación: Una rápida (312ºC/min) y la otra lenta (71ºC/min). La velocidad rápida se conseguirá colocando los tubos de ependorff en un recipiente con agua a una temperatura de 50º C, durante 30 seg, (después de sacarlos del nítrogeno liquido y agitarlos en el aire por 5 seg.), luego de lo cual serán transferidos directamente en agua a una temperatura ambiental, hasta su completo descongelamiento. Para obtener el descongelamiento lento se procede de igual manera que el descongelamiento rápido excepto que los tubos con las muestras son sumergidos en agua a temperatura ambiental, hasta que se produce el descongelamiento total de las muestras. Inmediatamente producida la descongelación, las soluciones espermáticas, se trasladarán a cápsulas de Petri con 50 ml de AMMFE, procediéndose a homogenizar la muestra y extraer una alícuota para eveluar el estado de motilidad de los espermatozoides por medio de hematocitómetro y microscopía óptica.

6.- Viabilidad de los espermatozoides congelados

Con el propósito de determinar la viabilidad de los espermatozoides después del congelamiento-descongelamiento, se procederá a realizar experimentos de fecundación con ovocitos maduros y frescos extraídos de la forma descrita en el pto 1. Después de descongelados los espermatozoides se colocarán en una cápsula Petri con 50 ml de AMMF, solución que será adicionada a un vaso precipitado de 50 ml que contiene los ovocitos frescos.. La evaluación será efectuada a las 3 horas post-inseminación, momento en el cual ocurre la tercera segmentación del embrión (Fuentes, 1988 y Munizaga, 1995).

7.- Análisis estadístico

Para comprobar si existen diferencias significativas entre los distintos crioprotectantes, concentraciones y tiempos de exposición los resultados obtenidos en porcentajes serán transformados a arcoseno, para aplicarles análisis de ANOVA multifactorial, y luego el test de comparaciones multiples de Tukey para determinar entre que tratamientos están las diferencias. Para comprobar si existen diferencias significativas en las motilidades y fecundaciones de los espermatozoides sometidos a los distintos crioprotectantes, concentraciones, velocidades de congelamiento y descongelamiento, los resultados serán analizados de la forma mencionada en el párrafo anterior.

CRONOGRAMA DE TRABAJO

LUGAR DE REALIZACION

Esta investigación se realizará en el Laboratorio de tesistas y en el Laboratorio de Criopreservación, Facultad de Ciencias del Mar, Universidad Católica del Norte.

FI NANCIAMIENTO

Esta Tesis será financiada con fondos provenientes del proyecto DGI Interacciones moleculares en la fecundación del Camarón de roca Rhynchocinetes typus, a cargo del Profesor Enrique Dupré.

LITERATURA CITADA

1.- Almendras, F. 1993. Ensayo de un sistema de criopreservación de semen de salmonideos aplicado a la trucha Arco Iris (Oncorhynchus mykiss). Tesis de grado para obtener el grado de Licenciado en Medicina Veterinaria. Universidad Austral de Chile.47 pp.

2.- Anchordoguy, T.; Crowe, J.; Griffin, F. & Clark, W., 1988. Cryopreservation of sperm from the marine shrimp Sicyonia ingentis. Cryobiology, 25: 238-243.

3.- Anil, A.; Tulaskar, D.; Khandeparkar, D. & Wagh, A. 1997. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology, 34: 1131-140.

4.- Asahima, E. & Takahashi, T. 1978. Freezing tolerance in embryos and spermatozoa of the sea urchin. Cryobiology, 15: 122-127.

5.- Babiak, I.; Glogowski, J.; Luczynski, M.; Kucharczyk, D. & Luczynski, M. 1995. Cryopreservation of the milt of northern pike. Journal of Fish Biol. 46: 819-828.

6.- Baynes, S. & Scott, A. 1987. Cryopreservation of Rainbow trout spermatozoa: The influence of sperm quality, egg quality and extender composition on post-thaw fertility. Aquaculture, 66: 53-67.

7.- Bougrier, S. & Rabenomanana, L. 1986. Cryopreservation of spermatozoa of the Japonese oyster, Crassostrea gigas. Aquaculture, 58: 277-280.

8.- Chao, N. Chiang, Ch. ; Hsu, H.; Tsai, Ch. & Lin, T. 1994. Toxicity tolerance of oyster embryos to selected cryoprotectants. Aquat. Living. Resour. , 7: 99-104.

