Terapia génica en piel

Dermis. Epidermis. Clones y holoclones. Transgénesis. Genes víricos

  • Enviado por: María Zubizarreta
  • Idioma: castellano
  • País: España España
  • 9 páginas
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Terapia génica en piel

La piel es uno de los tejidos accesibles para la manipulación génica, en la

cual se pueden introducir genes que produzcan proteínas terapéuticas de forma

regulada.

La piel consta de dos tejidos: La epidermis y la dermis. La primera es la

principal barrera de protección contra las agresiones del medio ambiente, por lo

que su diferenciación celular es compleja y las células se organizan formando

diferentes estratos. Cada una de ellas sufre un proceso de diferenciación y migra

a la superficie hasta morir. La dermis, es más inerte y sus células se encuentran

en una matriz formada por colágeno, a la que acceden capilares sanguíneos y

terminaciones nerviosas. Finalmente, la piel contiene estructuras anexas, como

los folículos pilosos que envuelven al pelo maduro. Es imprescindible que la piel

se regenere rápidamente, si no es necesario recurrir a transplantes de piel.

En 1975, Howard Green y James Rehinwald cultivaron in vitro

queratinocitos, que se resistían a ser mantenidas en estas condiciones debido a su

tendencia natural a diferenciarse y morir en cultivo. El hallazgo de la dispasa,

capaz de desprender los queratinocitos adheridos entre sí en forma de una lámina

continua de la superficie plástica de cultivo. Ahora las láminas podían ser

transplantadas. En 1980, Nicholas O´Connor y John Mulliken realizaron el

primer el primer transplante de queratinocitos cultivados a un paciente con

quemaduras.

En 1987, otra vez Green y sus colaboradores, trabajando con R. Mulligan

del MIT, quien poseía experiencia en el desarrollo de vectores retro virales, uno

de los agentes más usados para introducir genes terapéuticos en células, fueron

capaces de generar queratinocitos que producían la hormona del crecimiento.

Pero en la práctica, el resultado fue frustrante. No obstante, este experimento

demostró que las células epidérmicas eran capaces de llevar a cabo funciones de

secreción. Ahora la meta era introducir eficazmente información genética en los

queratinocitos y conseguir que se exprese de manera permanente. El problema

radica en identificar las células madre. Además, han aparecido datos que indican

que sólo entre el 1 y el 10 % de los queratinocitos proliferarán y formarán

colonias, y éstas ni siquiera son homogéneas.

Es posible aislar subtipos clonales, como por ejemplo, los holoclones,

clones con un alto potencial de crecimiento, formados a partir de células madres

epidérmicas. Otro subtipo clonal son las células transitorias, que provienen de

holoclones. Son una población celular cuya misión es dividirse un cierto número

de veces para finalmente desaparecer. Son incapaces de mantenerse por tiempo

indefinido en un transplante.

Otros factores que condicionan la eficacia y duración de la terapia son la

naturaleza del vector portador del gen terapéutico y las secuencias de DNA

reguladoras de la "expresión" de dicho gen. Existen discrepancias entre los

investigadores en este campo. Hay quienes atribuyen el problema a la

inactivación de las secuencias reguladores de la expresión del gen terapéutico en

el organismo huésped, de forma que, aunque el gen persiste en el tejido

transplantado, no es activo y la proteína deja de sintetizarse. Otros sostienen que

el problema ese encuentra en los vectores retro virales, ineficientes a la hora de

introducirse de células madre, y transducen fundamentalmente células

amplificadoras transitorias, las cuales se pierden de la piel al diferenciarse

terminalmente y descamar. Posiblemente, ambas causas sumadas a una cierta

ineficacia en las técnicas de cultivo de los queratinocitos y del transplante de

éstos al animal huésped, contribuyan en cierta medida a la disminución gradual

de las proteínas codificadas por los genes terapéuticos transferidos. Con esto en

mente, actualmente, se trabaja intentando diseñar nuevos vectores de

transferencia de genes así como mejorando las condiciones para hacer diana en

un alto porcentaje de células madre.

