TEMA 1.- INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO

1.- FUNCIÓN

La función del laboratorio de análisis clínicos es efectuar determinaciones analíticas cualitativas y cuantitativas de líquidos orgánicos como sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, etc, así como heces y otras sustancias.

2.- PELIGROS Y ACCIDENTES EN EL LABORATORIO

a.- Incendio o explosión

Ocurre cuando se utilizan solventes inflamables o sus vapores. Ej. Alcohol, éter, tolueno, etc. Se deben manipular todos los solventes inflamables o vapores alejados de llama directa o chispa.

b.- Ácidos y Bases fuertes

• Destruyen rápidamente tejidos produciendo cicatrices.

• Nunca pipetear con la boca.

• Siempre se añadirá el ácido o la base sobre el agua, lentamente y agitando con frecuencia utilizando vidrios resistentes. Si se realiza el agua sobre el ácido o la base, se produce una reacción exotérmica que puede llegar incluso a explotar.

• Los vapores de amoniaco son irritantes y pueden dañar ojos y pulmones.

c.- Oxidantes fuertes

Como por ejemplo H2O2, ac. perclórico, ac. crómico, dicromato potásico, etc.

d.- Compuestos venenosos

Como ac. perclórico, ac.crómico, dicromato potásico, metanol, cianuro, arsénico, Hg, Pb, I, Ba, Zn, hidrocarburos, derivados del petróleo, aminas aromáticas,etc.

El I y Hg son compuestos venenosos que en bajas concentraciones no son perjudiciales para el organismo y pueden ser utilizados como antiséptico.

Todos los reactivos hay que manejarlos con mucha precaución para evitar daños en piel y ojos.

e.- Quemaduras y Escaldaduras. Choque eléctrico

Quemadura: daño en los tejidos producido por un sólido.

Escaldadura: daño en los tejidos producido por líquidos o vapores.

Medidas de Seguridad

• Atención (descuido, rapidez)

• Extintor manual

• Contaminación

• Vacunar al personal del laboratorio con gammaglobulinas

• No pipetear con la boca. En caso de pipeteados accidentales enjuagarse con agua y/o profilácticos.

• Botiquín de urgencias

3.- CAUSAS DE ERROR EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICOS ( ojo cae en examen)

A.- Debido al paciente

• Error en la identificación

• Error en la petición

• Preparación del paciente

Variaciones individuales

Toma de alimentos

Hora del día al realizar las analíticas

Posición del cuerpo al realizar las analíticas, ya que puede haber variaciones de parámetros, como por ejemplo las proteínas debido a la variación existente entre el líquido intra y extracelular en distintas proporciones.

Medicamentos que tomen los pacientes

• Recomendaciones:

estar sentado

en ayunas

mañanas de 7-9 horas

B.- Debido a la muestra

• Extracción de la muestra.

No deben utilizarse recipientes contaminados

El paciente debe estar en reposo

Cuando se vaya a realizar una extracción de sangre el éstasis no sea muy prolongado

No hemólisis en la muestra

• Transporte de la muestra. Hay que tener en cuenta:

Temperatura de la muestra

Protección frente a la luz

Tiempo (lo más rápido posible y no pasar más de 2 horas desde la toma de la muestra hasta que llega al laboratorio)

• Separación de la muestra

• Conservación de la muestra

Evitar la contaminación

Luz

Evitar posible evaporación de la muestra

Evitar pérdida de su estabilidad

C.- Determinación

• Método analítico. Los más adecuados son los que sean más específicos a la hora de determinar una sustancia, generalmente son los enzimáticos.

• Errores técnicos

• Medio ambiente

• Error instrumental

Mal funcionamiento del aparato

Mal uso del instrumental

Reactivos

Pipetas

Espectrofotómetros

Tiempo y temperatura

D.- Procesos de Datos

• Tener en cuenta las prediluciones

• Trabajar con unidades concretas

E.- Resultados

• Tener en cuenta las prediluciones (multiplicar por inverso de dilución)

• Trabajar con unidades concretas

• Errores en la coma

TEMA 2.- INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA

La microbiología es una disciplina que estudia la biología de los microorganismos. Los microorganismos son seres vivos cuya característica común es que para su visualización es necesario utilizar el microscopio.

Los microorganismos se agrupan en el reino de los protistas, las creación de este nuevo reino se debe a Haeckel (1866), discípulo de Darwin que ante la polémica de la época que incluía a unos microorganismos en el reino animal y otros en el reino vegetal , sugirió que había microorganismos que distan mucho de parecerse a los animales o a los vegetales y eran considerados una cosa u otra según la corriente del momento, por eso Haeckel sugirió el nuevo reino para agrupar a los protozoos, bacterias, algas, etc.

El reino de los protistas es muy heterogéneo, son unicelulares y lo más característico que lo diferencia esencialmente de los animales y vegetales es que no presenta diferenciación interna, es decir, no hay diferenciación celular ni mucho menos especialización celular en tejidos.

Mientras las células microbianas son capaces de crecer y reproducirse como seres aislados, los animales y vegetales no son capaces de vivir solos sino en grupo.

En el reino de los protistas se aprecian claramente dos grados de evolución, cuya diferencia fundamental radica en la estructura nuclear:

• Procariotas: no tienen estructura nuclear definida. Ej: bacterias.

• Eucariotas: si tienen estructura nuclear definida. Ej: hongos, protozoos.

Otros autores hablan de un tercer grupo que se denomina Acariota, en este grupo incluyen los virus.

1.- IMPORTANCIA Y APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGÍA

La microbiología la podemos clasificar desde distintos puntos de vista:

Taxonómico

• bacteriología

• viriología

• microbiología

• fitología (algas)

Ecológico

• del suelo

• de las aguas

• de la leche

• etc.

Aplicado

• Agrícola

• Industrial

• Clínico

2.- BACTERIOLOGÍA CLÍNICA

Estudia las bacterias que pueden causar infecciones en el hombre.

Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan una estructura relativamente sencilla y que se incluyen en el reino de los protistas subgrupo procariota.

CARACTERÍSTICAS DE LAS BACTERIAS.

1.- Tamaño y forma

- Tamaño:

Las bacterias miden 0,5 - 1m de diámetro y de 2 - 5 m de longitud.

De las más pequeñas esta el micoplasma con 0,125 - 0,250m de diámetro ( no visible al microscopio óptico).

De las más grandes es la Espiroqueta que puede llegar a 500m de longitud, pero con un diámetro de 0,1 - 0,2m ( no visible al microscopio óptico por ser demasiado fina).

- Formas:

Las bacterias pueden ser:

Cocos: son esféricos y exponen menos superficie al exterior distorsionándose menos. Suelen ser más resistentes a la desecación. La relación superficie/volumen es pequeña.

Bacilos: tienen forma cilíndrica rectangular, aparece mayor superficie al exterior. La relación superficie/volumen es mayor que la anterior. Tienen un metabolismo muy rápido.

Espirales: son adaptaciones al movimiento, avanzando con mayor facilidad. Tenemos:

• Vibrios: tienen media vuelta de hélice.

• Espirilos: tienen más de una vuelta de hélice y son rígidos.

• Espiroquetas: que se pueden confundir con los espirilos ya que tienen más de una vuelta de hélice, pero son más flexibles.

Otras formas:

• bacterias estrelladas.

• Bacterias penduladas.

• Bacterias con forma filamentosa.

• Bacterias con forma ramificada.

Cuando se dividen las bacterias pueden quedarse unidas, esto da lugar a una serie de agrupaciones. Estas dependen de:

• que la bacteria tenga cápsula, ya que va a impedir que se separe.

• que la bacteria sea móvil o inmóvil. Las bacterias móviles tienden a separarse y las inmóviles a juntarse.

• los planos de división.

Las agrupaciones más frecuentes en cocos son:

Diplococos, un único plano de división. Las bacterias aparecen unidas de dos en dos y su morfología puede variar.

Estreptococos, se dividen en un único plano formando cadenas.

Estafilococos, se dividen según dos planos de división. Algunas quedan unidas y otras sueltas, dan lugar a agrupaciones irregulares (racimo de uvas).

Lampropedia, se dividen según dos planos y permanecen unidas siempre, formándose una especie de tableta.

Sarcina, se dividen según tres planos de división, formando una agrupación en forma de cubo.

Las agrupaciones de bacilos más frecuentes son:

Estreptobacilos, son bacilos en cadena.

Otros casos:

*pendulares

*empalizadas

2.- Estructura

Se comparan células procariotas y eucariotas. Las células eucariotas tienen núcleos definidos mientras que la procariotas no tienen núcleo definido.

	PROCARIOTA	EUCARIOTA
M. Nuclear	No	Si
Nucléolo	No	Si
ADN	Una molécula no asociada a proteínas	Varios cromosomas constituidas por ADN y proteínas
División	No mitosis	Si mitosis
Reproducción Sexual	No meiosis	Si meiosis
Composición	No esteroles	Si esteroles
Formaciones Membranosas	Son invaginaciones de la membrana plasmática	Tienen retículo endoplásmico, Ap.Golgi
Ribosomas	Son 70 S	Son 80 S
Órganos de Membrana Simple	Están ausentes	Están presentes vacuolas, lisosomas…
Respiración	Lo poseen en parte de la membrana plasmática	Son órganos específicos para la respiración como las mitocondrias
Aparato Fotosintético	Aparecen vesículas en continuidad de la membrana plasmática	Tienen órganos especializados: cloroplastos
Flagelos	Simples	Complejos formando subunidades de 9+2
Movimiento no flagelados	Movimiento deslizante	Movimiento no deslizante y ameboide
Microtúbulos	Probablemente están ausentes	Movimientos extendidos

ESTRUCTURA BASICA DE FUERA A DENTRO

1.- CAPSULA: puede existir o no.

2.- PARED

3.- MEMBRANA: por debajo de la cual puede existir o no flagelos.

4.- CITOPLASMA: se encuentra hacia el exterior, contiene gran cantidad de ribosomas. El material nuclear es un filamento formado por una maneja sin principio ni fin. No hay cromosomas.

5.- ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS NO FOTOSINTETICAS: cuerpos laminares, lisosomas y vacuolas.

6.- ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS FOTOSINTETICAS: son equivalentes a los cloroplastos y se denominan tilacoides, pueden ser laminales, vesicales y tubulares.

7.- INCLUSIONES CON DISTINTAS SUSTANCIAS:

a) poli--hidroxibutilico que son sustancias de reserva carbonada.

b) glucógeno: reserva de hidratos de carbono.

c) bolutina: reserva de fósforo y cobre.

1.- CÁPSULA

Algunas bacterias poseen hacia el exterior una envoltura constituida por sustancias mucosas ricas en agua denominada cápsula. La cápsula es cuando esta sustancia tiene un espesor de 0.2 micrómetros y si está en menor cantidad se habla de capa mucosa.

