Apuntes de Microbiología

Tema 1: Introducción histórica a la microbiología

Definición: Estudio de los organismos que no pueden verse a simple vista (menores de 1mm)
Los microorganismos son de tamaño muy variable:

Esterichia coli: 1x3 micras
Epulopiscium: 80x600 micras
Thiomargarita: 100x750 micras
Nanochlorum 1x2 micras

Su estudio está determinado por la metodología, como es el empleo del microscopio, etc. La microbiología estudia los viruses, los procariotas, los protozoos, hongos y algas; y el objetivo principal de la microbiología es el estudio de la naturaleza de los procesos vitales como la fisiología, la estructura y función, genética y taxonomía. Algunas aplicaciones de la microbiología pueden ser en el campo de la alimentación, la biotecnología, medioambiente, la agricultura y la medicina.

Los microorganismos han causado daños al ser humano durante toda la historia de la humanidad. Por ejemplo en el siglo XIV, 25 millones de personas murieron por la peste, y en la actualidad misma, se siguen buscando curas contra el sida o la malaria.

Fases en la historia de la microbiología:

1) Periodo especulativo:
Desde la antigüedad hasta la creación de los primeros microscopios
Se intuye que hay actividades microbianas. Las enfermedades infecciosas se creía que estaban relacionadas con los “miasmas”: Lucrecio, un medico romano, los llamó “semillas de enfermedad”, mientras que Frascatoro (1478) dijo que había criaturas vivas e invisibles que nos transmitían las enfermedades.

2) Primeros microscopios:
Van Leewenhoek invento el microscopio y dibujó algunas bacterias que veía. Cuando se empiezan a ver los microorganismos se empezó a plantear si existía la generación espontanea, porque no se sabía de dónde venían.
También se empezó a plantear si los microorganismos son la causa de todas las enfermedades. A partir de estas cuestiones surgió la microbiología como ciencia. Redi (1625-1697), en el siglo XVII hizo experimentos para descartar la posibilidad de la generación espontanea. Needham (1713-1781)a su vez, comprobó el crecimiento de microorganismos hirviendo caldo de carne de cordero y aislándolo en un matraz, pero no había esterilizado previamente el matraz.
Spallazani (1729-1799) hizo otro caldo y lo cerró herméticamente en un recipiente esterilizado. En este caso no se desarrollaron microorganismos. Fue una de las primeras demostraciones exitosas en contra de la generación espontanea.
Finalmente, Pasteur (1859) modificó un matraz poniéndole un “cuello de cisne” y hirvió un caldo de cultivo. A pesar de que el recipiente estaba abierto al medio exterior, el caldo no se contaminó. Si el medio no contaminado se acercaba al “cuello de cisne”, este entraba con los microorganismos que ahí se habían quedado atrapados y se contaminaba.
Tyndall y Cohn (1820-1893) descubrieron las bacterias termoresistentes (las esporas) y demuestran que el polvo transporta y contiene bacterias (1877).

3) Cultivo de microorganismos:
Koch desarrollo los cultivos puros o axénicos (de un solo microorganismo) y comprobó que cuando se multiplica en medio sólido, forma una colonia. Petri desarrolla las “placas de petri” para aislar los cultivos puros.
Los postulados de Koch:
-El agente patógeno debe estar presente en los individuos enfermos
- El mismo debe poder aislarse del individuo en un cultivo puro o axénico
-El microorganismo crecido en cultivo puro puede inocularse en individuos sanos, enfermándolos.

Los postulados resaltaron la importancia de los cultivos axénicos en los laboratorios, que permitieron avances técnicos en la tinción de microorganismos.

4) multitud de enfoques en el estudio microbiano:
Wingoradsky contribuyó a la microbiología del suelo, descubriendo bacterias que oxidan los metales para obtener energía, bacterias que transforman dióxido de carbono en materia organica, etc.
Beijerink aisla una bacteria fijadora de nitrógeno y también aisla unas bacterias sulfato reductoras.

La Estructura Celular:

Las células están rodeadas de la membrana plasmática que aisla la célula del exterior. Algunas tienen una pared celular como las células vegetales y algunos microorganismos. Dentro de la célula hay siempre ribosomas y macromoléculas. Hay dos tipos de células: las procariotas, que no tienen un núcleo definido, y las eucariotas, que si lo tienen. Las bacterias y las arqueas son ambas procariotas. Las algas, los hongos, protozoos, plantas superiores y animales, en cambio, son eucariotas.
El reino monera, al igual que el protista, se compone de procariotas. El reino Fungi, Animalia y Plantae tienen tanto células eucarioticas como algunos protistas.
Para dividir los microorganismos en familias, nos fijamos en el ARN ribosómico, que tiene mas regiones con la misma secuencia de unos microorganismos a otros, pero otras regiones que son muy variables y especificas. Entonces se comparan los ARNr encontrando relaciones filogenéticas y evolutivas entre los microorganismos.
Podemos diferenciar tres dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya (Bacteria, arquea y eucariota). Las bacterias y las arqueas son células procariotas.
Evolutivamente los tres dominios provienen de uno en común, y se fueron escindiendo primero las bacterias, luego las arqueas y por último las eucariotas.
Las arqueas se diferencian de los otros dos porque en su membrana plasmática se dan enlaces éter, mientras que en bacterias y eucariotas se dan enlaces éster.

Bacterias: Se pueden encontrar en cualquier parte. Hay una gran variedad de bacterias.

Arqueas: Hay tres grandes grupos: Termófilos, halófilos (afines a la sal) y Metanógenas (producen gas). Las arqueas termófilas y halófilas son mas extremas que las bacterias que también son halófilas y/o termófilas.

Eucariotas: Hay también tres grandes grupos: hongos, algas y protozoos. Las algas tienen clorofila, los hongos son filamentosos o unicelulares (que son los que se estudian como microorganismos) y no tienen clorofila.
Los protozoos son móviles e incoloros, ingieren otros organismos o partículas orgánicas (heterótrofos), no tienen pared celular y son de vida libre, aunque algunos patógenos necesitan un huésped.

Tema 2: Microscopia y tinciones

Un microscopio consta de tres factores importantes, el aumento, el contraste y la resolución.

Apertura numérica: Depende del tamaño de la lente y del aceite.
AN = n x sen Ф
n= índice de refracción; Ф= mitad del ángulo del cono de luz que entra en el objetivo
d = distancia mínima entre dos puntos para diferenciarlos uno del otro:

D = λ/ 2 AN

Ejemplo: ¿Cual es d, si usamos luz azul de λ=450nm y sabemos que AN= 0,65?

Modificaciones al microscopio:

Los cambios que se le pueden hacer al microscopio son los siguientes: Campo oscuro, contraste de fase, contraste diferencial de interferencia y fluorescencia.

Tinciones y preparaciones:

Las preparaciones en fresco son simples: Se pone una gota con microorganismos en un portaobjetos, se cubren con un “cubre” y se observan directamente al microscopio óptico. La preparación en gota pendiente, que es ligeramente diferente, usa un cubre que deja espacio para la gota y no la aplasta (extiende).

Cualquier colorante que se use para tinciones tiene estas características:
- Está formado por compuestos con dobles enlaces conjugados
- Puede unirse a las células mediante enlaces iónicos, covalentes o hidrofóbicos.

Hay dos tipos de covalentes: Ácidos y básicos

Covalentes Ácidos: Fucsina ácida, Eosina, Rosa de bengala

Covalentes Básicos: Azul de metileno, Fucsina básica, Violeta de genciana, Verde malaquita, Safranina

Los colorantes básicos están cargados positivamente, luego se unen a proteínas y ácidos nucleicos. Es la más utilizada en bacteriología. Además, las tinciones pueden ser simples, diferenciales y específicas:

3) Tinción de Gram: Es un tipo de tinción diferencial. Se distinguen dos tipos de microorganismos: Las Gram negativas y las Gram positivas. Se tiñe de positivo o negativo dependiendo de la pared celular. Las gram positivas tienen pared celular con una capa de péptidoglicanos muy gruesa.
Por el contrario, las Gram negativas tienen pared celular de peptidoclicanos más reducida y recubierta de una membrana plasmática externa.
La tinción de Gran se realiza de la siguiente manera:

-Fijación
-Tinción Cristalvioleta (que tiñe solo las Gram positivas)
- Iodo (lugol) que fija el colorante en los microorganismos
-Se lava la muestra con etanol y luego con agua
-Se tiñe con safranina, que tiñe a las Gram negativas
-Se lava con agua

4) La tinción ácido alcohol resistente: Se usa para las micobacterias que producen enfermedades como la tuberculosis o la lepra. Estas bacterias tienen una pared muy resistente, por lo que lo primero que debe hacerse es:

-Un frotis
-Teñir con Fucsina Básica, que se debe calentar para que adquiera el colorante y tiñe las micobacterias
-Se lava con acido clorhídrico (HCl) y alcohol
-Se tiñe con azur de metileno normal, que tiñe el resto de las células y microorganismos.

5) Tinciones Específicas: Incrementan el contraste de células microbianas y revelan estructuras particulares como las endósporas (Bacillus y Clostridium), así como flagelos y capsulas.
La tinción de las endósporas se realiza como sigue:

-Frotis
-Se cubre con papel con verde malaquita y se calienta (tiñe endosporas)
- Se usa otro colorante: Sefanina, que tiñe el resto de células.

