BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Definición: conjunto de técnicas, de cualquier tipo, empleadas sobre vegetales como

organismos enteros o sobre alguna de sus partes (moléculas, tallos, orgánulos, hojas…)

Objetivos: mejorar las especies, obtener nuevos productos, obtener de una especie productos

minoritarios útiles para la industria.

Cultivo “in Vitro”: base de la biotecnología. Consiste en el cultivo de partes de una planta

sin tener la planta. Se realiza a partir de zonas meristemáticas (que poseen células similares a las células madre en animales). Estos meristemos tienen la capacidad de cultivarse y dividirse en determinadas condiciones. Mediante técnicas de cultivo, si tomo un explanto (fragmento de una planta) y lo coloco en un medio adecuado, se induce la formación de una nueva planta sin la necesidad de semillas… .Estas plantas se llevan a maceta donde se desarrollan.

aplicaciones del cultivo “in Vitro”:

• propagación de especies en vías de extinción

• conservar y cultivar especies de mucho valor

• obtener plantas libres de enfermedades cultivando el meristemo

apical, que no tiene conexión con el resto de la planta y está libre de microorganismos.

• micropropagación (propagación vegetal “in Vitro”) rápida de

plantas ornamentales que tenemos en tubos de cultivo y fácilmente se pueden llevar a otros piases y allí se colocan en invernaderos.

• Obtención de híbridos incompatibles sexualmente, juntamos

genomas de 2 plásmidos diferentes, que serán HÍBRIDOS SOMÁTICOS.

• Obtención de plantas homocigóticas rápidamente; sembramos “in

Vitro” óvulos, obtenemos la mitad de los genes (haploides), damos colchicina y obtenemos un individuo diploide.

• Transformaciones genéticas: introduciendo genes que nos

interesan

• Almacenamiento de plantas en poco espacio

• Uso de plantas (previamente transformadas) para purificar agua,

mejorar el suelo, eliminar compuestos tóxicos, metales…)

Asepsia

fuentes de contaminación:

material plástico: se compra estéril

material de vidrio: si es nuevo se lava con agua desionizada, si se

reutiliza lavar en autoclave (121º) o estufa (140º)

material metálico; en autoclave a 120º, también al alcohol a fuego.

Medio de cultivo: en autoclave a 120º 15 min. Si hay sustancias

termolábiles no se puede usar autoclave, una vez preparado se hace pasar por cámara de flujo laminar con filtro estéril.

Material biológico: asepsia superficial con lejía, luego eliminar las

células dañadas, las semillas en alcohol etílico (20 seg.) y se evapora al aire. También podemos usar detergentes

Área de trabajo y cultivo: el cultivo se desarrolla en una cámara de

aire forzado. El uso de luz UV mantiene la asepsia, pero el 03 liberado es tóxico. Las placas se sellan con parafilm.

Procedimiento

limpiar el material con agua

preesterilización: 5-30 seg. con etanol

desinfección con agente tensioactivo

lavar con agua estéril

disección con material con pinzas estériles (flambear)

cerrar y sellar placa con film de parafina

pruebas de esterilización

• Enturbiado (medio líquido)

• Aparición de colonias

• Mal olor

preasepsia. Para evitar posible contaminación: almacenamiento en frío,

estimulación climática, tratamientos preculturales

Medios de cultivo: el más habitual es el medio MS, aunque no existe el medio perfecto.

Puede ser: Sintético: formados por componentes perfectamente definidos.

Complejos: formado por algún compuesto no definido.

Están formados por:

nutrientes orgánicos: sales de fosfato, N en forma de nitrato o amonio, Fe a

pH= 5.2. se recurre a quelantes.

Nutrientes orgánicos: fuente de energía porque no hacen fotosíntesis, fuente

de C: sacarosa, fructosa, poli OH… vitaminas: biotina, tiamina.

Sustancias reguladoras del crecimiento: auxinas (naturales= AIA o

sintéticas=2,4 -D)

Citoquininas (naturales

=ZEA o sintéticas= KIN).

gelificación: añadir gelificante en medio semisol.

Condiciones físicas: luz/ oscuridad .Tª de 25º. Gases: sin problemas excepto por

la acumulación de etileno.

Niveles de modificación

Molecular

A nivel genómico: mapeado y aislamiento de genes de interés.

• mapeado: identificar genes de un rasgo determinado (tamaño). Arabidopsis

thaliana, Pirus taeda: deforestación)

• aislamiento: los genes puede ser que se expresen

• constitutivamente: siempre y en todos los sitios.

• Selectivamente: sólo en una parte (fase) por ej. Cuando florece.

Podemos hacer que un gen constitutivo se exprese selectivamente, también

podemos silenciar los genes (que no se expresen): interesa que la almendra no produzca amigdalina.

Control de rutas metabólicas

• se puede modificar la actividad enzimática.

• se pueden potenciar rutas minoritarias, obteniendo metabolitos secundarios.

• hacer que una planta deficitaria en aá no lo sea.

• mejorar la ruta de las proteínas

Desarrollo y diferenciación

• favorece el crecimiento de plantas en condiciones diferentes a las de su

naturaleza

• favorecer el crecimiento en raíces

•controlar la talla (pinos más largos y menos ramificados)

• captar energía para incrementar la biomasa

• hacer que los frutos duren más tiempo tras su recogida

Interacciones con el medio

• el medio puede ser :abiótico, biótico(insectos, hongos)

• conseguir plantas resistentes al calor y tolerantes al frío

• plantas resistentes al ataque de patógenos

-formando FITOALEXINA

- lanzando compuestos al aire

- organismos que protegen

•plantas resistentes a la salinidad, a la sequía

Estructural (crecimiento)

• para ello, incidimos sobre los parámetros que hacen crecer a la planta.

• Las plantas pueden crecer: aumentando el número de células y aumentando

el tamaño de las células.

El crecimiento de una planta es el sumatorio de los procesos de división celular y diferenciación celular. Con la división se aumenta el número de células. Con la diferenciación, incrementa la diversidad celular, no incrementa la materia orgánica.

• el crecimiento celular dependerá (la diferenciación): de relación de

crecimiento, dirección de crecimiento y capacidad de división.

• Para que una célula vegetal crezca hay que ablandar la pared celular, esto se

consigue, disminuyendo el pH, con auxinas, acción enzimática. Ha de ablandarse pero no en exceso.

• Una vez ablandada, se van depositando capas de celulosa de forma: apical

(células alargadas y plantas de gran porte) o difusa (en tallos, frutos, crecimiento en grueso). La depositación la dirigen los túbulos que forman el citoesqueleto celular.

• La división celular da lugar a la formación de una capa de células, la

división también está algo influenciada por los túbulos, si rompemos el plano de división creado por los túbulos: crecimiento anárquico. La división también está influenciada por la luz, el calor…

• El núcleo condiciona la estructura del vegetal:

• FITÓMERO: estructura entre 2 hojas, formado por nudo, entrenudo,

hoja y yema.

• ÁPICE: zona apical por donde crece la planta, también controla la

salida de hojas

• CÉLULAS TRAQUEALES: células conductoras. Su producción está

controlada por túbulos.

• CÉLULAS TOTIPOTENTES: células susceptibles de mantener sus

genes y reiniciar su división

Técnicas más habituales en cultivo “in Vitro”

Por semillas

Por esquejes

Por biperismo las células vegetales, al ser totipotentes,

vegetativa cualquier parte de la planta vale para

proliferar

ORGANOGÉNESIS: ruta que conduce a la diferenciación de meristemos que originarán tallos o raíces adventicias, respectivamente.

Hay que regenerar la planta (organogénesis). Cojo yemas auxiliares, para conseguir una planta clónica. Es un proceso rápido, muy útil para plantas de mucho valor (sólo obtenemos tantas plantas como yemas hay). Estas yemas en un medio adecuado dan tallos.