Este material lo sintetiza la propia bacteria y se pone de manifiesto mediante tinción negativa con Ac específicos ya que la cápsula tiene poder antigénico.

Si observamos al microscopio óptico (m.o.) las cápsula es mucho más refringente, lo que se denomina hinchazón de la cápsula o Reacción de Quellus.

La formación de la cápsula no e característica de especie (sp) pudiendo existir en cepas. La cápsula no es una estructura básica, es facultativa, puede o no estar presente, y se puede eliminar por medios enzimáticos.

Composición química

En general, la cápsula esta compuesta por polisacáridos, aunque puede haber polipéptidos y complejos polisacárido-proteína.

Ejemplo:

• Estreptococo neumoniae, tiene una naturaleza polisacárida a base de glucosa y ácido glucurónico formando ácido celobiurónico.

• Estreptococo pyógenes, tiene en su capsula ac. glucurónico y N-acetilglucosamina que dan lugar al ac. hialobiurónico.

Funciones

Bacterias patógenas

• protección frente a fagocitosis

• contribuye a aumentar su virulencia

• si el animal está inmunizado frente a la cápsula, posee Ac. anticapsulares y la bacteria puede ser fagocitada

Bacterias no patógenas

• protección de la ingesta de protozoos

• protección frente a la infestación de bacteriofágos

Otras funciones

• protección frente a la desecación

• captación de cationes mediante restos carboxílicos libres (COO-)

• adherencia al medio formando rosetas

La cápsula está unida a la pared, y esta unión puede ser por medio de enlaces iónicos, enlaces covalentes, puentes de H y fuerzas de Vander-Walls.

2.- PARED

Está fuera de la membrana plasmática y aparece n todas las bacterias a excepción del micoplasma. Su composición química es original y las bacterias con pared se dividen en dos grupos: gram + y gram -, denominación que procede de la respuesta frente a la Tinción de Gram.

Desde el punto de vista de la composición química, las bacterias gram + retienen el colorante cristal violeta mientras que en las gram - el colorante es eliminado.

Desde el punto de vista de la estructura física si damos un corte y observamos al microscopio electrónico:

• las bacterias gram + por fuera de la membrana plasmática aparece una capa gruesa y compacta de 150 a 800 amstrongs.

• las bacterias gram - fuera de la membrana plasmática aparece una capa estratificada de 100 amstrongs.

Composición química

Está formada por mureína, glicopéptidos y peptidoglucanos. Es importante tener en cuenta que la mureína sólo aparece en la pared bacteriana ( podemos utilizar antibióticos inocuos para el hombre ( las células humanas no tienen pared y por tanto el antibiótico no las daña)).

Ejemplo: en E.Coli existe en la mureína una serie de cadenas polisacáridas derivadas de N-acetilglucosamina y N-acetilmuránico.

En la pared también pueden aparecer ac. teicoicos, estos se encuentran en la pared de las bacterias gram + y no existen en las gram -. Estos ácidos son polímeros de polialcoholes fosfatos, los más importantes son:

• glicerol teicoico

• ribitol teicoico

Los OH libres de los ac. teicoicos se sustituyen por distintos radicales como N-acetilglucosamina, alanina, etc.

Para la síntesis de los ac. teicoicos es necesario fósforo en el medio, si no lo hay estos ácidos son sustituidos por los ácidos teutónicos formados por: ac. teurónico y N-acetilgalactosamina.

Son compuestos cargados negativamente con carácter ácido que sirven para captar cationes y proporcionando un ambiente de carga necesaria para la actividad enzimática. Tienen función en el crecimiento de la pared, tienen carácter antigénico y son receptores para fagos (virus)

En la pared también se encuentran lipopolisacáridos que se encuentran en las bacterias gram -. Son moléculas complicadas desde el punto de vista químico y presentan una parte lípidica y una sacárida. Se denominan Ag 0 (somáticos)

Otro componente de la pared son las lipoproteínas apareciendo solo en las bacterias gram -.

Las proteínas se encuentran en gram + y gram - y tienen una función degradativa, como ribonucleasas o desoxiribonucleasas, aunque algunas no son degradativas como las isomerasas.

Las proteínas degradan los compuestos grandes que no pueden atravesar la membrana. Las bacterias producen las proteínas que degradan los polímetros en monómeros. No todos los monómeros pueden ser transportados, actuando las isomerasas las cuales transforman los monómeros en isómeros.

3.- MEMBRANA

Es un elemento obligado. Está situada debajo de la pared, se cree que íntimamente adherida a la pared debido a la existencia de una elevada P osmótica que la empuja hacia la pared.

Presenta lo que se conoce como unidad de membrana, que es la presencia de dos capas densas envolviendo a una capa clara con un espesor de 75 amstrongs.

Composición química

Su composición química global es igual a la de la membrana de las células eucariotas, 40% lípidos y 60% proteínas, aunque existen diferencias en el detalle del análisis químico, por ejemplo: en la membrana de las bacterias hay ac. grasos ramificados, existe ciclopropano y es raro encontrar lecitina.

La función de los lípidos de membrana son:

• estructural

• intervenir en procesos de biosíntesis

La función de las proteínas de membrana son:

• estructural

• tienen enzimas con acción dirigida al citoplasma

• enzimas que participan en la síntesis de la pared

• permeasas

• actividad ATPasa

Funciones de la membrana

• Mantenimiento osmótico de la célula que regula el paso de sustancias de un lado a otro. Este paso de sustancias puede ser a favor de gradiente o en contra de gradiente requiriendo un gasto de E.

• Interviene en el metabolismo oxidativo y en la producción de E.

• Participa en la división celular, en la duplicación del material genético y síntesis de la nueva pared.

4.- ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS

Se les denomina tilacoides porque son similares a los tilacoides de las plantas, y pueden ser tubulares, vesicales y laminares.

Son invaginaciones de la membrana plasmática igual que le mesosoma.

Pueden crecer en condiciones de anaerobiosis si las ponemos en condiciones anaerobias y si se aplica cierta cantidad de luz aparecen vesículas en la periferia siendo muy numerosas.

5.- CITOPLASMA

No presenta gránulos membranosos independizados. La mayor parte de sus componentes están en estado soluble. El citoplasma está lleno de ribosomas (síntesis de proteinas) estando libres y no unidos a la membrana como en las cels. eucariotas.

Se puede encontrar distintos pigmentos como piocianina (azul), pioverdina (verde), prodigiosina (rojo) y violacina (violeta).

6.- RIBOSOMAS

No se obtienen ribosomas aislados sino polirribosomas. Para obtener ribosomas aislados tratamos el polirribosoma con ribonucleasa y también con actinomicina-D. Si se hace en presencia de Mg se obtienen las dos subunidades del ribosoma, la 30s y la 50s. Su composición química es ARN y proteínas.

7.- INCLUSIONES CITOPLASMÁTICAS

Las bacterias pueden presentar en su citoplasma distintas inclusiones que son generalmente sustancias de reserva y se suelen formar cuando hay un desequilibrio nutricional en el medio.

Las inclusiones son:

a.- Glucógeno: en el medio hay muchos carbonos en forma de azúcares capaces de dar glucosa, que por medio de la glucogénesis da glucógeno. Estas inclusiones no tienen morfología diferenciada al observarlas al microscopio electrónico como ocurre con los animales. Al microscopio ótico el glucógeno no se ve pero puede ponerse de manifiesto cuando la bacteria tiene una alta concentración de glucógeno mediante tinción con lugol ya que se tiñe de color pardo-rojizo.

b.- Bolutina: su principal constituyente es el fósforo. Desde el punto de vista químico son fosfatos polimerizados, también pueden encontrarse otros constituyentes en menores proporciones. Pueden llegar a constituir el 50% de los fosfatos de reserva en la célula.

c.- Poli-beta-hidroxilbutílico: es una reserva de carbono que se sintetiza cuando la fuente de carbono es acetato o compuestos que se degradan en acetato.

d.- Azufre: la acumulan dos tipos de bacterias:

• sulfooxidantes: capaces de oxidar compuestos de azufre para obtener E.

• fototrofas: emplean compuestos de azufre como dadores y aceptores de electrones en la fotosíntesis.

e.- Cristales paraesporales: se forman en bacterias esporuladas. Desde el punto de vista químico son proteínas de estructura cristalina muy compacta y brillante al microscopio óptico. Su significado funcional no se conoce y tiene relación con la esporulación.

8.- MATERIAL NUCLEAR

Se habla de material nuclear y no de núcleo ya que no tiene envoltura nuclear, por lo que no hay separación entre núcleo y citoplasma. No se puede ver al microscopio óptico( M/O), para ver el material nuclear se recurre a técnicas especiales, como la técnica de Feulgen que consiste en hacer una hidrólisis ácida sobre los ácidos nucleicos.

La duplicación del cromosoma bacteriano se caracteriza por:

ser semiconservativa, el material nuclear esta constituido por dos cadenas de ADN a partir de la doble hélice. Cuando se produce la duplicación cada cadena sirve de molde para la síntesis de su complementaria.

sólo tiene un origen de duplicación.

Es discontinua, la cadena no se sintetiza continuamente sino en pequeños fragmentos denominados de Okazoki que posteriormente son soldados.

Es bidireccional, ya que crece en dos direcciones.

En la duplicación cromosómica es necesario la participación de enzimas, como:

• enzimas desenrollantes, cumplen la función de desenrollar la doble hélice para que cada cadena sintetice su complementaria.

• ARN polimerasa, ya que el ADN no se puede biosintetizar sin obtener un pequeño fragmento de ácido nucleico al que se añade.

• ADN polimerasa, que se va añadiendo al ARN cebador.

9.- ADN EXTRACROMOSÓMICO

Pequeños fragmentos de ADN pueden estar libres y duplicarse de forma autónoma , se les denomina plásmidos o bien estos pequeños fragmentos de ADN que están libres pueden integrarse en el cromosoma bacteriano y duplicarse al mismo tiempo que el cromosoma y se les denomina episoma.

Dentro de los plásmidos tenemos distintos ejemplos:

1º- Factor R o RTF (Factores de Transferencia a la Resistencia): son factores que transfieren resistencia antimicrobiana, son frecuentes. Ej: bacterias que tengan plasmido penicilasa.

2º- Factor F o factor sexual: codifican para la síntesis de una estructura de la superficie de la bacteria denominada Pili sexuales, permite que en unas bacterias se de la conjugación.

A las cepas que presentan el factor F se las denomina F+ o machos, ya que cede su material genético. Las cepas que carecen del factor F se las denomina F- o hembras.

10.- ESPORAS

Se tratan de estructuras presentes en algunas bacterias bacilares que pueden estar en el interior de la bacteria (endoespora) o permanecer libre. Son formas de resistencia y son capaces de soportar durante tiempos elevados temperaturas de 60- 80 ºC, esta temperatura no la soporta una bacteria normal. Las más resistentes pueden resistir 120ºC durante 10 minutos.