6) Tinción de Flagelos:
-Fijar con formol (sin calor)
-Tratar con ácido tánico, que ayuda a la tinción a adherirse
-Teñir con rosanilina (no se verá el movimiento de los flagelos al estar fijados)

7) Tinción negativa de cápsulas de microorganismos patógenos:
-Añadir tinta china a la mezcla de bacterias
-Extender sobre un portaobjetos
-Secar al aire

La Microscopia electrónica:
En la microscopia electrónica se proyecta un haz de electrones (guiado por electroimanes). Las muestras se ven a través de una pantalla. Se usa para ver las estructuras internas o ultraestructuras en el caso del Microscopio electrónico de transmisión (MET), mientras que al microscopio electrónico de barrido (MEB) se observa una visión tridimensional del exterior del microorganismo. El microscopio óptico tiene una resolución de unos 200n,, mientras que el microscopio electrónico tiene entre 1 y 200nm. Los aumentos del microscopio electrónico son de x200000 (200 veces mayores que al microscopio óptico),
En el MEB la muestra se recubre de oro o platino. El MEB se usa un chorro de electrones primarios que rebotan sobre la muestra (mientras que en el MET el chorro de electrones atraviesa la muestra), con lo que éstos luego inciden en unas pantallas que forman una imagen tridimensional (electrones secundarios). El MET refleja la visión en una pantalla fluorescente. No se usan colorantes, sino metales pesados, y se coloca la muestra en una rejilla de cobre (para dejar pasar el chorro de electrones).

El MET tiene la variante de la criofractura, que consiste en congelar y romper el microorganismo para ver las estructuras del interior celular. En el proceso de preparación, se congela el microorganismo a -196ºC, se introduce en una cámara al vacio y se calienta hasta los -100ºC. Una vez a esa temperatura se fractura la muestra al azar con una cuchilla que también esta a la misma temperatura. De este modo quedan a la vista los orgánulos del interior. Éstos se recubren con un polvo, mezcla de platino y carbono, quedando sobre las estructuras expuestas. Se elimina el compuesto orgánico de la célula y se observa de carbono y platino al MET. Por tanto, mediante la criofractura, no se observa la muestra directamente, sino el molde de platino y carbono.

Tema 3: Medios de cultivo, Esterilización y Métodos de siembra

Para empezar se mira la muestra al microscopio, viendo la forma, el movimiento, el tamaño, etc. De los microorganismos. Se puede ver también si se trata de organismos Gram positivos o Gram negativos.
Un medio de cultivo es una mezcla equilibrada de nutrientes, que en concentración adecuada y en condiciones físicas optimas de temperatura, presión, pH, etc. Permiten un buen crecimiento de los microorganismos. Tienen una base mineral, fuente de Carbono ( C), Nitrógeno (N), Sulfuro (S), etc. Y a veces factores de crecimiento (como las vitaminas).

Tipos de medios de cultivo:

-Medios definidos: Son aquellos de los cuales se conoce su composición química exacta, preparada a partir de compuestos químicos puros. Dan resultados reproducibles en laboratorio.

-Medios complejos o indefinidos: Son aquellos en los que se desconoce la composición química exacta, porque han sido producidos a partir de extractos naturales (por ejemplo carne, zumos, levaduras, sojas, etc.). También se les denomina caldos. Se pueden solidificar añadiéndoles agar.

-Medios selectivos: Favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos suprimiendo el crecimiento de otros. Se hacen a partir de un medio de mezcla compleja. Por ejemplo, el agar sulfito de bismuto, que permite aislar Salmonella tiphi (Gram negativa).

-Medios diferenciales: Identifican colonias de un microorganismo. Permiten la identificación tentativa según sus características biológicas. Por ejemplo el “agar sangre” contiene sangre y se utiliza para determinar microorganismos hemolíticos (que rompen las células sanguíneas), por ejemplo el Streptococcus pyogenes, de modo que alrededor de donde crecen se crean zonas blancas.

-Medios de enriquecimiento: Se aisla un tipo particular de microorganismo presente en pequeñas cantidades a partir de una población mixta de gran tamaño. Este medio es muy específico para cada microorganismo.

Métodos físicos para el control microbiano:

Con la esterilización (1) se matan todos los microorganismos incluidas las esporas. Un agente antiséptico (2) elimina los microorganismos patógenos y un desinfectante (3) elimina los microorganismos, pero solo se usa sobre superficies inanimadas.

Métodos de Siembra:
El medio debe estar esterilizado. Todo el proceso se hace cerca de un mechero para que no se contamine el medio. Se quema el asa de siembra y cerca de la mecha se abre el tubo y se coge la muestra para depositarla en el medio de siembra (placa de petri).

-Método de aislamiento por siembra por estrías en placa: Se quema el asa de siembra y se hace un zig-zag en el agar de la placa. Se vuelve a hacer arrastrando parte de los microorganismos anteriormente depositados. Con el asa de siembra se aíslan los microorganismos y se separan en diferentes medios de siembra (se aíslan colonias).

-Técnica de siembra en profundidad: Se hacen disoluciones previas y se siembran las disoluciones más altas. En cada nuevo cultivo se pasa solamente un 10% del anterior, de modo que se va diluyendo la concentración de microorganismos.

Conservación de cultivos bacterianos:

• Refrigeración: A 4ºC. No se mantienen durante mucho tiempo, apenas una o dos semanas.

• Ultracongelación: A -50ºC/ -90ºC o a -196ºC. Se suspenden los microorganismos del cultivo en un preservante que ayuda a que no se dañen las células. Estos preservantes pueden ser Glicerol, leche en polvo, etc.).

• Liofilización: Se congela el medio a una temperatura de entre -20ºC y -70ºC y se deshidratan con vacio.

• Colecciones ce cultivo tipo: Pertenecen al gobierno. Contienen una muestra de todos los microorganismos conocidos o al menos los mas importantes y están a disposición de los investigadores que pueden solicitar una muestra de las mismas.
  

El Crecimiento celular:

El incremento en el número de células de un cultivo se produce normalmente por fisión binaria (bipartición). Durante el proceso se duplica todo el contenido de la célula y empieza a crear septo que acabará por separar las dos células hijas.
La gemación (en levaduras) es una separación en la que la célula hija aparece como un grano en la pared celular y que va aumentando de tamaño hasta finalmente escindirse.
El tiempo requerido para esta fisión binaria depende de dos factores fundamentales: Los nutrientes disponibles y los factores genéticos.

El ciclo de crecimiento de poblaciones: Se estudia analizando la curva de crecimiento de un cultivo microbiano (cultivo discontinuo o en BATCH). La curva resultante tiene siempre 4 fases claramente diferenciadas: Latencia, crecimiento exponencial, fase estacionaria y muerte.
El crecimiento de poblaciones se determina por el tiempo de duplicación o tiempo de generación. Es el tiempo requerido para duplicarse una población de células:

A partir de una sola célula, el crecimiento es N = 2^n
N(t) = No x 2^n
Log N(t) = No + nLog2
n= (LogN(t) - LogNo)/ Log2

La velocidad de crecimiento viene dada por K = n/t
Y el tiempo de generación es g = 1/K

Ejercicio: Supongamos que un cultivo aumenta de 10^3 a 10^9 células en 10 horas, hallar K y g.
k= (Log10^9 - Log10^3)/Log2 x 10 = 6/3,01 = 2 generaciones por hora aprox.
g= ½ = 0,5 = 30 minutos /generación

El cultivo continuo (Quimiostato): Consta de un reservorio, un recipiente de cultivo, una bomba peristáltica y un sistema de desagüe. Se usa sobre todo en la industria para fabricar etanol, cerveza, etc.
Consiste en dejar pasar los nutrientes desde el reservorio hasta el recipiente de cultivo de forma continua para que el alimento nunca se agote, pero la población se mantenga estable. Por el desagüe se eliminan los residuos de la población, para que esta no se muera, y este residuo normalmente es el producto deseado (alcohol, etc.)

Efecto de los Factores ambientales:

• Psicrófilos: Se desarrollan a temperaturas bajas, siendo la mínima los 0ºC, aunque la optima se encuentra por debajo de los 15ºC y la máxima no supera los 20ºC
  Además de los Psicrófilos, también existen los microorganismos Psicrotolerantes, que pueden soportar las temperaturas bajas, aunque sus temperaturas optimas están por encima de los 20ºC. Están muy extendidos y son fruto de la adaptación (las enzimas activas a bajas temperaturas tienen mayor cantidad de alfa hélices que de laminas Beta, etc.)

• Mesófilos: La mayoría de los microorganismos son mesófilos, incluidos los que causan enfermedades en el hombre. Sus temperaturas mínimas oscilan entre los 15-20ºC, sus Óptimas entre los 20-45ºC y sus máximas no sobrepasan los 45ºC.

• Termófilos: La mayoría de ellos son bacterias, aunque también hay algunos hongos y algas. Las temperaturas óptimas están entre los 45-60ºC y las máximas no sobrepasan los 80ºC.

• Hipertermófilos: Viven a temperaturas superiores a 80ºC y solo pertenecen a las arqueas. Sus hábitats habituales son el compost, los fardos de heno, las tuberías de agua caliente, las zonas volcánicas, las fumarolas hidrotermales y los fondos oceánicos.
  Su adaptación viene dada por una mayor cantidad de ácidos grasos saturados y su membrana celular carente de ácidos grasos. Un ejemplo de estos microorganismos es el Thermus acuaticus (taq polimerasa en acuarios).

