INTRODUCCIÓN

Las vacunas orales son un beneficioso descubrimiento no solo por su facilidad de administración sino también por su facilidad de aceptación por los pacientes al no ser inyectables. Otra ventaja es la capacidad de estimular la producción de anticuerpos de la mucosa que son más efectivas que las vacunas inyectables. Esto es importante porque el sistema inmune de la mucosa es la primera línea de defensa contra cualquier organismo patógeno.

Las vacunas de diseñan para que provoquen la respuesta inmune sin causar ninguna enfermedad. Normalmente están compuestas por organismos patógenos muertos o atenuados. Las subunidades de vacunas recombinantes son una buena alternativa por sus menores efectos ya que no contienen ningún agente infeccioso siendo de este modo más seguras de administrar, preparar, y las dosis además son mas uniformes.

La biología molecular ha identificado algunas proteínas y péptidos que podrían funcionar de una forma efectiva como subunidades para vacunas.

Las vacunas recombinantes tienen suficiente potencial para ser efectivas en la prevención de enfermedades en animales y en el hombre, pero son bastante mas caras de producir, y por eso su uso esta limitado en todo el mundo.

Para algunos antígenos para vacunas las plantas transgénicas han proporcionado un sistema de expresión ideal, en el cual el material de la planta transgénica puede ser dado directamente al paciente como su dosis oral de vacuna recombinante.

PLANTAS TRANSGÉNICAS COMO SISTEMA DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

Existe una gran variedad de sistemas de expresión hoy en día: levaduras, cultivos de células de insectos, mamíferos, de bacterias, animales transgénicos y plantas. El sistema más común de todos ellos podría ser el de bacterias aunque también el de levaduras por su relativa facilidad de manejo y por su rápido crecimiento.

Las plantas transgénicas proporcionan un sistema alternativo que podría ser explotado por su alta capacidad de producción. Una gran ventaja de producir vacunas en plantas transgénicas es la capacidad de usar directamente el tejido vegetal comestible para una administración oral sin necesidad de purificarlo.

Si una “fuente alimenticia vegetal” es usada para la producción de vacunas comestibles, algunos de los problemas asociados con los otros sistemas de producción a gran escala durante la purificación no deberían ser considerados, como toxinas y aditivos.

El desarrollo y refinamiento de las técnicas de ingeniería genética vegetal y la mejora en el conocimiento de la biología molecular de plantas están continuamente expandiendo el potencial de la biotecnología vegetal. La mayoría de la investigación se basa en el conocimiento de los procesos fundamentales de expresión de transgenes y la acumulación de proteínas recombinantes así como su estabilidad y procesamiento en plantas

EL PAPEL DE LAS DISTINTAS ESPECIES VEGETALES PARA LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES

Algunas de las plantas que se han utilizado para su transformación son: Alfalfa, manzana, espárrago, plátano, cebada, repollo, semillas de colza, zanahoria, coliflor, pepino, berenjena, lino, uva, kivi, lechuga, altramuces, maíz, melón, papaya, pera, cacahuete, pimiento, ciruela, patata, frambuesa, fresa, arroz, soja, calabaza, caña de azúcar, girasol, tomate, nuez y trigo.

Para muchos animales de granja el maíz puede ser una buena forma de vacunación ya que los cereales son el principal componente de los piensos animales. Los animales jóvenes que no se alimentan de alimentos sólidos, pueden ser también inmunizados pasivamente al mamar leche materna que contenga anticuerpos. En el caso de vacunas para el hombre el plátano puede ser una buena opción porque puede ser ingerido por los bebes, consumido sin cocinar y es indígena en muchos países en vías de desarrollo donde son necesarias las vacunas con bajo costo.

OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES

Las plantas transgénicas son producidas generalmente mediante dos métodos:

1.Transformación por Agrobacterium tumefaciens

2. Bombardeo de partículas.

Con ambos métodos el transDNA puede ser introducido en casi todos los lugares de la planta. La posición de la inserción tiene generalmente efectos sobre la expresión de los transgenes, por lo que muchas líneas de plantas transformadas deben ser analizadas para encontrar la mejor línea de expresión.

Para utilizar de forma económica plantas para producción de proteínas, es esencial maximizar la expresión de los transgenes y la acumulación de proteína recombinante.

Pueden aparecer dificultades técnicas cuando se utilizan las plantas transgénicas para producir proteínas extrañas.

El rendimiento de las proteínas recombinantes puede ser incrementado si se aumenta la estabilidad de la proteína, o del RNAm, su transducibilidad o se aumenta la fuerza del promotor.

Para algunas proteínas recombinantes, su acumulación se aumenta si se hace dirigir esta proteína hacia un compartimento subcelular como el retículo endoplasmático o las vacuolas. Secuencias especificas dentro de un RNAm pueden afectar a la estabilidad y trasducibilidad del mensaje en células vegetales.

En muchos casos, el uso de genes sintéticos en “plantas optimizadas” aumentan drásticamente la acumulación de proteína recombinante. Además el uso de promotores fuertes es critico para maximizar el rendimiento de proteínas recombinantes. Puede ser deseable utilizar promotores específicos de tejidos inducidos sintéticamente como es el caso del LT-B (vacuna contra el cólera y el ETEC.)

MODELOS DE SISTEMAS VEGETALES

El tabaco transgénico como sistema para producir vacunas recombinantes proteicas no es un buen método debido a sus altos niveles de alcaloides y nicotina.

Patata, tomate y maíz tiene mejores ventajas practicas y moleculares como sistemas de producción de vacunas. Todos ellos poseen tejidos vegetales comestibles, los cuales pueden ser administrados a animales para su alimentación.