Son visibles al M/O, la forma y posición de la espora en el interior de la bacteria es característica taxonómica a la hora de clasificar las bacterias esporuladas.

El tamaño es importante y se pueden clasificar en :

esporas no deformantes, son aquellas que su diámetro es inferior a la célula vegetativa. En función de la posición en que se encuentra la espora tenemos:

• Espora en posición central.

• Espora en posición subterminal.

• Espora en posición terminal.

esporas deformantes, son aquellas en las que su diámetro es mayor que la célula vegetativa.

Las bacterias esporuladas son un pequeño grupo de géneros, los más importantes son :

• Bacillus, son aerobios.

• Clostridium, son anaerobios.

Estructura de las esporas

De dentro hacia fuera encontramos:

1. Citoplasma con material nuclear.

2. Membrana plasmática.

3. Pared.

4. Por fuera aparece una capa gruesa propia de la espora llamada Cortex (corteza) que da resistencia.

5. Aparecen dos túnicas ( intima y exina) o más que son más resistentes a los agentes físicos y químicos.

6. Puede haber una última capa de contorno irregular llamada exosporio (sólo en algunas especies).

A la bacteria que produce la espora se la denomina célula vegetativa o esporangio.

Se denomina esporulación al fenómeno por el cual una bacteria vegetativa produce una espora al ser las condiciones del medio adversas.

Se denomina gemación al proceso por el cual de una espora surge una bacteria al volver a ser favorables las condiciones para el germen.

11.- FLAGELOS

La mayoría de las bacterias móviles deben ésta a apéndices filamentosos denominados flagelos, cuya longitud es igual a 10 - 20m y su diámetro a 10 - 20nm.

No son visibles al M/O por su pequeño diámetro .

Según el número y posición de los flagelos en la bacteria se clasifican en :

Monotriticas, un flagelo en el polo.

Politriticas o L ofotriticas, varios flagelos en el polo.

Anfitrícas, varios flagelos en ambos polos.

Peritricas, varios flagelos alrededor de la bacteria.

Los flagelos tienen naturaleza proteica. Al observarlos al M/E se distinguen tres partes:

Filamentos, constituidos por una cadena proteica denominada flagelina (diferente en cada especie). Tiene carácter antigénico y se denomina Ag h o Ag flagelar.

Gancho, es un engrosamiento constituido por proteínas globulares.

Cuello o cuerpo basal, con dos parejas de cilindros y proteínas diferentes.

12.- FIMBRIAS, PILIS O PELOS

Son apéndices filamentosos similares a flagelos, aparecen en la superficie de algunas bacterias , son móviles e inmóviles y no tienen nada que ver con el movimiento y son más finos que los flagelos, longitud 0,5 - 2m y diámetro 7 - 8nm. No son visibles al M/O.

Puede haber distintos tipos de pilis según el grosor: pili I, pili II, pili III, pili IV, pili V. Una bacteria puede tener varios tipos dentro de una misma especie.

Los pelos mejor conocidos son los de E. Coli, tipo I, en los que se ha aislado una proteína denominada pilina que son proteínas globulares con ordenación helicoidal o lineal. A las especies cuyas cepas no tienen pelos se las denomina calvas.

Función de los pelos

1º.- Adherirse al medio donde vive, en superficies inertes o células de animales.

2º.- Las cepas con pelos poseen una actividad respiratoria mayor que las cepas sin pelos.

Existen unos pelos especiales (pilis sexuales) que determinan presencia de material genético extracromosómico (Factor F) su función es actuar como conducto de material genético de una bacteria F+ a una F- . La proteína es distinta de los pelos normales y se denomina pilina F.

13.- GLICOCÁLIX

Es una masa de fibras constituida por polisacáridos que rodean a una o varias bacterias (posición extracelular). Gracias a él las bacterias pueden unirse a distintas superficies, como piezas dentarias, etc.

Sus funciones son :

• De adherencia.

• Concentra enzimas líticos.

• Almacena y canaliza alimentos.

• Protege a la bacteria de los fagocitos.

• Interfiere en la respuesta inmune.

3.- Tipo de reproducción bacteriana

La principal forma de reproducción bacteriana es binaria o asexual, esta división requiere la duplicación de todos los constituyentes necesarios y el reparto de todos en las células hijas.

La 1ª etapa es la separación de las cadenas de ADN y replicación de cada una para dar dos cromosomas más que se repartirán entre las dos células hijas, luego se forma un tabique transversal asociado al mesosoma que separa las dos células que se origina. Los dos cromosomas hijos emigran a uno de los polos así como los orgánulos más importantes. También puede haber una reproducción bacteriana pero menos importante a partir de la gemación (más típica en hongos)

% Mecanismo de intercambio genético:

Tiene lugar principalmente por división binaria. Tiene como principal inconveniente la falta de material genético, por ello la única posibilidad de que la bacteria evolucione:

Variación en el fenotipo: relacionado con las condiciones del medio ambiente. El genotipo no se altera, es reversible y no hereditario.

Mutación: se altera el genotipo, son irreversibles y hereditarias.

Transferencia: se produce cuando un fragmento de ADN (plásmido) procedente de una bacteria pasa a otra.

Existen tres tipos de trasferencias:

transformación: la bacteria receptora capta ADN que se encuentra presente en el ADN después de haber sido liberado por la bacteria donante.

congujacion: se transfiere el plasmido por medio de un contacto físico entre dos bacterias a través de pilis sexuales.

Traducción: transferencia de ADN por medio de bacteriófagos (virus).

% Crecimiento bacteriano:

La principal función de cualquier bacteria es el crecimiento considerando este un aumento de número o masa de todos los componentes celulares.

La medición del crecimiento se realiza inoculando un medio líquido con la bacteria y estudiando la concentración celular en cada momento. De esta forma comparando el número de células vivas/ml a lo largo del tiempo se obtiene la curva de crecimiento, en la que se distinguen las siguientes fases:

1ª) fase de latencia: las bacterias inoculadas se adaptan al nuevo medio, no se observa crecimiento.

2ª) fase exponencial: la masa bacteriana aumenta como consecuencia de la multiplicación bacteriana.

3ª) fase estacionaria: a medida que se agotan los nutrientes y aparecen productos tóxicos de materia celular, el crecimiento se endentece pero existe un equilibrio que mantiene constante el número de células.

4ª) fase de declive: la tasa de mortalidad aumenta y el crecimiento se endentece por disminuir nutrientes el número de bacterias viables disminuye hasta casi cero.

El tiempo que un cultivo bacteriano necesita para completar este ciclo depende del tiempo de generación de cada especie (tiempo para que cada célula de lugar a dos células hijas). Este tiempo de generación es de 20-30 minutos encontradas con frecuencia en patología humana por lo que la curva se completaría en 18-24h.

El crecimiento bacteriano también se puede simular en aparatos del laboratorio denominados quimiostatos y túrbidostatos, ambos aparatos se basan en añadir medio fresco en un cultivo a medida que eliminamos igual volumen que el cultivo viejo.

4.- Nutrición Bacteriana

Para que una bacteria se desarrolle adecuadamente es necesario que el medio disponga de:

% De una fuente carbonada a partir de glúcidos, lípidos y cetoacidos.

% Una fuente de nitrógeno que se consigue a partir de proteínas, péptido y aminoácidos.

% Fuente de fósforo a partir de fosfatos inorgánicos.

% Metabolitos esenciales obtenidos de la degracion de alimentos y formados en el interior de las bacterias gracias a reacciones metabólicas que dan lugar a g-6-p.

% Factores de crecimiento que las bacterias no pueden producir F.V y F.X.

% Factores estimulantes que no son imprescindibles pero aligeran el procedimiento.

Las bacterias pueden obtener la energía de dos formas:

Energía radiaciones solares (fototrofas)

Reacciones químicas (quimiotrofas).

En cuanto al poder sintetizante de cada bacteria, tiene una distinta capacidad para sintetizar glucidos, lípidos y proteínas a partir de elementos sencillos como agua, CO2… dependiendo de esta capacidad podemos distinguir:

Bacterias autótrofas: gran poder de síntesis (glucidos, lípidos y proteínas) obtienen energía a partir de materia inorgánica. Dentro de estas las podemos clasificar en:

% Estrictas: no pueden utilizar la materia orgánica.

% Facultativas: si pueden utilizar la materia orgánica.

Bacterias heterótrofas: poder de síntesis menor. Necesita obtener sus propios nutrientes (glucidos, lípidos, proteínas) a partir de materia orgánica.

5.- Metabolismo bacteriano

Cuando los nutrientes has entrado en la bacteria sufren transformaciones químicas que dan lugar a la síntesis de materia bacteriana. A estas reacciones se les denomina metabolismo, el cual se divide en tres etapas:

Catabolismo: conjunto de transformaciones que sufre la materia asimilada por las bacterias hasta llegar a degradarse en componentes más sencillos y producir energía necesaria para que la bacteria pueda sintetizar sus propios nutrientes. La energía se almacena en forma de ATP.

Anfibolismo: los metabolitos intermedios se transforman enzimaticamente en componentes básico como aminoácidos, bases nitrogenadas. También se puede obtener energía y almacenar en forma de ATP.

Anabolismo: síntesis de macromoléculas de las bacterias. Aprovechando la energía obtenida en las fases anteriores. Las bacterias tienen un anabolismo sintetizado, hidratos, lípidos, proteínas, ADN, ARN, y 20 aminoácidos necesarios. (las células eucariotas no sintetizan los 20 aminoácidos).

Principales vías catabólicas: se pueden clasificar en función de las oxidaciones biológicas teniendo en cuenta la naturaleza del aceptor final del hidrogeno:

1º) Respiración aerobia: el aceptor final es el oxigeno.

2º) Respiración anaerobia: el aceptor final es un componente inorgánico distinto del oxigeno, Ej.: sulfato y nitrato…

3º) Fermentación: el aceptor final es un componente orgánico.Existen distintos tipos de fermentación:

Alcohólica: producto final es el CH3-CH2-OH y CO2.

Láctica: producto final es el acido láctico y el CO2 por contaminación de bacterias acéticas que pueden dar lugar a acido acético.

Propionica: CH3-CH2-COOH, CO2 y acido acético.

La fuente de obtención y utilización del oxigeno en los distintos microorganismo permite clasificarlos en los siguientes grupos:

Aerobios estrictos u obligados: deben utilizar el oxigeno como ultimo aceptor de electrón. Utiliza la respiración aerobia en su metabolismo.

Anaerobios estrictos u obligados: mueren o se inhiben ante la presencia utilizando la fermentación en su matebolismo.

Facultativas: pueden utilizar el oxigeno como aceptor final de electrones o alternativamente sales como son, NO3, carbonatos. Utiliza la respiración anaerobia.

Microaeroficos: son inhibidos por una partícula de oxigeno que es igual que atmosférica, crecen o lo hacen mejor con una concentración baja de oxigeno.