• Microorganismos acidófilos: Oxidan minerales sulfurados y producen acido sulfúrico. Bacterias: Thiobacillus; Arqueas: Sulfolobus.

• Alcalófilos: Se encuentran en suelos altamente carbonatados y lagos bicarbonatados. Producen enzimas de gran interés industrial. Bacterias: Bacillus; Arqueas: Natronbacterias.

Tema 4: Medición del crecimiento

Para medir el crecimiento de microorganismos se usan varios métodos:

Medidas Directas:
- Contaje total de células: Se usa una rejilla o unas cámaras especulares. Se coge un volumen determinado y se cuentan directamente las bacterias. Tiene el problema de que solo se puede contar si el crecimiento ha sido abundante. Es también difícil de distinguir las células vivas de las muertas. Finalmente, es difícil si las células son pequeñas.

- Contaje de viables: Un viable es una célula capaz de dividirse y crear una colonia. Se usa el método de crecimiento por siembra en profundidad y se cuenta en la última dilución, calculando cuantos microorganismos hay en un mililitro.

Medidas Indirectas:
- Turbidez: Las células dispersan la luz que atraviesa una suspensión. Cuanto mas células haya, mas luz se dispersará. Se usa el espectrofotómetro que mide la densidad óptica.
- Peso en seco
-Actividad metabólica

Control químico del crecimiento:

Un antimicrobiano es una sustancia química capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo, o bien de destruirlo. Hay dos conceptos que hay que tener claros acerca de estos productos químicos: La concentración mínima inhibitoria y la concentración mínima letal:
- La concentración mínima inhibitoria es la concentración más baja de un fármaco que inhibe el crecimiento de un determinado patógeno. Allí donde no hay crecimiento microbiano se forma un halo de inhibición.
- La concentración mínima letal es la concentración más baja de un fármaco que mata a un determinado patógeno. Un bactericida mata a concentraciones de dos a cuatro veces superiores a las de un inhibidor del crecimiento. Un bacteriostático mata a concentraciones aun mucho mayores.
Los antimicrobianos se clasifican de la siguiente manera:

• Según su origen: Puede ser natural, sintético o semisintético, dependiendo de si se elabora o no, o si se modifica en el laboratorio.

• Según su efecto: Pueden ser microbicidas (cuando atacan a los microorganismos) y pueden ser bactericidas, viricidas o fungicidas. También pueden ser estáticos, que son los que inhiben el crecimiento de microorganismos, y son los bacteristáticos, fungistáticos y viristáticos. Por último, los bacteriolíticos matan las bacterias rompiendo su membrana.

• Según su espectro de actividad: Que puede ser amplio o corto. Los Gram positivos suelen ser más sensibles a los antimicrobianos.

• Según su mecanismo de acción: Están los que inhiben la síntesis de paredes celulares, los que inhiben la síntesis proteica, la síntesis de ácidos nucleicos o los que dañan las membranas celulares. También están los antimetabolitos.

Mecanismos de resistencia:

Los antifúngicos: Al ser microorganismos eucariotas, para eliminarlos sin matar otras células del medio, se usan micostáticos. El principal esterol de la membrana celular de los mamíferos es el colesterol, mientras que en los hongos es el ergosterol. La anfotericina B, por ejemplo, inhibe la síntesis de este ergosterol.

Los antivirales: Van directamente a inhibir el ciclo de los viruses, ya que es diferente al de los seres vivos y de esta manera no son dañadas otras células. También hay antivirales que alteran la síntesis de ácidos nucleicos del virus.

Tema 5: Estructuras Celulares

La membrana es de estructura bilipidica en la que están incluidas las proteínas con diversas funciones. La unión de los ácidos grasos al glicerol en bacterias y eucariotas es de tipo éster, mientras que en arqueas es de tipo éter. No hay ácidos grasos en la membrana plasmática de las arqueas. En arqueas son moléculas carbonatadas de tipo isopreno. La estructura del fosfolípido es de diéter de glicerol. Si se forma una monocapa lipidica se le llama tetraéter de glicerol.

Los mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmática formando estructuras que pueden parecer orgánulos. Pueden ser vesiculares, tubulares y laminares. Su función no está determinada. Pero se piensa que ayuda a la división celular.

Está presente en casi todas las bacterias conocidas. Su función principal es proteger a las células de la lisis osmótica. Es la responsable de la forma del microorganismo y muchas de las paredes celulares aumentan la patogenicidad del microorganismo. También protege a la célula de tóxicos.
En la tinción de Gram, los Gram positivos indicaban la presencia de una pared celular más gruesa de peptidoglicanos. Los Gram negativos tienen una capa más pequeña de peptidoglicanos entre la pared celular y la membrana plasmática.
El peptidoglicano consiste en una cadena larga glucosidica de azucares cuyas unidades están formadas por el N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetil-glucosamina (NAG). Al N-acetil-murámico se le unen unos aminoácidos específicos de cada microorganismo, y al conjunto de aminoácidos, NAM y NAG se le llama “tetrapeptido de glicano”.

Varía la composición de los aminoácidos y del número de uniones entre las diferentescadenas. Entre una cadena y la paralela se producen enlaces peptídicos entre el ultimo aminoácido de una cadena con el penúltimo de la otra cadena. La unión entre los aminoácidos es directa.
En Gram positivos hay otros aminoácidos como la L-homoserina, la L-diaminobutírico, L-ornitina y la L-lisina.
La unión entre aminoácidos no es directa, sino que se unen mediante puentes de aminoácidos. Por ejemplo y muy común es el de 5 glicinas (GLY); o con una Lala; o con 2 alaninas, 3 alaninas o 3 alaninas y una ornitina.
Puede haber hasta 50 capas de peptidoglicanos en los Gram positivos, en comparación con las tres o cuatro capas de las Gram negativas. Además, en Gram positivas hay mas uniones entre cadenas de otras capas, mientras que en las Gram negativas las uniones entre aminoácidos se dan solo entre cadenas paralelas. Por ello, la capa de Gram positivas de peptidoglicanos es más fuerte y rígida

Sintesis de peptidoglicanos:
Se requieren dos transportadores. En el citoplasma se forman todos los componentes del peltidoglicano, unidas al UDP (transportador). A él se unen todos los aminoácidos del péptido y necesitan electrones. La N-acetil-glucosamina se une después formándose la UDP-NAM(aa)-NAG. Otro transportador, el Bactoprenol), saca todo este conjunto de la célula al unírsele dos fosfatos.

Otros componentes de la pared celular:
En los Gram positivos también hay ácidos teicoicos unidos covalentemente al NAM o a los ácidos grasos de la membrana plasmática (ácidos lipoteicoicos). Tienen la función de darle carga negativa a la pared celular gracias a la cual se unen cationes importantes para el metabolismo. En Gram negativos puede haber una membrana externa con fosfolipidos similares a los de la membrana plasmática. Exteriormente tienen lipopolisacaridos (LP) que es una capa formada por un lípido A, un CORE y cadenas laterales o antígeno O.
El lípido A son dos moléculas de glucosamina con cadenas de ácidos grasos. El lípido A se introduce en la membrana. El CORE tiene azucares raros, al igual que la cadena lateral.
La capa externa hace a las Gram negativas menos solubles a detergentes y resistentes a disolventes orgánicos, antibióticos y moléculas hidrofóbicas, y une a cationes divalentes. También constituye la endotoxina que induce a la fiebre, la hipertensión, etc.
En los Gram negativos hay además unas “proteínas de Braun” que unen la membrana externa al peptidoglicano. La membrana externa tiene porinas para dejar pasar las sustancias que necesita. En E.coli hay porinas OmpC (hasta 500g/mol), OmpF (hasta 600g/mol) y PhoE (moléculas grandes).

El espacio periplásmico: Es un compartimento acuoso, relleno de un gel periplasmico en el que hay fosfatasas, RNAsas, penicilasas, etc.

Importancia de la pared celular: La pared celular da forma y evita que la célula se rompa por la presión osmótica. Cuando una Gram positiva pierde su pared por causa de la penicilina o por lisozimas, tenemos “protoplasma”. Si es una Gram negativa queda como un esferoplasto. Los esferoplastos y los protoplastos sen de utilidad en la investigación.

Antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular:
- Fosfomicina: inhibe la formación de N-acetil-murámico
- Tunicamicina: inhibe la translocasa que cede NAM unido a UDP y lo pasa a bactoprenol
- Bacttracina: impide la regeneración del bactoprenol
-Penicilina: inhibe la unión entre aminoácidos de distintas cadenas
- Lisocima: inhibe la unión entre NAM y NAG

Pared de las arqueas:
1. En arqueas metanógenas: No existe peptidoglicano sino pseudopeptidoglicano: NAG-N-acetil-talosaminourónico. Se unen mediante enlaces Beta (1-3). Al ser otro tipo de enlace, no son sensibles a la lisozima.
2. En el resto de arqueas: En lugar del peptidoglicano tienen una capa S de glicorpoteinas, de estructura hexagonal. En el caso de los generos Methanosarcina y Halococcus, la capa S está rodeada de otro polímero, que es la metanocondroitina, formada por subunidades de N-acetil-galactosamina, ácido glucurónico, glucosa y manosa. El género Thermoplasma son las únicas arqueas que no poseen pared celular.

