INTRODUCCIÓN

“El ojo humano sólo tiene un poder de resolución de aproximadamente 1/10 milímetros, o 100 micrómetros. El poder de resolución es una medida de la capacidad para distinguir un objeto de otro; es la distancia mínima que debe haber entre dos objetos para que sean percibidos como objetos separados”.

Esta limitación del ser humano ha llevado a los científicos ha desarrollar uno de los inventos más importantes de la historia : el microscopio.

Este invento ha permitido el descubrimiento y observación de innumerables de organismos y componentes de cuerpos vivos.

Gracias al microscopio se han logrado desarrollos de la medicina, física, y química impensables para el hombre de hace dos siglos; logrando incluso en la actualidad la visualización de átomos , partículas elementales de la materia .

En el siguiente trabajo explicaré el funcionamiento de los microscopios, deteniéndome sobre todo en los electrónicos, que son los que nos ocupan y los que nos fueron enseñados en el centro de microbiología del Instituto de Salud Carlos III de Majadahonda.

Tipos de Microscopios

Microscopio: “Cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos”.

Dependiendo de la fuente energética que utilizan, se pueden distinguir dos tipos de microscopios:

Microscopio óptico o fotónico, utilizan la luz como fuente energética.

Microscopio electrónico, emplean un haz de electrones.

Ambos tipos de microscopios permiten la observación gracias a su capacidad de aumento (la cantidad de veces que se incrementa el tamaño de la imagen del objeto observado) y de resolución (capacidad del microscopio que permite distinguir como separadas dos estructuras que se encuentran muy próximas) .

Microscopios ópticos o fotónicos: este tipo de microscopios utilizan la luz como fuente de energía y las propiedades de los lentes ópticos que permiten aumentar el tamaño de los objetos observados. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta quince veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2000 veces.

Dentro de los microscopios fotónicos existen varios tipos, distinguidos por pequeñas diferencias, aunque el principio básico de funcionamiento es el mismo:

• Microscopio de campo claro o compuesto: Es el microscopio más comúnmente usado, consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentra en el punto focal del ocular. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. La muestra que se va a observar debe ser teñida con algún colorante que permita hacerla destacar sobre el fondo claro o brillante que proviene de la fuente luminosa.

• Otros tipos son:

• Microscopio de campo oscuro

• Microscopio de fase

• Microscopio de fluorescencia

• Microscopio petrográfico o de polarización

• Microscopio de luz ultravioleta

• Microscopio de campo cercano

• La fotomicrografía, que consiste en fotografiar objetos a través de un microscopio, utiliza una cámara montada en el mismo microscopio. La cámara suele carecer de objetivo ya que el microscopio actúa como tal. El término microfotografía , utilizado a veces en lugar de fotomicrografía, se refiere a una técnica de duplicación y reducción de fotografías y documentos a un tamaño minúsculo para guardarlos en un archivo.

• Los microscopios que se utilizan en entornos científicos cuentan con varias mejoras que permiten un mejor estudio de la muestra. Dado que la imagen de la muestra está ampliada muchas veces e invertida, es difícil moverla en forma manual. Por ello los soportes del los microscopios científicos de alta potencia están montados en una plataforma que puede moverse con tornillos micrométricos. Algunos microscopios cuentan con soporte giratorio. Todo los microscopios de investigación cuentan con tres o más objetivos montados en un cabezal móvil que permite variar la potencia de aumento.

• Microscopios electrónicos: La potencia amplificadora de un microscopio óptico está bastante limitada en comparación con la del microscopio electrónico, que utiliza electrones para iluminar un objeto, pudiendo mostrar estructuras mucho más pequeñas.

• Los principios básicos de los microscopios electrónicos son similares a los microscopios ópticos, las diferencias están dadas en la fuente de luz (electrones ) y en el tipo de lente, ya que los electrónicos emplean lentes electromagnéticas. La gran diferencia de los dos tipos de microscopios es la potencia que tiene cada cual, ya que el microscopio óptico es capaz de aumentar unas 2000 veces y una resolución de 0,2 micrones ( 0,0001 mm. ) mientras que el electrónico aumenta hasta un 1000000 de veces con una resolución de 0.1 nanómetros ( 0,0000001 mm.).

• Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elemento básicos. Disponen de un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra la muestra, creando una imagen aumentado. Se utilizan lentes electromagnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, junto con un sistema de vacío al interior del microscopio, para que las moléculas de aire no desvíen los electrones.