Anaerobios aerotolerantes: no requieren oxigeno ni son inhibidos o destruidos por el, utilizan matebolismo fermentativo.

TEMA 3.- CLASIFICACIÓN, TAXONOMÍA Y NOMENCLATURA BACTERIANA. BACTERIAS MÁS COMUNES, BACTERIAS DE LENTO CRECIMIENTO Y BACTERIAS ESPECIALES

1.- CLASIFICACIÓN, TAXONOMÍA Y NOMENCLATURA

Para clasificar las bacterias se hace colocándolas en distintos según sus características. Una bacteria pertenece a:

a.- Cepa. En ellas se encuentran organismos dentro de la misma especie con una cualidad determinada. Son organismos con la mayoría de sus características iguales.

b.- Serotipo o Serogrupo: Son organismos que difieren por la posesión de los mismos Ag siendo todos de la misma especie.

c.- Especie: Son organismos que tienen características biológicas iguales para todos.

d.- Género: Son un grupo de especies estrechamente relacionadas.

e.- Familia: Grupos de géneros estrechamente relacionados.

En la clasificación podemos distinguir:

• Reino

• Filo

• Orden

• Clase

• Familia

• Tribu

• Género

• Especie

• Cepa

• Serotipo

Ejemplo: Neisseria gonorreae IV

• Reino: Procariotas

• Filo: Bacteria

• Orden: Eubacteria

• Clase: Escotobacteria

• Familia: Neisseriaceae

• Género: Neisseria

• Especie: Gonorreae

• Cepa: IV

2.- BACTERIAS MÁS COMUNES

Cuadro de las fotocopias

3.- BACTERIAS DE LENTO CRECIMIENTO

Como vimos en la curva de crecimiento bacteriano, la mayoría de las bacterias crecen entre 18-24 horas, aunque hay algunas bacterias que su periodo de crecimiento es superior. (> 7 días). Ejemplo: Brucella y Micoplasma.

4.- BACTERIAS ESPECIALES

a.- Rickettsias

Son parásitos. Son cocobacilos pleomórficos, gram + que se presentan en cadenas o parejas y poseen pared celular rígidas. Son parásitos intracelulares. La infección es transmitida por vectores.

Generalmente el parásito vive en las células intestinales y la saliva de donde se trasmiten al hombre por picadura o agresiones en la piel.

b.- Clamidias

Son cocobacilos gram - con pared celular que se caracterizan por ser parásitos intracelulares. Es uno de los microorganismos patógenos de mayor difusión dentro del reino animal, ya que utiliza como huésped desde el hombre hasta artrópodos pasando por todos los animales peridomésticos.

En el género Clamidia hay muchas especies entre las que se destacan:

• Clamidia trachomatis (ETS)

• Clamidia neumoniae ( relacionado con enfermedades respiratorias)

• Clamidia psittachi (relacionada con enfermedades respiratorias)

c.- Micoplasma

Organismos procariotas gram - que carecen de pared celular, por lo que son muy pleimóficos y varían desde coco a filamentoso.

Su hábitat es muy amplio y puede multiplicarse en plantas, insectos o mamíferos. Entre los aislados en el hombre y productores de patología:

• Micoplasma neumoniae (infecciones respiratorias)

• Micoplasma hominis (ETS)

• Ureaplasma (ETS)

TEMA 4.- RELACIÓN HUÉSPED-PARÁSITO

• Parásito: Organismo que vive en otro organismo llamado huésped y le causa un daño

• Infección: La infección es la situación en la cual un microorganismo se introduce en el huésped y se desarrolla perjudicándolo o no. No es sinónimo de enfermedad puesto que una infección no siempre se traduce en daño para el huésped, incluso si el patógeno es potencialmente virulento.

• Enfermedad: Resultado de la interacción entre agente patógeno y huésped causando como consecuencia un daño en el huésped (modificación en el metabolismo celular, malestar, lesiones, etc. Las enfermedades infecciosas se clasifican según la facilidad de transmisión de un individuo a otro en:

a.- Enfermedades infecciosas contagiosas o transmisibles: se transmiten fácilmente por contacto directo o indirecto (besos, tos, toallas, cepillos de dientes). Ej. SIDA, gonorrea, sarampión, lepra, etc.

b.- Enfermedades infecciosas no contagiosas: No se transmiten fácilmente por contacto sino por inoculación directa. Ej. Tétanos.

• Virulencia: Capacidad de una cepa para producir enfermedad.

• Patogenicidad: Capacidad de un grupo de organismos para producir enfermedades; pueden existir especies patógenas que tengan cepas virulentas.

La Epidemiología se encarga de estudiar las enfermedades infecciosas y los factores que determinan su frecuencia y distribución en una población dada.

Desde el punto de vista etimológico:

• “epi” significa por encima o sobre

• “demos” significa pueblo

• “logía” significa tratado o ciencia.

En la Epidemiología es importante:

1º. Identificar el agente causal.

2º. Descubrir la fuente de infección.

3º. Buscar el mecanismo de infección.

4º. Buscar las características del huésped.

5º. Investigar la influencia del medio ambiente.

Para que se produzca las enfermedad infecciosa es indispensable que se cierre la cadena epidemiológica, la cual está constituida por tres eslabones:

Fuente de Infección: Pueden ser:

• Personas: pueden ser:

Persona enferma, es aquella que elimina los gérmenes durante un periodo característico de la enfermedad.

Persona portadora, es aquella que transmite la enfermedad pero no la padece. La persona está infectada pero no presenta manifestaciones clínicas. Hay dos tipos de portadores: temporales (1-2 meses) y crónicos (toda la vida).

A veces lo gérmenes no se eliminan se quedan en sangre o tejidos del enfermo portador, serán, por tanto, reservorios siempre que haya un vector que transmita el microorganismo (artrópodos picadores como plasmodium, tripanosoma, leismonia,etc).

Cuando la fuente de infección es el hombre hablamos de infección homóloga, si es un animal infección heteróloga.

• Animal: Tiene un doble papel ya que el animal puede actuar como fuente de infección y como vector.

Mecanismo de Transmisión

Son los procedimientos que los agentes patógenos utilizan para su transmisión desde la fuente de infección hasta la persona susceptible. Pueden ser:

• Directos:

• Por contacto físico o estrecha relación entre la persona sana y la fuente. Ej. contacto sexual, piel.

• Por gotitas salivares: gotículas de Wells y de Pfluge. La diferencia entre unas y otras es el tamaño. Ambas están en la boca u se transmiten por besos, estornudos, tos, el habla, etc.

• Manos sucias.

• Objetos recientemente contaminados, principalmente por contaminación salivar u orofaríngea. (fomites)*

• Inoculación directa por transfusiones sanguíneas u jeringuillas (SIDA, hepatitis).

• Indirectos:

• Aire

• Agua contaminada

• Artrópodos (vectores)

• Fomites (objeto contaminado capaz de transmitir enfermedad como toallas, ropa, bolígrafos, etc.)

Persona sana o susceptible de padecer enfermedad

La principal a destacar son las vías de entrad y de salida de los microorganismos como son:

• Aerea

• Digestiva

• Parenteral

• Cutánea

• Ocular

• Ótica

• Urogenital

• Anal

• Placentaria

2.- CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMAEDADES TRANSMISIBLES

DIGESTIVAS: El contagio se denomina DAME (dedos, alimentos, moscas y excretas)

RESPIRATORIAS: Su via de transmisión más frecuente son las gotículas de Wells y las de Pluge (ej. Paperas, sarampión, gripe)

ETS (sífilis)

ANIMALES (zoonosis) ej. Brucelosis, triquinosis.

3.- MEDICINA PREVENTIVA

La prevención se realiza a tres niveles:

Fuente de infección.

• En el hombre, realizar un diagnostico precoz, tratamiento y aislamiento.

• En el portador, realizar control y aislamiento.

• En animales, realizar un diagnóstico, tratamiento y sacrificio.

Mecanismo de Transmisión.

• Saneamiento ambiental.

• Desinfección.

• Lucha contra el vector.

Persona sana.

• Vacunación.

• Prevención con quimoprofilaxis.

4.- EPIDEMIOGÉNESIS

Es el estudio de las epidemias y su desarrollo. Hay que saber:

• Endemia: Presencia habitual de una enfermedad en un área geográfica. El reservorio es generalmente humano y el número de casos que casos que aparecen es aproximado al número teórico.

• Epidemia: Se produce cuando en un país o comunidad el número de casos de una enfermedad es el esperado.

• Pandemia: Se produce cuando la epidemia afecta a varios países o continentes.

Comienzo y Desarrollo de la Epidemiología

La epidemiología se inicia al romperse el equilibrio entre el huésped y el germen debido a:

• Falta o disminución de inmunidad o resistencia de un grupo de población con respecto al germen.

• La llegada de un nuevo germen. (ej. Gérmenes que llevaron los conquistadores a América)

• Mutación del agente infeccioso; ocurre con frecuencia en virus de la gripe.

El desarrollo depende de:

• Número de población susceptible

• Conservación y virulencia del germen

• Factores sociales, ambientales y económicos

• Factores de agregación (colegios, internados)

• Factores de dispersión (turismo, inmigración)

• Factores de saneamiento ambiental y hábitos higiénicos.

• Clima y meteorología que influyen en la supervivencia del germen.

Hay distintos tipos de epidemia:

Brote Holomiántico: Se produce a través de una fuente común transmitiendo la infección a un número de personas en poco tiempo. Suele transmitirse por vía digestiva a través de agua y/o alimentos contaminados. Se caracteriza por una fuerte subida y un descenso brusco afectando a mucha población. La epidemia se extingue al suprimir la fuente de infección. Ej. Salmonelosis.

Brote Prosodémico: La propagaciópn es de persona a persona estableciéndose una cadena de casos que aumenta gradualmente hasta alcanzar un máximo que perdura en el tiempo y luego empieza a declinar. Ej. Gripe.

Brote Mixto: Se caracteriza porque presenta un comienzo holomiántico y continuación prosodémica o viceversa.

5.- PODER PATÓGENO DE LOS MICROORGANISMOS

En la relación huésped- microorganismo existen diversos grados:

1º) Colonización: llegada, establecimiento y multiplicación del microorganismo sin que haya respuesta inmune por parte del huésped.

2º) Infección inaparente: los microorganismos que han colonizado origina una respuesta en el organismo inmunitario.

3º) Enfermedades infecciosas: cuando el microorganismo provoca daños en el huésped, la enfermedad depende del nº de microorganismo, virulencia y resistencia que oponga el huésped.

E= N x V / R

Para saber la virulencia de un germen se recurre a:

1º) dosis mínima letal (DmL) que es la menor cantidad de microorganismo capaz de producir la muerte en la dosis mínima letal, debemos señalar:

% El animal de experimentación.

% Vía entrada.

% proporción respecto al animal.