Diversidad del peptidoglicano: Solo se presenta en el dominio Bacteria. En las paredes de los dominios Arquea y Eucaria no se han encontrado NAM ni DAP. Todas las bacterias tienen DAP, en todas las Gram negativas y en algunas Gram positivas. La presencia de dos aminoácidos con configuración D (D-alamina y D-glucosamina). Hay 100 tipos diferentes de peptidoglicanos.

3. El glicocalix

El glicocalix está formado por polisacáridos. Si es grueso y rigido se denomina capsula, si es delgada se le denomina capa mucosa. Para verlo se usa una tinta china como tinción. Tiene como función la fijación o adherencia que puede ser sobre soportes inertes o sobre sustratos vivos. Si es a sustratos inertes, se forman microcolonias de la misma especie, o consorcios de diferentes especies. Si se unen a sustratos vivos actúan como adhesinas. Por ejemplo las colonias de bacterias del intestino; aunque se hacen resistentes al sistema inmune.
Finalmente, otra función del Glicocalix es la protección frente a la fagocitosis. Por ejemplo en la neumonía.

Tema 6: El Citoplasma

En el citoplasma procariótico no hay orgánulos. Está formado en su mayor parte por agua, en la que están disueltas algunas sustancias. También hay material genético, ribosomas y en algunos casos, cuerpos de inclusión.

Formación de una Espora:
Primero se produce una división celular, dando lugar a una célula grande y otra pequeña. Luego la célula grande envuelve a la célula pequeña. Formando una proespora, a partir de la cual se forman las estructuras celulares hasta que tenemos una espora en el interior de una célula.
El ácidodipicolínico se acumula en el protoplasto de la espora, además de iones Calcio (Ca2+), que se unen al ácido y que alcanzan hasta el 10% en peso seco de la espora. Las esporas están deshidratadas, con apenas un 15% de agua y con todo ello la espora logra hacerse mas resistente. Cuando se ha formado la espora, la célula vegetativa se rompe dejando libre la espora.

Algunos microorganismos (Bacillus thuringiensis) a la vez que forman la espora, van acumulando una proteína (CRY) a la que denominan “cuerpos parasporales” y que son unas toxinas insecticidas que actúan específicamente sobre larvas de determinados insectos como las mariposas, escarabajos o moscas. El mecanismo de acción es el de esparcirlos por los campos de cultivo para que las larvas se los coman y se activen las proteínas en el interior de las mismas debido al pH elevado. Estas proteínas inducen un cambio en la permeabilidad del intestino de la larva, con lo que la larva muere. La espora germina dando una espora vegetativa que se alimenta de la larva muerta.
Los cuerpos parasporales se usan para la agricultura ecológica; la biotecnología (las plantas que tienen en su interior el gen del Bacillus thuringinensis se vuelven resistentes a los insectos), etc.

Germinación de las endosporas:

1. Preactivación: Se erosionan las cubiertas de la espora por el envejecimiento de la misma. De modo artificial se pueden erosionar calentándolas, con radiaciones ionizantes o a pH bajos.
2. Activación: Es una etapa reversible. Entra agua en el protoplasto, diluyendo los compuestos que hay en su interior y perdiendo así su resistencia al calor.
3. Germinación: Es ya irreversible. Hay un metabolismo endógeno (no necesita adquirir compuestos del exterior) en el que las SASP se hidrolizan y los aminoácidos utilizan la célula para formar nuevas proteínas. Se pierden el ácido dipicoliico y los iones de Calcio (Ca2+) y empieza la transcripción de genes.
4. Crecimiento: La célula madura sintetiza ADN, crece, etc. Usando las paredes de la espora para formar sus propias paredes. La célula vegetativa sale rompiendo finalmente las cubiertas.

Tema 7: Apéndices y Movimiento bacteriano

1. Las Fimbrias
La mayor parte de las Gram negativas tienen fimbrias. Son como “pelitos” que rodean a las células. Sólo son observables al microscopio electrónico. Están formadas por una proteína (fimbrina) que forma estructuras helicoidales dejando un hueco en el centro. Tiene como función unirse a superficies solidas.
Un tipo de fimbrias son los “pili”, que son muy numerosos (de 1 a 10 por célula). Otros son los pelos sexuales, que unen dos microorganismos para permitir el intercambio génico mediante conjugación. Las fimbrinas no intervienen en el movimiento celular.

2. Movimiento
Hay varios tipos de movimiento según sea en medios líquidos o en superficies solidas. En medio líquido se dan las siguientes:

a) Movimiento flagelar clásico:
Los flagelosle ayudan a impulsarse en el liquido. El numero de flagelos varia, igual que su distribución, habiendo distribución flagelar polar (monotrica, con solo un flagelo; lofotrica, con varios flagelos en un polo; anfitrica, con un flagelo en cada polo; o varios flagelos en cada polo), o flagelación perítrica, cuando los flagelos no salen de los polos, como en el caso de E. coli.

La estructura de un flagelo: Se distinguen tres zonas diferenciadas: El cuerpo basal, que está en el interior celular; el Gandio que actúa como bisagra uniendo el cuerpo basal con el filamento; y el filamento.

El cuerpo basal: Se encuentra en el interior celular, constituido por anillos unidos por una varilla. Están los anillos C, SM, P y L en los microorganismos Gram negativos; mientras que en los microorganismos Gram positivos se encuentran los anillos C y SM. La flagelina y la fimbrina se disponen de una manera helicoidal con un hueco en el centro que es el filamento. El gandio sirve para direccionar el movimiento del flagelo.

En E. coli la flagelación es perítrica. Los flagelos pueden rotar a favor o en contra de las agujas del reloj. Cuando gran en contra de las agujas del reloj, la célula avanza. Si gira a favor, aunque solo sea uno de los flagelos, la célula se voltea (parándose y cambiando de dirección). Los microorganismos detectan las fluctuaciones de las sustancias y modifican su movimiento para acercarse si son nutrientes o alejarse si son sustancias toxicas. Los microorganismos también se mueven atendiendo a factores físico-químicos como la radiación luminosa, el oxígeno o el potencial redox. También detecta interacciones célula-célula. Todos estos movimientos son las “taxias” (quimiotaxia, aerotaxia, fototaxia, magnetotaxia, etc.).
En la quimiotaxia están incluidas proteínas de la quimiotaxia, aceptoras de restos metilo MCP's. En E. coli hay 4 MPC's: CTsr- receptor de serina; Tar- detector aspártico; Trg- receptor de la ribosa, glucosa y galactosa; y Tap- receptor para dipéptidos. Todas las MCP's son proteínas transmembranosas y se encargan de detectar estímulos externos y trasladar la señal al citoplasma mediante un sistema de traducción de señales.

La Traducción de señales: Ocurre gracias a que hay un conjunto de proteínas Che (Che A, Che W, Che Y, Che R, CheB y Che Z). Las MCP's pueden estar en dos estados conformacionales.
- En uno de ellos, interacciona con Che W, que a su vez interacciona con Che A (quinasa), que se fosforila y fosforila a la Che Y que una vez fosforilada interacciona con Fli II (del motor flagelar) y hace que el flagelo gire a favor de las agujas del reloj.
- En el otro estado conformacional, la MCP no interacciona con Che W, por lo que es el estado relajado en el que el flagelo gira en contra de reloj.
Si se une un atrayente a la MCP, la célula camina.
La Che R añade continuamente grupos metilo a MCP hasta que el grado de metilación cambia el estado de conformación de la MCP, soltándose el atrayente y pasando a otro estado, lo que le permite volver a unirse a Che W, saltando la célula.
La Che B está fosforilada por Che A y elimina los grupos metilo que introduce Che R, completando el ciclo.

En la flagelación polar (Sinouhizobium melioti), los flagelos giran en solo un sentido. Si quieren girar, cada flagelo gira a distinta velocidad. En Rodobactus sphaeroides (flagelación polar monotrica), los flagelos también giran en un solo sentido, pero para girar hace un ovillo con el flagelo y deja que se modifique la dirección aleatoriamente por la inercia.

En la aerotaxia (E. coli) hay una proteína sensora Aer en el citoplasma bacteriano. Unida a ella hay dos moléculas de Flanin adenindinucleótido (FAD), que interviene en el transporte de electrones. Se modifica su configuración, pudiendo interaccionar con Che.

En la fototaxia (E. coli) hay una serie de proteínas que perciben la luz y que actúan igual que los anteriores detectores.

En la magnetotaxia, las bacterias que producen magnetosomas se mueven siguiendo el campo magnético terrestre. Los magnetosomas tienen diversas formas; se pueden unir en agrupaciones, están rodeados de una membrana y su función es llevar a las células acuáticas a zonas donde la concentración de oxigeno es la adecuada.

b) El movimiento axial:
Es producido por el giro del microorganismo. Como consecuencia del movimiento de flagelos internos (en la zona del periplagio). Se da en espiroquetas, que son las causantes de la sífilis, las fiebres recurrentes, la enfermedad de Lyme, la leptospirosis, etc.

