TEMA 9: Transcripción.

Para expresar la información del DNA se copian trozos, segmentos de información. Se trasncribe y la información del DNA pasa al RNA. Hay genes que se expresan en todas las células, son esenciales (constitutivos) y otros sólo se usan a veces. En organismos muy diferenciados hay genes que se expresan en unos sitios y en otros no, estando regulados a muchos niveles. Es importante el nivel de transcripción, incidiendo en el enzima DNA polimerasa que une monómeros (ribonucleótidos) que forman el RNA cogiéndolos del entorno. Necesita ATP, CTP, GTP y UTP, nucleósidos trifosfatos en forma activada que hacen de molde). Como se han de unir en un orden necesita plantilla por lo que se llama DNA dependiente. Coloca ATP enfrente de timina y así con los otros. No necesita cebador porque añade ribonucleótidos igual que DNA polimerasa en dirección 5'3' uniéndose al OH de nucleótido anterior. RNA tiene un extremo con fosfato y otro con OH. La cadena que copia es la codificante y el molde la complementaria.

Características importantes de los genes para la transcripción.

La polimerasa se une a una secuencia llamada promotor que normalmente está delante de la secuencia que especifica el RNA. El primer nucleótido que está e el RNA (incluido en el promotor) es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto de referencia, delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.

Procariotas: el promotor tiene dos zona comunes que son puntos de reconocimiento de polimerasa en las regiones -10 y -35. Esta secuencia de bases está bastante conservada:

Región -10: TATAAT

Región -35: TTGACA

La eficiencia de la transcripción depende de lo bien que reconozca la polimerasa al promotor, que pueden se diferentes en eficacia. Uno muy fuerte se transcribe muy rápido (1/ 2s) y otros menos fuertes más lentamente (1/10min). Cuanto más se parece el promotor a los anteriores más fuerte es. Las proteínas muy necesaria tienen genes con promotores fuertes. Hay secuencias reguladoras de polimerasas en el mismo promotor. Todos los genes tienen un sitio de término bien definido. En muchos casos en el sitio de término se forman estructuras secundarias, lo que depende de la proteína rho. A veces el mensaje es para varias cosas: RNA policistrónico. En u operón hay u promotor controlando la transcripción de varios genes juntos y al final hay una terminación común para todos.

Eucariotas: Todos los genes tienen promotor y término. No hay policistrónicos. Con mucha frecuencia en los promotores se da una secuencia llamada caja TATA que está en la región -20. No hay zona en -35. Muchos genes tienen secuencias que pueden estar lejos de ellos para reactivar la transcripción (enhancers). Esto se logra porque una proteína (elementos trans) se une a una secuencia (elemento cis).:

- El mensaje está interrumpido por intrones que el RNA se pierden. Las terminaciones se pierden y aunque no se sabe bien para qué sirven parece que hay un procesamiento del RNA, El RNA se va muy lejos y otro enzima lo corta. Es muy común que muchos RNA mensajeros terminen en una cola común llamada poliA añadida por una endonucleasa posteriormente (no codificada). La cola sirve para separarlos del resto.

Hay tres tipos de genes en eucariotas:

Familia 1: muy repetidos, codifican para RNA ribosómico. Son grandes y normalmente son precursores del que después se parte y da los distintos RNA.

Familia 2: mensajeros, cola poliA, intrones, exones ... Todo explicable. Muchos mensajeros distintos, sólo repetidos los de histonas.

Familia 3: codifican para tRNA y para uno ribosómico pequeño (rRNA 55). A veces tienen promotores internos pero no en 5'.

RNA polimerasa DNA dependiente.

Lleva a cabo transcripción, necesita mole pero no cebador. Añade nucleósido trifosfato al OH del nucleótido anterior de manera que alarga en dirección 5'3' quedando pirofosfato que se hidroliza y desplaza la reacción. No puede corregir los errores que comete. Tasa de error 1/100.000.