• Existen dos tipos básicos de microscopios electrónicos:

• Microscopio electrónico de transmisión (TEM) : se utiliza para ver secciones o cortes de tejidos, dirige un haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar; una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas con un grosor entre 50 a 200 nanómetros. Dicha muestra se coloca en una redecilla que se untroduce en el tubo con una pieza alagargada que se introduce por un lateral

• Para el funcionamiento de este microscopio se utiliza un haz de electrones, obtenido desde una lámpara especial de tungsteno. El tubo tiene vacío en su interior, para impedir que nada dificulte el paso de los electrones. Un fallo en este vacío ocasiona la aparición de cuerpos extraños en el visor. Luego de ser enfocados por las lentes electromagnéticas, los electrones inciden sobre la muestra, formando la imagen que se obtiene en blanco y negro, la cual puede proyectarse sobre una pantalla especial o película fotográfica. El TEM examina partes grandes de la muestra.

• Éste microscopio obtiene imágenes en dos dimensiones, que luego pueden ser plasmadas en fotografías si interesa. Éste es el tipo de microscopio electrónico más utilizado en investigación, ya que obtiene muy buenos resultados y tiene gran potencia.

• TEM

• Microscopio electrónico de barrido (SEM): Este permite la observación de superficies sin la necesidad de realizar cortes microscópicos, explorando la superficie de la imagen punto por punto. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión.

• Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios, ambos son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados de la muestra. Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el numero de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. Como consecuencia del barrido electrónico se genera una imagen con apariencia tridimensional, que permite estimar parámetros celulares como tamaño y forma, dándole ventajas en este sentido sobre el TEM. Las desventajas del SEM es su menor capacidad de aumento ya que sólo puede a unas 100000 veces y también tiene una resolución 1000 veces menor que el TEM. Eso y que sólo permite ver el exterior de la muestra.

• También se han desarrollado otro tipo de microscopio electrónico: microscopio electrónico de barrido y transmisión el cual combina los elementos de un SEM y un TEM, pudiendo mostrar los átomos individuales de un objeto. Es bastante moderno y relativamente raro, pero también vimos uno en el centro.

• Otros tipos son:

• Microscopio sonda de barrido

• Microscopio de túnel de barrido

• Microscopio de fuerza atómica

SEM

Preparación de muestras

Tanto en el microscopio óptico como en el microscopio electrónico de transmisión, la formación de una imagen con un contraste perceptible exige que diferentes partes de la célula difieran en su transparencia al haz de iluminación, ya sean rayos de luz o electrones. Las partes de la muestra que permiten el paso de la luz o los electrones, aparecen brillantes, mientras que las partes que bloquean el paso del haz de iluminación aparecen oscuras. En el microscopio electrónico de barrido, las áreas que aparecen claras son aquellas que desvían los electrones a la imagen; las partes que aparecen oscuras son aquellas que no están bien iluminadas por el haz electrónico o que desvían los electrones fuera del detector.

Para crear suficiente contraste cuando se usa el microscopio óptico, las células deben ser tratadas con colorantes u otras sustancias que se adhieran diferencialmente a lugares específicos, o reaccionan con ellos, produciendo regiones de opacidad diferente. Para el microscopio electrónico los especímenes se tratan generalmente con compuestos de metales pesados.

Después que un espécimen ha sido teñido, todo el colorante que no se haya adherido a estructuras específicas debe ser lavado. Sin embargo, las células son bastante frágiles y cualquier tratamiento enérgico desharía su estructura. Para resolver este problema, los espécimen biológicos, generalmente se “fijan” antes de teñirlos. Este procedimiento implica un tratamiento con compuestos que amarran las estructuras a su lugar, habitualmente con la formación de enlaces covalentes adicionales entre las moléculas .

Los especímenes para el microscopio electrónico también deben deshidratarse, ya sea por métodos químicos, o por métodos de congelación-desecación parecidos a los que se usan para hacer el café deshidratado. Este paso es necesario debido a las propiedades de los electrones que forman el haz de iluminación. Si atraviesan una cámara que contiene moléculas gaseosas, los electrones son desviados por las moléculas y no pueden enfocarse en un haz. Así que, como ya dije, todo el aire debe ser evacuado del interior de la cámara interna de un microscopio electrónico, creándose un vacío. Si las muestras no deshidratan primero, las moléculas de agua que se evaporan y penetran en la cámara, destruirán el vacío y el haz de electrones enfocado. Los procedimientos requeridos para preparar la mayoría de las muestras para el microscopio óptico o para el electrónico, habitualmente producen la muerte de las células constituyentes.

Para el SEM, la muestra debe estar recubierta de un metal tal que oro para permitir la refracción de los electrones.