Movimientos sobre superficies sólidas, se dan los siguientes:

Tema 8: La expresión génica

El dogma de la biología molecular es la Replicación, la Transcripción y la Traducción.
Un gen es un segmento o secuencia de ADN que codifica para proteínas. Un Operón es el conjunto de genes bacterianos que se cotranscriben al estar relacionados.

Síntesis del RNA:

-RNA polimerasa:
Consta de cuatro subunidades: alfa 2, Beta, Beta', y Sigma. Estas subunidades se componen de sustratos de UTP, GTP, ATP y CTP. La RNA polimerasa de eucariotas y arqueas tiene más subunidades y son más complejas, pero la estructura es similar.

Proceso de Transcripción: Consta de tres fases, la iniciación, la elongación y la terminación.
-La iniciación: Unos promotores como la caja Tata (TATAAT) en posición -10 y la TTBACA en posición -35 son promotores fuertes. Cuanto menos se parezcan estos promotores al ideal, más débil es el promotor. Si es muy fuerte, cada dos segundos se contranscribirá, mientras que cuanto más alejado del consenso, variará la velocidad hasta los dos minutos. La primera base por la que empiezan a transcribirse los genes es una Guanina o una Adenina.
-La elongación: La polimerasa se une a los promotores y se sintetiza una pequeña región de 9 bases (cebador o primer), con lo que empieza la transcripción.
-La terminación: Son secuencias ricas en Guanina y Citosina seguidas de secuencias ricas en Adenina y Timina, ya que son complementarias y pueden formar una horquilla. La transcripción termina con una secuencia de 4 uracilos.
El factor rho actua como una helicasa. Se une al mRNA y corta la hélice hibrida ADN-RNA.

Antibióticos que inhiben la transcripción:
-Actinomicina D (Streptomyces): Bloquea a la RNA polimerasa. Es quimioterapéutica.
-Rifampicina: Se une a la subunidad Beta.

Adaptación en bacterias:

Cuanto más versátil es un organismo, mas información génica contiene. Un microorganismo medio tiene unos 6000 genes, aunque se utilizan solamente de unos 600 a 800. La síntesis de una proteína media tiene un gasto de 3000 ATP's. Los microorganismos tienen que tener un control génico para sintetizar el producto que les es necesario en cada momento e inhibir el que no necesitan.

El control génico: El control génico más común y con menor gasto energético es en la transcripción. Los genes tienen operones y regiones promotoras. Cerca del promotor hay un gen regulador y un operador:

-Gen regulador proteína reguladora represor (control negativo) o activador (control positivo). Ambos pueden ser reprimiebles o inducibles.

El control negativo inducible se da cuando la proteína se une al operador y no se produce la síntesis de ARN. Si se une un inductor, el inducible no se une al operador y si se produce la síntesis de ARN. En el reprimible si se produce la síntesis de ARN pero si hay un correpresor en el medio, este se une al represor y deja de haber síntesis.

Las mutaciones:

El Genotipo son los genes que tiene un microorganismo, mientras que el fenotipo es la expresión de los genes. Las mutaciones son cambios en el genotipo que afectan al fenotipo. Las mutaciones pueden ser:
1. Por sustitución de pares de bases por otras
2. Por deleción: Hay un cambio de sentido en un fragmento del ADN
3. Por transposición: Un segmento se traslada de una zona a otra
5. Por duplicación: Se inserta un segmento idéntico al lado del original

Las mutaciones pueden ser espontaneas o inducidas, causadas por tratamientos con agentes mutagénicos químicos, físicos o biológicos. Las espontaneas son muy raras. En bacterias se da una mutación espontanea cada 10^8.
Los agentes mutagénicos pueden ser químicos (reaccionan con el ADN o con la maquinaria de replicación del ADN, como por ejemplo el 5-bromurouracilo, que es un análogo de base y que aparece con Adenina y con Guanina. Otro ejemplo seria el hidroxilamina, que se une a la citosina formando a la hidroxilamincitosina que puede aparear con la Adenina y con la Guanina. Se cambia entonces un G-C por uno A-T, de forma similar a como actúa el 5-bromouracilo.

Los agentes mutagénicos físicos: Son los UV que forman dímeros de Timina.
Los agentes mutagénicos biológicos son elementos de ADN o ARN responsables de que muchos microorganismos puedan utilizar ciertos nutrientes o sean resistentes a ciertas condiciones.
Los elementos genéticos transponibles son fragmentos de ADN que no son autorreplicativos, sino que necesitan un hospedador. Son capaces de moverse entre el cromosoma y un plásmido y viceversa. Las enzimas que catalizan el proceso son las transposasas. Puede darse (1) un mecanismo replicativo en el que el elemento transponible se replica y queda una copia en la posición original; o (2) un mecanismo de cortar y pegar en el que no se produce la replicación.
Los lugares de inserción dependen del grado de enrollamiento, del grado de metilación o de la susceptibilidad a la transcripción.
Tipos: Hay secuencias de inserción, transposones y los transposones conjugativos.

Las secuencias de inserción están formadas por 1000 pares de bases y en sus extremos tienen secuencias repetidas inversamente. Tienen solo información para que se sintetice la tansposasa para que les ayude a saltar. Los tansposones son fragmentos más grandes (de 3000 a 20000 pares de bases) que tienen un gen para la transposasa e información génica más especifica (por ejemplo, resistencia a antibióticos). Conlleva consecuencias genéticas como la inactivación insercional de un gen (si se introduce en la mitad de un gen, con lo que este puede quedar inactivado); se pueden generar escisiones anómalas que arrastran material genético adyacente al saltar de un lado para otro, etc.

Consecuencias de las mutaciones:

Depende del grado de la mutación y de la importancia que tenga el producto génico para la célula. Según el grado de la mutación, puede ser silenciosa (se produce lo mismo), sin sentido (da proteínas no funcionales) o mutación por cambio de sentido (proteína defectuosa).
Según la importancia que tenga el producto génico, si la proteína era muy necesaria y ya no se produce (o viceversa), la mutación es letal. La autotrofia es que los microorganismos pueden vivir, pero sin sintetizar un aminoácido y moriría si no puede adquirirlo del medio.

Tema 9: Genética microbiana

El Nucleoide:
No se encuentra diseminado por el citoplasma, sino que está en una región especifica. El ADN no está rodeado por membrana. Hay microorganismos que tienen además plásmidos. El cromosoma procariota está formado por ADN, ARN y proteínas. Normalmente es un solo cromosoma circular, de doble cadena, covalentemente cerrado; dentro de un microorganismo se pueden encontrar copias del genoma bacteriano, a lo que se llama haploidía y se da cuando la bacteria crece rápido.
Algunas especies de los géneros Borrelia y Streptomyces tienen los cromosomas lineales. También hay bacterias con dos o mas cromosomas: Rhodobacter, Vibrio, Leptospira y Brucella tienen dos cromosomas lineales, Sinorhizobium melioti tienen tres cromosomas circulares, Agrobacterium tumefaciens tiene un cromosoma circular y otro lineal.

Los plásmidos son elementos genéticos extracromosomicos con capacidad de autorreplicarse y pueden formar copias de si mismos de forma independiente. Los plásmidos están compuestos por ADN, y muchos de ellos tienen la capacidad de integrarse en el genoma bacteriano .Para ello debe haber más secuencias de inserción por las que se producen la recombinación entre el plásmido y el cromosoma. Al plásmido integrado en el cromosoma bacteriano se le llama episoma .Tiene un tamaño de 2-1.000 kb.los plásmidos dependen del número de copias y del control de la replicación .Cuanto más baje el número de copias más estricto es el control.
Algunos plásmidos se transfieren de un microorganismo a otro, son los plásmidos conjugativos. Estos pueden transferir solo entre cepas de la misma especie o de especies parecidas; otros pueden transferirse a especies muy diferentes. Finalmente hay plásmidos no conjugativos, que no se transfieren a otros microorganismos.
Hay plásmidos de resistencia antibióticos (plásmidos R), a metales pesados y otros tienen información sobre la virulencia (factor F de fertilidad).

Reacciones de transferencia génica:
1. Conjugación: Para que se produzca la transferencia de información, los microorganismos deben estar en contacto físico.
2. Transformación: Se transfiere material génico desnudo.
3. Traducción: Se intercambia la información mediante un virus bacteriófago.
La transferencia es unidireccional y parcial. Una vez en la célula receptora se recombina la información nueva con el genoma. La recombinación puede ser general u homóloga, cuando se da en cualquier lugar del cromosoma e intervienen enzimas especificas; o específico, que puede ser conservativo si se requiere cortas secuencias de homología (especifico del sitio) o ilegítimo, que es un fenómeno de transposición que depende de un elemento genético transponible.
Endogenote: es el genoma de la célula que recibe la información génica.
Exogenote: Es la porción de material génico que la célula dadora transfiere a la célula receptora.

La conjugación:

Una de las células tiene que tener el factor F (plásmido conjugativo), que se puede encontrar como plásmido independiente, incluido en el cromosoma bacteriano (episomas) o independientemente del cromosoma pero con una porción de información génica del mismo. Es ADN circular de doble cadena, de unas 100 Kb. Se han identificado 60 genes con funciones diferentes.
Los genes Tra son 25 genes que forman un operón. Son necesarios para la biosíntesis y ensamblaje de los pelos sexuales.
Las secuencias de Inserción: Permiten la integración del factor F en diferentes lugares del cromosoma.
El factor ori:
El factor F tiene una secuencia de inserción para unirse al cromosoma bacteriano formando episomas. Son las Hfr (high frecuency of recombination).