Procariotas: sólo hay una forma 2` formada por cadenas (holoenzima). Se separa cuando el enzima trabaja.  se une a elementos reguladores,  tiene el centro activo, ` permite unirse al molde, en esa unión participa  que es importante para reconocer al promotor.

Eucariotas: varias subunidades, varias clases de RNA polimerasa.

RNA polimerasa 1: transcripción genes tipo 1.

RNA polimerasa 2: mensajeros.

RNA polimerasa 3: los restantes.

Seleccionan los nucleótidos según el molde y forma enlace fosfodiéster. Primero localiza promotor y luego se suelta para dejar el RNA libre. Debe ser sensible a señales reguladoras que aceleren o retarden.

Proceso de transcripción.

Iniciación de la transcripción.

Procariotas.

RNA asociado al promotor. En E. Coli pueden haber 2000 promotores. La RNA polímerasa se une a cualquier sitio de la molécula y busca el promotor rápidamente deslizándose hasta encontrarlo. Se posa donde ve un promotor, pero otras órdenes exteriores le indican el promotor correcto, reconociéndolo estableciendo puentes de hidrógeno en uno determinado. Las zonas de interacción son -10 y -35 dentro del promotor. Cuanto más fuerte sea el promotor más interacciones podrá formar. Este proceso es rápido porque para reconocer promotores no es necesario desenrollar el promotor, se leen las bases a través del surco mayor. En el reconocimiento del promotor interviene .

Eucariotas.

Requieren presencia de proteínas para reconocer promotores, estos factores transcripcionales se unen al promotor formando un complejo que se une al RNA polimerasa.

- Complejo cerrado: polimerasa se fija al promotor produciendo un cambio conformacional que da lugar al complejo abierto (porque hay un trozo de hélice desenrollado). Se separan las dos cadenas del promotor del DNA, lo que da lugar a una burbuja de transcripción. Imprescindible desenrollamiento para que sirva de molde. separados por unos 17 nucleótidos que se mantienen dentro. Son más de los nucleótidos necesarios para dar una vuelta pero menos que para dar dos. La transcripción produce superenrollamiento negativo, lo que favorece porque desenrolla del DNA. El primer nucleótido del RNA da la posición +1. Una parte grande del promotor no se copia en el DNA sino a partir de +1. Primer y segundo ribonucleótido se usan para formar fosfodiéster. Ribonucleótidos con 3 fosfatos. RNA polimerasa no necesita cebador. Selecciona ribonucleótidos en base a los apareamientos de la doble hélice de Watson y Crick. Escogiendo los complementarios que mejor formen interacciones. El primer nucleótido del RNA deriva de una purina: adenina o guanina y se pone en +1. La burbuja se desplaza y se sintetizan unos 5 nucleótidos antes de abandonar el promotor.

Elongación.

Alargamiento de la cadena. La RNA polimerasa pierde  al pasar a esta etapa. El cambio conformacional determina la pérdida de . La burbuja se desliza separando las hebras (unos 17 nucleótidos) para leerlas. Luego el DNA vuelve a enrollarse. El trozo recién sintetizado se enrolla al DNA en una estructura helicoidal. Dentro de la cadena hay un dúplex de tipo híbrido de ambas cadenas, tipo A.

Terminación de la transcripción.

Procariotas.

Terminación muchas veces asociada a una secuencia. Normalmente en el gen hay secuencias ricas en guanina y citosina repetidas pero invertidas para asociarse entre ellas. Hay otras ricas en adenina y timina. La diferencia entre ambas es que guanina y citosina interaccionan con tres puentes de hidrógeno y adenina y timina sólo con dos. La zona invertida y repetida forman horquillas que interaccionan (secuencias polindrónicas). Forman estructura secundaria, la RNA polimerasa se hace muy lenta, la secuencia de bases nuevas están unidas al molde más débilmente por lo que se suelta. RNA polimerasa sin  no tiene mucha afinidad por lo que se libera del DNA, vuelve al citosol y recupera . Normalmente como procesos en dirección fija a veces la síntesis de un segundo mensajero por un gen antes de que acabe el primero ya se está sintetizando.

