Microscopia electrónica de barrido

Materiales orgánicos. Células. Tejidos. Procesamiento de muestras. Instrumentos. Electrones. Luminiscencia

  • Enviado por: Mary
  • Idioma: castellano
  • País: España España
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TEMA 18 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

1. Introducción

La MEB nació en 1958por Manfred Von Arden cuando basándose en estudios experimentales construyó un prototipo de microscopia de esta índole. Sin embargo, no alcanzó un completo desarrollo hasta los años 60.

Las dificultadas planteadas en el procesamiento de los especimenes biológicos hicieron q las investigaciones realizadas sobre este material no avanzaran tanto como los estudios sobre materiales inorgánicos.

Hoy día, subsanados casi todos los problemas relacionados con el proceso de las muestras, la MEB constituye un método sumamente útil para el estudio de la morfoestructura superficial de las muestras biológicas y, en consecuencia, un medio complementario de análisis q suministra importante información sobre la estructura de células y tejidos.

En comparación con la ME convencional, la MEB presenta dos ventajas:

  • Permite observar áreas mucho mayores sobre la superficie de los objetos.

  • Puede proporcionar más información sobre la estructura y composición del objeto debido a la gran cantidad de interacciones q realizan los electrones del haz de observación entre sí y con el propio objeto de estudio.

  • 2. Principios básicos de la MEB

    En la MEB un haz de electrones emitidos por un filamento de tungsteno q actúa como cátodo es dirigido hacia la muestra a través de una columna incluida en el microscopio. Este haz se desplaza sobre la muestra realizando un barrido de su superficie q es proyectado sincrónica y simultáneamente sobre la pantalla de observación.

    Dependiendo de la señal detectada la información q proporciona el instrumento puede hacer referencia a:

  • Al poder de emisión de electrones secundarios arrancados de la muestra por el haz primario.

  • A la capacidad de incluir cambios eléctricos sobre un objeto q actúa como semiconductor (efecto inducido).

  • A la emisión de luminiscencia debido a la liberación de fotones por parte del objeto sometido a la irradiación electrónica.

  • A la detección de los electrones residuales q atraviesan la superficie.

  • Cuando la información hace referencia sobre todo a electrones absorbidos y al efecto de fotoluminiscencia se obtiene una imagen 3D del objeto de estudio.

    Los componentes básicos del MEB son:

  • Cañón de electrones: emiten los electrones q chocan contra el espécimen creando una imagen aumentada.

  • Lentes magnéticas: crean campos q dirigen y enfocan el haz de electrones.

  • Sistema de vacío: es muy importante en el ME debido a q los electrones pueden ser desviados por el aire. Se debe hacer un vacío total (10-5Pa).

  • Placa fotográfica o pantalla fluorescente: se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada.

  • Sistema de registro: muestra la imagen q producen los electrones. Suele ser una computadora.

  • 3. Procesamiento de las muestras

    Debido a la gran variedad de los materiales susceptibles de ser observados con MEB los criterios metodológicos para su preparación son a sí mismo muy numerosos. No obstante, es posible esbozar una pauta general aplicable a muestras biológicas.

  • Lavado minucioso con suero salino de la superficie objeto de estudio.

  • Fijación del material: esta fase persigue dar una adecuada estabilidad a la muestra. Se usan fijadores químicos del tipo de aldehídos. El más usado es el glutaraldehido al 2.5%. La presión osmótica del fijador debe regularse usando un tampón tipo fosfato. Tb se puede usar el tampón cacodilato. El tiempo q debe permanecer la muestra en el fijador es variable y depende de la experiencia de cada laboratorio al igual q el tipo de solución amortiguadora empleada. El tiempo suele oscilar entre 2-24h según el tamaño considerándose como tiempo medio 6h. Una vez fijadas las muestras se lavan en solución amortiguadora, generalmente tres cambios de 10-15 min cada uno.

  • Tratamiento postfijación: esta fase es importante ya q previene la deformación del secado al aire cuando no se dispone del procedimiento del punto crítico, aumenta la conductividad eléctrica de la muestra y evita casi por completa la extracción de los lípidos de las mbs durante la deshidratación. Como agente postfijador se suele emplear el tetróxido de osmio al 1 o 2% en igual solución amortiguadora k la usada para glutaraldehido y durante un tiempo entre 30min y 2h.

  • Deshidratación: es la liberación de agua de los tejidos q debe realizarse de forma gradual en baños crecientes del agente deshidratante. Los más usados son etanol, acetona y etilenglicol. Entre esta fase y la desecación hay q usar líquidos intermedios.