También podemos promover la formación de tallos adventicios (tallos que no había). Esto se hace cogiendo un explanto que se somete a unas condiciones adecuadas, inicialmente tengo un callo (masa de células indiferenciadas) en los bordes o lesiones del explanto, tras un tiempo se formarán internamente. Tras un tiempo aparecen órganos (dependiendo de si en el medio hay auxinas o citoquininas).

Puede haber organogénesis directa: cuando los órganos se originan directamente del explanto en ausencia de proliferación del callo, aunque normalmente es indirecta.

Puede haber variación somoclonar cuando hay células que mutan espontáneamente.

También podemos recurrir a la embriogénesis somática, con el fin de obtener embriones somáticos (es una ruta alternativa a la organogénesis). Un embrión somático se forma en el cuerpo de la planta por los diferentes tratamientos, son estructuras bipolares. Para que se forme un embrión somático, hay que inducirlo, el principal inductor son las hormonas.

Puede haber embriogénesis directa: si en la superficie del explanto se forma directamente el embrión.

Puede haber embriogénesis indirecta: si en la superficie del explanto, se forman callos y sobre este callo surge el embrión. La embriogénesis puede ser:

zigótica: el zigoto está dentro de la planta protegido por ella.

Somática: es más variable.

Para inducir la formación de un embrión somático es imprescindible un tratamiento con auxinas (2,4-D) y una vez que se ha inducido el crecimiento del embrión hay que retirarles del medio ya que en vez de estimularse, se inhibe. Además de auxinas, en el medio ha de haber Potasio y Prolina que desarrollan algo más los embriones.

Para el desarrollo y maduración del embrión podemos utilizar 2 medios, líquido o sólido.

Las auxinas hacen que se formen células más densas de los normal que son las que luego darán el embrión. Cuando quitamos las auxinas se forman glomérulos de células: FASE GLOMERULAR DE EMBRIÓN. Los glomérulos pasan por distintas fases:

Estado de corazón fase de torpedo estado cotiledón embrión

Diferencias entre embriogénesis /organogénesis:

• EMBRIÓN: estructura bipolar, surge normalmente a partir de una célula,

ápices cerrados y hay conexión entre ellos.

• ÓRGANO: formación de estructura monopolar, surge a partir de de varias

células, tallos y raíces se forman de modo independiente, ápices sin cerrar.

• EMBRIÓN CIGÓTICO: de embrión pasa a semilla

• E. SOMÁTICO: de embrión pasa directamente a planta

Obtención de plantas haploides:

Las plantas haploides tienen la mitad de la dotación cromosómica y no suelen ser viables. Podemos obtener: plantas androgénicas (2n) a partir del polen (n) o plantas ginogénicas(2n) más viables pero más difíciles de manejar a partir del óvulos(n).

• ANDROGÉNESIS: obtener una planta a partir del polen. No hay que esperar

a que se forme el polen, quito las antenas y la coloco en un medio adecuado, pueden ocurrir 2 cosas: que se forme callo, embrión (n), o que haya embriogénesis directa, embrión (n), aunque también pueden ser 2n. Si cultivo el polen se forma un embrión n, nunca uno 2n. Para ver si la planta formada es n o 2n lo hacemos por citometría, flujo, PCR…

• MICROSPOROGÉNESIS: formación normal del polen

• CULTIVO NODRIZA: cultivo en el que se aprovecha un cultivo previamente

hecho como soporte.

• GINOGÉNESIS: obtener una planta a partir del óvulo. Obtenemos plantas

más verdes mientras que en la androgénesis hay 60% albinas, sin clorofila que no proliferan. Es más complicado porque no es fácil separar el óvulo nitidamente.

• Fecundación de 2 plantas filogenéticamente separadas, perdemos una

dotación cromosómica(n)ej. Hard vulgare+ h. Bulvoso.

Cultivo de órganos: raíz + agrobacterium rizogeus: obtenemos raíces peludas que son muy estables.

1. INGENIERÍA GENÉTICA, TRANSFORMACIÓN Y MANIPULACIÓN: la técnica consiste en:

Identificar los genes: una manipulación genética puede ser aditiva o eliminativo.

Extracción del gen: se necesita una secuencia determinada que se corta con enzimas de

restricción que son enzimas específicas de secuenciación que cortan por un punto determinado

Multiplicación: amplificación, para ello introduzco el gen en una bacteria y así se

obtienen muchas copias.

Introducción del gen en una planta (formas alternativas):utilizo algún vector (bacteria,

virus…) lo más habitual es introducirlo en un plásmido (se corta la parte del plásmido que interesa y se introduce un gen, así ya se tiene el gen en la bacteria) cuando la bacteria ataque la planta, introduce el gen, que va al genoma de la planta. El vector más usado es el Agrobacterium.

Otras alternativas son : bombardeo con partículas, proyectar partículas a gran velocidad para que se introduzcan en las células: MICROBIOLÍSTICA. Las partículas pueden ser An (caras, regulares y uniformes) o Tusteno (baratos pero irregular). Estas partículas se recubren con el gen que yo quiero meter, la ventaja es que no hay que liminar bacterias con Ab.

Otro sistema es la ELECTROPROPAGACIÓN: utilización de protoplastos y una serie de liposomas. Mediante una corriente eléctrica los liposomas se fusionan (con el gen dentro) con la membrana del protoplasto (célula vegetariana sin pared celular) y así el gen puede llegar al núcleo. También con jeringas

Eliminación de la bacteria: con Ab una vez el gen está dentro de la planta

Regeneración de la planta. Marcadores. Planta transgénica: lo primero es saber qué células contienen el gen, eso es sencillo porque en el gen que nos interesa, existe además del promotor y una fase Terminal, tiene un gen marcador o de sección.

TIPO DE MARCADORES:

• de resistencia: por ej. La KANAMICINA: las células que presenten resistencia a la Kanamicina, serán los que contienen el marcador y por lo tanto nuestro gen. Esto se ha rechazado porque puede resultar peligroso para los hombres

• de coloración: se usan dos

• gen productor de antocianinas: las células se ponen de color azul

• gen de la glucorinato sintetasa (GUS): las células con este gen, en presencia de un sustrato comercial, liberan un colorante azul que no es permanente.

• de fluorescencia: hay que irradiar con luz UV

• gen de la luciferasa: irradian fluorescencia

• proteína fluorescente verde (GFP): luminosidad verde.

Una vez que tengo las células con un gen, regenero la planta y ya se tiene una planta transgénica (plantas obtenidas artificialmente mediante técnicas de ingeniería genética, alterando alguno de sus genes con el fin de obtener algún tipo de beneficio)

Se ha encontrado una alternativa que consiste en introducir los genes en los cloroplastos y no en el núcleo celular, ya que los cloroplastos son específicos de células vegetales.

Ventajas de introducir los genes en los cloroplastos:

Los genes se introducen en los cloroplastos de forma definida y no al azar

Una célula vegetal tiene muchas copias del cloroplasto, es más rentable

La síntesis que se produce en los cloroplastos, no va a afectar al resto de la célula

Hay menor posibilidad de contaminación con genes extraños si transforma los cloroplastos

2. LOGROS Y POSIBILIDADES DE LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

2.1 En agricultura:

- domesticación de plantas: en este caso se abandona una variedad de beneficio de otra.

.- el maiz antes tenía muchas espigas y pocos granos, ahora se ha conseguido que con 2 espigas tengan más granos.

.- hay una serie de genes que se transmiten juntos, si se logra contar todos, tendremos una planta domesticada, pero no es posible en todos los casos.

- conseguir más a menos coste: manipulando la siembra, el riego…aumentando la producción.(aumenta el potencial genético)

- semillas resistentes a determinadas hervicidas

-conseguir nuevas variedades

- hacer plantas tolerantes a determinados alimentos o resistentes a sustancias tóxicas (aluminio citratosintetasa)

- microrizas: hongos sobre las raíces principales, hacen que exista una capa húmeda.

-infectar la planta con organismos que capten N2 y así la planta puede fijar N2.