Ej.: conejo, por vía parenteral con 50 mg/Kg. de conejo.

2º) dosis letal 50 ( Dl 50): dosis mínima letal que mata el 50% de los animales de experimentación.

3º) dosis infectiva 50 (Di50) provoca la infección del 50% de los animales.

6.- FACTORES QUE DETERMINAN LA VIRULENCIA

1º) Colonización

2º) Penetración

3º) Multiplicación

4º) Invasión por continuidad a través de vía linfática, nerviosa o sanguínea. Cuando el germen invade la vía sanguínea hay que definir:

bacteremia: paso ocasional de bacterias o virus de la sangre.

septicemia: paso constante y masivo de la bacteria a la sangre.

viremia: paso ocasional de virus a sangre.

5º) Toxinas: sustancia que proceden de las bacterias y causan lesión en el huésped.

Se denomina toxigenicidad: a la capacidad de producir enfermedad por la liberación de toxinas.

Las toxinas se clasifican:

Exotoxinas: toxinas liberadas extracelularmente por las bacterias a medida que van creciendo. Las toxinas se trasladan por el cuerpo y causan daños en regiones retiradas del lugar donde están creciendo las bacterias que las produce.

Cada toxina tiene un tejido u órgano específico donde actúa o causa daño denominado tejido u órgano diana. Se dirá que la toxina tiene tropismo (tendencia) Ej.: toxina del botulismo es neurotropa.

Son de naturaleza proteica, la producen las bacterias gram positivas y negativas. Son sensibles al calor y a los rayos UV. Se deterioran a Tª ambiente y pierden su capacidad toxica a mas de 60º. Tiene un gran poder toxico (el veneno biológico mas potente es la toxina de botulismo). Ej.: 1mg de la toxina mata 100 toneladas de materia viva.

Las exotoxinas tienen un gran poder antigenico por lo que estimulan la formación de Ac.

Si se le aplica formol se convierten en Anatosoides: pierden su capacidad toxica pero no la antigénica, esto es a base de las vacunas hechas a partir de exotosinas. Son altamente específicas frente a su actuación de su órgano diana.

Endotoxinas: de naturaleza liposacárida y provienen de la pared bacteriana gram negativa. Se liberan con la lisis de la bacteria. la bacteria tiene poder toxico bajo, no forman anatoxoides por lo que no sirven para vacunas. Provocan leucopenia, hipertermia, hipotensión, plaquetopenia, etc.

	EXOTOXINAS	ENDOTOXINAS
Origen	Bacterias positivas y algunas negativas. Se recogen del sobrenadante del cultivo.	Bacterias negativas. Salen de la bacteria cuando se destruye
Composición	Proteica	Liposacáridos
Toxicidad	Elevada	Baja
Acción	Especifica sobre tejidos diana	Inespecífica
Labilidad	Termolábil es	Termoestables
Poder antigénico	Son muy antigénicos estimulando formación de Ac	Pocos antigénicos no inducen la formación de Ac
Acción del formol	Se transforman en toxoides por lo que sirven como vacunas	No se transforman en toxoides
Acción de los sueros	Son efectivos	No son efectivos

Estudio de las exotoxinas más importantes

• Toxina Diftérica: producida por Corinebacterium difteriae. Es pantotropa (tendencia por todo el organismo). Se unen a las células del huésped y a las pocas horas pierde su capacidad de síntesis proteica y mueren.

• Toxina tetánica: producida por Clostridium tetanus. Es cardiotoxica y hemolítica. Lo más importante es su acción espasmolizante al ser neurotropa y fijarse de forma irreversible a la sinapsis (conexiones entre neuronas) neuronal.

• Toxina botulínica: producida por Clostridium botulium. Es neurotropa y provoca una parálisis dando lugar a la muerte por asfixia debida a parada cardio respiratoria.

• Toxina de Clostridium perfinges: provoca gangrena gaseosa.

• Toxina del Estreptococos pyogenes: lo más importante es la estreptolisina que provoca hemólisis y la toxina eritrogénica que es la responsable del eritema de la escarlatina.

• Toxina del Estafilococos aureus: actúa como enterotoxina.

• Toxina del Vibrio cholerae: produce el cólera.

• Toxinas enterotóxicas: toxinas de E.coli y Salmonella, producen deshidratación que puede llegar a la muerte.

7.- TIPOS DE MICROORGANISMOS

1.- Patógenos: son exógenos al huésped colonizan, infectan y producen enfermedad. Su acción patogénica es debida al número y virulencia.

2.- Oportunistas: suelen ser endógenos al huésped formando parte de la flora microbiana normal, colonizando y en determinadas circunstancias provocando enfermedad, la cual es provocada por la disminución de las defensas del huésped.

3.- Flora habitual (saprofita): Son microorganismos que colonizan al huésped y le producen incluso beneficio comportándose como simbiótico y preservando la salud del huésped al :

• facilitar la absorción de vitaminas.

• Degradación de ácidos biliares.

• Realizar la interferencia microbiana que consiste en evitar la infección de verdaderos patógenos por medio de bactericidas, alterar el pH o competir por el espacio con los verdaderos patógenos. Por tanto ante un tratamiento antibiótico se debe elegir el que menos daña la flora habitual.

Flora normal, oportunista y patógena en el hombre

Las áreas del cuerpo se subdividen en dos categorías generales:

Las que poseen normalmente microorganismos.

Las que normalmente son estériles o que ocasionalmente albergan algunos microorganismos pero que pueden ser altamente colonizados en caso de enfermedad.

La flora según aparatos es:

1º- Aparato Respiratorio

áreas que normalmente albergan microorganismos:

• boca

• nariz

• garganta

• región nasofaríngea

• amígdalas

• senos paranasales

La localización del organismo es muy importante para saber si es patógeno o no. Pueden aparecer en algunas personas sin ser patógenos.

áreas normalmente estériles:

• bronquios

• bronquíolos

• alvéolos

• laringe

• traquea

Es posible su contaminación por distintos microorganismos ocasionales. Los distintos mecanismos de defensa tenderán a eliminarlos rápidamente.

Tanto el exputo como algunos aspirados pueden estar contaminados por la flora de garganta, nariz y boca.

2º- Tracto gastrointestinal

áreas que normalmente albergan microorganismos:

• intestino grueso

• ileon inferior

áreas normalmente estériles aunque ocasionalmente pueden presentar microorganismos:

• esófago

• estómago

Aunque hay que tener en cuenta que debida al paso de alimentos pueden estar contaminados por bacterias pero no sobreviven por los jugos del estómago.

El hígado y la vesícula biliar están normalmente exentas de contaminación microbiana. En estas zonas los microorganismos son síntomas de enfermedades.

3º- Tracto genitourinario

áreas que normalmente albergan microorganismos:

• genitales externos

• uretra

• vagina

La microflora normal de la vagina dura hasta la menopausia siendo frecuente la presencia de bacilos de Doderlein o más correctamente Lactobacilus acidofilus. En ocasiones las complicaciones de los abortos prolongados pueden ser ocasionados por la microflora vaginal, de modo similar los recién nacidos pueden tener enfermedades por la flora vaginal.

áreas normalmente estériles:

• el riñón

4º- Tracto de la piel, oído y ojo

L a superficie externa del cuerpo esta poblada constantemente por microorganismos que reflejan las costumbres del individuo, su dieta, clima, trabajo, etc.

5º- Sangre y LCR (líquido cefalorraquídeo)

Son generalmente estériles pero en muchas enfermedades infecciosas y durante las complicaciones infecciosa de las enfermedades es frecuente encontrar microorganismos en sangre.

8.- CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES PRODUCTORES DE INFECCIÓN

De acuerdo con la clasificación etiológica se dividen en agentes productores de infección en:

1.- enfermedades por hongos.

2.- enfermedades por bacterias.

3.- enfermedades por virus.

4.- enfermedades por protozoos.

5.- enfermedades por helmintos.

6.- enfermedades por artrópodos.

7.- enfermedades por algas.

8.- enfermedades por priones.

Priones: son partículas infecciosas de pequeño tamaño y naturaleza no bien conocida. Se presentan como partículas de naturaleza proteica en las que no se ha determinado ni ADN ni ARN aunque no se excluye que tenga alguno. Se les considera los agentes productores de la enfermedad de Crentzfeld - Jacobs (C-J).

TEMA 5.- OBSERVACIÓN DE LOS GÉRMENES VIVOS: MOVILIDAD DE LOS ORGANISMOS. TINCIONES

1.- OBSERVACIÓN DE LOS GERMENES VIVOS

Para la investigación de algunas características biológicas de los microorganismos como son su morfología y movilidad es necesario observar los gérmenes in vivo.

Para ello se debe partir de cultivos jóvenes ya que los microorganismos de los cultivos viejos pierden su movilidad y gran parte de ellos están en regresión.

Estas técnicas son las siguientes:

a.- EXAMEN EN FRESCO

• Fundamento: Suspendiendo el microorganismo en un medio líquido transparente es posible observar al M/O sus características morfológicas y su movilidad. Se utiliza para clasificar a los organismos en los procesos de identificación en :

• móviles o inmóviles

• observación de estructuras espiriladas

• fase de reproducción

• Material: m.o., cubreobjetos, portaobjetos excavado, mechero, asa de siembra.

• Reactivos: vaselina sólida y microorganismos (Proteus vulgaris).

• Técnica: Para el examen en fresco existen dos métodos, son los siguientes:

1º- Método de la gota pendiente

• Técnica:

1º En el centro de un cubre limpio y desengrasado se coloca una gota de la suspensión de microorganismos con un asa esterilizada.

2º Invertir sobre el cubre el porta excavado untando con vaselina alrededor del pocillo, colocándolo de forma que la gota quede centrada en la depresión, la vaselina adhiere el cubre al porta de modo que se forma una cámara que evita la evaporación de la gota.

3º Después dar rápidamente la vuelta a la preparación.

4º Observar al M/O con el objetivo de 40x.

2º- Método de la cámara húmeda

• Técnica:

1º Depositar en el centro de un porta limpio y desengrasado una gota de agua estéril.

2º Tomar con el asa una muestra del microorganismo y realizar una suspensión con la gota de agua.

3º Colocar sobre la suspensión un cubre evitando que queden burbujas de aire.

4º Observar al M/O con el objetivo de 40x.

• Resultados e interpretación: La movilidad se manifiesta en un desplazamiento del microorganismo en todas las direcciones del campo del M/O a diferencia del movimiento browniano de los gérmenes presentes en la suspensión que no presentan movilidad, los cuales se desplazan en la misma dirección. Este extremo se puede comprobar añadiendo un antiséptico a la preparación en caso de tratarse de organismos móviles desaparecerá el movimiento observado.