Una estrategia a desarrollar seria la expresión especifica en tejidos para que se acumulen estas proteínas recombinantes específicamente en el tejido que va a servir de alimento para la vacunación. El confinamiento de la expresión de una proteína heteróloga a un órgano especifico de la planta puede ser beneficioso a la hora de regenerar la planta transgénica así como la acumulación de proteína recombinante en altos niveles puede ser nocivo para el desarrollo de la planta.

PATATA

Ventajas de usar la patata como sistema de producción de vacunas experimentales.

Eficiencia de transformación genética por A.tumefaciens con relativa pequeña transformación y tiempos de generación.

Propagación clonal

Disponibilidad de promotores específicos de tejidos y capacidad de producción de micro tubérculos .

Potencial de almacenamiento

Capacidad para alimentar con tubérculos tanto a animales como al hombre.

Los tubérculos son el órgano de almacenamiento en la planta de la patata y pueden ser almacenados durante un tiempo antes de ser consumidos. Las proteínas extrañas tiene una alta capacidad de sobrevivir durante largos periodos de tiempo en el tubérculo mientras este no sea dañado. Los beneficios de poder ser almacenados sin haber sido sometidos a ningún proceso, hacen a las patatas muy deseables como sistema de producción de vacunas para los animales que comen patatas crudas.

Se están desarrollando estudios sobre inmunogenicidad con tubérculos de patata en ratones y seres humanos voluntarios.

Una desventaja de estos tubérculos es que no tienen un alto contenido en proteínas es decir, las patatas tienen aproximadamente un 2% de proteína de su peso total por lo que, un gramo de tejido de tubérculo, contiene al menos 20 mg de proteína. Para un gramo de tubérculo que contiene 1 mg de proteína recombinante, esta ultima debe ser un 5% del total de proteína en el tejido del tubérculo. Para tejidos con un mayor contenido proteico, como 10% de proteína, para producir 1mg de proteína recombinante por gramo de tejido, se requiere un nivel de expresión de proteína de al menos un 1%.

TOMATE

Las ventajas de los tomates incluyen :

Facilidad de transformación

Capacidad de cruzamiento genético para combinar transgenes para la producción de múltiples subunidades de vacunas en una planta

producción de semillas que pueden ser almacenadas a altas temperaturas

Son fácilmente ingeribles crudos por los humanos

Una desventaja es la necesidad de crear homocigotos para la continuación de las líneas o para el análisis de la descendencia de cada individuo, por su contenido del transgen y también porque los tomates, al igual que las patatas, no tienen un alto contenido en proteínas.

PLÁTANO

Los plátanos transgénicos son nuestro mejor método para la producción de vacunas orales para el hombre. Alguna de las ventajas son:

Comodidad de alimentación

Capacidad de ser consumido sin ser cocinado

Facilidad de obtención en países en vías de desarrollo, gracias al uso de la tecnología de propagación clonal.

Las desventajas están en la dificultad de crear plantas transgénicas de bananas. La regeneración y el crecimiento necesarios para la maduración y producción del fruto, puede llegar incluso a tres años. El contenido proteico del plátano es aproximadamente del 1%. Recientes estudios en biología molecular de plátanos, han identificado varios genes que son regulados positivamente durante la maduración del fruto, y cuyos promotores son muy apropiados para la expresión especifica en tejidos de vacunas comestibles.

CANDIDATOS A VACUNAS

Las vacunas típicas están compuestas por organismos patógenos muertos, organismos vivos atenuados o estirpes de organismos patógenos cuyo huésped difiere del de la especie que va a ser vacunada.

Investigaciones recientes en inmunología proponen las subunidades de vacunas como una nueva alternativa. Una subunidad esta compuesta por una o más proteínas o componentes del organismo patógeno que inducen al huésped a aumentar una respuesta inmune. Un ejemplo de subunidad de vacuna es el antígeno de la cápsida del virus de la hepatitis B. Este antígeno (HbsAg) ha sido utilizado con éxito contra el virus de la hepatitis B (HBV). Este es una proteína de la cápsida del virus y aparece de tres formas en la cápsida nativa viral, diferenciándose en sus aminoácidos terminales. Las subunidades comerciales están compuestas por la forma más corta, la proteína S.

La vacuna se produce en un sistema de producción en levaduras y se ensambla en partículas esféricas llamadas VLPs (virus-like particles) que son muy similares a las cápsidas nativas del HBV. Esta fue la primera subunidad recombinante usada como vacuna. Esta se administra en tres inyecciones que contienen de diez a veinte microgramos de HbsAg en cada dosis.

La producción de VLPs en sistemas de cultivos celulares de insectos infectados con Baculovirus se han descrito para los siguientes agentes patógenos:

• Virus de la enfermedad del caballo africano

• Virus de la lengua azul

• Virus de Dengue

• Hv190SV

• Virus de Hawai

• Hepatitis B

• Hepatitis E

• Virus de Norwalk

• Parvovirus

• Rubeola

• Papilomavirus

• Virus hemorrágico del conejo

Muchos de estos pueden ser candidatos para su producción en plantas como subunidades de vacunas. Si el ensamblaje de los VLPs puede ser acompañado de un sistema in vitro su potencial estaría disponible para ensamblarlo dentro de una célula vegetal.

INMUNOGENICIDAD ORAL Y ADYUVANTES

Una exitosa vacuna oral sería aquella que estimulase el sistema inmune de la mucosa para producir una respuesta protectora inmune contra el agente infeccioso.

