Urocultivo

Bacteriología. Recuentos de Colonias. Método del Asa calibrada, rápidos de diagnóstico. Tinción

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I. INTRODUCCIÓN

Varios miembros de las enterobacterias pueden aislarse de la orina en el curso de infecciones del aparato urinario o urogenital, como también en otros tipos de afecciones.

La orina vesical normalmente no contiene microorganismos. Sin embargo, los primeros 10 a 15 ml. de orina emitidos por personas normales de cualquier edad o sexo, siempre presentan bacterias, las que proceden de la flora corriente de la uretra anterior, prepucio, región vulvovaginal o de contaminación fecal. La flora de estas localizaciones es variada y está constituida por estafilococos coagulasa-positivo y negativos, estreptococos diversos, bacilos difteromorfos, enterobacterias, lactobacilos, micoplasmas, bacterias anaerobias, levaduras y muchos microorganismos. En la presencia de esta flora influyen localización anatómica, sexo, edad, hábitos de higiene y factores patológicos propios del huésped.

En la etiología de las infecciones urinarias predominan los bacilos gramnegativos. Los procesos agudos y crónicos son provocados por E. coli y por especies de los géneros Enterobacter, Proteus, Citrobacter, Pseudomonas, Serratia, etc. De estos agentes, E. coli se aísla en 80% de los casos. Ps.aeruginosa y S.marcescens se identifican en pacientes hospitalizados, muy debilitados o sometidos a instrumentación repetida. Con bastante menor frecuencia desempeña un papel causal Streptococcus faecalis (enterococo) y excepcionalmente los estafilococos.

El examen microbiológico de una muestra de orina se denomina Urocultivo. Éste se ha de hacer desde un punto cuantitativo y cualitativo.

A. Examen cuantitativo

  • Método de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kaas para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de contaminación, se realiza de la siguiente manera:

    • Se homogeneiza la muestra mediante agitación.

    • Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa o de suero fisiológico, estériles.

    • Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilución al 1:100.

    • Se deposita 1 ml. de cada dilución en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se vacía un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45°. Mediante rotación suave, se favorece la distribución homogénea de la siembra.

    • Se incuban todas las siembras a 37° durante 24 a 48 horas.

    Para calcular el número de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contadas éstas, basta multiplicar su número por la dilución respectiva para obtener la cuenta total.

  • Método del asa calibrada. Esta estimación cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agar-sangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de diámetro). Después de incubar las siembras a 37° durante 24 a 48 horas, se cuenta el número de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada de platino contiene 0.01 ml. de orina.

  • Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera:

    • No hubo desarrollo microbiano.

    • Menos de 10 000 colonias por ml.

    • Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml.

    • Más de 100 000 colonias por ml.

    Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con más de 100 000 colonias por ml., la probabilidad de infección es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado se logra en tres recuentos sucesivos.

    Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10 000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y 100 000 colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstrucción uretral, infecciones crónicas e infecciones por cocos grampositivos.

    b. Examen cualitativo

    El estudio cualitativo, que conduce a la identificación del agente, se realiza mediante la siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar-sangre, agar-CLED, agar de Levine o MacConkey. Es recomendable el medio CLED, porque favorece el desarrollo de bacterias patógenas urinarias y permite la identificación de los microorganismos contaminados. Su contenido en cisteína y lactosa y su deficiencia en electrolitos facilitan, por una parte, el reconocimiento de colonias de bacterias y, por otra, inhiben el carácter invasor de las colonias de Proteus. Así se facilita la identificación de estafilococos, bacilos difteromorfos, lactobacilos y otros agentes que pueden contaminar la orina.

    La identificación final de los agentes se hace mediante el estudio de sus propiedades bioquímicas y características serológicas. Esto permite establecer relaciones de identidad entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o de control, y definir el estado de revivida o de reinfección. De esto deriva el valor que tiene el conocimiento del biotipo, del serotipo (particularmente en E. coli), del piocinotipo (en especial cuando es de Ps. aeruginosa) y del antibiótico. Éste último se obtiene al comparar el antibiograma de cepas aisladas de muestras obtenidas de diferentes oportunidades en un mismo paciente Si existe correspondencia, se concluye que se trata de una misma cepa.