  • Desecación: es importante señalar q en MEB no vale con deshidratar es necesario conseguir una completa desecación. Para ello se aplica casi siempre el método del punto crítico q evita en gran medida los efectos de la tensión superficial. La muestra se coloca en una interfase de líquido y gas, el conjunto se lleva a una combinación de presión y Tª a la cual la densidad del gas lleva a una Tª superior a la crítica sin modificar la presión. Todo el líquido pasará a gas sin atravesar las superficies celulares y del tejido incluyendo el contenido en la muestra con la q se evitan los defectos de arrastre y de tensión superficial q toda evaporación supone. El procedimiento técnico es :

  • La muestra se pone en unas cestas con acetato de amilo, se baja la Tª a una inferior a 10ºC añadiéndole CO2 líquido q va a desplazar al acetato de amilo. Seguidamente se lleva la muestra al punto crítico del CO2 (31ºC y 74bar). Alcanzadas las condiciones se elimina el gas de la cámara y la muestra queda desecada.

  • Montaje de las muestras: las muestras desecadas se colocan en soportes de aluminio especialmente diseñados para el MEB usando como adherente sustancias conductoras como la plata coloidal. Es importante reiterar q en esta fase del proceso la manipulación de la muestra suele ser extremadamente cuidadosa evitando dañar o manchar la superficie a observar.

  • Recubrimiento: esta última fase consiste en proveer a las muestras de una superficie conductora de la electricidad y del calor q facilite sin carga durante el barrido para lo cual es necesario usar carbón o metales pesados como oro, platino, aluminio...

  • De entre las numerosas pautas existentes para el recubrimiento destaca el bombardeo iónico en cámara de vacío. El procedimiento más común es la metalización con oro o doble metal con carbón y oro.

    Otro método para obtener una superficie conductora es el recubrimiento por evaporarización tras calentamiento de un metal en cámara de vacío

    Otros métodos más antígenos son la inmersión simple en soluciones alcohólicas saturadas de cloruro de oro y secado al aire. Este es muy poco usado en la actualidad.

    4. Variantes metodológicas en MEB

  • Criofijación

  • Sustituye a la fijación primaria y consiste en la inmersión en líquidos criogénicos (N2 líquido) evitando la movilización iónica de las muestras.

    Previamente, se deposita el tejido sobre los portamuestras de barrido ya seas de aluminio o de grafito. El conjunto se sumerge en N2 líquido.

    Para evitar la formación de microcristales por el importante cambio de Tª debe utilizarse un agente criogénico intermedio como el Freon 22 líquido.

    En la actualidad, existen sistemas q en cámaras de vacío y a muy bajas Tª permiten realizar tras la criofijación una deshidratación progresiva q sustituye por completo al proceso convencional.

  • Criofractura

  • Corta o fractura las muestras a baja Tª tras producir un enfriamiento en N2 líquido. Proporciona una superficie q refleja fielmente las características del interior de las muestras.

  • Técnicas conductoras

  • El fin es aumentar la conductividad de las muestras biológicas y, por tanto, la emisión de un mayor nº de electrones secundarios en muestras en las q no se desean utilizar la metalización.

    Existen variantes metodológicos de éstos entre los q destaca la propuesta por Murakami q emplea la combinación de dos ácidos, el ac. tánico y tetróxido de osmio. De esta manera, las muestras no recubiertas presentan mejor resolución y mayor contraste durante la observación.

    5. Aplicaciones de la MEB

    Paleontología, cristalografía, microelectrónica, arte y ciencias de materiales, botánica, microbiología, parasitología, histología y citología.

    En general, tiene aplicaciones en todas aquellas ramas de la ciencia q tienen por objeto de estudio la morfoestructura de muestras, siempre q estas sean capaces de resistir un alto vacío.

    A continuación, vamos a ver en síntesis diferentes aplicaciones de la MEB en biología celular:

    • En el estudio de las poblaciones celulares del sistema inmunitario y sanguíneo, la MEB está permitiendo tipificar nuevos patrones morfológicos de superficie. Así ocurre en las recientes descripciones de los linfocitos “peludos” y vellosos q definen morfológicamente a dos formas particulares de leucemia.

    Una tipificación morfológica similar se esta revelando importante en los estudios de proliferación y renovación de las poblaciones epiteliales de la morfología cromosómica, espermetozoides, etc.

    Singular interés tiene la aplicación de este tipo de microscopia a los procesos de biomineralización y, por tanto, a los tejidos duros al no se necesarios su decalcificación. De este modo, ha sido posible realizar descripciones de esmalte, dentina, cálculos urinarios, huesos, entre otros, tanto en condiciones normales como patológicas y de experimentación.

    Tb tiene su aplicación tras la preparación de moldes vasculares para conocer mejor la configuración tridimensional, microvascular de diferentes órganos y sistemas.

    La MEB permite incorporar sistemas de detección de energía dispersiva de rayos X y electrones lo cual es útil para la detección cualitativa y cuantitativa de distintos elementos químicos.

    Permite visualizar estructuras artificiales teñidas con elementos de elevado nº atómico lo q posibilita la localización de diversas actividades enzimáticas.

    La MEB ha proporcionado información sobre determinados receptores de mb.

    Las imágenes en 3D permiten ampliar conocimientos estructurales q quedaban parcialmente ocultos en el empleo exclusivo de la MO y MET.