La estimulación del sistema inmune a través de la mucosa para producir un nivel similar de anticuerpos circulantes, comparables a los que habría con una inyección vía parenteral, normalmente requiere múltiples dosis de antígenos, bastantes mas de lo que se necesita por vía parenteral. Una vacuna oral debe ser resistente a proteasas y al bajo pH del estomago para poder alcanzar las células receptoras del intestino donde se encuentran las células M. Estas transportan partículas y peptidos hasta tejidos linfoides subyacentes a la membrana mucosa. Las partículas parecen ser mucho más efectivas con las células M de lo que son los peptidos como inmunogénicos. Antígenos que forman estructuras multiméricas o heteroméricas son probablemente mejores candidatos para ser vacunas porque estimulan mejor la mucosa que las proteínas solubles.

Hay muchos métodos de presentar los fármacos o las vacunas orales: encapsulación en microesferas lipídicas, precipitados fosfolípido-calcio, polímeros mucoadhesivos.

La producción de vacunas orales en plantas proporcionan un sistema de encapsulación con paredes celulares y membranas celulares que protegen al candidato como vacuna en el estomago. La digestión del material vegetal puede proporcionar una lenta liberación de la vacuna a lo largo del sistema digestivo que haría despertar al sistema inmune de la mucosa.

Los adyuvantes son sustancias que aumentan la respuesta inmune, y se usan normalmente como vacunas inyectables. Algunos se encuentran bajo estudio para uso en la mucosa, y entre ellos destacamos la enterotoxina lábil al calor (LT) que proviene de una cepa de Escherichia coli (ETEC) y la toxina colérica (CT) de Vibrio colera.

LT y CT son similares en estructura, función y cualidades inmunológicas. Cada molécula de holotoxina esta compuesta por una subunidad A y cinco subunidades B de manera que forman un pentámero. Las subunidades B cuando se ensamblan pueden unir gangliosidos GM1 en la superficie de las células M en el tracto digestivo. Para estudios animales CT o LT pueden añadirse junto con una sustancia oral que aumente la respuesta inmune. Los efectos tóxicos de CT y LT hacen imposible su uso en humanos, sin embargo algunos mutantes de CT y LT se están estudiando como posibles adyuvantes de la mucosa.

Seria muy interesante el uso de vacunas comestibles de plantas sin necesidad de un adyuvante, sin embargo es necesario para algunos antígenos. También es posible modificar la planta para que produzca el adyuvante, o si no una forma mutante del adyuvante que no produjese efectos tóxicos. Esto posibilitaría la coadministracion del antígeno con el coadyuvante. Normalmente la cantidad de coadyuvantes es menor que la cantidad de antígeno cuando se presentan oralmente.

EJEMPLO DE VACUNA CONTRA UN AGENTE BACTERIANO PATÓGENO

LT-B como vacuna contra el colera y el ETEC:

En 1995 se demostró que si se alimentaban a ratones con tubérculos transgénicos que producían la subunidad B de la LT toxina, estos producían suero y anticuerpos de la mucosa contra la proteína LT-B. Esta proteína LT-B recombinante ha sido sintetizada en plantas de tabaco y patata y se ha visto que siguen manteniendo su capacidad de auto ensamblaje y formación de estructuras pentaméricas. La planta produce LT-B unida a gangliosidos GM1 que son reconocidos por anti-LT anticuerpos, cuando se alimentaban estos ratones con tubérculos LT-B. Esto se produce gracias a la producción de sIgA de la mucosa y IgG del suero. Experimentos in vitro con células Y-1 adrenales comprobaron que los anticuerpos neutralizaban la toxina LT.

b) EJEMPLO DE VACUNA CONTRA UN AGENTE PATÓGENO VIRAL

Hepatitis B:

Las vacunas comerciales contra el HBV incluyen proteínas recombinantes de la cápsida del virus de la hepatitis B como antígeno (HBsAg). Este antígeno fue la primera vacuna recombinante hecha con sólo un transgen.

HbsAG se expreso en plantas de tabaco y patata y se vio que se ensamblaban como VLPs(virus-like protein) siendo muy similares a las producidas comercialmente por levaduras. Los resultados obtenidos en tabaco fueron comparables con los de levaduras en cuanto a su estimulación de la respuesta inmune. La única limitación de este proyecto fue el bajo nivel de expresión de partículas en el tejido vegeta. Cerca de un 0.01% del total de proteína soluble era proteína HbsAg recombinante, aproximadamente 1 microgramo por gramo fresco usando el promotor especifico de la patatina de tubérculos. Recientes experimentos han logrado aumentar mucho el nivel de expresión en tubérculos d patata. Esto permitirá futuros estudios para probar su inmunogenicidad oral.

OTROS VLPs Y ANTIGENOS PARA VACUNAS EXPRESADOS EN PLANTAS

Un problema común en todos los experimentos que se refieren a expresión de proteínas foráneas en la planta, es el bajo nivel de expresión de esta proteína en el material vegetal.

Normalmente una dosis oral de una vacuna requiere mucha mas cantidad de antígeno que una vacuna administrada por vía parenteral, por lo que es necesario determinar exactamente cual es la cantidad de antígeno de una dosis que se necesita para que sea efectiva. Avances en biotecnología como la producción de genes sintéticos y nuevos descubrimientos sobre expresión en tejidos vegetales permitirán un mayor nivel de expresión de las proteínas recombinantes. Además las futuras vacunas comestibles que sean producidas en plantas también expresaran un adyuvante como el LT(o un mutante no toxico de LT).

