Bacteriología

Introducción

En esta práctica se trata de estudiar diversos microorganismos mediante técnicas de identificación en diversos medios de cultivo, observando las diferencias en el comportamiento de los distintos microorganismos.

Dentro de las eubacterias existen tres grupos de bacterias que pueden ser diferenciados en relación a la estructura de la pared celular. Para poder diferenciar a estos grupos no es necesario utilizar complejos sistemas de identificación, y basta con un microscopio óptico y unas cuantas soluciones de colorantes. La forma más sencilla de iniciar una identificación del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloración o tinción de Gram. La tinción de Gram es una tinción diferencial porque no todas las células se tiñen de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram positivas y Gram negativas.

Los microorganismos Gram positivos, como el Staphylococcus aureus, adquieren un color violeta después de la coloración de Gram debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram negativos, como la Escherichia coli, que adquieren un color rosado. El tercer grupo de eubacterias es el de los Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados utilizando la coloración de Ziehl-Neelsen. La diferencia en la coloración no se debe a reacciones químicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura física de la misma.

Eubacterias Gram Positivas

Las eubacterias Gram positivas son células que contienen una membrana citoplasmática con fosfolípidos y proteínas. Por fuera de la membrana citoplamática se encuentra la pared celular que está compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. Este peptidoglicano es una macromolécula gigante formada por cadenas de un dímero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre sí mediante péptidos, que son pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan. Estos puentes peptídicos son característicos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto más completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la célula, y evita que la célula estalle en medios hipotónicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalíticas y productos de secreción hacia el exterior de la célula.

La pared celular Gram positiva también contienen ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodiésteres, y están unidos covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodiéster en el oxihidrilo del C6 del N-acetilmurámico. Los ácidos lipoteicoicos son polímeros de glicerofosfato se encuentran anclados en la membrana citoplasmática y no están unidos al peptidoglicano. La función de estos compuestos sería estructural, pero existen evidencias que indican que también participarían en la regulación de las enzimas hidrolíticas que renuevan la pared celular (autolisisnas) y que serían sitios de fijación de fagos.

Eubacterias Gram Negativas

Las eubacterias Gram negativas son células rodeadas por una membrana citoplasmática formada por una bicapa fosfolipídica y proteínas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida covalentemente a unas lipoproteínas de anclaje que fijan la membrana externa por medio de porciones lipofílicas. Entre la membrana citoplasmática y la membrana externa queda delimitado el espacio periplásmico. Este espacio es ocupado por el periplasma que es una matriz isotónica respecto al citoplasma, isotonicidad que es mantenida mediante los oligosacáridos derivados de membrana (MDO), y en la que se hallan componentes catalíticos de suma importancia para la viabilidad celular.
La membrana externa tiene una estructura de bicapa asimétrica en donde la cara externa esta compuesta por el lipopolisacarido (LPS) y la cara interna por fosfolípidos. Además, esta membrana es rica en proteínas, algunas de las cuales se denominan porinas. La membrana externa funciona como una barrera de permeabilidad para ciertas sustancias como antimicrobianos y enlentece el pasaje de otros que son inactivados en el periplasma. El LPS está formado por tres regiones: el polisacárido O (Antígeno O), el polisacárido del centro (KDO) y el lípido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la célula una efectiva protección contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a la superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la célula evadir la fagocitosis, tener cierta resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune específica por alteración de la superficie antigénica y adherirse a ciertas células del hospedador. Las porinas son poros o canales proteicos no específicos que pueden ser atravesados por pequeñas moléculas hidrofílicas. En la membrana externa se encuentran otras proteínas que funcionan como canales de difusión específicos y facilitan el paso de di, tri y oligosacáridos.

Eubacterias Acido-Alcohol Resistentes (BAAR)

Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Acido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por una bicapa lipídica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rígido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilglucosamina. Por medio de una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polímero de arabinosa y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican periféricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordón porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias más virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el equivalente mycobacteriano del lipopolisacárido de las Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal del LAM está recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los nutrientes a través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnósticos (PPD).

El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis también causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infección causada por el Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios.

IDENTIFICACIÓN DE AEROBIOS:

Agar
MacConkey

Es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo hacen.
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La hidrólisis de la lactosa produce ácidos orgánicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo.

Las colonias lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio tira a amarillo por la subida de pH que origina la utilización de las proteínas (peptona) del medio

Se inoculan placas del medio y se incuban a 37 oC

Agar sangre

Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los hematies. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematies.

Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba

Beta
galactosidasa

Esta enzima hidoliza la lactosa originando glucosa y galactosa
Se añade un sustrato artificial ortocitrofenial galactósido (ONPG) que hidrolizado por la ß-galatosidasa originandose en color amarillo

Catalasa

La catalasa es una enzima que proteje a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno.

Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva)

La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.

Citrato

Es uno de los test del IMVIC usado para diferenciar enterobacterias. el crecimiento consume el ácido y como consecuencia se produce un incremento de pH en el medio y el indicador tira de verde a azul.