• Observaciones al método: Es importante que el tamaño de la gota sea adecuado. Si es muy grande provocaría en ambas técnicas el desplazamiento del cubre impidiendo la visión correcta de la preparación, si es muy pequeña puede evaporarse en el interior de la cámara. En el método de la gota pendiente si no se dispone de vaselina se puede humedecer los bordes de la excavación con solución salina estéril o agua destilada.

b.- COLORACIÓN VITAL

• Fundamento: Es un proceso intermedio entre el examen en fresco y las técnicas de coloración después de fijación.

Tiene por objeto poner de relieve detalles estructurales de los microorganismos que no es posible observar en fresco sin causar modificaciones físicas o químicas incompatibles con el elemento examinado.

En general no se tiñen sino que se acumulan en ciertas partes del microorganismo. Se deben emplear colorantes atóxicos a diluciones muy altas.

• Material: Portaobjetos, cubreobjetos, asa de siembra, mechero, papel de filtro y aceite de inmersión.

• Reactivos: Se emplean colorantes en disoluciones: 1/1000, 1/5000, 1/10000. Son: nigrosina, azul de metileno, verde janus, verde malaquita.

• Técnica:

1º Colocar en el centro del porta una gota de la suspensión del microorganismo y otra del colorante.

2º Mezclar con el asa de siembra y colocar el cubreobjetos sobre la gota resultante (sin burbujas).

3º Observar al M/O con el objetivo de inmersión (100x).

2.- TIPOS DE COLORANTES

Los colorantes son sustancias capaces de dar color a otros cuerpos, pero para que sean efectivos deben tener predilección por determinados organismos, es decir, deben ser selectivos.

Los colorantes se pueden dividir en:

a.- En función de su naturaleza estructural, pueden ser:

• Naturales (carmín y hematoxilina).

• Artificiales (anilinas), que proceden de la destilación de la hulla.

b.- Desde el punto de vista químico, pueden ser:

• Ácidos (citoplasma)

• Básicos (núcleo)

• Neutros (cuando se asocian el colorante ácido y el básico. Los más conocidos son los eosicionatos de tiacina que suelen designarse con el nombre del autor que inventa la mezcla)

• Indiferentes (son insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej. Sudán III)

En bacteriología, se usan principalmente los colorantes artificiales básicos. Algunos colorantes se depositan sobre determinadas estructuras cuando han sido sometidas a la acción de un mordiente (fijador) que puede actuar en solitario o junto con el colorante formando lo que se denomina como “laca” (LACA=FIJADOR+COLORANTE).

3.- TÉCNICAS DE TINCIÓN

En la mayoría de las ocasiones para la observación de los microorganismos, éstos son teñidos ya que de esta forma son más fáciles de visualizar y se pueden poner de manifiesto características diferenciales. Las tinciones se pueden clasificar es función de 2 características:

a.- Procedimiento de coloración: Se pueden dar:

• Técnicas de Inmersión: Permite teñir varias preparaciones a la vez. Se realizan introduciendo la extensión en el/los recipientes que contienen colorante.

• Técnicas de Vertido: Son las más usadas. Se efectúan por decantación libre de colorantes y reactivos distinguiéndose 2 tipos:

• Técnica en condiciones normales.

• Técnica en condiciones drásticas. Llamada Tinción de Emisión de Vapores. Se suele emplear para los BAAR (Bacilos ácido alcohol resistentes).

• Materiales: El mismo utilizado en condiciones normales.

• Técnica: La extensión debe quedar cubierta por un trozo de papel de filtro del mismo tamaño que el porta que se irá impregnando de forma intermitente con el colorante usado en la tinción. La emisión de vapores se consigue calentando la parte inferior del porta con algodón impregnado en alcohol etílico sostenido del extremo de una varilla de vidrio. No se debe mantener la llama fija, pues se puede romper el porta. La extensión se somete a calentamiento hasta que se emitan vapores. En ese momento se retira la llama hasta que deje de emitirlos y se repite nuevamente el ciclo, así sucesivamente durante todo el tiempo que dure al titulación (práctica).

• Observaciones: No se debe dejar secar el papel de filtro ya que si no se deterioraría la extensión. Hay que ir añadiendo periódicamente el colorante. Algunos autores no usan papel de filtro realizando la técnica por contacto directo del colorante sobre la extensión y posterior calentamiento hasta la emisión de vapores. Se debe tener la precaución de añadir el colorante repetidamente. Estas tinciones requieren calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana como en las micobacterias.

b.- Según su aplicación

Técnica General de Tinción

1º.- Extensión.

Para obtener una película lo más homogénea posible de muestra.

Si la muestra el líquida, depositar una pequeña cantidad en el extremo del porta, extenderlo con el asa de siembra hasta conseguir una capa fina y homogénea.

Si la muestra es sólida, depositar una gota de suero fisiológico o agua destilada y suspender en ella una pequeña cantidad de cultivo, hasta obtener una capa fina y homogénea.

2º.- Desecación.

Tiene como objeto eliminar el agua de la extensión para fijarla. Se deja secar a Tª ambiente o calentando ligeramente alrededor de la llama, jamás directamente sobre ella.

3º.- Fijación.

Se consigue la muerte de los microorganismos por coagulación de las proteínas quedando la extensión adherida al porta, para que resista las operaciones siguientes. Tiene por objeto mantener la composición fco-qca. del microorganismos de forma que conserve definitivamente una estructura lo más parecida posible a la inicial.

La fijación puede realizarse por:

• Solución fijadora (etanol, metanol), que se deja actuar durante varios minutos; se escurre y se deja secar.

• Calor, poniendo la parte inferior del porta contra la llama del mechero repitiendo la operación.

4º.- Tinción.

Mediante la cual el microorganismo capta el colorante.

5º.- Lavado.

Mediante el cual eliminamos el exceso de colorante.

6º.- Secado.

Se mejora la visualización del microorganismo.

Hay distintos tipos:

• Tinción Simple

Son aquellas que solo utilizan un colorante y tienen como objetivo permitir la observación de la morfología bacteriana. La tinción resultante puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su interior, lo que significa una mayor afinidad de determinados componentes de la célula por el colorante. Los mas usados son: verde malaquita, violeta de genciana…

• Tinción diferencial o compuesta

Requieren más de un colorante y sirven para poner de manifiesto algún carácter propio de microorganismos. Las principales tinciones son: tinción de Gram y tinción Ziehl-Nielsen.

TINCION DE GRAM

• Fundamento: divide a los microorganismos en gram positivas y gram negativas. Las gram positivas son aquellas que resisten la acción de colorante del disolvente alcohol-acetona, tras el tratamiento con un colorante básico y lugol, mientras que las gram negativas son decoloradas siendo posteriormente teñidas con un colorante de contraste como puede ser la fusina diluida o safranina, este hecho se debe a la diferente composición de la pared celular. Es conveniente realizar la tinción de gram sobre células de cultivos jóvenes ya que algunos microorganismos son gram positivos solo en la fase de crecimiento.

• Material: portaobjetos, mechero, asa de platino, pipeta, pinzas de madera, M.O. y equipos de tinción (cristalizador, barras paralelas y frascos lavaderos).

• Reactivos: lugol, violeta de genciana, fusina diluida o safranina, alcohol-acetona, aceite de inmersión.

• Técnica (ver fotocopia)

PASOS	METODOS	RESULTADOS Positivos Negativos
Colorante básico	Violeta genciana	Violeta Violeta
Mordiente	Lugol	Violeta Violeta
Decolorante	Alcohol / acetona	Violeta Se decolora
Colorante contraste	Suframina o fusina	Violeta Rosa

• Resultados e Interpretación: Las bacterias gram positivas son de color violeta y las gram negativas de coloración rosa.

TINCION DE ZIEHL-NIELSEN

• Fundamento: se utiliza para diferenciar BAAR es decir, aquellos microorganismos que resisten la decoloración con una mezcla de ácido y alcohol.

Algunas bacterias poseen en su pared celular ciertos lípidos que le confieren la propiedad de resistir la decoloración con ácido - alcohol.

Esta tinción requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana. Los microorganismos que resisten la coloración son: micobacterias, actinomicetos y nocardia.

• Material: portaobjetos, asa de siembra, pipetas, pinzas de madera, mechero, M.O. y equipo de tinción.

• Reactivos: fusina, alcohol clorhídrico (97:3), azul de metileno, microorganismo uno BAAR y uno no BAAR y aceite de inmersión.

• Técnica: (ver fotocopia).

• Resultados e interpretación: Los microorganismos BAAR adquieren color rojo y los no BAAR azul.

Tinción Auramina-Rodamina

• Fundamento: Tanto la Auramina como la Rodamina son dos fluorocromos que tiñen microorganismos. En las micobacterias se fijan sobre los ácidos micolicos de la pared diferenciándolas, por lo que en la investigación de estas bacterias es una técnica principal. Además se aplica un colorante de contraste no fluorescente con el fin de ejercer un papel de campo oscuro.

• Materiales: portaobjetos, mechero, equipo de tinción, m/f.

• Reactivos: Auramina-rodamina.

• Técnica:

1º Extender, secar y fijar.

2º Teñir con Auramina-Rodamina a temperatura ambiente (37ºC) durante 15 minutos.

3º Lavar con agua destilada.

4º Decolorar con alcohol clorhídrico durante 2-3 minutos y después lavar con agua destilada.

5º Contrastar durante 2-4 minutos con colorante de contraste, ya que tiempos mayores originan perdidas de brillo. El contraste reduce la posibilidad de artefactos.

6º Lavar, secar y observar al m/f con objetivo de 40x.

• Resultado e interpretación: En los microorganismos se verán puntos amarillos-verdosos brillantes.

• Observaciones al método: Es una tinción equivalente a la de los B.A.A.R.

No obstante debe utilizarse una tinción B.A.A.R de Ziehl-Nielsen para confirmar su prueba.

Este método tiene la ventaja sobre el anterior de que no es necesario el calentamiento de la preparación.

Tinción ácido resistente de Kinyoun

• Fundamento: la observación de presencia o ausencia de B.A.A.R.

• Técnica:

1º Extensión.

2º Fijación en llama(preferiblemente).

3º Cubrir la muestra con solución de Kinyoun durante 3 minutos.

4º Lavar con aguas corriente durante 30 segundos.

5º Cubrir con solución de Gabett durante 1 minuto.

6º Lavar con agua corriente y secar.

7º Observar al m/o con objetivo de inmersión.

• Tinciones estructurales

Nos permiten ver distintas estructuras: flagelos, esporas, cápsula, corpúsculos metacromáticos, etc.

• Flagelos:

• Método de Rodees.

• Método de Triboadeau.

• Método de Leifson.

• Esporas:

• Método de Moeller.

• Método de Wirlz-Conklin.

• Cápsula:

• Método de Hiss.

• Método de la tinta china.

• Corpúsculos metacromáticos:

• Método de Albert.

• Método de Loeffer.

Tinción de Wirlz-Conklin

• Técnica:

1º Extensión.

2º Desecación.

3º Fijación.