    * Métodos rápidos de diagnóstico.

    Existen varios procedimientos prácticos y económicos para el diagnóstico rápido de infecciones urinarias o de bacteriurias significativas. Son útiles para investigar grandes grupos de personas. Estos métodos pueden ser microscópicos, químicos o de microcultivo.

    La coloración de un frotis de orina no centrifugada mediante el método de Gram constituye un índice práctico para diferenciar entre infección y contaminación urinarias. En efecto, la observación de un bacilo gramnegativo por campo microscópico puede realizarse cuando la muestra contiene más de 100 000 bacterias por ml. Sin embargo, la dificultad de encontrar bacterias en frotis de orina por este método, provoca resultados falsos negativos. Menos confiable aun es el hallazgo de 20 o más bacterias gramnegativas por campo microscópico de sedimento urinario, aunque dicho número permita sospechar recuentos superiores a 100 000 microorganismos por ml.

    Los procedimientos químicos están basados en propiedades enzimáticas de las bacterias, que se pueden poner de manifiesto en la orina. Entre las pruebas se pueden mencionar: catalasa, reducción de nitratos, reducción de trifeniltetrazolio e hipoglucosuria. Estos métodos, aunque rápidos y económicos, tienen el inconveniente de ser indirectos, basarse en propiedades metabólicas de las bacterias y no en su desarrollo y observación, y producir muchos falsos negativos.

    II. REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA

    A. TOMA DE LA MUESTRA

    El método más recomendado para realizar la recogida de muestra para un urocultivo es la toma, durante el periodo medio de la micción, siempre que el paciente sea capaz de limpiarse y recogerla, ya que la muestra de orina requiere una cuidadosa limpieza de los genitales externos. Esta técnica impone los siguientes requisitos:

  • El paciente debe tener como mínimo de tres a cuatro horas de retención de orina, y la muestra más representativa es la primera orina de la mañana.

  • El paciente no debe haber recibido tratamiento antimicrobiano durante los tres días anteriores a la recolección, exceptuando los casos de control de tratamiento, y paciente gravemente enfermos.

  • Esta técnica no es apropiada para niños que no controlan sus esfínteres, en cuyo caso se procede a hacer limpieza de los genitales y a fijar un recolector de orina estéril (especial para bebés). Se deja en esta posición hasta que el niño realice su micción; se despeja el recolector y se sella inmediatamente. No debe dejarse colocado el recolector por tiempo prolongado. La alta probabilidad de contaminación en muestras de orina de lactantes, obliga a realizar el estudio en tres muestras sucesivas de micción espontánea.

    En ciertas ocasiones se justifica el sondeo uretral o la aspiración suprapúbica. No obstante, existe un pequeño riesgo de infección tras sondeo uretral, el cual varía según el tipo de paciente. Debido a la colonización por bacterias de la uretra, suele ser difícil definir si los microorganismos aislados a partir de orina tomada con sonda son de origen urinario o uretral.

    En los pacientes con sonda uretral permanente con drenaje cerrado, la orina para cultivo se recoge después de desinfectar la pared de la sonda en su punto de unión con el tubo de drenaje. Se aspira la orina por medio de punción en la sonda con una aguja 21. En ningún momento deberá sacarse de la bolsa de drenaje material para cultivo.

    b. Conservación y/o Transporte

    En lo que respecta al transporte y conservación de muestras de orina, hay que tener en cuenta que la orina constituye un excelente medio de cultivo para casi todas las bacterias, por lo que una vez recogida, la muestra debe enviarse de inmediato al laboratorio, previa colocación del envase en un recipiente que contenga cubos de hielo. Este procedimiento permite que el número de bacterias permanezca relativamente constante por un tiempo considerable.

    C. Procesamiento de la muestra

    Una vez se ha obtenido la muestra de orina se homogeneiza en dos partes:

  • Una parte de la muestra va destinada al Examen en Fresco y posterior Tinción.

  • La otra parte va destinada al Urocultivo.