Álvaro Meana, de Asturias, ha desarrollado una matriz dérmica basada en

fibroblastos humanos embebidos en fibrina donde los queratinocitos normales o

manipulados crecen y expresan los genes con gran eficiencia. Por ahora, se ha

conseguido mantener la expresión de distintos genes durante, al menos, 40

semanas. Ejemplos de potenciales aplicaciones de terapia génica a través de

queratinocitos epidérmicos son: Enfermedades hereditarias de la piel, úlceras

crónicas, heridas extensas, enanismo, hemofilia, enfermedades víricas o

enfermedades metabólicas. En años venideros, la piel será uno de los primeros y

más atractivos sistemas para corregir enfermedades mediante terapia génica.

Virus manipulados para transferir genes:

El primer ensayo clínico de terapia génica tuvo lugar en 1990, y ocho años después,

3000 pacientes han llevado en su organismo células genéticamente modificadas. Se han podido

tratar una gran variedad de patologías, además, sin riesgos, pero todavía no hay ninguna

prueba tangible de que la terapia génica haya conseguido tratar una enfermedad humana.

¿Cuáles son las razones?

La terapia génica abre nuevas perspectivas al tratamiento de enfermedades, pero uno

de sus mayores problemas es la transferencia de genes a células. Los virus constituyen hoy el

origen de los vectores de transferencia, pero están lejos de ser los instrumentos ideales porque

su empleo plantea innumerables problemas, como por ejemplo, que han de ser sistemas

seguros, eficaces, capaces de funcionar en células que no se dividan y garantizar la estabilidad

de la expresión del gen. Además, su producción ha de ser fiable y rentable.

En efecto, el cuerpo humano ha aprendido a protegerse de la introducción de DNA

extraño en su genoma, y sólo los virus han conseguido superar estas barreras. De ahí la idea de

los investigadores de crear células de encapsidación que se reúnen para formar partículas

víricas vacías. Los retro virus fueron los primeros virus empleados como vectores de

transferencia. Presentan la enorme ventaja de poder integrar su material genético de manera

permanente en el genoma de las células que infectan. Son los más empleados en un porcentaje

del 60%. Estos virus modificados presentan unos riesgos limitados.

El proceso se basa en tomar del paciente las células objetivo, cultivarlas y modificarlas

genéticamente con el vector retro vírico antes de readministrarlas. la penetración en células se

efectúa por reconocimiento entre una proteína presente en la envoltura vírica y un receptor

celular. En el citoplasma de la célula, el material genético vírico ha de penetrar hasta el núcleo

de las células para integrarse en el cromosoma celular, lo cual, es posible sólo en el momento

de la mitosis. Hoy, los vectores retro víricos sólo pueden ser utilizados por células que, por

una parte, expresen a niveles altos el receptor MLV, y por otra, se dividan activamente durante

la exposición del virus. Cuando el vector se administra por vía sanguínea, existe la posibilidad

que durante su recorrido infecte las células que encuentra en su recorrido. Este problema se ve

acentuado por el hecho de que estos vectores no pueden producirse en concentraciones

elevadas.

Una de las estrategias utilizadas ante este problema consiste en reemplazar la parte del

virus responsable de la unión con el receptor. Se han conseguido de este modo una serie de

receptores-objetivo. Pero en la práctica ha sido imposible ya que la adición del ligante o del

anticuerpo hace imposible la fusión de las membranas.

Otra posibilidad consiste en insertar en la proteína de la envoltura vírica un ligante

capaz de reconocer un compuesto de la matriz extra celular que envuelve la célula-objetivo.

Esta técnica, llamada "de anclaje", permite una unión natural. En este método pueden utilizarse

dos proteínas: el colágeno y la fibronectina.

Otro obstáculo es la incapacidad de los retro virus MLV para transducir células que no

se dividen. La solución se encuentra en los lentivirus (como el VIH), capaces de infectar

células que no se dividen, sin embargo, es peligroso manipular este tipo de virus porque son

siempre susceptibles de producir un virus patógeno. Las investigaciones actuales se orientan

hacia el empleo de sistemas híbridos que combinan una parte del genoma de VIH en un vector

retro vírico, con una proteína de envoltura no VIH. Pero aunque es muy prometedor, en la

práctica todo está por hacer.