LUCHA CONTRA LA AUTOINMUNIDAD

Aunque el suministro oral de los antígenos derivados de agentes infecciosos estimula a menudo el sistema inmunitario, la ingesta de “auto antígenos” ( proteínas procedentes de tejidos sin infectar en in individuo que no ha recibido tratamiento) puede en ocasiones suprimir la actividad inmunitaria, fenómeno este que se observa con frecuencia en los animales de experimentación. Nadie sabe dar la razón de esa diferencia.

Algunas de las pruebas de que la ingestión de autoantigenos podría suprimir la autoinmunidad se han obtenido investigando la diabetes tipo I, resultado de la destrucción inmunitaria de las células del páncreas productoras de insulina (células beta).Esa labor destructora progresa calladamente conduciendo a una perdida de células beta que conduce a una grave deficiencia de insulina.(hormona que se necesita para que las células capten la glucosa de la sangre y obtener energía).Por culpa de esta perdida suben los niveles de azúcar en sangre. Las inyecciones de insulina ayudan a controlar la diabetes, pero no la curan. Los diabéticos se hallan expuestos a un riesgo elevado de complicaciones graves.

A lo largo de los últimos 15 años se han identificado varias proteínas de la célula beta capaces de despertar autoinmunidad en personas predispuestas a la diabetes tipo I.
Los principales culpables, sin embargo, son la insulina y la ácido glutámico descarboxilasa(GAD). Se ha progresado también en la detección del momento de incubación de la diabetes. El próximo paso a dar será encontrar el camino para detener las bases del proceso antes de que aparezcan los síntomas.

Con este propósito se ha trabajado en vacunas contra la diabetes basadas en plantas que, como la patata, contengan insulina o GAD ligadas a la subunidad B inocua de la toxina del V. Cholerae (para potenciar la captación de los antígenos por las células M).

La administración de las vacunas a unas capas de ratones en los que se había inducido la diabetes contribuyo a suprimir el ataque inmunitario y prevenir o retrasar la elevación del azúcar en sangre.

No se han conseguido todavía plantas transgénicas que produzcan las cantidades de autoantigenos necesarias para una vacuna viable contra la diabetes humana u otras enfermedades autoinmunitarias. Pero se están explorando diversos esquemas prometedores para vencer esta y otros retos, igual que se avanza en el terreno de las enfermedades infecciosas.

A las vacunas comestibles para combatir la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas les quede un largo camino por delante antes de que estén listas para las pruebas a gran escala con humanos. Los obstáculos técnicos, no obstante, parecen superables. Nada seria más satisfactorio que proteger la salud de millones de niños, ahora indefensos.

OTROS PRODUCTOS

Estos comprenden una gran variedad de productos que pueden ser manufacturados en plantas transgénicas, y que tienen un común denominador: tienen un relativo alto valor y su producción en plantas transgénicas es más barata que los procedimientos clásicos. Podríamos incluir:

-oligopéptidos y proteínas como terapéuticos y para investigación biomédica.

-Oligómeros y polímeros de azúcar

-Alcaloides y fenoles

-Enzimas para humanos y animales

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No se puede negar que los productos manufacturados están en auge, pero todavía no se tiene todo el acceso al publico mas que nada por consideraciones de propiedad, ya que debemos tener en cuenta que hasta llegar al publico un producto debe pasar por varias etapas de licencia y aceptación por parte de las autoridades y del propio publico.

OLIGOPEPTIDOS Y PROTEINAS

Un ejemplo que los investigadores intentan producir son las leuencefalinas es semillas de plantas transgénicas. Estos son unos neuropéptidos que comprenden cinco aminoácidos(Try-Gly-Gly-Phe-Leu) con propiedades opiáceas.

La estrategia a seguir es la de insertar este pentapéptido en la albumina 2S de semillas.

Se eligieron estas albúminas porque son solubles en soluciones con baja concentración salina y porque son muy abundantes entre las proteínas de almacenamiento en semillas. Es muy importante elegir correctamente el sitio de inserción para que el plegamiento en cuerpos proteicos, no se dañe.

Se construyeron cDNAs para genes quiméricos de albumina 2S en los cuales el código para los 5 aminoácidos de las leuencefalinas se reemplazaron por los de una albumina modificada. Estos genes quiméricos de insertaron en cassettes de transformación que contenían también elementos cis reguladores y marcadores seleccionables.

La transformación fue hecha en A. thaliana y Brassica napus mediante A. tumefaciens.

Las semillas se cosecharon y se extrajo la albúmina, se purifico y se comprobó la presencia de leuencefalinas en las semillas transgénicas de A.Thaliana y B.napus.

El rendimiento fue aproximadamente de 200 nmol/g semilla en A. Thaliana y 10-50 nmol/g semilla en B. Napus.

Otro hecho importante realizado en plantas transgénicas fue la producción de seroalbúmina (HSA), concretamente en plantas de tabaco y patata.

En el hombre la HSA se sintetiza en el hígado como prepro-albumina, pero en plantas se ha intentado modificar su gen para que se produzca directamente la albumina madura en la planta.

Se observo que era importante el péptido señal Asp-Ala-His-Lys en ambas plantas. Para patata se usaron discos de tubérculos, se transformo con A. Tumefaciens y se seleccionaron en un medio con kanamicina. Los niveles de HSA se evaluaron por inmunoblot. Las hojas contenían un 0.02 % de HSA del total de proteína soluble. Resultados muy parecidos se observaron en tabaco, y se observo además que el procesamiento de la proteína precursora era dependiente del tipo de secuencia señal.