El citrato es la única fuente de carbono y se realiza sembrando la bacteria en la superficie de un agar de Simmon's inclinando el tubo

Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción postiva y los no patógenos negativa

Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.

Contraste
de fases

El microscopio de contraste de fases es un sistema en el que se acentúa la diferencia del índice de refracción entre las células y el medio incrementando así el contraste en células translúcidas sin uso de colorantes.

Descarboxilasa
de aminoácidos

Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias.

Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de pH (púrpura de bromocresol)

DNasa

Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA

Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.

Esporas
(calentamiento)

Las Endosporas son formadas por Bacillus y Clostridium. Son Formas de resistencia, metabolicamnete inactivas que resisten la alta temperatura, la desecación y la radiación.

Las endosporas pueden sobrevivir al calentamiento y originan nuevas formas vegetativas en un medio de cultivo.

Se inocula un tubo de caldo con una suspensión sospechosa de contener endosporas.

Se calienta a 80 oC durante 10 min.

Se enfría y se incuba a temperatura adecuada.

Fenilalanina desaminasa

Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico

Se incolulan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina. Después de la incubación se añade una solución de cloruro férrico.

Fermentación
de azucares

Las bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azúcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entéricas.

Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.

Gram

La tinción de Gram es la más importante de las tinciones diferenciales. Las células Gram positivas retienen el cristal violeta cuando se tratan con etanol mientras que las gram negativas no lo tienen y se tiñen entonces del color rojo de la safranina.

Diferencias en la estructura de la pared son las responsables de este comportamiento.

Se tiñe con cristal violeta

Se trata con lugol como mordiente

Se decolora con etanol 96o

Se añade safranina como colorante de contraste

Hidrólisis
de Esculina

La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus.

Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.

Hidrólisis
de gelatina

La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer.

La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteina no hidrolizada.

Hidrólisis
de lípidos

Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar lípidos grandes en sustratos de bajo peso molecular que son trasportados al interior de la célula para ser utilizados en el crecimiento.

Una emulsión de lípidos y un indicador llamado Spirit Blue se incorporan en un medio sólido complejo.

Hidrólisis
del almidon

Los polisacaridos, como el almidón son demasiados largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligo o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer.

La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

Hidrólisis
del hipurato

El hipurato es un compuesto orgánico aromático que puede ser hidrolizado enzimáticamente originando benzoato y glicina. Este test se usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus.

Una suspensión de bacterias se añade a una solución de hipurato y se incuba 2 horas. En ese momento se añade la nihidrina.

Indol

Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias.
Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol
La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptoma). La presencia de indol se ensaya añadiendo dimetilaminobenzaldehído.

Inhibición
por KCN

El KCN inhibe la cadena de transporte de electrones uniéndose a los citocromos impidiendo el crecimiento microbiano. Sin embargo, algunas bacterias no son inactivadas y pueden nacer.

Las bacterias se inoculan en caldo de peptona que contiene cianuro potásico.

Motilidad

La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en preparación en fresco con el microscopio de contraste de fase

Para ver la movilidad se realiza una preparación en fresco que se observa en contraste de fases.

La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación.

O-F
(oxidación-fermentación)

En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El oxígeno es el aceptor final de e- en el metabolismo respiratorio. en condiciones anaerobicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido que se detecta gracias al azul de bromotinol (indicador de pH) Es útil en la distinción de pseudomonas y enterobacterias.

Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y otro no (tubo de oxidación)

Oxidasa

La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Este test se usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo)

Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar nutritivo.

Producción
de sulfhídrico

Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato.

La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS

Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato metionina y sulfato ferroso.

Reducción
de nitrato

Algunas bacteris pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. el nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso más a gases (óxidos de nitrógeno). Las enterobacterias y pseudomonas son usualmente positivos.

Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciendose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a más que a nitritos produciendose gas. Si al añadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación)

Rojo de
metilo

Es uno de los test del IMVIC para bacterias entéricas. Algunas vias fermentativas originan ácidos orgánicos mientras otras originan productos que son neutros.

Las bacterias se crecen en caldo de glucosaçpeptona. Si se fermenta el azúcar el pH baja por debajo de 4.3.

Se añade rojo de metilo como indicar que es rojo a pH <4.3. y amarillo a pH >4.3.

Tioglicolato

Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano. Un tubo con medio semisólido contiene tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la superficie y no en el resto del tubo. Un indicador redox, resazurina, indica si hay oxígeno (rojo) o no (incoloro).

El tubo es inoculado con un asa de punta y se incuba hasta que se produce su crecimiento.

Ureasa

Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador.

Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol

Utilización
Fuentes de Carbono

La mayoría, pero no todas las bacterias pueden crecer en medios simples con una única fuente de carbono. Este método permite ensayar tal habilidad y la capacidad para utilizar sustratos específicos.

Las bacterias se inoculan en medios simples conteniendo diferentes sustratos orgánicos como fuentes de cargono y energía.

Voges-
Proskauer

Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a caso fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio.

Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa aumentean acetoína en el medio.

Se añade alfanaftol en medio alcalino (KOH). La acetoina se convierte en diacetilo que reacciona formandose un color rojo