9.- Chao, N-H. ; Lin, T-L. ; Chen, Y-J. ; Hsu, H-W. ; Liao & I-CH. 1997. Cryopreservation of late embryos and early larvae in the oyster and hard Clam. Aquaculture, 155:31-44.

10.- Chereguini, O.; Fernández, P.C. & Rasines, I. 1992. Adaptación de la técnica de criopreservación de esperma para el Rodaballo(Scohthalmus maximus) y Besugo (Pagellus bogaraveo). Instituto español de Oceanografía, 117:1-11.

11.- Chow, S.; Taki, Y. & Ogasawara, Y., 1985. Cryopreservation of spermatophore of the fresh water shrimp, Macrobbrachium rosenbergii. Biological Bulletin, 168:471-475.

12.- Ciereszko, A.; Ramseyer, L. & Dabrowski, K. 1993. Cryopreservation of perch semen. The Prog. Fish. Cult. 55: 261-264.

13.- Cloud, J.; Miller, W. & Levanduski, M. 1990. Cryopreservation of sperm as a means to store salmonid germ plasm and to transfer genes from wild fish to hatchery populations. The Prog. Fish. Cult. 52: 51-53.

14.- Conget, P.; Fernández, M; Herrera, G. & Minguell, J. 1996. Cryopreservation of Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa using programmable freezing. Aquaculture, 143:319-329.

15.- Dupré, E. 1998. Toxicidad de diferentes crioprotectantes sobre espermatozoides y larvas de ostras y ostiones, Crassostrea gigas y Argopectem purpuratus. Informe de avance. Dirección general de Investigación y Cooperación Técnica. Universidad Católica del Norte. (DGI-UCN)

16.- Dupré, E. & Espinoza, C. 2000. Determinación del porcentaje de fecundación del Ostion del Norte Argopectem purpuratus, utilizando espermatozoides criopreservados. Informe Final Proyecto DGI-UCN.

17.- Fuentes, I., 1988. Desarrollo y morfología externa comparada de larvas y postlarvas de Mesodesma donacium y Mulina sp (Bivalvia: Mactracea) cultivadas en laboratorio. Tesis de licenciatura. Universidad Católica del Norte, Sede Coquimbo. 71 pp.

18.- Graybill, J. & Horton, H. 1969. Limited Fertilization of Steelhead trout eggs with Cryo-Perserved sperm. Journal Fish. Res. Bd. Canada. 26 (5): 1400-1404.

19.- Harvey, B. 1983. Cryopreservation of Sarotherodon mossambicus spermatozoa. Aquaculture. 32: 313-320.

20.- Hotz, . 1993. Cryopreservation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) sperm: practical recommendations. Aquaculture. 110: 97-100.

21.- Hoyle, R & Idler, D. 1968. Preliminary results in the fertilization of eggs with frozen sperm of atlantic salmon (Salmo salar). J. Fish. BD. Canada. 25: 1295-1297.

22.- Kurokura, H.; Namba, K. & Ishikawa, T. 1990. Lesions of spermatozoa by cryopreservation in oyster Crassostrea gigas. Nippom Suisan Gakkaishi. 56(11): 1803-1806.

23.- Lovelock, J. & Bishop, M 1959. Prevention of freezing damage to living cells dimethyl sulfoxide. Nature, 183:1394-1395.

24.- Meryman, H.1971. Cryoprotective agents. Cryobiology, 8: 173-183.

25.- Munizaga, M. 1995. Morfología gamética y fecundación en Mesodesma donacium (Lamarck, 1818) (Mollusca: Bivalvia: Mesodesmatidae). Tesis para obtener el Título profesional de Biólogo Marino, Universidad Católica del Norte, Sede Coquimbo.

80 pp.

26.- Osorio, C. & Bahamonde, N., 1968. Los moluscos Bivalvos en las pesquerias nacionales Chilenas. Biología Pesquera, Chile, 3:69-128.

27.- Ott, A. & Horton, H. 1971. Fertilization of chinook salmon eggs with cryo-preserved sperm. Journal Fish. Res. Bd Canadá. 28: 745-748.

28.- Pillai, M; Yanagimachi, R. & Cherr, G., 1994. In vivo and in vitro initiationn of sperm motility using fresh and cryopreserved gametes from the pacific herring, Clupea pallasi. The Journal of Experimental Zoology, 269: 62-68.