Aun así, tendremos que esperar mucho hasta comercializar a gran escala estas patatas transgénicas.

POLIMEROS Y OLIGOMEROS DE AZUCAR

Los tubérculos de patata transgénica se han usado como productos manufacturados por la presencia de un oligosacárido cíclico; las ciclodextrinas (CDs).

Estos oligosacáridos poseen unidades de glucopiranosa unidos con enlaces alfa, beta y gamma (1-4) y forman complejos de inclusión con sustancias hidrofóbicas que les hacen más estables. Estas CDs tienen aplicaciones farmacéuticas además de otros usos.

Se trabajo con el gen de la ciclodextrina glicosil-transferasa de la bacteria Klebsiella pneumoniae y se unió a un promotor de la patatina especifico de tubérculo.

La transformación se hizo con A. Tumefaciens y aunque el RNAm de la enzima no se pudo detectar y los niveles de CD en los tubérculos no pudieran ser precisados los investigadores estiman que cuando la producción de CD alcance al menos un 10% en el almidón del tubérculo, este podrá ser comercializado.

ALCALOIDES Y FENOLES

Los alcaloides propanos, hiosciamina (forma racémica de la atropina ) y escopolamina son de uso farmacéutico y actúan como agentes anticolinérgicos en el sistema nervioso parasimpático.

La planta con la que se trabajo, que sintetizaba hiosciamina es una solanácea , Atropa belladona.

Teniendo en cuenta la ruta metabólica desde la hiosciamina a la sopolamina los estudios se centraron en la enzima hiosciamina -6-ß-hidrolasa (H6H).

Esta enzima convierte la hiosciamina en 6-ß-hidroxihiosciamina para mas tarde sufrir una epoxidación para dar escopolamina. La estrategia a seguir fue el aislamiento del DNA que contenía la H6H de Hyoscymun niger y expresarlo en la A. belladona transgénica. Se incluyo junto al gen un promotor 35S, un terminador Nos, y la transformación se hizo con A. tumefaciens. Se selecciono en un medio con kanamicina y se hizo un western para comprobar los niveles de H6H. Se autopolinizaron las To obteniendo la descendencia T1 .

Esta generación T1 se observo que contenían altos niveles de escopolamina en sus hojas, pero no-hiosciamina, además se vio que los alcaloides se sintetizaban en las raíces y eran transferidos a las partes altas de la planta. Concretamente se observo hasta un 1.2% de escopolamina en hojas. Posiblemente la combinación de métodos de reproducción convencionales y expresión de H6H por transformación genética podrán incrementar y estabilizar en el futuro la producción de escopolamina.

ENZIMAS PARA EL HOMBRE Y OTROS ANIMALES

Los animales monogástricos has perdido las capacidad de utilizar el fósforo contenido como fitato en semillas de plantas cultivadas.

En los estudios realizados se intento introducir la fitasa de Aspergillus niger en semillas de tabaco. Esto hacia que no se tuviera que añadir fósforo o fitasa fúngica a este cultivo. Pero además los autores de este experimento se plantean el insertar este gen que codifica para la fitasa en cosechas que normalmente se usen como alimento. Un ejemplo par el hombre podría ser la producción de proteínas biorreactivas.
En este sentido hay muchas limitaciones por la dificultad de producir proteínas humanas en cultivo de tejidos humanos, y también en bacterias por los procesos de glicosilación que requieren las proteínas humanas y cuya capacidad no poseen estas bacterias.

Existen tres características que se requieren para los productos modificados genéticamente:

-Seguridad medica

-Pureza e identidad con la proteína natural

-Bajo coste de producción

Estas características son indispensables a la hora de tratar con expresión heteróloga de proteína humana para tratamientos médicos.

Las plantas no son huéspedes de agentes patógenos del hombre, y sin embargo tienen la capacidad de modificaciones post-transcripcionales, además d no haber opiniones negativas contra la experimentación con plantas, no así con los animales, por eso se pueden explotar para el beneficio del hombre.

Aquí se intento utilizar una planta transgénica como sistema bioproductor para la expresión heteróloga de genes humanos.

Concretamente se uso la planta de tabaco para expresar una proteína C humana (hPC) que es un complejo serina proteasa que tiene una potente actividad anticoagulante y un valor significativo como proteína para usos terapéuticos.

Esta hPC es una protesa dependiente de la vitamina K importante en la cascada coagulación / anticoagulación. Esta es segregada desde el hígado ala sangre como cimógeno para luego sufrir complejas modificaciones co y post-transcripcionales.

El gen de la hPC se introdujo en plantas de tabaco con un promotor 35S y la transformación fue llevada a cabo por A.tumefaciens. Los resultados obtenidos no fueron muy satisfactorios ya que solo se logro alcanzar un 0.002% de hPC del total de proteína soluble en la planta transgénica de tabaco.

Se hicieron otros estudios para expresar otra proteína glucocerebrosidasa (hGC) de importancia en el hombre ya que causa la enfermedad de Gancher cuyos enfermos lo que hacen es acumular glucosiceramidas en el hígado, bazo, huesos largos como los de las rodillas y en células reticuloendoteliales lo que requiere administraciones intravenosas de glucocerebrosidasas humanas modificadas ( como la cerdaza), cuyo coste es muy alto siendo comercialmente atractiva si producción en plantas transgénicas.

Se introdujo el DNA que contenía hGC en un cassette de transformación de A.tumefaciens pero en vez de utilizar un promotor 35S se uso un promotor MeGA (propietery inducible plant promoter).