-favorecer la absorción de H2O variando el diámetro radicular mediante modificación hormonal, regular tamaño de hoja y modificando los sistemas estomáticos.

-plantas resistentes a agentes biológicos para no tener que hacer uso de pesticidas.

Resistente a:

Virus: hacer que la planta exprese genes sin sentido. Explanaos sin virus para obtener la planta

Bacterias: con la producción de fitoalexinas que son componentes antimicrobianos de bajo Pm, que se sintetizan y acumulan en las plantas después de la exposición al organismo. Su producción se dispara por la acción de los ELICITORES.

Hongos: producción de Ab. Haciendo que se exprese la estilbeno sintetasa que provoca la síntesis de resveratol que inutiliza al hongo(en la vía). Producción de quitinasa que destruye al hongo mediante lisis (arroz resistente al hongo)

Insecto: se puede usar baculovirus: el insecto se lo come y muere

Insecticidas naturales: el Bacillus Thurigensis, al esporular produce un cristal que si es comido por el insecto, destruye su interior.

Nemátodos: casi todos los nematicidas están prohibidos

Plantas resistentes a Ab:

• Tº: introducir genes CORI 5ª que la hacen resistente al frío.

• segura: introducir genes mesembriaterum (de zonas desérticas)

• hervicidas: introducir genes BAR: tolerancia a fosfatos

2.2 En alimentación : interesa eliminar agentes que afecten a la cosecha, hacer que el coste sea menor que la producción, aumenta el consumo de otros vegetales, aumenta el tamaño de los sumideros (alta producción alimentos/hectárea) alta calidad de los alimentos.

- proteínas:

• Animales: más completas

Más caras

•Vegetales: más carencias -cereales: déficit de Lys

Más barata - legumbres: déficit de aá azufrados

- alfalfa: déficit de aá azufrados

Hacemos modificaciones introduciendo genes que aumenta el contenido en aá deficitarios.

- patatas transgénicas ricas en triptófano

- colza americana rica en lisina

- alfalfa rica en aá azufrados= mejor lana

- girasoles ricos en metionina

- trigo con más gluten para harinas diferentes

- grasas:

•alargar la cadena de ácidos grasos; soportan mejor el calor y así podemos reutilizar el aceite.

•se potencian los de tipo oleico

- glúcidos:

• muchas o pocas ramificaciones del almidón para bollería, pan…

• transformar celulosa en fructano que no aporta calorías???

• menos cantidad de lignina (sabor desagradable) introduciendo un gen sin sentido/ contrasentido.

• alfalfa con fitasa que mejora el metabolismo

- carotenoides:

•usando genes (narciso y agrobacterium) se han conseguido arroz con carotenos que no hay en el arroz corriente y que provoca avitaminosis en Asia.

•astaxantina que da color rosita al salmón.

- minerales:

• gen de la ferritina introducido en el arroz, así aporta 100 veces más de Fe.

•eliminar cianoalanina (latinismo)de alimentos

•mediante cruces se ha obtenido la colza doble O que no posee ácido erúcico (malo)

- frutos y semillas:

• frutos que duren más tiempo: flave-save: tomates que duran incluso un mes, alterando peptidasas.

• flores que duren más tiempo: actuando sobre receptores de etileno

• frutos sin semillas: para mejorar el paladar, facilitar elaboración de tomates, Ketchup…, actuando sobre auxinas.

• café descafeinado del árbol: introducción de xantin-7-transferasa (enzima productora de cafeína) que es una enzima sin sentido (café con 1- 2% cafeína)

NORMAS DE LA OMS PARA EL CONSUMO DE TRANSGÉNICOS:

1- No contener sustancias peligrosas

2- No superar la toxicidad permitida

3- Advertir la presencia de compuestos nuevos o alergénicos

2.3 Industriales

- grasa vegetal/aceites usados como combustibles (diesel) o lubricantes en hidráulica.

-aceites que valen como aislantes, adhesivos, emulsionantes.

-obtener algodón de colores, usando determinados genes, son plantas de algodón transgénicas

- detergentes: la subtilisina es una enzima que destruye la grasa, se está modificando para que además sea resistente a la lejía.

-aditivos y colorantes

-espesantes

-obtención de plásticos biodegradables mediante bacterias que son capaces se síntesis de polihidroxivaleratas.

2.4 En sanidad:

.- glucobrassicina: protege el estómago

.- cataratas: antileucémico

.- obtención de vacunas orales

.- en tomate se ha introducido el gen spaA del tabaco que inhibe la adhesión a piezas dentales (menos caries)

2.5 En el medio ambiente.

a. fitorreparación: sólo es necesario agua y sal, se eliminan metales, disolventes…

.- corregir los malos efectos del MAN

.- FITOEXTRACCION: las plantas toman productos y los acumulan en la parte aérea, se cogen, se queman y se eliminan. El gen “mer P” y “mer T” eliminan compuestos orgánicos de Hg que son muy tóxicos.

.-RILOFILTRACIÓN: las raíces, al filtrar el agua acumulan compuestos.

.-FITOESTABILIZACIÓN: mediante el uso de compuestos que liberan las raíces se estabilizan y solubilizan los metales.

.- FITOVOLATILIZACIÓN : los compuestos que se abs por el agua, se expulsan al aire y se degradan.

.- RIZODEGRADACIÓN: las raíces, al ir avanzando remueven la tierra y captan sustancias que las bacterias usan para degradar sustancias tóxicas.

b. fitodegradación: * control hidráulico, mediante:

1. bombas hidráulicas: aprovechar el efecto de la transpiración para hacer pasar por la planta mucha agua.

2. Corredores ribereños: usando por ejemplo álamos con baja concentración de nitratos de 150 mg/l a 3 mg/L.

2.6 Vitaminas hidrosolubles

2.7 Ética en biotecnología vegetal:

. Riesgo : ha de ser menor que el beneficio

. principio de autonomía: el paciente o la población ha de estar informada

. Principio de justicia: los beneficios han de ser para todos

. Información: ha de ser veraz y dada por el científico

a. riesgos o problemas que dan las plantas transgénicas: hay que ver si el riesgo es en el producto final o en el hombre. Se exige que el riesgo se detecte antes de que el producto se use, aunque en muchos casos no es detectable.

1. problema para el hombre: que se produzcan toxinas y alergias

2. problemas para el ambiente: al introducir genes extraños en una planta, puede ocurrir: muerte de la planta, la planta se asilvestra, se pasen genes de una planta a otra= flujo transversal (sólo en plantas que se polinizan por el viento) de genes, de 3 formas:

• polen

• restos de la planta

• exudado de hojas o raíces

O por último apilamiento de genes: que se encuentren los genes que hemos introducido por transgénesis con los que la planta ha cogido de las plantas próximas.

b. patentes: propiedad intelectual: se pueden patentar productos y procesos pero no la vida, las patentes se hacen para recuperar la inversión hecha en la investigación.

Las patentes han de cumplir unos requisitos:

1. exclusión

2. innovación: se patentan descubrimientos totalmente novedosos.

3. reproducibles: se han de poder repetir

4. subjetividad: en cada país hay unos requisitos

5. limitación en el tiempo: normalmente 10 años.

Hay que etiquetar los transgénicos obligatoriamente, en EEUU no es obligatorio.

3. CULTIVOS LÍQUIDOS: se utilizan para el cultivo de órganos (tallos, raíces) y células.

3.1 Cultivo de órganos: explanto (plántula) da callo y de ahí raíces y tallos

• El cultivo de tallos se utiliza para la formación de metabolitos secundarios.

• El cultivo de raíces se utiliza para el estudio de los requerimientos nutritivos del vegetal y para la producción de metabolitos secundarios

• Se necesita plántula joven (formada en condiciones de asepsia), se asila la raíz y se corta en pequeñas secciones, lo que nos interesa es el meristemos apical (que no tiene conexión con el resto de la planta y estará libre de org). Se coloca en un medio adecuado con fuente de C (sacarosa) y tiamina, así se forma el callo.