Admitamos que se ha resuelto el problema de la eficacia de la transferencia. La etapa

siguiente consiste en obtener una expresión a largo plazo. Cuando no son las propias células

las que reconocen las secuencias reguladoras como extrañas y las inactivada, es el sistema

inmunitario el que destruye la célula infectada. Todavía no se ha conseguido la expresión

estable a largo plazo. Una vez vencido este obstáculo, habrá que obtener una expresión

regulable del gen. La insulina, por ejemplo, responde a señales fisiológicas. Por lo tanto, la idea

es recurrir a secuencias que respondan a señales fisiológicas del cuerpo o a sustancias capaces

de controlar el nivel de actividad del gen. Finalmente, la producción industrial de los vectores

ha de rentabilizarse y ofrecer todas las garantías.

El principal problema de los vectores retro víricos es que pueden reconstruirse por

recombinación y formar otros retro virus con una recuperada capacidad de replicación (RCRs).

Otras secuencias víricas pueden incorporarse a los RCR para producir un virus potencialmente

patógeno. La otra dificultad deriva de la capacidad de un vector para integrarse en un gen

supresor de tumor e inactivarlo. Estos temas han sido analizados en Estados Unidos y parece

ser que la formación de RCR y la aparición de cáncer son acontecimientos improbables. Sin

embargo, la fabricación y los tests siguen siendo caros y complejos, y lo que se consigue

producir son vectores inofensivos que reducen la eficacia de la transferencia del gen.

Para producir partículas víricas que no sean reconocidas y eliminadas, hay que utilizar

células murinas modificadas o cepas de encapsidación no murinas. Esta solución plantea de

nuevo el problema de la aparición de un RCR potencialmente patógeno por recombinación

entre el vector y los retro virus. A este respecto, la utilización de células humanas como células

de encapsidación presenta menos riesgos. Los adenovirus, por ejemplo, permiten transferir

secuencias muy amplias de DNA, y son capaces de infectar muchos tipos celulares diferentes y

con una gran eficacia pueden infectar células que no se dividen y ser producidos en altas

concentraciones. Pero también tienen deficiencias, como por ejemplo que los vectores de

primera generación provocan fuertes reacciones inflamatorias e inmunitarias.

Obtener más y más genes víricos no siempre es una ventaja. Ciertas secuencias

protegen de la vigilancia del sistema inmunitario a las células que expresan el vector. Hay que

contemplar soluciones intermedias, una de las cuales consiste en administrar al paciente

tratamientos inmunodepresores que hagan posible la inyección repetida del vector. Otro virus

de DNA empleado en ensayos clínicos es el AAV, un virus no patógeno muy corriente en el

hombre, que ha de ser ayudado por un adenovirus o un virus del herpes. Es el único virus

conocido en mamíferos que se integra específicamente en una región concreta del genoma de

la célula (el brazo corto del cromosoma 19 humano). Desafortunadamente, los vectores AAV

transformados en vectores de transferencia parecen perder esta propiedad, pero son capaces de

transducir eficazmente células. Punto fuerte de estos virus: su capacidad para infectar células

que no se dividen. Pero también esta propiedad del virus original desaparece cuando es

modificado. Por tanto, las ventajas de estos vectores no son explotables en clínica, pero siguen

siendo unos candidatos prometedores. El virus Herpes simplex (HSV), puede transducir

células del sistema nervioso, y varios equipos estudian sistemas híbridos en los que se utiliza un

vector adenovírico para transportar un vector de tipo retro virus a una célula normalmente

inaccesible a la transducción retro vírica.

Lo cierto es que, por el momento, los investigadores no disponen todavía de vectores

derivados de virus con DNA seguros y que permitan la integración del gen-medicamento en el

genoma de células humanas que no se dividen.

El pasado otoño, French Anderson, piñoneo de la terapia génica propuso tratar dos

enfermedades genéticas graves: la alfa-talasemia, enfermedad fatal de la sangre, debida a un

efecto del gen de la hemoglobina, y una deficiencia inmunitaria grave (SCID), resultado de la

carencia de un gen esencial, el de un enzima llamada adenosina desaminasa. En cuanto al

estudio, su autor propuso ensayar el método en fetos portadores de estas anomalías genéticas,

cuyas madres hayan decidido abortar. Sólo después de la interrupción del embarazo, podrán

los investigadores verificar la eficacia del tratamiento. Todavía se necesitarán de dos a tres

años de trabajo en vectores y de ensayos para que estos proyectos sean técnicamente

aceptables. Además, esta nueva terapia plantea un problema ético de difícil solución.

