ATP SINTETAS: ESTRUCTURA - F (X) PARENTESCOS.

INTRODUCCIÓN

La ATP sintetasa mitocondrial posee dos componentes principales:

*F1 pp localizada en la matriz mitocondrial, en bacterias en el citosol, y contiene cinco

subunidades {3a ,3b ,d ,g ,e }

*Fo, es un canal de protones que presenta tres subunidades en bacterias y muchas mas en cariotas.

En hígado de ratón el Fo presenta un min. 8 polipéptidos distintos. F1 ha sido estudiado profundamente con relación a sus cadenas de nucleótidos y a sus propiedades cinéticas.

Aunque hay un convenio que dice que existe un mínimo de seis lugares de cadena de nucleótidos en F1, uno en cada una de las subunidades de a y b.

Cuando son usados sustratos mas naturales o análogos solo los sitios mas ligados son detectados y la estequiometría cae a menos de 6 moles de nucleótidos por mol de F1.

Este s entonces un pequeño convenio sobre cómo las subunidades de F1 trabajan mecánicamente durante la sintetización de ATP . algunos investigadores creen que es necesario entender la dinámica de las pequeñas subunidades para entender el mecanismo enzimático.

¿Realizan el movimiento de un par de ab a otro específico en torno al papel del ATP sintético?, o bien lo hacen las pequeñas subunidades limitando sus papeles a unir F1 a Fo y tal vez a regular el flujo de protones a F1.

En este artículo podemos comprobar que las investigaciones no tienen resuelto este “dilema”.

MATERIAL Y MÉTODOS:

Incluye:

• Reactivos usados o uso de reactivos.

• Contrastar funciones.

• Preparaciones y cristales de F1.

• Técnicas de biología molecular.

• Péptido-sintetasa.

• Cristalografía de rayos-X.

Todos los estudios están referidos a la mitad de F1 del hígado de rata de ATP-sintetasa.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES:

• Estudios biofísicos:

Modelo de la fig.1 en la estructura cuaternaria de F1 del hígado de rata de la molécula de ATP- sintetasa obtenida con rayos-X. Basado en 3.6 A de reducción. En el modelo, las subunidades b se ven desde arriba y a desde el botón cerrando al canal de protones (H*). Estos datos bioquímicos indican que a yace cerca de la molécula. Existen cinco estructuras distintas que nos son de interés.

Una sexta diferencia del modelo que puede tener implicaciones funcionales en la localización del fuerte espacio atómico para el agente “mersalyl”.

Los tres espacios atómicos se sitúan cerca de la interfase de ab. La subunidad b de la enzima del hígado de rata no tiene residuo de cisteína, mientras que la subunidad a tiene dos, las cuales están localizadas entre los temas del consenso del Walker A y B, aunque deben estar incluidos en cadenas de nucleótidos.

Estos resultados sugieren que las cadenas de nucleótidos de subunidades a se sitúan cerca de la interfase con subunidades b.

Actualmente, los trabajos están enfocados en definir la localización de los dominio de las cadenas de nucleótidos, en difundir fuertes átomos de nucleótidos análogos entre simples cristales y en determinar si las coordenadas de cristalografía de un o más de uno está ligando polipéptidos de ATP se ajusta dentro de ellos, en la mitad de F1.

ESTUDIOS QUÍMICOS Y DE BIOLOGÍA MOLECULAR:

Los dos tipos de estudios están enfocados inicialmente en determinar si el tema del consenso Walker A en la subunidad b incluiría la cadena de nucleótidos, y si es así, la naturaleza de esa interacción.

Químicos: 50 péptidos de aminoácidos (Asp-Thr) estaban sintetizados, extendiendo esta referencia en la subunidad b. Conteniendo el tema del consenso de Walker A GX4 8GKT y el “predictor” entero del lazo flexible del correspondiente a la fusión con la Adenilata Kinasa. Este péptido se llama pp-50 (Fig. 2 a), perificado homogéneamente para estructuras secundarias y para interactuar con Adenosil-trifosfato.

Estos datos explican que en 10mM tris-HCl (tampón a pH=7.4), el pp-50 interactuaba con ATP y precipitaba. Significativamente, GTP e ITP (sacados de F1) también inducen este precipitado, dando pirofosfato.

AMP (deja de estar unido a F1) no produce precipitación. Esto sugiere que la mayor interacción entre pp-50 y los ligandos que precipitaban inducían pirofosfato.

Usando el análogo del nucleótido trinitrofenil, la interacción entre pp-50 y el análogo puede seguirse fluorométricamente en soluciones sin precipitado pp-50.con lo cual TNP- ATP y TNP-ADP interactuan fuertemente con el pp-50 .mientras que TNP-AMP tiene poca capacidad de interacción.

Dando lugar a la misma conclusión de antes. En estudios biomoleculares se confirmo que en E.C. que la que unía TNP-ATP y TNP-ADP era un fragmento mas largo de subunidad b. Al suprimir una sección de b ( Gly - Lys ) que contienen el consenso A y la espiral flexible de Gly (fig 2 a) la pp resultante despliega una marcada reducción de afinidad por el TNP-ATP.(Kd de 5 a 60 mM)

Uniendo los resultados vemos que se recalca que la región de la subunidad b que contiene el Walker A y la espiral flexible de glicina esta probablemente relacionada directamente en unir tanto ATP como ADP y que dicha reacción de unión implica un enlace de pirofosfato.

Región de b: “ receptor de pirofosfato” .también muestran que no es la única región implicada en esta unión y su supresión no previene completamente la unión de nucleotidos mas bien disminuyendo la afinidad.

ESTUDIOS BIOQUIMICOS:

Los estudios de la unión de nucleotidos se han llevado a cabo en un F1 con mucho detalle. se han establecido 3 criterios estrictos:

Encuentran que 1 mol de F1 del hígado de rata intactos une irreversiblemente 4 moles de nucleotidos. Hay un solo lugar donde se detecte ADP (Kd 1 mM ) , un solo sitio AMP-PNP con una similar Kd y dos AMP-PNP con nivel mas bajo de Kd (20-30 mM). Significativamente AMP-PNP no tiene efecto en la unión sobre ADP y viceversa, indicando que están separados y distinguidos de la superficie del F1.

La enzima también contiene un sitio que une MG +2 no cambiable, demuestra que F1 distribuye nucleotidos y MG +2 asimétrico, una interpretación mas simple es (fig. 3) que el par asimétrico ab (en contacto con pequeñas subunidades) une ADP,AMPPNP y MG +2 mas fuertemente( que cualquier otro par ab el cual solo un AMP PNP )

Aunque el nucleotido que une mas fuertemente sitios en F1 es llamado “nocatalitico” esto significa que los nucleotidos de estos sitios no combinan durante la hidrólisis del ATP. Aun así el interés real de la reacción fisiológica es la síntesis del ATP y se da por sentado que el papel del gradiente de H+ es el de separar nucleotidos fuertemente unidos. Parece que estas separaciones tuviesen lugar desde el asimétrico ab, con las subunidades entonces especificadas los dos pares de ab restantes en secuencia para una fuerte unión de nucleotidos seguido de una liberación de energía inducida.

Hoy en día los experimentos están enfocados en determinar la exacta localización de la subunidad de los cuatro nucleotidos reversibles que unen el F1 del hígado de rata y el efecto del gradiente de H+ electroquímico en la unión de estos nucleotidos así como sus efecto sobre nucleotidos unidos endógenamente no detectado en estos estudios.