Transformación:
Es la captación por parte de una célula receptora de una molécula o fragmento de ADN desnudo y libre en el medio y la incorporación mediante recombinación de este material al cromosoma de la célula. Puede ser natural o artificial. En el proceso natural, el ADN que está fuera de la célula es de doble cadena, y el ADN que queda dentro es de cadena simple. Una sola molécula de ADN puede producir la transformación, y el número máximo de moléculas de ADN que pueden entrar depende de la cinética de saturación.
Las células deben ser competentes para producir la transformación, es decir, son aquellas que tienen los mecanismos para hacer más permeable la membrana plasmática para que entre el ADN en la célula. Esta competencia depende de la temperatura, del pH, los nutrientes, la densidad celular, etc. Cuando se introduce la cadena de ADN llega un momento en el que no puede funcionar la cadena de ADN de la célula y es la fase de eclipse.
El material que hay fuera de la célula puede estar ahí por la lisis de otras células o por bacterias que expulsan el ADN al medio.
En las Gram positivas, el ADN monocatenario se introduce en la célula mientras la complementaria se degrada simultáneamente. Buenos ejemplos son los Streptococus y Bacillus.
En las Gram negativas se pega a la pared una molécula de ADN de doble cadena, pero solo una de las cadenas se introduce en la célula y y la otra cadena se degrada en el espacio periplásmico. Se da en Haemophilus, Neisseria, Roraxella, Acinetobacter, Pseudomonas, Cidmobacterias y Azobacter.

Gram positivas: Son inespecíficas, por lo que captan el ADN del mismo grupo de microorganismos o de otros microorganismos. Solo es capaz de transformar los que se parezcan mucho, aunque se pegue cualquier ADN a la pared celular.
En Streptococus pneumonaie, que es Gram positiva, un FAC (factor activador de la competencia), una vez formadas las células, lo expresan y se unen a unos receptores de membrana que inducen la expresión de genes que traducen 12 proteínas. Una de ellas, la autolisina, es la que hace agujeros en la pared celular y deja al descubierto los sitios de unión al ADN exógeno. Según entra la cadena de ADN, hay más proteínas que se unen al mismo para que no sean atacados y le ayudan a llegar al cromosoma bacteriano para que pueda unirse a él.
En Haemophilus influenzae, que es Gram negativa, el ADN que entra tiene que ser del todo homólogo. La competencia se produce en la fase estacionaria de crecimiento y para que se produzca la transformación necesitan de receptores de membrana, llamados transformasomas, los cuales reconocen una secuencia especifica y se produce la entrada de una de las cadenas.
De manera artificial, para hacer las células competentes se le hacen poros con cloruro cálcico en la pared celular y se introduce el ADN en la célula.

Transducción:
Se da por la unión de bacteriófagos a la célula a la que le introduce el ADN. Los bacteriófagos tienen dos fases de “ida”. Se unen a sitios específicos de anclaje de la pared celular e introducen el ADN en la bacteria, donde puede seguir dos ciclos:
1. El ciclo lítico, que obliga a la célula a formar nuevos virus en el interior de la célula. Luego esta se rompe, dejando libres los viruses. Se da en fagos virulentos.
2. Ciclo lisogénico: El ADN vírico se recombina con el cromosoma bacteriano y se le llama profago. Por agentes externos (como la radiación UV), el fago puede saltar del cromosoma bacteriano, yendo al ciclo lítico. Se da en fagos moderados.
Las células con profago son células lisogenicas. La transducción puede ser generalizada (cuando el fago introduce el material génico y cuando se da el ensamblaje de los componentes del virus -dentro de la célula-, se introduce simultáneamente y por error, material génico de la célula anterior creador del virus, por lo que se da la transferencia génica adicional); o especializada (cuando el profago se introduce en una zona especifica en el cromosoma de la célula y arrastra consigo información específica del cromosoma cuando se retira).

Tema 10: Bioenergética:

La célula usa la diferencia de potencial con el exterior para obtener energía. Pueden usar la diferencia de concentración o gradiente de protones (H+), sodio o de OH- (Teoría quimiosmótica de Mitchell).
Las reacciones de oxidación y reducción son esenciales para la obtención de energía. Las moléculas que se usan para la obtención de energía son ATP, PEP; NADH+H+, NADPH + H+. El sustrato que se usa debe estar reducido (con electrones de más), para poder oxidarlo, ganar electrones y con ellos ganar energía.

Transporte:

-Transporte pasivo o difuso: Si tenemos una membrana semipermeable y existe una diferencia de concentración entre el exterior y el interior de la célula, esto se regulará para que la diferencia sea la menor o sea nula. Este intercambio con el medio no le conviene a la célula cuando los nutrientes en el exterior escasean. Por ello también usan transporte contra gradiente (y para lo que gastan energía).

-Trabajo osmótico o transporte activo: Es el transporte contra gradiente, que necesita un aporte de electrones y traslocadores. Puede llegar un momento en el que no se pueda introducir más nutrientes dentro de la célula por saturación.

El uso de un transporte u otro depende del tamaño de las sustancias y de la carga:
- Transporte activo primario: Es aquel que aumenta la fuerza motriz de protones.

-Transporte activo secundario: Hace disminuir la reserva de protones al gastarla para transportar macromoléculas.

- Respiración (transporte primario): Requiere de una cadena transportadora de electrones, un dador y un aceptor. El dador suele ser el NADH+H+ y el aceptor puede ser el Oxigeno. Con este mecanismo se crea un gradiente de protones.

- La fotosíntesis (transporte primario): Necesita una proteína que cambie de conformación con la energía lumínica y con ello cambie la conformación de su cofactor. Cuando el cofactor vuelve a su estado normal, impulsa protones al exterior.

- Metabolismo (transporte primario): Elimina los productos del metabolismo. Se acopla la diferencia de concentración del producto del metabolismo con el gradiente de concentración de protones. Se usa este mecanismo de expulsión para producir energía.

-Incorporación de nutrientes contra gradiente (transporte secundario): Se debe impedir la salida de los mismos por difusión simple. Para su adquisición se usa el simporte con protones del exterior, pues se mueven en la misma dirección (hacia el interior de la célula).

-Incorporación de iones (transporte secundario): Igual que en el caso anterior, se usa el gradiente de protones para introducir potasio y otros iones, contra gradiente, lo que supone un gasto de energía en forma de protones. En el caso de iones negativos como el sodio, se da el antiporte (se incorporan protones).

Finalmente, el gradiente de protones también se usa para hacer rotar los flagelos.

Sistemas de transporte:

-El primer sistema es el de la ATPasa / ATPsintasa. Es una misma estructura que se encarga de bombear protones con gasto de ATP, o también puede funcionar inversamente produciendo moléculas de ATP a partir de ADP dejando pasar protones del exterior. Es por tanto también un sistema de regulación para el que hacen falta muy pocos genes. Incluso los organismos más simples, con muy poca información genética, tienen esta estructura.

-Translocación de grupos: Se usa el PEP, que se hidroliza para dar piruvato (Pir), que cede energía para fosforilar un enzima. El enzima fosforilado puede fosforilar otro enzima desfosforilándose el mismo. Hay algunos mecanismos que son específicos de sustrato (se fosforila un enzima o no, dependiendo de donde esté localizado). Al fosforilar (activar) una enzima especifica, puede dispararse una cascada de señalización: Si no encuentra su sustrato (por ejemplo, la glucosa) y no puede importarlo a la célula, se pone en marcha el AMP cíclico, que va al ADN para que el enzima cambie y sea específico de otro sustrato (sistemas alternativos de obtención de energía).

-Sistemas de translocación ABC: Gracias a tres componentes (uno en el espacio periplásmico, otro en la membrana plasmática y otro en el citoplasma) se favorece la entrada de nutrientes. Se usa para la regulación de entrada de metales y requiere de ATP para romper el enlace de los componentes con el sustrato.

La respiración:

Los seres vivos pueden ser quimiótrofos y fotótrofos. Los quimiótrofos pueden ser a su vez quimioheterótrofos o quimioautótrofos y lo mismo con los fotótrofos.
Para los quimioheterótrofos, el carbono es a la vez la fuente de energía y la fuente de carbono, mientras que los autótrofos usan el CO2 como fuente de carbono.

Agentes oxidantes:
- Celulares: NAD+ y NADP+
- Ambientales: Fe3+, NO3-, SO4 2-, H2

Agentes reductores:
- Celulares: NADH + H+ y NADP + H+
-Ambientales: Fe2+, NO2-, S2-, H2

Lo primero que se debe hacer para poder respirar, es introducir glucosa en la célula, contra gradiente y en simporte con protones del exterior. Luego la glucosa se oxida durante la glucolisis al reaccionar con el NAD+. De este modo se obtiene ATP por fosforilación a nivel de sustrato (ADP se transforma en ATP) y la glucosa se oxida a piruvato (Pir). El piruvato a su vez entra en el ciclo de Krebs, quedando oxidado a CO2 y H2O.
El NADH + H+ de la glucolisis y también del ciclo de Krebs luego entran en una cadena transportadora de electrones de la membrana, donde vuelven a ser NAD y donde sueltan los electrones. Éstos necesitan un aceptor final, como es el Oxigeno en el caso de los seres humanos, y de esta manera se produce un gradiente de protones.
Este gradiente de protones es el que luego permite toda la actividad bioenergética celular posterior y la obtención de ATP a partir de ADP en las ATP sintasas.