29.- Piiromen, J. 1987. Factors affecting fertilization rate with cryopreserved sperm of withefish ( Coregonus muksun Pallas). Elsevier Scien. Publ. B. V. 66: 347-357.

30.- Piiromen, J. Cryopreservation of sperm from brown trout (Salmo trutta m. lacustris L.) and artic charr (Salvelinus alpinus L.)

31.- Ramlov, H. & Hvidt, A., 1992. Artemia cists at subzero temperatures studied by differential scanning calorimetry. Cryobiology, 29: 131-137.

32.- Ramlov, H. & Westh. P. 1992. Survival of the Cryobiotic Eutardigrade adorybiotus coronifer during cooling to -196ºC: Effect of cooling rate, Trehalose level, and short-term acclimation. Cryobiology, 29:125-130.

33.- Renard, P. 1991. Cooling and freezing tolerances in embryos of the Pacific oyster Crassostrea gigas: metanol and sucrose effects. Aquaculture, 92:43-57.

34.- Renard, P. & Cochard, J. 1989. Effect of various cryoprotectans on Pacific oyster Crassostrea gigas Thumberg, Manila clam Ruditapes philippinarum. Reeve and King scallop Pecten maximus (L) embryos: Influence of the biochemical and effects. Cryo- Letters, 10: 169-180.

35.- Richardson, G.F.; Wilson, C.; Crim, L. & Yao, Z. 1999. Cryopreservation of yellowtail flounder (Pleuronectes Ferrugineus) semen in large straws. Aquaculture, 174 : 89-94.

36.- Ritar, A. 1999. Artificial insemination with cryopreserved semen from striped trumpeter (Latris lineata). Aquaculture, 180:177-187.

37.- Santarius, K. & Giersch, C. 1991. Cryopreservation of spinach chloroplast membranes by low-Molecular-Weight carbohydrates. Cryobiology, 20: 90-99.

38.- Sernapesca, 1999. Anuario estadístico de pesca. Servicio Nacional de Pesca. Ministerio de Economía, Fomento y Reconstrucción. 291 pp.

39.- Steyn, G. & Van Vuren, J. 1987. The fertilizing capacity of cryopreserved sharptooth catfish (Clarias gariepinus) sperm. Aquaculture. 63: 187-193.

40.- Storey, K. 1990. Life in a frozen state: adaptive strategies for natural freeze tolerance in amphibians and reptiles. American Physiol. Soc., 559-568

41.- Stoss, J. & Holtz, W. Cryopreservation of rainbow trout (Salmo gairdneri) sperm. Aquaculture. 32: 321-330.

42.- Thorogood, J. & Blackshaw, A. Factors affecting the activation, motility and cryopreservation of the spermatozoa of the yellowfin bream, Acanthopagrus australis (Günther). Aquaculture and Fish. Manag. 23: 337-344.

43.- Toledo, J. & Kurokura, H. 1990. Cryopreservation of the euryhaline rotifer Brachionus plicatilis embryos. Aquaculture. 91: 385-394.

44.- Toledo, J.; Kurokura, H. & Nakagawa, H. 1991. Cryopreservation of different strains of he euryhaline rotifer Brachionus plicatilis embryos. Aquaculture, 57(7): 1347-1350.

45.-Toyoda, Y. 1986. Principios de criopreservación de oocitos y embriones de mamíferos. Compendio del curso de criopreservación de embriones de mamíferos 1986. Universidad Austral de Chile, Pp. 52-66.

46.- Yankson, K. & Moyse, J. 1991. Cryopreservation of the spoermatozoa of Crassostrea tulipa and three other oysters. Aquaculture, 97: 259-267.

47.- Yao, Z.; Crim,L.; Richardson, G. & Emerson, C. 2000.Motility, fertility and ultrastructural changes of ocean pout (Macrozoarces americanus L.) sperm after cryopreservation. Aquaculture, 181:361-375.

48.- Zell, S.; Bamford, M & Hidu, H. 1979. Cryopreservation of spermatozoa of the american oyster, Crassostrea virginica Gmelin. Cryobiology. 16: 448-460.

49.- Yoo, B.; Ryan, M. & Wiggs, J. Loss of protein from spermatozoa of atlantic salmon (Salmo salar L.) because of cryopreservation. Can. J. Zool. 65: 9-13.