Otra forma de acabar la transcripción es la que depende de las proteínas rho que tienen 6 subunidades y es capaz de interaccionar con una zona específica de algunos RNA. Rho tiene actividad ATPasa, capaz de hidrolizar ATP, obteniendo energía. Rho se une al sitio de RNA acabando de sintetizar y gracias a la energía se mueve hacia la burbuja de transcripción. Se une al complejo por medio de sus subunidades. Se coloca entre RNA y RNA e impide que interaccionen.

Eucariotas.

RNA se sintetiza y un enzima lo corta a trozos, terminación por procesamiento de la molécula.

Hay dos tipos de antibióticos que bloquean la transcripción matando a procariotas:

- Rifampicina y actimicina D (mata a eucariotas, utilidad oncológica porque inhibe crecimiento celular).

- Amanitas: bloquean la actividad de la RNA polimerasa 2 por la -aminitina.

Regulación a nivel transcripcional.

Genes con promotores más fuertes se transcriben mejor que otros. Muchos genes tienen su expresión regulada por activadores de la transcripción, proteínas que se unen a secuencias específicas y transforman promotor débil en fuerte. Activador cerca del promotor. Hay proteínas alostéricas que en unas condiciones se unen y en otras no. Unión a la secuencia modulada por ligandos. También hay represores que son moléculas que pueden impedir que la RNA polimerasa se una al promotor bloqueando su movimiento. También son proteínas. Los represores se unen cerca del promotor. Modificación aumentan velocidad de síntesis o disminuirla. Siempre hay secuencia de nucleótidos a la que se unen activadores y represores. estas secuencias están el genoma de todas las células. En una célula habrán proteínas activadoras y en otras no. Las proteínas se pueden modificar para que se unan en unas condiciones y en otras no. Cuando la proteína tape promotor no habrá transcripción. Las secuencias intensificadoras normalmente cerca del promotor, pero no siempre. Normalmente a la izquierda del 5' del promotor (antes) y otras veces dentro del gen. Ejemplos:

Regulación de la transcripción en procariotas: E. Coli.

Gen implicado en la utilización de la lactosa. El medio en que se halla la bacteria puede variar mucho. Los genes se expresan en determinadas condiciones y en otras no. En el entorno de la bacteria hay sustrato que puede metabolizar e induce síntesis de mensajeros implicados en su utilización (regulación positiva). Si está sintetizando algo que luego encuentra en el medio deja de sintetizarlo (regulación negativa). La lactosa es una fuente de carbono que usa la bacteria rompiendo el enlace glicosídico rompiéndola en glucosa y galactosa. Se usan varios genes coordinados (operón, mismo mensajero). El operón lactosa tiene tres genes con un mismo promotor:

- LacZ: codifica enzima encargado de romper lactosa (galactosidasa).

- LacY: encargado de dejar entrar la lactosa dentro de la célula colocándose en la membrana, es una permeasa.

- LacA: codifica para proteínas implicadas en metabolismo lactosa (transacetilasa).

Se expresan las tres juntas porque se utilizan a la vez. Otro gen está separado, el LacI codifica proteínas que es un represor del gen lactosa. Su sitio de unión es al lado del promotor y se llama operador. Impide que la RNA polimerasd avance y copie al unirse. En condiciones normales el operón lactosa no se expresa por culpa de LacI. Cuando en el medio hay lactosa y la bacteria tenga que metabolizarla se expresa el operón. La lactosa se une a LacI que ya no puede unirse al operador. Los niveles de glucosa en el medio determinan que se exprese el operón lactosa porque glucosa se metaboliza mejor. Hay dos mecanismos de regulación:

- Sólo si hay lactosa.