Los aceptores de electrones son agentes oxidantes que el organismo normalmente tiene que adquirir del medio para la obtención de energía. En nuestro caso usamos el oxigeno, que es con el que se obtiene el mayor gradiente de protones y por tanto más energía. Sin embargo, esto no quita que otros organismos usen otros sustratos diferentes de la glucosa.

La Fermentación:

En el caso de la fermentación de la glucosa, se usa el gradiente de protones para la obtención de glucosa en el interior celular. Luego la glucosa pasa por el proceso de la glucolisis, dando 2 moles de ATP por cada mol de glucosa y produciendo Piruvato.
El producto de la glucolisis puede luego expulsarse, expulsando también protones para dar un gradiente de protones. Con esto se obtiene hasta el 30% de la energía de la célula.
Aunque este sistema de obtención de energía parece primitivo y poco eficiente, hay que entender que con la fermentación no se obtiene solo energía, sino que también se obtienen numerosos sustratos necesarios para la actividad celular, como son las cadenas de azucares, etc, etc.

La Fotosíntesis:

Para la fotosíntesis se necesita una membrana, un centro de reacción (clorofila), y una cadena transportadora de electrones, además de un aparato recolector de luz.
La transferencia de energía hace que la luz se filtre a una sola longitud de onda, que es la que va a poder ser utilizada. Esta luz excita los electrones del centro de reacción, deslocalizandolos. Cuando estos vuelven a su posición original, producen fluorescencia, pero más comúnmente pueden ir a la cadena transportadora de electrones.
En la cadena transportadora, se produce un gradiente de protones. De esta manera se puede obtener ATP gracias a la ATP sintasa (en un proceso no acoplado). Esto recibe el nombre de fosforilación aciclica.
La fosforilación cíclica es aquella en la que los electrones de la cadena transportadora son impulsados en sentido contrario, creando materia orgánica y suponiendo un gasto de energía.

Sistemas de obtención de energía en la evolución:

Gracias a los descubrimientos en micropaleontología sobre cianobacterias del Arcaico-opaloides, se ha podido comprobar que su antigüedad coincide con la acumulación de oxigeno en la atmósfera. Estos datos han permitido desarrollar la teoría de que los primeros pobladores de la Tierra fueron anaerobios.
Una de las hipótesis más fundamentadas sostiene que en el principio existieron unos organismos que vivían en el sustrato (suelo) para protegerse de la fuerte radiación solar. Estos microorganismos además poseían carotenos, pero estos no debían servir para la fotosíntesis aun, sino para más protección frente a la radiación solar.
De aquí, lo más probable es que la vida evolucionase hacia la fotosíntesis anoxigénica, utilizando el caroteno como colector de electrones y desarrollando un centro de reacción, que sería la clorofila. Esto podría coincidir con la aparición de la primera atmosfera terrestre y la atenuación de la radiación solar sobre el planeta.
Mas tarde aun llegaría la fotosíntesis oxigénica, que necesita dos centros de reacción y también agua. Con la fotosíntesis empezó a producirse oxigeno, lo que en aquel entonces no era deseable para los microorganismos que allí vivían y para quienes el oxigeno era toxico. Para disiparlo, algunos microorganismos empezaron a respirarlo para eliminarlo y para obtener energía.
Actualmente, la concentración de oxigeno en la atmosfera (21%) es muy grande, que es más de lo que necesitan los microorganismos aerobios para vivir y que es una concentración dañina para los microorganismos anaerobios.

Tema 11: Clasificación y filogenia de los Procariotas

Los arboles filogenéticos se suelen hacer por características fenotípicas, sin embargo, es posible hacer cladogramas genotípicos. La evolución, siendo la suma de mutaciones (y transferencia horizontal de genes), puede esquematizarse como un cladograma en el que, comparando las secuencias génicas se pueda calcular las distancias evolutivas.
Los sistemas eucarióticos se han estudiado a partir de la teoría endosimbióntica de Margullis, que fue confirmada mediante la comparación del ADN mitocondrial y de los cloroplastos con el ARN ribosómico de bacterias aerobias (como lo fueron en su día las mitocondrias) y el de las cianobacterias (a las que pertenecían los cloroplastos).
El ancestro común de todos ellos, LUCA aun no ha sido completamente secuenciado en su ARNr, pero no es sorprendente, teniendo en cuenta que solo se conoce el 1 o 2% de todas las especies procariotas que existen.

Metodología de ecología microbiana:

DGGE: Electroforesis en campo desnaturalizado. Es un proceso de laboratorio que permite averiguar a qué género o especie pertenecen unos determinados microorganismos en base al grado de homología de bases. El ADN, con carga negativa, es colocado sombre un campo electroforético sobre el que se hace pasar una corriente. De esta manera se desnaturaliza el ADN y se separa en bandas que se analizan y secuencian. Repitiendo las pruebas con distintos cebadores de bacterias, arqueas o eucariotas se compara la velocidad de desnaturalización y la disposición de las bandas entre sí y con una base de datos. Cuando tenemos una homología del 97% o superior, podemos decir que se trata de la misma especie, y cuando es superior a 93% podemos afirmar que los microorganismos son del mismo género.

FISH: Cuantificación, saber cuántos microorganismos de una muestra son de una especie especifica gracias a una sonda. Se precisa de un microscopio de fluorescencia. La muestra se trata y luego se observa todos los microorganismos que hay en ella. Hibridando la muestra y filtrando la luz se pueden observar solamente aquellos microorganismos que hayan hibridado ya que aparecen en otro color. La cuantificación se establece comparando con los que han hibridado con los del contaje total que se hizo al principio.

Métodos automatizados para identificar microorganismos:

-Perfil de ácidos grasos: En un cultivo axénico se extraen las membranas de los microorganismos, hidrolizándolas y separándolas con un detergente polar. Se usa luego un cromatógrafo de bases, obteniendo una gráfica con los ácidos grasos que tienen las membranas del microorganismo, su cantidad y cuáles son. Estos datos se pueden comparar con una base de datos para identificar al organismo (perfil de aminoácidos).
Algo parecido se puede hacer con enzimas de restricción. Se obtiene una especie de código de barras que también se compara con una base de datos. Este método se basa en información genotípica, al contrario de lo que ocurre con el perfil de ácidos grasos, que es una información fenotípica.

Tema 12: Clasificación de los procariotas

Filo 1: Las proteobacterias
Filo 2: Las Hielobacterium
Filo 4: Cianobacterias, Proclorofitas y Cloroplastos
Filo 10: Bacterias verdes del azufre
Filo 13: Bacterias verdes no del azufre

Phyllum 1: Proteobacteria:
Son las llamadas bacterias púrpuras o rojas y de las que hay dos tipos: las bacterias rojas del azufre y las bacterias rojas no del azufre.
Todas ellas en general tienen una gran versatilidad de obtención de energía, que puede ser mediante la fotosíntesis o la respiración. Tienen distintos tipos de pigmentación, entre ellas varias bacteroclorofilas y carotenos y poseen un aparato fotosintético lamelar. Como sucede en la mayoría de los microorganismos, son imposibles de clasificar en base a su morfología externa, ya que son muy distintas de una especie a otra.

Las bacterias rojas se clasifican en bacterias rojas del azufre (BRS) y en bacterias rojas no del azufre (BRNS):
Las Bacterias rojas del azufre (BRS) son Gram negativas y utilizan distintos derivados del azufre como poder reductor del CO2. Se encuentran sobre todo en los lagos meromícticos y tienen una filogenia coherente como grupo (todos son γ).
Dos ejemplos son Ectothirodospira y Halorodospira.

Por su parte, las bacterias rojas no del azufre (BRNS) pueden utilizar bajas concentraciones de H2S y además poseen una versatilidad extrema a la hora de obtener energía, ya que pueden usar la fermentación, la respiración anaerobia y aerobia y la fotosíntesis. Son Fotoheterótrofas, por lo que obtienen l energía de la radiación lumínica, y fijadoras de nitrógeno.
Su cultivo en laboratorio se consigue mediante cultivos de enriquecimiento a base de sales, ácidos grasos, sedimento y luz.
Aunque tienen una filogenia coherente (α y β), las especies son morfológicamente distintas entre sí y apenas pueden reconocerse.

Phyllum 2: Heliobacterium:
Las Heliobacterium son un reducido grupo de bacterias Gram positivas de bajo contenido en Guaninas y citosinas en su DNA. Son anaerobios estrictos y su medio de obtención de energía es la fermentación en ausencia de luz. Tienen bacterioclorofila g y producen endósporas ricas en iones de calcio y ácidos dipicolínicos.

Phyllum 4: Cianobacterias, Proclorofitas y Cloroplastos:

Las cianobacterias: Son un grupo grande de bacterias Gram negativas (con peptidoglicanos) y morfológicamente variable. Dependiendo de su estructura, que puede ser unicelular o filamentosa, se subdividen en 5 grupos taxonómicos:
-Unicelulares con fisión binaria
-Unicelulares con fision multiple
-Filamentosas con heterocistos
-Filamentosos sin heterocistos
-Ramificados

En general su tamaño oscila entre las 0,5-1 micras hasta las 60 micras. Poseen envolturas celulares y/o exopolisacáridos mucilaginosos y un aparato fotosintético lamelar con dos centros fotosintéticos y poder reductor del agua. Para la fotosíntesis utilizan la bacteroclorofila a y las ficobilinas (ficocianina y ficoeritrina).