¿Transgénesis sin ayuda de los virus?

Los investigadores hoy en día, más que desarrollar nuevos vectores, lo que intentan es

modificar del modo más sencillo posible los transportadores comerciales; las partículas que

encierran el DNA han de asociarse a las células-objetivo, penetrar en su citoplasma y,

finalmente, entregar su contenido en el núcleo celular.

El DNA es una molécula cargada negativamente. Los virus compactan fuertemente el

DNA gracias a proteínas ricas en aminoácidos cargados positivamente: los histones. Esto hace

que la mayor parte de los vectores de síntesis sean lípidos, péptidos o polímeros cargados

positivamente, llamados catiónicos. Este exceso de cargas positivas permite a los

transportadores interaccionar, mediante enlaces electrostáticos, con las cargas negativas que

presenta la membrana celular.

La mayor parte de los equipos mezclan vector y ácido nucleico, formando un complejo

que contiene, en general, varias moléculas de DNA. Únicamente una condensación controlada

del DNA permitiría la formación de partículas que encerraran una sola molécula de DNA, lo

que facilitaría considerablemente su paso a los compartimentos vasculares, así como la

penetración en las células y su núcleo.

¿Cómo lograr que los complejos transfectantes entren en las células? Ciertos virus i

nteraccionan electrostáticamente con la membrana de las células, lo que les permite la entrada.

In vitro, la etapa de penetración en la célula no plantea problemas, sin embrago, in vivo, su

eficacia cae considerablemente. Así, después de una inyección por vía intravenosa, se constata

que la transferencia de genes tiene lugar principalmente hacia las células del pulmón y del

hígado. Por tanto, no pueden abandonar eficazmente el sistema vascular, y penetran en las

primeras células que encuentran.

Para conducir el DNA hacia objetivos específicos se pueden transplantar al

transportador de los ligantes, unas moléculas que serán reconocidas por los receptores

presentes en el tipo celular elegido, (azúcares, péptidos, hormonas, etc.). Por ejemplo,

proteínas azucaradas permiten la entrada dirigida hacia las células del hígado. Las células

absorben el DNA por endocitosis, y es vertido a los lisosomas. Como estos últimos contienen

enzimas que degradan el contenido, a los vectores sintéticos se les asocia unas moléculas, las

fusiógenas, que les permiten evadirse. Los otros tipos de vectores se asocian a péptidos

fusiógenos. Éstos sólo actúan después de la entrada de la sustancia al citoplasma, cuando el

medio se acidifica. También pueden utilizarse adenovirus para este fin, pero el complejo ya no

sería del todo sintético.

Una vez en el citoplasma, todavía es necesario que el ADN llegue al núcleo de la

célula. Introduciéndolo en células en crecimiento, el DNA penetra en el núcleo durante la

división celular, cuando se disloca la envoltura nuclear. En las células en reposo las moléculas

de menos de 9 nm entran por los poros de la membrana nuclear por transporte activo, para las

demás, no hay un método eficaz por el momento.

Otro problema: si el vector ha de permanecer asociado al DNA hasta el interior del

núcleo, hay que asegurarse de que su presencia no interfiera con la transcripción del gen

introducido.

Para asegurar el mantenimiento del gen, se intenta introducirlo en el genoma, pero es

difícil de conseguir al azar. Otra vía es que se replique con las divisiones celulares. Y una

tercera posibilidad: introducir en la célula-objetivo minicromosomas artificiales que se

repliquen de modo autónomo. Entonces, su expresión estaría controlada por la célula de forma

natural. Ésta es una ventaja de los vectores sintéticos: casi no hay límite al tamaño del DNA

transfectado.

Ante las dificultades de la técnica de transfección por vector sintético, se están

desarrollando unos métodos alternativos que se agrupan bajo la denominación de técnicas

físicas. Es el caso de la inyección del DNA sin vector. Esta técnica podría desembocar de

manera imprevista en un nuevo modo de vacunación.

Hoy, el interés de los sistemas no víricos reside en la simplicidad de su preparación y su

estabilidad y pureza. Con el tiempo, serán interesantes para la utilización local.