Las plantas transgénicas obtenidas expresaron un alto nivel de transcritos de hGC bajo inducción. Además las plantas transgénicas de tabaco inducidas producían una glicoproteína de 69 KD que reaccionaba de forma contraria con los anticuerpos monoclonales anti-hGC y que es aparentemente activa enzimaticamente. Esto indica que al menos una parte de la proteína heteróloga es correctamente glicosilada y plegada.

Los investigadores demostraron la co-expresión de la alfa y beta globina de la hemoglobina humana HbA en plantas transgénicas de tabaco. Mostraron que la Hb recombinante, un complejo proteico multimérico, puede obtenerse de una planta.

Obviamente hay todavía un largo camino por recorrer -de la expresión hPC y hGC en plantas de tabaco- hasta que puedan ser productos aceptables terapéuticamente y que serán adecuados para el tratamiento médico.
Sin embargo la producción de proteína humana para uso terapéutico en plantas transgénicas parece ser una atractiva tentativa.

TAXOL

Este diterpeno, ha sido establecido como un potente agente quimioterapéutico, produciendo una excelente actividad contra una amplia variedad de cánceres, incluyendo el de ovarios y mama.

Este compuesto es extraído de la corteza del tejo, Taxus brevifolia , y aunque se han hecho muchos intentos para desarrollar su producción en cultivos celulares, la síntesis total no es todavía comercialmente viable.

Lo que sí se ha logrado es la síntesis de unos análogos, taxotere y el bacatín III , aunque se esta trabajando mucho en conocer la ruta de biosíntesis del taxol, tanto las enzimas implicadas, como los genes que las codifican.

EPITOPOS

Son pequeños peptidos que tienen una considerable importancia recientemente por ser una fuente potencial para la producción de nuevas vacunas. Aunque estos peptidos libre, a menudo, pueden estimular la producción de anticuerpos, su inmunogenicidad puede ser incrementada presentándolos en múltiples copias en la superficie de proteínas portadoras.

Por esto, han sido desarrollados varios sistemas en los cuales los epitopos son fusionados junto con una macromolécula con poder de autoensamblaje que a menudo son partículas víricas.

El uso de virus vegetales para esta aplicación tiene una serie de ventajas:

• Los virus vegetales crecen extremadamente bien en sus huéspedes y se obtiene un alto nivel de partículas víricas.

• La purificación de estas partículas además es sencilla.

• Muchos virus vegetales son termoestables llegando alcanzar con ello la esperanza de producir vacunas en las que no se requiera refrigeración.

• El “reactor” usado para el crecimiento del material es la planta, que es barata y fácil de mantener.

Un ejemplo muy estudiado es el desarrollo de un sistema con epitopos basados en el CPMV ( cowpea mosaic virus) que infecta a Vigna unguiculata, en el que mediante la expresión de secuencias heterólogas en la superficie del virión se producen las CVPs ( chimaeric virus particles). Estos CVPs tienen propiedades inmunológicas ya que llevan un inserto, es decir, el epitomo, que es el que verdaderamente posee las características inmunológicas.

Epitopos que están siendo investigados derivan del rhinovirus humano (HRV), del virus VYH, virus de la enfermedad del pie y de la boca (FDMV), parvovirus canino, virus del sarampión, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Plasmodium falciparum y otros agentes no patógenos como las hormonas, antígenos de células tumorales, proteínas estructurales y RGD ( que contienen peptidos).

Los estudios mas avanzados en este campo han utilizado el CPMV. Tras el análisis de su estructura tridimensional se ha comprobado que los bucles existentes entre sus cadenas  son los sitios mas adecuados para la inserción de estos epitopos, concretamente en la hélice  B- C de la proteína S, aunque estudios mucho mas recientes demuestran que la inserción de secuencias heterólogas en otras hélices de las proteínas de la cápsida del virus. Esta inserción de secuencias heterólogas no afectan a la replicación del virus en el vegetal.

Como la viabilidad y conformación del epítopo son muy importantes por su uso terapéutico en la respuesta inmune, el conocimiento de la configuración exacta de un epítopo expresado seria un gran beneficio para la ingeniería de vacunas potenciales.

El desarrollo de productos farmacéuticos mediante el uso de ingeniería de virus vegetales debe aplicar todos los criterios regulados existentes para poder acceder a los ensayos clínicos en humanos. Esto requiere un estudio completo pre-clínico en tejidos aislados y en animales que puedan generar datos que sirvan para los posteriores ensayos clínicos. Estos estudios incluyen la validación de productos específicos y procesos tecnológicos, estudios de seguridad, resistencias en animales de experimentación, estudios de formulación y estabilidad, junto con precisos controles de calidad.

El proceso entero esta estrictamente regulado por las autoridades, FDA(The Food and Drug Administration) en los Estados Unidos y en el MCA (Medicines Control Agency) en el Reino Unido.

Se necesita el desarrollo de una formulación apropiada de CVPs purificadas, en conjunción con un adyuvante apropiado para la administración parenteral, para facilitar la respuesta inmune. Por ello son necesarios los controles de calidad para demostrar la consistencia y calidad del producto.

Los CVPs ofrecen distintas ventajas como vacunas. La particular naturaleza de los CVPs las hace apropiadas para la producción de una respuesta mucosal y sistémica inmune. El uso de plantas como vehículos de producción ofrece ventajas en términos de seguridad ya que la mayoría de agentes patógenos de cultivos celulares de mamíferos no los son de plantas. De momento no se ha encontrado, de todos los que se conocen, ningún agente patógeno viral de plantas que lo pueda ser del hombre. Resultados de estudios in vitro e in vivo indican que el CPMV no infecta a mamíferos y no evidencia efectos patológicos. Se espera que como resultado de los esfuerzos realizados por desarrollar esas técnicas en las que participan proteinas de la cápsida de los virus, pronto podamos contar con nuevos producto comercial y terapéuticamente viables para su uso en humanos.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS VACUNAS COMESTIBLES.