  • En nuestra práctica vamos a realizar en primer lugar una siembra en placa con la muestra de orina. Cuando se desean observar las características de las colonias de un microorganismo, las placas de Petri resultan muy adecuadas para tal fin. La poca profundidad de la placa y la extensa superficie de cultivo facilitan el examen macroscópico de las colonias así, como si fuera necesario, la observación microscópica de las mismas.

    Para aislar colonias de modo individualizado el medio en placas de Petri se inocula de la siguiente manera. Empleando un asa estéril se extiende la toma de la muestra a modo de estrías en el primer cuadrante. A continuación se hace lo mismo en el segundo cuadrante pero en una dirección diferente a la anterior. En el tercer y cuarto cuadrante hacemos lo mismo.

    Una vez realizada la extensión de la muestra dejamos incubar la muestra a 37° C durante 24 o 48 horas.

    A continuación vamos a hacer un urocultivo en el cuál emplearemos un tubo a cuyo tapón hay unido una lengüeta. En cada cara de la lengüeta hay una medio de cultivo. En nuestro caso, uno de los medios de cultivo es agar MacConkey y el otro es Agar CLED.

    EL agar MacConkey es un medio selectivo-diferencial. Los microorganismos aislados de orina pueden ser fermentadores o no fermentadores de la lactosa. Se emplean medios diferenciales para distinguir unos de otros. El medio MacConkey se utiliza para diferenciar los microorganismos intestinales fermentadores de la lactosa de los que no presentan esta propiedad. En el agar, los nutrientes básicos son el agar y la peptona. El taurocolato sódico (sal biliar) inhibe la flora Gram positiva, mientras que la lactosa y el indicador (rojo neutro) diferencia los fermentadores de la lactosa de los que no tienen esta capacidad.

    Los microorganismos que fermentan la lactosa producen ácido láctico, que neutraliza la sal biliar y absorbe el colorante dando colonias rojizas. Los microorganismos que no fermentan la lactosa dan una reacción alcalina, no toman el rojo neutro y dan lugar a colonias incoloras.

    Composición del agar MacConkey:

    Taurocolato sódico 5 g.

    Peptona 20 g.

    Lactosa 10 g.

    ClNa (opcional) 5 g.

    Agar deshidratado 15 g.

    Solución acuosa rojo neutro

    al 1% 5-7 ml.

    Agua destilada 1000 ml.

    El otro medio de cultivo utilizado es diferente según la casa comercial. Uno de los más utilizados es el agar CLED. Según la casa comercial éste recibe diferentes nombres; en nuestro caso se llama Brolacyn. El medio CLED (Cistina-Lactosa-Deficiente en Electrolitos) se recomienda para bacteriología urinaria. La deficiencia en electrolitos evita el crecimiento invasivo de Proteus spp. , al mismo tiempo que se consigue una buena diferenciación de colonias para la mayor parte de los patógenos.

    Composición del agar CLED:

    Peptona 4 g.

    Extracto de carne 3 g.

    Triptona 4 g.

    Lactosa 10 g.

    L-Cistina 0.128 g.

    Azul de Bromotimol 0.02 g.

    Agar en polvo 15 g.

    H20 destilada 1000 ml.

    Tanto en el medio MacConkey como el Brolacyn tienen un sustrato llamado MUG sobre el cuál actúa E. coli. De modo que si existe E. coli. en la muestra romperá la molécula de MUG dejando libre una parte de ella de tal modo que al aplicarle luz ultravioleta (360-400 nm.)emitirá fluorescencia.

    Para la realización de nuestra práctica introducimos la lengüeta en la muestra de orina, lo cerramos y dejamos incubar durante 24 horas.

    III. RESULTADOS

    Placa de agar MacConkey ! No ha crecido nada

    Tubo-Lengüeta MacConkey/CLED ! Los colores no han virado y mantienen e brillo.

    Resultados: no se observan microorganismos en la muestras analizadas.

    Vemos un análisis paralelo para ver como deberían haber virado los colores. Así:

    • verde brillante ! amarillo mate

    • anaranjado ! rojo fuerte