- Sólo si no hay nivel de glucosa, que es el sustrato metabólico más importante.

Al bajar la concentración de glucosa se activa la expresión de algunos genes relacionados con otros sustratos energéticos que palian el déficit de glucosa. Mientras haya no une lactosa y velocidad de transcripción es pequeña. La velocidad se hace alta cuando concentración de glucosa es baja para usar lactosa, uniéndose una proteína que activa transcripción se une cerca del promotor. Activa operón lactosa y otros genes controlados por el nivel de glucosa. Cuando el nivel de glucosa es bajo la proteína anterior se une al DNA. Otra molécula relaciona el nivel de glucosa y la activación de la proteína activador. Al bajar el nivel de glucosa aumenta el de AMP cíclico 3'5' que se une a la proteína y ambos se unen al DNA. El AMP cíclico importante para metabolismo y mecanismos de regulación, es un nucelótido especial derivado de adenina. El fosfato está unido al 5' y el 3'. A la proteína se le llama proteína reguladora activador del AMP cíclico (CAP ó CRP).

Procesamiento post-transcripcional.

Después de sintetizado el RNA se transforma. La mayor parte del RNA se sintetiza en forma de precursor no funcional. Modificaciones:

- Implican que el transcrito, que puede ser más grande que el funcional necesita nucleasas que quitan trozos de cadena.

- Si el transcrito es más pequeño se adicionan nucleótidos no codificados.

- Modificación química de las bases, obteniendo además de los cuatro otros.

Tipos de RNA y sus modificaciones.

- Los de transferencia y ribosómicos no tienen diferencias entre procariotas y eucariotas.

. tRNA: se sintetiza un transcrito que incluye varios tRNA. Actúan nucleasa. Otras modificaciones son que se añaden nucleótidos que no están en el gen (no codificados): en el extremo 5' tiene CGA todos.

- rRNA: todos sintetizados en forma de precursor que se escinden por nucleasas. Según se necesiten ribosomas

- mRNA:

Procariotas: no sufren procesamiento, funcionales tal y como son sintetizados. Participan en la síntesis de proteínas incluso antes de acabarse de sintetizar.

Eucariotas:

1- Procesamiento en los extremos de las moléculas. A veces mensaje interrumpido.

2- Si hay intrones se eliminan. Todos los mRNA son modificados en el 5' (los 3 fosfatos) y se le añade una guanina que luego se metila. Guanina no especificada en los genes. Extremo 5' también conocido cono gorra.

La modificación el extremo es importante para la estabilidad de la molécula y síntesis de proteínas. La gorra 5' es esencial para ser reconocida por el ribosoma.

La modificación 3': hay secuencia AAUAAA reconocida por endonucleasa que corta cerca de ella y añade cola poliA de 200 ó 250 adeninas seguidas (señal de poliadenilación). No hay codificación génica para la cola poliA. Las histonas no tienen poliA ni los mRNA de los cloroplastos o mitocondrias porque provienen de procariotas.

3- Sólo si hay intrones: proceso implica cortar cadena polinucleotídica y volver a unirla. Proceso de corte y unión (Splicing). Primero una nucleasa corta dos enlaces fosfodiéster, y el trozo se suelta. Luego se vuelve a formar fosfodiéster. El sistema (espliceosoma)es muy complejo y preciso a la hora de cortar. El espliceosoma detecta intrones, reconoce secuencia a cortar, quedándose con los trozos de DNA unidos para enlazarlos. Los intrones son ,muy distintos en tamaño aunque hay secuencias consenso que se reconocen para cortar. No se sabe la utilidad de los intrones, pero a veces un exón codifica un dominio de la proteína, lo que es una forma de facilitar la evolución porque es como si hubiesen módulos que se combinan para formar proteínas. Los exones se disponen a veces en lazos para que sean fáciles de procesar.