Las plantas y los árboles podrían cultivarse in situ, sin excesivo coste, con los métodos tradicionales del lugar. Y como muchos cultivos se regeneran fácilmente, habría siempre cosecha sin q los campesinos tuvieran que comprar las semillas o las plantas año tras año. Las vacunas cultivadas in situ ahorrarían los inconvenientes logísticos y económicos del transporte de las preparaciones tradicionales con su obligada conservación a bajas temperaturas hasta llevar a sus lejanos puntos de distribución. Al tomarse por vía oral, se prescindiría de las jeringuillas, que, costes a parte, constituyen una fuente de infecciones si se contaminan.

Pero la investigación realizada en los últimos diez años con animales, y algunas pruebas restringidas con personas, levantan una fundada esperanza en torno a la viabilidad de las vacunas comestibles. Parece, a sí mismo, verosímil que ciertas vacunas comestibles puedan suprimir la autoimunidad, fenómeno en cuya virtud las defensas del organismo atacan por error los tejidos normales, sin infectar. Entre las enfermedades autoinmunitarias que se podrían prevenir o aliviar se encuentran la diabetes tipo I, la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide.

Las vacunas clásicas presentan su riesgo: aunque pequeño no deja de ser preocupante. Los microorganismos de la vacuna pueden despertar provocando la enfermedad contra la que se pretendía defender. Por ese motivo los laboratorios prefieren las preparaciones de subunidades, compuestas fundamentalmente por proteínas antigénicas, separadas de los genes del agente infeccioso. Ocurre, sin embargo, que las vacunas de subunidades son caras, hay que purificarlas y deben conservarse refrigeradas.

Las vacunas comestibles se parecen a las preparaciones de subunidades en las que de han manipulado para que contengan los antígenos pero no los genes que posibilitarían la formación del patógeno entero. Pero antes de abordar los efectos de las vacunas comestibles en las personas, había que despejar numerosas incógnitas. ¿Se lograrían transformar las plantas para que aportaran genes que produjeran copias funcionales de las proteínas especificadas?. Cuándo las plantas comestibles se administraran a los animales de experimentación, ¿se degradarían los antígenos en el estomago antes de ejercer el efecto buscado?(para evitar precisamente dicha degradación, se administrarían por vía parenteral las vacunas habituales de subunidades.) Si los antígenos superaran ese obstáculo, ¿Atraerían la atención del sistema inmunitario? ¿Seria la respuesta lo suficientemente potente como para defender los animales frente a la infección?

Había que determinar, además, si las vacunas comestibles promoverían la inmunidad mucosal. Muchos patógenos penetran en el organismo a través de la nariz, boca y otros resquicios. Por eso las primeras barreras que se encuentran se hallan en las membranas mucosas que tapizan las vías respiratorias, el tubo digestivo y el tracto reproductor. Tales membranas constituyen el mayor obstáculo disuasor contra la invasión del patógeno. Si la respuesta inmunitaria mucosal es eficaz, genera anticuerpos secretores, moléculas que se lanzan a las cavidades de esos conductos, neutralizando cualquier agente infeccioso que le salga al paso. Una reacción eficaz activa también una respuesta sistémica; en ella, las células circulantes del sistema inmunitario contribuyen a la destrucción de invasores en lugares remotos. Las vacunas inyectadas orillan las membranas mucosas y apenas estimulan las respuestas inmunitarias de las mucosas. Pero las vacunas comestibles entran en contacto con el revestimiento del tubo digestivo. En teoría, pues, activarían ambos tipos de inmunidad, la mucosal y la sistémica. Doble efecto que contribuiría a mejorar la protección contra muchos microorganismos incluidos los causantes de la diarrea.

Además la alimentación de los animales de experimentación con tubérculos o frutos portadores de antígenos pueden evocar respuestas inmunitaria sistémicas o de mucosa que los protegen, total o parcialmente, ante la exposición subsiguiente de patógenos reales o frente a toxinas microbianas. Las vacunas comestibles les han proporcionado cierta protección frente al virus de la rabia, Helicobacter pylori y el virus entérico del visón. No es del todo sorprendente que los antígenos administrados a través de la planta persistan tras su curso por el estomago y alcancen y activen el sistema inmunitario. La dura pared externa de las células vegetales sirve al parecer de armadura temporal para los antígenos, conservándolos mas o menos salvo de las secreciones gastricas. Cuando esa pared termina por romperse en el intestino, las células liberan gradualmente su cargamento de antigenos.

La cuestión clave estriba en la viabilidad de las vacunas comestibles para el hombre.

En 1997 los voluntarios que ingirieron trozos de patatas crudas peladas que contenian un segmento benigno de la toxina de E. coli (la subunidad B), presentaron respuestas inmunitarias mucosales y sistemicas. Si las vacunas comestibles pueden realmente proteger al ombre contra las infecciones es, sin embargo, una cuestion todavía por determinar.

En resumen, los estudios realizados en animales y personas proporcionan una prueba de principio. Respaldan la estrategia. Pero quedan muchas cuestiones pendientes que deben abordarse. La primera: la escasa cantidad de vacuna que una planta produce. Puede incrementarse dicha producción de varias maneras; por ejemplo, ligando los genes con elementos reguladores que aviven la actividad de los genes. Resuelto ese problema, habrá que establecer que cantidad de alimento con vacuna comestible proporciona una dosis predecible de anfígeno.