Al cabo de un tiempo crecen raíces laterales/tallos.

Subcultivo, se realiza cortando los ápices de las nuevas raíces laterales y así sucesivamente.

La única diferencia fisiológica entre una raíz de laboratorio y una normal es que nunca se forman raíces con crecimiento secundario en el laboratorio y que se pierde la respuesta gravitrópica

3.2 Cultivo de células:

• Células aisladas en un medio líquido: suspensión celular. Este tipo de cultivo proporciona células relativamente homogéneas que crecen en un líquido de composición definida. El contacto con los nutrientes es grande porque deben crecer con agitación y se facilita el intercambio gaseoso entre el medio y la población. A este medio nutritivo se le pueden añadir productos exógenos fácilmente: modificando el crecimiento celular.

• Cualquier órgano puede ser donante de células, las células se aíslan de forma mecánica (raspando, incisiones…) o por tratamiento enzimático (tto con pectinas que degradan la pectina que las une=

• Generalmente a partir del órgano se forma el callo y si este es suficientemente friable, en un medio adecuado y con agitación, las células se separan.

•El medio de cultivo es similar al de formación de callos (fuente de C, tiamina, hormonas..)

• Se lleva a la cámara de cultivo

• Se cámara de crecimiento aproximadamente 2 semanas

• Una vez incubadas se puede hacer el subcultivo

* Si queremos que el proceso sea más rápido y que crezcan más células, lo que hacemos es transferir un poco de células formados a un medio líquido.

3.3 Caracterización de suspensiones celulares: curva de crecimiento

DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO

CURVA SIGMOIDEA

FASE 1: FASE DE LATENCIA (LAG): no hay división celular

FASE 2: FASE EXPONENCIAL O LINEAL: división celular muy activa

FASE 3: FASE ESTACIONARIA: casi no hay división

FASE DE LATENCIA: preparación de las células para la división

! ATP y ! NADPH

!invertasa, enzima que rompe sacarosa en glucosa y fructosa. Pequeños aumento de RNA

FASE EXPONENCIAL: ! síntesis de ácidos nucleicos.

FASE ESTACIONARIA: la división disminuye y los nucleótidos se estabilizan. Gran consumo de nutrientes

Se producen metabolitos secundarios, la producción de metabolitos secundarios está asociada a la diferenciación celular que no es más que una diferenciación metabólica.

3.4 Técnicas para conocer la cinética de crecimiento.7+ ensayos de tinción diferencial.

1. Aumento de peso: peso seco/peso fresco

2. Contaje de células: cámara de recuento (muy fiable)

3. Calcular el volumen celular de empaquetamiento: por sedimentación tras centrifugación y midiendo la altura del sedimento.

4. Contenido en proteínas y DNA: observar en qué fase están las células

5. Conductividad del medio: disminuye según envejece la población celular

6. Viabilidad celular: va disminuyendo

* ENSAYOS DE TINCIÓN DIFERENCIAL:

1. TINCIÓN POSITIVA: tinción de células vivas

a: Cloruro de trifenil tetrazolium: incoloro en solución y al reducirse queda rojo (las mitocondrias reducen el compuesto y la célula queda roja)

b: Diacetato de fluoresceína: incoloro en forma de sal, pero al liberar la fluoresceína se queda fluorescente. Las células tienen actividad estearasa en su membrana y rompe el enlace ester, por lo que quedan células fluorescentes. Es necesario un microscopio de fluorescencia.

2. TINCIÓN NEGATIVA: tiñen células muertas

a. Azul de Evans: tiene alto Pm y es rechazado por las células vivas. Entra en células muertas porque su membrana ya no es selectiva.

7. Consumo de nutrientes: valoración de azúcares totales, nitratos y fosfatos.

3.5 Cultivos celulares en suspensión

a. discontinuos: a lo largo del tiempo, va variando la composición del medio, también varía la población y el metabolismo celular

b. continuos: se va añadiendo medio frasco continuamente (a distinta temperatura), la composición del medio no varía. Con la población ocurren dos cosas:

1. CERRADOS: aumenta la población celular porque se can recuperando las células que salen con el medio

2. ABIERTOS: no hay aumento de población.

APLICACIONES DEL CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN:

Modelo para estudio de las rutas de metabolitos secundarios.

Para estudio de enzimas y asilamiento de genes

Purificación enzimática

Manipulación bioquímica, lo que permite incrementar la síntesis de determinadas sustancias.

Realizar estudios de replicación de DNA

Aislamiento de mutantes

Selección de líneas tolerantes al stress

Selección de líneas resistentes a hervicidas, Ab…

Usos industriales: producción de metabolitos secundarios

Producción de productos no nativos

Biotransformación

Aislamiento de mutantes y variantes:

Puede que en una planta se den mutaciones espontáneas. Podemos encontrar:

• Mutaciones: son raras y ocurren con poca frecuencia. Consiste en

un cambio en la secuencia de bases de un gen. Son estables y heredables.

• Cambios cromosómicos: frecuentemente nos encontramos con :

• eiploidías: cambio en el número simple de

cromosomas (ej. Síndrome de Down= 23n- por lo que quedan 47n)

• polipoidías: cambio en la dotación total de

cromosomas (ej. Planta 2n a 4n)

• translocaciones: un trozo de cromosoma normal se

separa y se une a otro cromosoma

• inversiones: se separa un trozo de cromosoma y se

vuelve a unir pero en sentido contrario.

• Mutaciones recesivas:(auxótrofo: necesita para crecer algún aminoácido)

Tiene la mutación pero no se observa fenotípicamente. Es difícil conseguir mutaciones recesivas. Pueden aislarse mediante:

• aplicación de selección positiva: añadir a la

suspensión el metabolito del que queremos conseguir células resistentes. Sólo sobreviven las células que confieran resistencia (mutantes resistentes). En la práctica es más difícil porque al añadir el componente tóxico lo normal es que el grueso de la población muera. Es complicado rescatar los mutantes resistentes. Para ello hacemos un PLANTING CELULAR y añadimos antimetabolito. Tomamos una alícuota. Se diluye con el medio de cultivo que contenga antimetaboliro y agar a 40º. Las alícuotas diluidas han de tener densidad conocida. Se dispersa en una placa petri. Como la concentración de células es escasa, las células quedan separadas y al incubar se producen células clones en colonias que serán resistentes al antimetabolito.

• Selección negativa: las células mutantes no

crecen. En un medio sin prolina (necesaria para el desarrollo de las células), se añadió bromouracilo (análogo de prolina). La población que se dividió era la salvaje. Se puso a la luz y el bromouracilo destruyó a las células con fenotipo salvaje y sobrevivieron los mutados que se rescataron mediante plating no selectivo.

• Agentes mutagénicos:

Se utilizan para aumentar la frecuencia de las mutaciones. Pueden ser:

• Agente químico: análogos de base (bromouracilo),

con muy alta toxicidad

• Agentes físicos: radiaciones con luz UV, rayos X y

rayos , que producen daños en los pares de bases del DNA.

Hay que dejar que el cultivo se exprese 2 o 3 generaciones para que se exprese la mutación.

CULTIVO DE UNA ÚNICA CÉLULA

Obtener un clon que provenga de una única célula se puede hacer mediante:

• Plating: no es fiable al 100% porque pueden caer 2 células juntas y no se

detectan. Lo mejor es sacar una célula con una pipeta y ver al copio.

• Cultivo nodriza: en un tubo de ensayo se cultiva el callo del que se ha

sacado la suspensión celular: se pone en un papel de filtro sobre el que se coloca una única célula. El callo dará todas las señales fisico-químicas y hormonales que la célula necesite para crecer. Para bloquear la división celular, el callo se irradia con luz UV.

• Técnica de la microcámara: variante del cultivo nodriza, usando un

medio acondicionado. Sencillo y barato. Sobre una porta se colocan los cubres que quedan levantados, entre ambos se pone una gota de parafina y sobre ella el medio nutritivo con una célula. Encima se pone un tercer cubre. Queda una cámara con un ambiente ideal para que la célula crezca y se divida el callo, lo que ocurre en medio sólido.