4º Teñir con verde malaquita a emisión de vapores durante 10 minutos.

5º Lavar con agua destilada arrastrando el papel de filtro (opcional).

6º Teñir con fusina diluida durante 3 minutos.

7º Lavar, secar y observar al m/o con el objetivo de inmersión.

• Resultados e interpretación: las esporas se observan de color verde, mientras que la forma vegetativa se observa de color rojo.

TEMA 6.- MEDIOS DE CULTIVO I

1.- INTRODUCCIÓN

Para estudiar las reacciones metabólicas y fisiológicas de las bacterias es necesario cultivarlas en un medio de cultivo que es una mezcla de sustancias que proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios para su crecimiento y multiplicación.

El desarrollo de las bacterias en un medio de cultivo depende de una serie de factores:

1º.- Composición: los medios de cultivo deben incluir los elementos imprescindibles para la vida bacteriana:

• Fuente de N y C.

• Elementos minerales como: S, P, Mg, Ca, Fe, etc.

• Factores de crecimiento que por si solas no son capaces de sintetizar(aa, vitaminas, etc.).

• Factores estimulantes o de arranque. Ej: sangre.

2º.- pH: suele estar alrededor de la neutralidad, aunque hay algunos microorganismos que tienen un pH específico diferente. Ej: bacterias acidofilas.

3º.- Presión osmótica: los medios se preparan en condiciones de isotonia.

4º.- Potencial Redox: esta en relación con el tipo respiratorio de cada bacteria, que puede ser:

• aerobios estrictos u obligados.

• anaerobios estrictos u obligados.

• facultativos.

• microaerófilos.

• anaerobios aerotolerantes.

5º.- Hidratación: el agua es imprescindible para el crecimiento bacteriano por lo que estará en cantidad suficiente en los medios de cultivo.

6º.- Temperatura: se incuba a la temperatura de interés médico (35-37ºC).

7º.- Atmósfera: algunas bacterias, especialmente algunas aerobias y facultativas necesitan la presencia de ciertos ambientes gaseosos. El más usado es el CO2 en proporciones entre 3-10%.

2.- CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo se pueden clasificar:

1.- Según el fin al que están destinados:

• Medios generales: en los cuales se desarrollan una amplia variedad de microorganismos sin condiciones nutritivas especiales. Ej: agar nutritivo o caldo nutritivo.

• Medios selectivos o inhibidores: inhiben por completo el crecimiento de bacterias distintas de las que se quieren aislar y que existen en la muestra. La selectividad del medio se consigue con la adicción de sustancias como sales biliares( inhiben las formas cocaceas gram +) o la ázida sódica( sólo permite el crecimiento de las gram+). Los antibióticos son otras sustancias que transforman los medios de cultivo en selectivos.

• Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de algún tipo de bacteria que se encuentra minoritariamente en una mezcla de varias bacterias. Ej: caldo de selenito y tetrationato que se usan para en aumento de Salmonellas que existen en el contenido intestinal.

• Medios de diferenciación: se usan para poner de manifiesto a las bacterias que dan positiva alguna prueba bioquímica y que están presentes en la mezcla. Ej: bacterias glucosa + o glucosa-

• Medios de identificación: son aquellos que se utilizan para estudiar la acción de un solo tipo de bacterias frente a un determinado sustrato. Se diferencian del anterior en que se siembran con bacterias pertenecientes a un sólo clon. Se utiliza para la identificación de bacterias.

• Medios de multiplicación: son aquellos que poseen una composición determinada y óptima que permiten el máximo aumento celular bacteriano en el mínimo tiempo. Son muy usados en la preparación de vacunas y Acs.

• Medios de conservación: son aquellos cuya composición favorece el mantenimiento de los microorganismos que en él se siembran y que posteriormente se incuban entre 2-4 ºC. Algunos medios de conservación incluyen glicerol y se guardan en el congelador(-20ºC), estos medios han sido desplazados por la liofilización.

Existe una variación de los medios de conservación que son los medios de transporte cuya finalidad es mantener el estado viable aunque sin reproducción(mínimamente) de los microorganismos presentes en la muestra, permitiendo con posterioridad recuperar incluso a los que están minoritariamente presentes. Los más utilizados son: de Stuart, Amies, Cary-Blair.

2.- Según su consistencia.

• Medios Líquidos: También llamados caldos. No llevan ninguna sustancia gelificante, se usa principalmente para enriquecimiento o identificación. Su recipiente puede ser un frasco, una botella o un tubo.

• Medios semisólidos: Contienen una proporción menor del 5% de agente gelificante.

• Medios sólidos: Se denominan agares. Contienen agentes gelificantes en proporciones considerables. Los medios sólidos se pueden dividir en:

• Inicialmente líquidos: según su reversibilidad de estado hay 2 tipos:

• Reversibles: después de solidificar pueden volver a licuar. Tienen fácil conservación. Los agentes gelificantes incorporados son agar, suero, etc.

• Irreversibles: no se pueden volver a licuar. Como sustancias solidificantes contienen huevo, suero, etc.

• Inicialmente sólidos: en función de la naturaleza química del agente solidificante se distinguen 2 tipos:

• Orgánicos: como tubérculos.

• Inorgánicos: como silicatos.

Los medios sólidos pueden estar contenidos en frascos, botellas o tubos, pudiendo aparecer éstos:

• en horizontal: usado en siembra de picadura

• inclinado: se emplean en identificación, obtención de masa de microorganismos y almacenamiento (colonias). Una variante es el pico de flauta.

También los medios sólidos suelen estar contenidos en placas, siendo las más utilizadas las placas de Petri.

3.- Según su consistencia.

• Medios naturales o empíricos: Están constituidos por componentes de origen animal o vegetal como huevos, leche, patatas, etc. Actualmente está en desuso.

• Medios sintéticos: Son una solución de medios puros químicamente disueltos en agua destilada. Poseen composición constante. Se utilizan para el crecimiento y metabolismo bacteriano.

• Medios semisintéticos: Contienen sustancias químicas de naturaleza y proporciones conocidas junto a productos de origen natural. Son los medios más utilizados actualmente.

3.- PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

• FUNDAMENTO: La manipulación adecuada de determinados agentes nutritivos permite obtener una fuente de alimentación y ambiente adecuado para que puedan crecer y desarrollarse los microorganismos en las condiciones idóneas.

• REACTIVOS: Ingredientes del medio de cultivo, NaOH (1%) y HCl (1%).

• MATERIALES: Vaso de precipitados de 250/500 cc., erlenmeyer de 250/500 cc., placa petri, pipetas de 10 y 25 ml, papel indicador de pH, tubos de cultivo, autoclave, algodón graso, papel de aluminio y balanza.

• TÉCNICA:

Elección de los ingredientes: Sólo cuando se elabora un medio de cultivo a partir de los elementos que los componen. Este paso es poco frecuente debido a la comercialización de los medios.

Pesada de cada uno de los ingredientes.

Hidratación: El agua usada en la reconstitución debe ser destilada o desionizada y calentada a 50-60ºC. Se coloca en un vaso de precipitado la mitad del agua a la que se le añaden los ingredientes o el medio de cultivo homogenizando con una varilla agitadora y manteniendo la exposición al calor. Los medios líquidos no necesitan llevar a ebullición en su preparación, mientras que los medios sólidos deben llevarse a ebullición pues necesitan una Tª de 98-100ºC para disolverse. En la preparación del medio sólido se recomienda que antes de iniciar el calentamiento se deje reposar el agua precalentada durante 5-10 minutos para provocar un esponjamiento del agente gelificante que facilitará la disolución.

Ajuste de pH: Se hace imprescindible cuando se parte de ingredientes por separado. Se mide el pH y si este no es el adecuado se ajusta con las disoluciones de NaOH y HCl.

Distribución: Para la esterilización se distribuirá el medio de cultivo en recipientes que permitan un buen proceso de esterilización y procurar que los recipientes sean los definitivos para llevar a cabo el cultivo. Se plantean dos posibilidades:

• Medios en tubo: con una pipeta de boca ancha o un dosificador se depositan en cada tubo la cantidad de medio de cultivo correspondiente a 10-20 cc., según la capacidad del tubo. Se tapa con una torunda de algodón graso que se cubre a su vez con papel de aluminio y se lleva a esterilizar. También se puede utilizar tubos con tapón de rosca. Con ello se consigue esterilizar recipiente y medio de cultivo por lo que éste estará dispuesto para ser sembrado y almacenado hasta su uso, ya que los tubos constituyen el recipiente definitivo.

• Medios en placa: Se vierte el medio en un erlenmeyer no debe ocupar más de 2/3 de la capacidad total pues la ebullición en el autoclave haría que el medio rebasase. Antes de esterilizar se tapa con algodón graso y aluminio.

• Esterilización: Se realiza a 121ºC durante 15 minutos. Para volúmenes mayores de 250cc. se aumenta el tiempo.

• Vertido en placa: Tras la esterilización se homogeniza moviendo en sentido rotatorio. El vertido en placa se debe realizar cuando la Tª sea próxima a la gelificación 45-55ºC (puede mantener la mano sobre el recipiente).Con ello se evita la excesiva formación de agua de condensación en la tapa de las placas. Para el llenado se usan pipetas estériles de boca ancha o un dosificador estéril, siendo este más adecuado para evitar la obstrucción del agar. Las placas estériles por lo que la técnica de vertido debe realizarse en condiciones de esterilidad. El volumen de muestra que debe depositarse en la placa será según el espesor de la capa deseada y las dimensiones de la misma ( de 2.5-3 mm, un poco más de la mitad de la placa).

• Enfriamiento:

• Medios líquidos: Tal como se extraen del autoclave se dejan enfriar.

• Medios sólidos: Dependerá de donde se encuentre el medio, así

-Tubos: enfriar a Tª ambiente en posición vertical (para conseguir agar horizontal) u oblicuo (para conseguir agar inclinado).

- Placas: tras el vertido debe asegurarse que no existen burbujas ejerciendo movimientos rotatorios (las burbujas se quitan con el asa esterilizada).

• OBSERVACIONES AL MÉTODO: Si no se dispone de autoclave se pueden esterilizar los medios en baño maría hirviente o en olla a presión durante 30 min. repitiendo la operación durante 3 días consecutivos.

Los ingredientes o medios deshidratados se protegerán de la humedad, la luz y el calor. Los recipientes deben ser de plástico o vidrio opaco y cierre hermético. No deben abrirse en ambientes húmedos y deben desecharse cuando se apelmacen. Se controlará periódicamente su fecha de caducidad. Los medios hidratados y esterilizados tienen un tiempo limitado de conservación, en general pueden conservarse 4-6 semanas en condiciones adecuadas. El problema más frecuente es la deshidratación, se tendrá en cuenta las siguientes recomendaciones:

• almacenar en nevera a 4ºC, también a Tamb. aunque su duración es más limitada.