En segundo lugar, tendría que potenciaarse la posibilidad de que los antigenos activaran el sistema inmunitario sin que se degradara antes en el organismo. El uso de estimuladores generales ( adyuvantes) y una mejora dirección de la selectividad para el sistema inmunitario podrían compensar en parte una producción baja de antigenos.

Una de las estrategias para incrementar la selectividad implica la unión de los antígenos a moléculas que se engarcen bien en las células M, componentes del sistema inmunitario que se encuentran en el forro interno del intestino. Las células M captan muestras materiales que han entrado en el intestino delgado ( incluido los agentes infecciosos) y las pasan a otras células del sistema inmunitario, como las células presentadoras de antígeno. Los macrofagos y otras celulas presentadoras de antigenos trituran las adquisiciones de ese tipo y exponen los fragmentos proteicos sobre la superficie celular. Si los leucocitos de la sangre llamados linfocitos T coadyuvantes reconocen los fragmentos como extraños, promueven que los linfocitos B ( celulas B) segreguen anticuerpos neutralizantes y contribuyen a iniciar un ataque mas amplio sobre el enemigo descubierto.

La investigación trabaja también en otros frentes. Las plantas muestran, a veces, un crecimiento pobre cuando se les exige producir grandes cantidades de una proteína foránea. Problema que se acabaria si se lograra equipar a las plantas con elementos reguladores que indujeran la activacion de los genes de antigenos en el instante deseado o en las partes comestibles.

Por si fuera poco, cada tipo de planta presenta sus propios problemas, como ya hemos descrito en apartados anteriores.

Importa a si mismo asegurar que las vacunas deben potenciar la respuesta inmunitaria no inviertan el sentido de su accion y supriman la inmunidad. La ingestión de ciertas proteinas pude provocar que el organismo bloquee su respuesta a las mismas. Para determinar las dosis seguras y eficaces y el calendario de la administracion de las vacunas comestibles la industria necesita mejorar sus instrumentos de manipulación que influyan sobre la accion del antigeno suministrado y saber si estimulara o bloqueara la inmunidad.

Un punto final digno de estudio concierne a la posibilidad de que las vacunas ingeridas por la madre protegan indirectamente a los hijos. En teoría una madre podría comer un plátano o dos y disparar a si la producción de anticuerpos que pasarían al feto a través de la placenta o al recién nacido durante la lactación.

Hay otros retos vinculados a las dificultades técnicas. No abundan los laboratorios farmacéuticos proclives a financiar la investigación de productos dirigidos fundamentalmente a mercados situados fuera de los países ricos.

Además, las vacunas comestibles caen bajo la rubrica de plantas “modificadas genéticamente”, sometidas a un creciente rechazo popular. Cabe, sin embargo, esperar que nuestras vacunas queden fuera de semejante rechazo, toda vez que se trata de salvar vidas y, además, se cultivaran en espacios restringidos. Igual que otros fármacos estarán sujetas a examen riguroso de los organismos reguladores.

LA BATALLA CONTRA LA DESNUTRICIÓN.

No solo progresa la investigación sobre las vacunas comestibles si no que sigue adelante la búsqueda de alimentos mas nutritivos. Famoso a este respecto es el “arroz dorado” con el que se pretende suplir la deficiencia en vitamina A que sufren numerosas zonas de Asia, África e Iberoamérica. La carencia produce ceguera y trastornos inmunitarios, que contribuyen a la muerte de mas de un millón de niños al año.

El arroz constituye un medio optimo para aportar la vitamina requerida. No se olvide que esa gramínea alimenta a un tercio o más de la población mundial. Pero las variedades naturales carecen de vitamina A. El arroz dorado, sin embargo, modificado genéticamente, sintetiza -carotenos, un pigmento que el organismo convierte en vitamina A. El equipo dirigido por Ingo Potrykus del Instituto Federal Suizo de Técnica, y Peter Beyer de la Universidad alemana de Friburgo dio a conocer sus éxitos el pasado enero en Science. En mayo una empresa con intereses en los productos agrícolas -Zéneca- compro los derechos y acordó permitir que se donase el arroz a las instituciones que introdujeran los

-carotenos en especies de arroz populares en zonas deprimidas y distribuyeran los productos resultantes entre los agricultores, sin cargo alguno. (Zéneca espera sacar beneficios de las ventas del arroz mejorado a los países ricos donde es probable que interese las propiedades antioxidantes del -caroteno.)

Pero el arroz no esta todavía listo para su comercialización. Quedan pendientes muchas pruebas, incluidos los análisis para comprobar si el organismo humano absorbe bien el  caroteno de la planta. Se espera que las pruebas duren hasta el 2003 por lo menos.

Mientras tanto, se intenta enriquecer el arroz con una abundancia mayor de  caroteno y con otras vitaminas y minerales. El año pasado Potrykus anuncio el éxito conseguido con el hierro. Mas de dos mil millones de personas padecen déficit de hierro.

Se investiga también en el refuerzo de otros alimentos. En junio, por ejemplo, se informo de la creación de un tomate que contiene un gen capaz de triplicar la cantidad de  caroteno habitual. No se minusvaloran los métodos tradicionales de cultivo; hay un proyecto internacional centrado en el incremento del contenido de vitaminas y minerales en el arroz y en otros cuatro vegetales, el trigo, maíz, alubias y mandioca.