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PROTOPLASTOS

Un protoplasto es una célula vegetal desprovista de pared celular, se usan para hacer:

• estudios de regeneración de la pared celular

• estudios de regeneración de membranas

• estudios de transformación genética

• Aislamiento de protoplastos

• Hay que quitar la pared celular, lo mejor es un tratamiento enzimático que rompa los componentes de la pared, que son :

•polisacáridos: celulosa=celulasas; hemicelulosa= hemicelulasas; pectinas= pectinasas, en realidad es una mezcla de las 3.

• Hay que tener en cuenta que las células vegetales tienen una gran vacuola

llena de agua por lo tanto hay que mantener las condiciones osmóticas (medio hiperosmótico). Interesa que exista plasmólisis, se separa la membrana de la pared celular= medio hipertónico.

• Tener pH de 5.7 o 5.8, en oscuridad, tiempo de incubación de 4 a 24 h, Tª de

digestión es aproximadamente 24º= el proceso se acelera aumentando la temeperatura a 37ª

• Añadir soluciones protectoras ClCa y Cl2Mg en altas concentraciones

• El tejido determina que queramos obtener el protoplasto, ha de ser un tejido

joven, preferentemente tejido folial, además de ser una planta sana y vigorosa.

RESUMEN:

• Se incuba el tejido donador en un medio con agente osmótico (sorbitol

o manitol) y un protector de la membrana plasmática (Cl2Mg…). En 1hora se logra la separación de la membrana por plasmolisis (en medio hiperosmótico)

• El tejido plasmalizado se incuba en presencia de enzimas, en

oscuridad y a Tª ambiente durante 4 a 24 horas. Pasado ese tiempo tenemos: protoplastos, células rotas, células que no se han digerido, fragmentos de pared celular.

• Purificación de protoplastos: puede hacerse de dos formas:

• filtración-centrifugación: la mezcla se hace pasar por un

filtro donde quedan retenidos los fragmentos grandes. El filtrado se centrifuga y en el fondo queda lo que más pesa, normalmente protoplastos. Quitamos el sobrenadante y el sedimento se resuspende en el e medio de cultivo sonde se vayan a cultivar esas células. La centrifugación se repite 4 o 5 veces.

*INCONVENIENTES: en el 5º centrifugado se recupera poco; es un proceso largo; pueden romperse los protoplastos

• Flotación: se filtra y centrifuga para quitar la solución

enzimática, los protoplastos se resuspenden en una solución de sacarosa (alta densidad) y volvemos a centrifugar (10min). Los protoplastos son estructuras esféricas, las demás células no lo son. Al ser esféricas son menos densas, por lo tanto tras centrifugar los protoplastos quedarán en la superficie. Se recuperan con una pipeta y se comprueba que están vivos.

• Cultivo de protoplastos: hacemos un test de viabilidad para ver si el protoplasto aún

está vivo (protocolos de tinción)

El medio de cultivo debe tener la misma composición que el medio utilizado para obtener

el callo= sales y hormonas, además de un agente osmótico (glucosa, sacarosa…)

El objetivo es que el protoplasto se divida y a largo plazo una planta.

El medio puede ser: líquido (sin agitación), líquido sobre sólido, y medio sólido (similar al plating)

• Resultados

• Los protoplastos duran poco, ya que la pared celular se regenera

rápidamente (24-72 horas)

• Una vez regenerada la pared celular comienza la división celular

• (NO HAY MITOSIS SIN PARED CELULAR)

• Cuando la regeneración de la pared no es completa, hay una falsa

división conocida como GEMACIÓN( en las partes de la pared celular no se ha regenerado, el citoplasma se expande)

• Si se agotan las reservas, hacemos subcultivos, normalmente

utilizamos callos. El medio de cultivo es nuevo y con agente osmótico aunque en menor cantidad (podemos eliminar el agente osmótico a partir del tercer subcultivo)

APLICACIONES DEL CULTIVO DE PROTOPLASTOS

• Estudio de receptores

• Estudio de flujos iónicos

• Estudio de regeneración de la pared celular

• Estudio de transformación genética( un gen aislado, y con dotación genética completa)

TRANSFORMACIÓN GENÉTICA:

• Se pude hacer en un gen aislado o alterando la dotación genética completa=

obtener híbridos.

• En la naturaleza la única forma de obtención híbridos es por reproducción

sexual. Pero mediante el empleo de protoplastos, podemos obtener 2 células somáticas (híbridos)= HIBRIDACIÓN SOMÁTICA: obtención de híbridos mediante la fusión de 2 protoplastos.

• ¿qué ocurre cuando los protoplastos distintos se fusionan? spA y spB

• Fusión de 2 protoplastos de misma sp: homocarionte

• Fusión de 2 protoplastos de distinta sp: heterocarionte

• Fusión de núcleos en heterocariontes: sincarionte/ híbrido verdadero

• Si en un heterocarionte se destruye un núcleo: heteroplasto/cíbido (no es un híbrido)

• El proceso de fusión de protoplastos puede ser espontáneo o inducido:

• F. espontánea: ocurre con poca frecuencia y es producido por repulsión de cargas

ya que cuando una célula pierde la pared celular se quedan con una membrana fuertemente negativa.

• F. Inducido: por agentes químicos o agentes físicos:

Ttos químicos: el objetivo es neutralizar las cargas, el pH es alto (10.7) para la

neutralización de cargas, se procede a una incubación de protoplastos en polietilen glicol (15 min) (aglutinamiento/acercamiento de protoplastos)a 37ºC con lo que se producen la fluidificación de membranas

*No pueden fundirse más de dos protoplastos porque a partir de células polinucleares no se puede obtener una planta (regenerar una planta)

Ttos físicos: electrofusión: se aplica un campo de corriente alterna (que provoca aglutinamiento de células) y posteriormente un campo de corriente continua (rotura de la membrana)OOOOOO: fusión de protoplastos (OO!OO!O)

• Rescate de híbridos: recuperación de protoplastos fundidos

- La mayoría de las técnicas se basan en:

1) Pruebas de complementación genética (para mutantes recesivos)

Auxótrofo para poliuria Auxótrofo para glutamina

En un medio sin pro y sin glu: se complementan dando un híbrido

Albino en gen X Albino en gen Y

Híbridos verdes: se complementan y donde uno tiene la mutación, pero el otro no y al revés, así crecen las plantas

2) Pruebas de complementación fisiológica (para requerimiento del cultivo)

Planta albina que Planta verde que no

regenera en medio X regenera en medio X

Cultivando productos de fusión en medio X, se regeneran los híbridos

3) Pruebas de rescate visual: se aplica cuando no es posible la aplicación de las anteriores

• Características que ha de tener una planta híbrida/ Ensayos para confirmar que tenemos una planta híbrida:

• características morfológicas de la planta: ej. Tallo de una planta y

hojas de otra.

• Características enzimáticas: en la planta híbrida, las isoenzimas

deben ser el total de ambas sp. HÍBRIDOS ASIMÉTRICOS: cuando la dotación genética (parte) de una de las sp se pierde. A pesar de ello estas plantas son totalmente fértiles.

• Características citológicas: ej 14+16: el híbrido tendrá 30

cromosomas.

• las plantas híbridas deben poder propagarse por semillas

TRANSFORMACIÓN GENÉTICA EN PLANTAS

Utilidad:

• Obtener plantas resistentes a infecciones

• Obtener plantas resistentes a Tª extremas

• Obtener plantas resistentes a sequía, salinidad

• Obtener plantas que tengas menor la fotorespiración

• Incrementar el valor nutricional de una cosecha

• Prolongar la vida media de almacenamiento

• Introducir enzimas bacterianas responsables de la captación de N2 (por

algunas bacterias) en la planta: aumentamos la producción.