Al ser un grupo tan grande y variado, presentan numerosas variaciones de una especie a otra:
-Pueden tener vesículas de gas
-Heterocistes para la fijación de nitrógeno
-Intercambian material con células vecinas
-Ficobilinas negativas y CRII negativo
-Pared celular gruesa
-Cianoficina (codímero de Asp+Arg)
-Movilidad por deslizamiento
-Quimiotaxis y fototaxis
-Hormogonia: Fragmentación de filamentos
-Acinetos: esporas durmientes
-Resistencia a desecación y temperaturas altas

Respecto de su fisiología, tienen una nutrición simple, pudiendo utilizar el NO3- o el NH4+ como fuentes de nitrógeno. Muchas cianobacterias son fijadoras de nitrógeno y la mayoría son fotótrofas estrictas. Las hay que asimilan compuestos reducidos de carbono (CRC) y otras que respiran azúcares. Finalmente muchas de ellas producen neurotoxinas y geomina (olor a tierra húmeda).

Ecología y filogenia: Las cianobacterias son universales y toleran los ambientes extremos. Pueden vivir tanto en la superficie como en el interior de las rocas y forman grandes desarrollos (Blooms) en océanos o lagos ricos en nutrientes (contaminados) y pueden vivir en simbiosis liquénica.
El porcentaje de guaninas y citosinas es amplio, rondando el 35 al 71% en las unicelulares. Se agrupan filogenéticamente por morfología, excepto las unicelulares que son muy variables.

Las Proclorofitas: Son unos organismos similares a los cloroplastos y a las cianobaterias y filogenéticamente relacionadas con ellas. Son fotótrofos oxigenicos con clorofilas a y b, pero no poseen ficobilinas. Algunos ejemplos de Proclorofitas son los siguientes:

-Prochloron: Son simbiontes de invertebrados marinos, de 8-10 micras de tamaño, poseen tilacoides y carotenoides (como las cianobacterias) y son Gram negativas con cubierta de ácido murámico.

-Plochlorotrix: Son microorganismos filamentosos, con tilacoides poco desarrollados y con proporción de Clorofila a y b de 8 a 1 respectivamente. Son difíciles de obtener en cultivo puro en laboratorio.

-Prochlorococcus: Se encuentran en concentraciones elevadas en los océanos (del orden de 10^5-10^5 c/ml). Su proporción de clorofilas a y b es de 1, aunque su Clorofila a es de un tipo modificado llamado divinil Clorofila a. También tienen α-carotenos.

Relación entre Prochlorofitas y los Cloroplastos: Las prochlorifitas tienen un espectro idéntico al de las clorofilas. Remontándonos a la teoría endosimbiontica de los cloroplastos, cabe pensar que las Prochlorofitas podrían ser el descendiente directo de los cloroplastos no endosimbiónticos, aunque quedaría por determinar el origen de la clorofila b. Según la filogenia actual, el origen es común, aunque el ancestro común aun sea desconocido.

Phlyllum 10: Bacterias verdes del azufre (BVS):
Las bacterias verdes del azufre son bacterias fotosintéticas anoxigenicas y por lo general no tienen otro sistema de obtención de energía, aunque las hay fotoheterótrofas y fotoautótrofas (que no tienen ciclo de calvin sino CAT-1). Usan el H2S como poder reductor, y el azufre es adquirido del exterior. Son morfológicamente diversos y se encuentran en lagos meromicticos y allí donde hay bacterias rojas del azufre, aunque estas toleran peor el H2S que las bacterias verdes del azufre y por tanto las BVS pueden vivir en el fondo de los lagos.
Las especies modelo son Chlorobium tepidum y Chlorobacilum tepidum.

Las BVS pueden formar consorcios de asociación con otros microorganismos como quimioorganótrofos o epibiontes de las bacterias verdes del azufre:
-Chlorochromatium aggregatum: Se encuentra en relación 12/1 y crece en el laboratorio. Se tiñe con sondas específicas para BVS y tienen un control de posición en columnas de agua.
-Pelochromatium roseum: Se encuentra en relación 20/1.

Phyllum 13: Bacterias verdes no del azufre (BVNS):
Tienen miembros fotótrofos y quimiótroffos y en general son termófilos. Las dos generos modelo son:
-Thermomicrobium: Que es quimiótrofo, aerobio estricto y con unos lípidos que son distintos (1,2 dialcoholes).
-Chloroflexus: Que es filamentoso, forma tapetes densos y es un hibrido entre las bacterias rojas del azufre (CdR) y las bacterias verdes del azufre (Chlorosomas). Fisiologicamente se parecen a las BRS, crecen mejor en caldos de cultivo con compuestos reducidos de carbono (CRC) (Fotoheterótrofos), respiran anaerobiamente CO2 y c. hidroxipropionato.

Tema 13: La Quimiolitotrofía:

La quimiolitiotrofia es el uso de compuestos inorgánicos como dadores de electrones (respiración) y muchos de ellos son autótrofos (transporte inverso de electrones).

Las bacterias nitrificantes utilizan fuentes de nitrógenos reducidas como el amoniaco o el ion amonio. Su filogenia es poco coherente, teniendo 4 o 5 subdivisiones de proteobacterias (α, β, γ, δ) y el Phyllum Nitrospira. Morfológicamente son muy variables.
La nitrificación requiere de dos microorganismos, uno que primero oxide el amonio a nitroso, que aun no se han encontrado y que es extraño dado que el nitroso es toxico, y otro segundo que oxide el nitroso a nitrito.
La estructura de las membranas es compleja debido al medio en que se encuentran, y también disponen de enzimas especiales como la amonio monoxigenasa y la nitritooxidasa. La mayoría solo pueden obtener energía mediante la quimiolitotrofía aerobia. Se encuentran en suelos y aguas donde descomponen proteínas.
En laboratorio se pueden obtener en caldos de cultivo de enriquecimiento a base de sales minerales, amoniaco o NO2- y HCO3- como fuente ce carbono.
Algunos géneros representativos son:
-Nitrobacter: que también es qimioorganótrofo y tiene acetato o piruvato (E y C).
-Nitrospira: que no tiene membranas internas y comparte su hábitat con las bacterias púrpuras.
-Anamox: que dispone de oxidación anaerobia del ion amonio. Pertenece al Phyllum Planctomycetes y no son ni Gram positivas ni negativas (no tienen peptidoglicanos). Sus compartimentos internos están separados por membranas (anaxosomas), que no es común en procariotas, además de que tienen una estructura nuclear similar al de las eucariotas. Se piensa que por todo ello podría ser el eslabón perdido del tránsito de las procariotas a las eucariotas.
Se encuentran sobre todo descontaminando ríos y océanos (Brocadia anamoxidans).

Procariotas oxidadoras del hidrógeno:
Tienen gran diversidad filogenética y taxonómica:
-Phyllum 1: Proteobacteia (α, β y γ)
-Phyllum 2 y Phyllum 3: Gram positivas
-Phyllum 15: Aquifex
-Arqueas: Crenarchaeotas (Sulfolobus) y euryarchaeotas (methanococcus)

En general son aerobios, aunque crecen mejor en condiciones de microaerobiosis, debido a que tienen enzimas con cofactores metálicos sensibles al oxigeno y al Ni, y algunos fijan nitrógeno (anaerobias). Tienen distintos tipos de deshidrogenasas y la mayoría de los microorgamisnos son quimiolitótrofos facultativos con versatilidad de sustrato (CRC, derivados del azufre y amoniaco).
El hidrogeno puede seguir la via respiratoria para producir ATP, pero también puede reducir NAD+ y NADH+H+ y entrar en el ciclo de calvin (intracelular y soluble).

Algunos microorganismos crecen con CO2 y son carboxidotróficas y autótrofas (ciclo de calvin). Estos microorganismos tienen una importancia homocéntrica ya que eliminan el monóxido de carbono. Tienen respiración anaerobia (NO3-) y pueden crecer quimioorganotroficamente. Son taxonomicamente heterogéneas.

Procariotas oxidadoras de azufre:
Son filogenéticamente muy extendidas, dividiéndose en dos grandes grupos, según vivan a pH neutro o pH ácido:
-Proteobacterias: α y β Thiobacillus, γ Acidithiobacillus y ε Thiovulum
-Crenarchaeotas: Sulfolobis, Acidianus, Metallosphaera

Tienen gran versatilidad de sustratos, pudiendo usar H2S, MS, S, S2O3(2-), SO3-. Son quimiolitoautótrofas, mixótrofos (energía del azufre y carbono de los CRC) y utilizan el carboxisoma (ciclo de calvin). Son difíciles de cultivar ya que son inhibidos por la presencia de acidos orgánicos, aunque A. ferroxidans ha sido cultivado con éxito oxidando azufre y Fe2+ y pirita (FeS2), por lo que es de interés en la biominería.

-Acidithiobacillus (Thiobacillus) es de gran interés en minería. Es un Gram negativo de forma bacilar, acidófilo y de filogenia coherente en las γ Proteobacterias.

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