• Mejorar el aspecto (para el consumidor)

• Para obtener sustancias que no son de origen vegetal (interferón, Ac,

vacunas…)

¿CÓMO HACERLO?

• Identificar: el carácter que queremos introducir (gen que confiera resistencia a Ab+)

• Asilar el gen: gracias a las enzimas de restricción que cortan el DNA en secuencias

específicas de nucleótidosy luego las DNA ligasas que permiten la unión de 2 extremos cohesivos de 2 hebras de DNA. Al aislar el gen , hay que obtener múltiples copias, para ello lo clonamos, existen moléculas que lo hacen , llamados VECTORES DE CLONACIÓN: plásmidos, bacteriófagos. Los plásmidos no tiene vida independiente, se multiplican dentro de sus huéspedes, con esto podemos transformar genéticamente un vegetal.

• Transformación genética de plantas, puede hacerse:

• transformación directa: hacen falta protoplastos, para introducir el plásmido en el

protoplasto podemos incubar el protoplasto con el plásmido que contiene el gen de interés, para que el plásmido se introduzca en el protoplasto.

• mediante: inyección , PEG+ Cl2Ca y electrosporación

•inconvenientes: difícil regenerar una planta a partir de protoplasto(solución

MICROBIOLÍSTICA). El gen no se suele incluir en el cromosoma y es degradado.

• ventajas: útil para hacer expresión transitoria del gen

• transformación indirecta. Agrobacterium tumefaciens

• utiliza un “ taxi molecular” que lleva nuestro gen a su destino llamado VECTOR

DE TRANSFORMACIÓN.

Vector de clonación (gen) “TAXI MOLECULAR” planta, mejor si se dirige directamente al

Vector de transformación núcleo

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS: gram +, un cromosoma y diversos plásmidos, el más conocido es plásmido Ti.

• Induce la división celular: tumor

• Al cultivar el tumor en un medio con sales minerales y sacarosa, las células se dividen indiscriminadamente (sin necesidad de hormonas)

• Al incubar esas células tumorales en presencia de Ab, la bacteria muere pero las células siguen proliferando.

• La bacteria le ha conferido algo a la célula vegetal que le ha dado un nuevo

carácter indefinidamente.

• Plásmido Ti (tumor inducing) cuando la bacteria invade la célula le

transfiere los genes oncogénicos y los genes de las opinas (aá especiales). En condiciones normales, se liberan las opinas, que son una fuente de C y N para la propia bacteria. Se transfiere una secuencia conocida como T-DNA que se caracteriza porque está circundando por una secuencia de 25 pares de bases, repetidas e imperfectas que reciben el nombre de borde izquierdo y borde derecho. Se transfiere lo que está en medio.

Hay varios oncogenes:

• iaaM codifican para la síntesis de ác. Indolacético (auxina)

•ica H

•ipt codifica para la síntesis de isopentilalanina que también en una citoquinina

Por lo tanto la bacteria al introducir estas hormonas, le da a la célula la capacidad de dividirse pero no de regenerarse.

¿QUÉ NECESITA AGROBACTERIUM PARA INFECTAR LA PLANTA?

• genes VIR

• Bordes izquierdo y derecho

• Genes CHV: están fuera del plásmido (transfieren el T-DNA) en el cromosoma. Proceso:

• herida: se liberan al suelo fenoles que son agentes quimiotácticos

• la bacteria se dirige hacia la herida de la planta

• tiene que existir contacto físico entre la bacteria y la planta. Los genes chv son

los que permiten este acercamiento, son genes constitutivos que están codificando continuamente.

• Introducción del T-DNA: los genes VIR funcionan como un operón. El primer

gen de esta secuencia es el VIR-A que es un gen constitutivo que se está expresando continuamente, pero los fenoles liberados hacen que se sobreexprese, generando múltiples copias de la proteína VIR-A, el fenol que lo produce es la ACETOSIRINGONA. Esta sobreexpresión, hace que se active un segundo gen que estaba silenciado es el gen VIRR-G que a su vez activa otros genes (VIR O2 y VIR E2) los productos de estos genes son enzimas que actúan parecido a las endonucleasas. Estas enzimas rompen el DNA por unos sitios que ellos reconocen, por el borde derecho e izquierdo, pero sólo se libera una de las hebras de DNA (cadena simple) y se une a uno de los extremos.

COMPLEJO T

VIR D2 VIR E2

Este complejo T, abandona la bacteria, penetra en la célula vegetal y se dirige al núcleo (ayudados por otros genes VIR-B). Una vez en el núcleo, las dos proteínas lo dirigen a un cromosoma (al azar) y se incorpora al genoma vegetal. Se integra una cadena simple que gracias a la maquinaria de la célula vegetal se replica.

** se logró eliminar el T-DNA de Agrobacterium y meterle un gen resistente a Kanamicina. Esta bacteria es contacto con células de tabaco les hizo plantas resistentes a kanamicina.

Podemos hacerlo utilizando un plásmido o 2 plásmidos.

Manejar el plásmido Ti no es fácil, se han diseñado 2 sistemas o vectores de transformación. Para que se incluya el gen ha de estar entre el borde derecho e izquierdo (dentro del complejo T)

• VECTORES O SISTEMAS COINTEGRADOS: tenemos el plásmido de E. coli en

el cual se introduce el gen que quiero transferir. Además se introduce un gen de resistencia a kanamicina. También hay un plásmido Ti (totalmente modificado). El plásmido Ti debe tener los genes de virulencia y los bordes para que el plásmido Ti pueda infectar a una célula vegetal, le quitamos el T-DNA y se sustituye por información genética del plásmido anterior (E. coli)

Introducimos el plásmido Ti en Agrobacterium que pasa a tener plásmido de E. coli. Dejamos que la bacteria se multiplique y también los plásmidos. Puede que al dividirse se mezclen ambos plásmidos (recombinaciones). En este caso, tendremos la bacteria con su cromosoma y un solo plásmido con los genes de virulencia, el gen resistente a Kanamicina y parte del plásmido de E. coli. Vector cointegrado: un plásmido Ti modificado.

• VECTORES O SISTEMAS BINARIOS: usamos 2 plásmidos. La bacteria tiene

su cromosoma, un plásmido de E. coli y un plásmido Ti. El de E.coli con el gen foráneo y una resistente a Kanamicina. El plásmido Ti conserva los genes de virulencia. En los genes que se quieran transferir, además de la secuencia modificadora, para que el gen se exprese se necesita un promotor que indica cuántas copias, cuándo u dónde y también una secuencia terminadora:

PROMOTOR-CODIFICADOR-TERMINADOR

MÓDULO DE EXPRESIÓN= GEN QUIMÉRICO

Además del gen “Quimérico”, debemos tener un gen marcador que nos indique si la

información genética de la célula está modificada o no.

PROCESO DE INFECCIÓN Y OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS:

• El más usado es el sistema de disco de hoja.

• A los discos de hoja se les añade una solución de bacterias que contengan el

gen que queremos transferir, se deja aproximadamente 2horas.

• Se secan los discos con papel de filtro y se llevan a un medio de cultivo que

contenga auxinas y citoquininas aproximadamente 2 días.

• Hay que eliminar a la bacteria

• A los dos días se añade un Ab que mate a la bacteria (cefotaxina contra

Arobacterium) y añadimos el marcador que si es de selección se añade Kanamicina. Las células resistentes a este Ab serán la que se regeneren.

• Agrobacterium sólo es útil para dicotiledóneas.

*** en el tomate, se introduce un gen que transfiere rigidez a la pared del

tomate. Se introduce el gen responsable del deterioro de la pared en antisentido que bloquea la producción de la proteína responsable.

***Agrobacterium rhizogens= tiene un plásmido Bi

CULTIVO DE TEJIDOS PARA LA OBTENCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

• Metabolito primario: sustancia esencial para el desarrollo de las funciones vitales de la

planta. Además su distribución es generalizada en toda la especie. Las células lo usan para multiplicarse.

• Metabolito secundario: sustancia que no es esencial para el desarrollo de las plantas.

Suelen estas restringidos a ciertas especies, incluso a ciertos momentos de la vida de una planta. MECANISMO DE DEFENSA.

• RUTA DEL ÁC, SIKÍMICO: met 1º: lignina. Met 2º taninos

• RUTA DEL ACETATO- MECALONATO: met 1º: fitol. Met 2º:digoxinas

• RUTA DEL ACETATO- MALONATO: met 2º: poliacetileno.

• Funciones de los metabolitos secundarios:

• Contribuyen al desarrollo de la planta generalmente.

• Defensa frente a herbívoros: repelentes

• defensa frente a org: fitoalexinas

• defensa entre plantas: compuestos alelopáticos

• atracción: insectos para polinización, bacterias beneficiosas, insectos predadores de

otros insectos, animales que dispersen semillas.

ELICITOR: sustancias que activan/inducen estimulación metabólica. Todo aquello que desencadena una actividad metabólica, ej: producción de fitoalexinas. Pueden ser biotinas: agente biológicos o abióticos: agentes fisico/químicos

En cultivo in Vitro, si añado el elicitor, se obtiene la fitoalexina que puede tener interés económico.

ESTOMAS: poros que se encuentran en la superficie foliar, formados por dos células de guarda, cuyos movimientos regulados por la turgencia controlan el tamaño del poro y de este modo regulan el intercambio gaseoso.

CLON: individuo genéticamente exactamente igual a otro

PRECURSOR: sustancia utilizada para inducir la síntesis de un compuesto

SUSPENSIÓN CELULAR: conjunto de células en medio líquido. Muy heterogéneas genética y cinéticamente. Muy inestables.

NECESIDADES DEL MEDIO NUTRITIVO PARA EL CRECIMIENTO EN SUSPENSIONES CELULARES

• Se habla de una evolución similar a la de una muestra microbiana, llega un momento en que tiende a detenerse( se han acabado los nutrientes)

• Es lo menos frecuente, la producción de metabolitos depende del número de células ( a mayor crecimiento, mayor producción)

• Cuando cesa el crecimiento de células, aumenta la producción de metabolitos

(lo más frecuente).

El material obtenido por el metabolito primario es lo que las células utilizan para multiplicarse (crecer). Cuando ya no crecen más, usan los metabolitos secundarios.

La producción inicial, no se tiene en cuenta, lo que valoramos es la producción final. Necesitamos una masa celular muy grande para iniciar la producción en el Biorreactor.

• hay que diseñar un medio de crecimiento para obtener un gran crecimiento y por

lo tanto una gran producción (más sencillo pero menos frecuente)

• hay que diseñar 2 medios, uno para el crecimiento y otro para la producción. Para

el crecimiento, usamos el medio inicial, variando poca cosa. Una vez establecido el medio de crecimiento hay que manipularlo para mejorar la producción, medios que detengas el crecimiento y que induzcan una mejora en la producción. Se suele manipular sobre todos los niveles de fosfato y nitrógeno. Tomamos la suspensión y reducimos algún componente (p o N) y vemos con cual obtenemos los mejores resultados. Normalmente disminuye el P se incrementa la producción y se detiene el crecimiento. Otro ag. Nutritivo es la fuente de C (sacarosa). Lo que ha dado resultado es el incremento de niveles de sacarosa, se incrementa la producción de metabolitos secundarios ya que como tiene energía suficiente, el metabolito primario que en un segundo plano, aunque realmente lo que ocurre es que se produce un stress osmótico y el crecimiento se detiene y se induce la formación de metabolitos secundarios.

El metabolito secundario normalmente es un mecanismo de defensa. También es muy efectivo disminuyendo N y sacarosa, aunque el resultado depende de cada especie. Ej: silimarina: eliminando Ca++, duplicamos la producción añadiendo Li, también hay incremento por estrés.

EJ: DIGITALIS: Si sustituyo Sr por Ca no aumenta la producción, hay una

relación especial. El Li también aumenta la producción por estrés.

El nivel hormonal también se puede manipular, del balance hormonal también depende la diferenciación (que dé raíces o tallos). En general los regímenes hormonales que favorecen la producción de metabolitos secundarios son los que potencian la diferenciación, sobretodo si la diferenciación va encaminada a la obtención de embriones somáticos.

En la práctica esto no es aplica porque si queremos incrementar la producción un medio y otro diferente para la diferenciación.

Los parámetros físicos también se manipulan, normalmente para el mantenimiento del cultivo (pH, Tª, luz, aireación…)

• modificación pH: afecta a la toma de nutrientes. Cambios en permeabilidad de la membrana.

• Lo normal es usar un pH óptimo para el crecimiento (5-6) y el mismo para el medio de producción (mejor no modificar)

•Tª: ocurre lo mismo

•Luz: tiene un efecto importante. Va ha variar el tipo de metabolitos (ej. Nicotina en ausencia de luz). Depende de cada especie y del metabolito. En la mayoría de los casos se requiere luz.

El problema de aportar luz es que se incrementen los costes en energía y en enfriar porque la luz calienta, por lo tanto se prefiere una menor producción y así disminuimos los costes, a no ser que si al aumentar la producción los costes no sean demasiado altos y por lo tanto compensa ese aporte de luz.

*los cultivos celulares aunque estés verdes no realizan la fotosíntesis, por eso, hay que aportar sacarosa.

El OL se manipula para el mantenimiento de cultivos a gran escala. El O2 es necesario para las mitocondrias para obtener energía, ya que no realizan la fotosíntesis. A nivel de laboratorio no se manipula el O2. Ya tenemos la línea celular, hemos seleccionado los dos medios…ahora a nivel industrial usamos BIORREACTORES.

EMPLEO DE BIORREACTORES PARA OBTENER METABOLITOS SECUNDARIOS

• Sistemas de biorreactores

El metabolismo que se produce se acumula en la célula, no sale al exterior, por lo tanto para obtenerlo, tengo que destruir el cultivo. Tenemos dos tipos de biorreactores:

• Continuo: vamos metiendo nutrientes en el medio, tubo por sonde hay una

entrada del medio, por otro lado extraigo el medio pobre que arrastra a los metabolitos, pero esto es lo menos frecuente porque normalmente los metabolitos no están en el medio.

• Tandas: destruyo la célula para tomar el metabolismo y lo pongo en otro medio

(ej. Matraz es un sistema de tandas). A nivel industrial se usan biorreactores, tandas más grandes. Útiles cuando el metabolismo secundario se queda dentro de la célula. Es el más usado.

• Semicontinuo: variante, variedad de tandas, en vez de vaciar el biorreactor

totalmente, sólo se vacía la mitad. De la mitad que se vacía se obtiene el producto (destruyendo las células), y rellenamos con la mitad y lo que había actúa como inoculo para nueva producción.

• Multifásico: 2 fases normalmente. Un biorreactor para desarrollar la biomasa

(crecimiento)

• se retira el medio (no es bueno para ka producción) y ponemos otro medio (en el

mismo reactor)

• Se pasa a otro biorreactor con el medio adecuado para la producción(usamos dos

biorreactores)

2.Diseño de la estructura del biorreactor

- condicionado por el tamaño de las células

- hay que tener en cuenta:

Necesidad de administrar nutrientes a las células

Necesidad de administrar oxígeno a las células.

Hay problemas derivados de la estructura celular (A TENER EN CUENTA EL SISTEMA DE AGITACIÓN)

-Células grandes y pared rígida (la agitación hace que las células choquen y se produce el efecto cizalla o tijera que puede provocar ruptura de la pared celular.

- Tienden a formar agregados, las células tienden a disminuir y el reparto de nutrientes y O2 no es muy equitativo.

A TENER EN CUENTA POR EL SISTEMA DE AIREACIÓN:

- Hay cierta cantidad de material celular libre (proteínas…) que con el aire (agitación) tiende a formar espuma. En el biorreactor si genera espuma (sobre todo en superficie), la espuma se adhiere a la pared y sistemas fijos del biorreactor, todas las células que hay en la espuma no son útiles para la producción por lo tanto hay que evitar la formación de espuma.

También hay que tener en cuenta las posibilidades de iluminación.

• con agitación mecánica: con entrada y salida de aire, con palos de

agitación (2 palas separadas de giro, hélice que sube y baja, distintas palas pequeñas, una única pala plana grande.

PROBLEMAS: generan aumento de la fuerza de cizalla, son costosos,

consumen energía. Peligro de contaminación porque hay muchos sistemas fijos.

• dentro de estos hay una variante, giran en torno a su eje; eso produce la

agitación (no palas). Puede ser (cilindro hueco y doble cilindro)

• VENTAJAS: se incrementa la relación entre superficie y volumen. Como

el eje es ajeno/exterior, se evita contaminación al ser mayor la superficie, se facilita la iluminación

• PROBLEMAS: para este volumen (tengo que dejas espacio), necesito un

biorreactor muy grande

• con agitación por aire

• biorreactor de burbujas(forma de balón): maya que fragmenta el

aire en pequeñas burbujas (difusor de aire)

• las burbujas al ascender a parte de aportar O2, agita

• disminuye la fuerza de cizalla, es bueno para células frágiles

• aumentan los problemas de formación de espumas

• biorreactor de elevación por aire: con dos cámaras, por dentro lleva

un compartimiento que se comunica con otro exterior.

• entra aire a Presión

• se forman burbujas, que bajan por la camisa exterior

• se mejora el burbujeo, hay flujo, menor fuerza de cizalla

• mejora el reparto de nutrientes

• el más usado

• aunque forman espuma, se añade un agente antiespumante.

También hay biorreactores que combinan agente mecánica con aire, la pala hace que

disminuya la espuma.

• biorreactor a chorro: turbina que gira y crea una corriente que

incrementa la velocidad de reparto.

Aumenta la fuerza de cizalla para mejorar el reparto.

iv: hay unos biorreactores modernos ( en experimentación): tienen palas, baja fuerza de cizalla, todo gira en el mismo sentido y es antiespumante.

TÉCNICAS PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN (una vez que tenemos el biorreactor adecuado)

También alternativas a las suspensiones celulares.

• Adición de percusores: el metabolito secundario entra en competencia con el primario y este es esencial para las células. Tenemos una ruta metabólica:

!!A metabolito primario A´

Metabolito secundario A´´ (ramificación)

El que funcione hacia A´o A´´ depende de lo que la célula necesite. Puede ocurrir que:

• A sea abundante y forme suficiente A´ y también podemos obtener A´´.

En vez de A (metabolito común), si le doy un precursores de la ruta de A´´, el metabolito M, lo toma y el A pasa a A´ y M a A´´ sin necesidad de competencia.

• Los precursores son más efectivos cuanto más próximos están al producto

final= BIOTRANSFORMACIÓN (añadir precursores, uno o dos pasos enzimáticos anteriores para obtener el producto final).

• En suspensiones celulares hay problemas:

• entrada del precursor dentro de la célula.

• que se estimule la transformación

•que puede el precursor atravesar la membrana celular, pero

haciendo pequeñas modificaciones, podemos hacer que penetre la membrana. Ej: la digoxina es una transformación de la digitoxina (la digoxina no atraviesa las membranas, pero sí la metil-digoxina.

Será rentable si el precursor es barato o se puede obtener por síntesis. La digoxina no la producen todos los Digitalis. El precursor, al añadirlo puede resultar tóxico para la célula.

• Elicitación Otra técnica empleada para mejorar la producción, es el uso de

ELICITORES que son sustancias que actúan sobre el agente invasor (fitoalexina) es un sistema de defensa de las plantas. Se ha comprobado que el inductor es un producto de la propia planta.

El elicitor es el que produce fitoalexinas, que no sólo se forman por ataques bianos, también por estrés (lluvia ácida, luz UV, Tª extremas). El elicitor induce la estimulación metabólica= formación de fitoalexinas.

Se puede n diferenciar 2 tipos de elicitores:

• E. bióticos: agentes biológicos

• E. abiótico: agente físico-químico

ELICITOR: todo aquello que desencadena una actividad metabólica.

En cultivo “in Vitro”, si añado al cultivo el elicitor, se obtiene la fitoalexina (metabolito que de forma natural no existe en la planta o en el cultivo “in Vitro”) que puede tener interés económico.

Ej: glycine max (soja) para obtener gliceolina.

. la producción de gliceolina es proporcional a la C del elicitor.

Thalictrum rugosum: berberina

. llega un momento en el que si C. elicitor es muy alto, la

producción de berberina disminuye.

ALTERNATIVAS A LAS SUSPENSIONES CELULARES PARA OBTENER METABOLITOS SECUNDARIOS

• Usar células inmovilizada: Fijar las células que tengo en suspensión a un soporte; hay distintos sistemas de fijación:

• Adherir las células a una superficie (poco en plantas, más para org)

• Incluir las células en el interior de un sistema, hay 2:

• Polimerización: al polimerizar, atrapa las células. Al polimerizar, se

forma una maya y atrapa a las células. Usamos agar, …se forman bolas, con cámaras en el interior que permiten el paso de nutrientes.

• Obtener el polímero y hacer que las células invadan los canales del

polímero. Se usa poliuretano (esponja) con tamaño de poro muy pequeño, se mete en el matraz con la suspensión y las células van entrando.

Por ambos sistemas se obtienen células fijajas. Se suele polimerizar por goteo (células + agente polimerizante)

• Ventajas sobre suspensiones celulares.

• Al estar atrapadas, las células mantienen el contacto, la comunicación es

intensa y estable.

• Se restringe el crecimiento de forma física, no se altera el estado de la célula.

No se deja espacio para crecer. Al estar restringido el crecimiento, se incrementa la producción

• La mayor facilidad en la manipulación de las condiciones del cultivo

• Se mejora la recuperación del producto, hay algunos metabolitos secundarios

que se liberan mejor al medio.

En principio se pueden usar los mismos biorreactores, pero se prefiere diseñar otros (ya que el medio es diferente) son incluso más sencillas.

• Se puede usar una columna de matriz fija, se introduce el

medio y se hace que pase por la matriz de perfusión. Esto será útil cuando el producto se libere al medio fácilmente.

• También se puede usar una columna con lecho fluido, en el

cual está la maya. El problema es que inmovilizar células es muy caro y sólo se hace cuando la producción es interesante.

• Cultivar órganos in Vitro.

Se pueden cultivar tanto órganos aéreos como raíces. Lo primero que se cultivó fueron raíces (antes que células). Las raíces se pueden formar a partir de otra raíz, cortada de la planta o bien a partir de callos. Hay una alternativa, usando A rhizogenes que invaden raíces, transfiriendo genes (activan anpina (azúcar), no válido para la raíz, pero si a la bacteria, activan la síntesis de auxinas.

La diferencia es que obtengo raíces transformadas, las cuales no necesitan que al medio le añadamos hormonas porque la síntetizan ellas mismas. Crecen a ritmo alto. Tienen gran cantidad de pelos radicales: raíces pilosas/peludas. Si el metabolismo se produce en la raíz, es uncultivo interesante de realizar.

Ej: Nicotina: si se sintetiza en la raíz, aunque luego vaya a la hoja. Aquí si sería útil el cultivo “in Vitro” de raíces.

El cultivo de tallos, se hace a partir de yemas apicales, que se multiplican. También puede ser a partir de la planta, a partir de callo o usando A. tumefaciens que transfiere que se estimule la producción de citoquininas. El crecimiento de parte aérea es menor que el de las raíces. Presenta problemas de esterilidad. La invasión de bacterias produce teratomas o llagas.

Se usan biorreactores de niebla, no hay agitación. Se genera una niebla del medio que se difunde sobre raíces o tallos.