• no deben guardarse a T menor de 0ºC (T de congelación) pues altera la estructura del gel.

• protegerlos de la luz, para ello envolver el recipiente en papel de aluminio

• los tubos con cierre hermético son más recomendables que las torundas de algodón

• los medios para verter en placa se conservan mejor en el frasco original aunque pueden quedarse en ellos teniendo en cuenta:

se deben refrigerar inmediatamente después de su solidificación

se protegerán frente a desecación precintando con cinta adhesiva su borde lateral o envolviendo varias en bolsa de plástico

se recomienda mantener en posición invertida para evitar que se caiga sobre el medio el agua de condensación

Los medios conservados en refrigerador deben ser atemperados antes de su empleo con estufas de cultivo o a T ambiente. No utilizar nunca medios con excesiva deshidratación, la cual se manifiesta:

• en medios líquidos, por aumento de concentración o disminución de volumen

• en medios sólidos, por disminución de espesor, agrietamiento, retracción, cambio de color, etc.

Algunos medios son conservados en estado sólido en el recipiente original y luego son refundidos para su distribución.

Las precauciones a tener en cuenta son:

• no deben realizarse con medios ácidos, ya que se alteran sus características (el agar se hidroliza al calentarse en medios ácidos)

• si se mantienen fundidos periodos de tiempo mayores de 60 minutos, la calidad del medio disminuye considerablemente

• es aconsejable refundir al baño maría o autoclave durante 30 minutos, nunca aplicar calor directamente

4.- ELIMINACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cualquier medio de cultivo sobre todo si ha sido sembrado, es un posible foco de contaminación debiendo eliminarlo tras su utilización.

Los medios de cultivo se pueden descontaminar:

1.- Inundación en solución desinfectante: Se cubre la superficie con esta solución y se deja unas 12 horas. Se utiliza cuando no hay autoclave.

2.- Esterilización en autoclave

3.- Incineración: se utiliza para microorganismos muy patógenos.

Solo después de la descontaminación del medio de cultivo se procederá a la limpieza de sus recipientes (cuando éstos son recuperables).

5.- CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El 4% de los medios de cultivo de los lotes se controlan en estufas durante 5-7 días a una temperatura de 37ºC, durante este tiempo debe verificarse el color del medio preparado así como la gelificación, los precipitados atípicos, etc. en el caso de advertir variaciones atípicas se desechan los lotes.

Con los medios de cultivo se deben establecer tres tipos de controles antes de considerarlos aptos:

1º.- Control de esterilidad (explicado anteriormente).

2º.- Control de calidad, se realiza para comprobar que el medio contiene aquellos componentes que le caracterizan. Para su comprobación se utilizan por lo menos dos gérmenes distintos:

• uno que crece en ese medio o da + una determinada prueba.

• Otro que no crece en ese medio o da - la prueba.

3º.- Control de caducidad, para ponerlo en práctica es necesario que en el momento de emplaque se rotule en un lugar de la placa además del medio, la fecha de preparación.

TEMA 7.- CULTIVO DE BACTERIAS II (SIEMBRA)

1.- Introducción

Dado que la manipulación de muestras en microbiología entraña riesgos, recordamos las siguientes instrucciones:

• Todo material debe ser estéril.

• La manipulación en radio de 10-15 cm. (zona aséptica) alrededor de campana o zona de flujo.

• Se procurará disponer de todo el material al alcance de la mano para evitar desplazamientos.

• Es necesario adquirir rapidez y automatismo indispensable para una buena ejecución de las técnicas.

2.- Manipulación del material

• Asa de hilo, platino o micro:

1º Esterilizar antes y después de su uso, para lo cual se coloca perpendicular a la llama hasta que alcance el rojo vivo en toda su longitud. Para evitar salpicaduras el instrumento se introduce gradualmente en la llama.

2º Cuando se quiere meter en recipiente de boca estrecha se debe flamear la parte del mango que quede dentro del recipiente durante su manipulación.

3º Tras la esterilización se enfriará unos segundos en la fuente aséptica, pues si contacta con la zona del microorganismo (colonia, medio líquido, etc.)esterilizaremos la muestra recogida.

• Pipetas: Con pipetas de seguridad (tienen filtro de algodón en su boquilla) o con prepipetas se flameará previamente la punta y en toda su longitud que contacte con el recipiente de la muestra. La pipeta se manejara con la punta dirigida hacia abajo, manteniéndola vertical u oblicua pero nunca horizontal.

• Recipientes de vidrio: Siempre que contenga algún producto en su interior (m.c.) deben estar tapados con torundas de algodón así:

• No se abrirán en posición vertical.

• Su apertura se realizara oblicuamente dirigiendo su apertura sobre la llama.

• El algodón se coge con el dedo meñique de la mano opuesta, evitando el contacto mientras se manipula el contenido del medio.

• La boca se flameara al abrir y al cerrar, la cual se expone en la llama unos segundos con movimientos rotativos.

• Placas de Petri: Se manipularan semiabiertas con la abertura orientada a la llama del mechero.

3.- MANUPILACION DE MUESTRAS

1º) Medio líquido:

• Con asa de platino o Nicron:

• destapar el tubo

• flamear la boca del tubo

• introducir el asa estéril y sumerguirlo

• extraer el asa

La muestra queda formando una película circular en la luz del asa, solo se puede conocer el volumen de la muestra utilizando asas calibradas.

• Con pipeta estéril: se debe tener la precaución de mantener limpia la parte exterior de la pipeta por lo que se dejara gotear él liquido adherido a las paredes sobre el recipiente antes de taparlo.

2º) Medios sólidos:

• destapar el tubo o flamear el tubo

• contactar suavemente el asa o el hilo estéril con alguna colonia visible

• flamear la boca del tubo o cerrar la placa

4.- PREPARACION DEL INOCULO ESTANDARIZADO (práctica)

Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas y para técnicas en las que se pretende el aislamiento del germen o la realización de un análisis cuantitativo, es necesario preparar él inoculo de siembra para obtener resultados fiables.

• Técnica general de preparación de inoculos:

Se obtiene a partir de un cultivo joven (fase exponencial de crecimiento) y puro o de un producto patológico.

Se toma con un asa estéril colonias de un cultivo o una porción de una muestra biológica y se diluye en 5 cm cúbicos de una solución diluyente, la cual se homogeneiza. Como diluyente podemos utilizar caldo nutritivo, solución salina o agua destilada estéril.

• Técnica de KYRBY - BAUER:

Utiliza escalas con gradiente de turbidez, cada tubo de la escala va numerada y sirve de referencia según el nº de microorganismos que se quieran. Él inoculo se puede ajustar al patrón de referencia mediante:

• comparación visual aproximada (turbidez)

• espectrofotometría

Una escala universalmente aceptada es la escala de Mc FARLAN, constituida por una serie de tubos en los que se origina un precipitado blanco de BaSO4 por acción de H2SO4 con BaCl2.

Tubo	0,5	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Cl2Ba 2H2O al 1,175 % (P/V)	0,05	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1
H2SO4 1% (V/V)	9,95	9,9	9,8	9,7	9,6	9,5	9,4	9,3	9,2	9,1	9
Densidad de cels. aprox x106 cel/cc	1,5	3	6	9	12	15	18	21	24	27	30

Cada tubo se lee en el espectrofotómetro y se obtiene una absorbancia de cada uno. Se representa Absorbancia frente a concentración y se obtiene una recta en la que se interpolan las absorbancias de las muestras problema pudiendo conocer la concentración de éstas, así se estandariza la muestra problema.

5.- SIEMBRAS

Existen diferentes técnicas y éstas se clasifican según el modo de efectuarse:

1.- Por inoculación.

Se puede llevar a cabo en medio liquido o medio sólido.

• Medio liquido:

• Con asa: sumergir el asa cargada y agitar.

• Con pipeta: verter el contenido de la pipeta sobre el m.c. y se homogeneiza.

• Con escobillon: se realiza de igual modo que con el asa de siembra.

• Medio sólido:

• En placa : Hay dos técnicas: técnica de Barry y la técnica de Kirby Bauer.

• Técnica de Barry: Es una inoculación previa al vertido en placa, se siguen los siguientes pasos:

1º) se toma 0,1 cm cubico de inoculo y se añaden a 25 cm cúbicos de m.c. fundido (40-50º).

2º) homogeneizar.

3º) verter en la placa de petri.

Una modificación de esta técnica consiste en verter él inoculo directamente en la placa y seguidamente se agrega en m.c. y dando movimientos de rotación para así mezclar. Esta técnica se utiliza para el recuento de viables y antibiogramas.

• Técnica de Kyrby Bauer: Es la inoculación sobre la superficie del medio solidificado, se siguen los siguientes pasos:

1º) preparado él inoculo en tubo estéril se introduce un escobillon también estéril hasta quedar impregnado.

2º) se elimina el exceso de inoculo presionando el escobillon con movimientos de rotación contra las paredes del tubo.

3º) se siembra la placa empleando la técnica de los tres giros, pasando el escobillon por toda la placa 2 o 3 veces antes de efectuar cada giro, para distribuir uniformemente él inoculo.

4º) se deja secar la placa 3-4 min. En posición semi abierta e invertida quedando lista para utilizar.

Esta técnica se emplea para el estudio de sensibilidad o inoculación directa de productos patológicos.

• En tubo: Existen dos técnicas: siembra en estrías y siembra en picadura.

• Siembra en estrías: En superficie inclinada, se siguen los siguientes pasos:

1º) se toma la muestra con el asa.

2º) se introduce en el tubo que contiene el medio.

3º) desde el fondo de la superficie y en progresión ascendente, deslizar el asa con movimientos de zig-zag.

Esta técnica se utiliza para obtener colonias, renovar cepas (resembrar) y pruebas biológicas.

• Siembra en picadura: Se siguen los siguientes pasos:

1º) se toma la muestra con la punta del hilo.

2º) se punciona en el centro del m.c. introduciendo la punta del hilo hasta 2-3 mm del fondo del tubo.

3º) se extrae el hilo por la misma línea que se introdujo.

4º) si se trata del medio inclinado (pico de flauta) se puede realizar una siembra en estrías con el mismo hilo por la superficie del medio.

Esta técnica se emplea para pruebas de identificación, movilidad, pruebas bioquímicas, hidrólisis de principios inmediatos etc.

2.- Por aislamiento

Se realizan en placa y hay dos tipos:

• Por dilución:

1º Disponer de tres tubos fundidos a 30-50 ºC previamente marcados con los números 1, 2 y 3.

2º Tomar con el asa estéril la muestra y sembrar en el tubo 1.

3º Homogeneizar el tubo 1 por dilación (entre las palmas de las manos) y tomar un asa del mismo tubo, resembrando al tubo 2 dejando el tubo 1 al baño maría a 45ºC.

4º Homogeneizar el tubo 2, tomar una muestra y pasarla el número 3 dejando el tubo 2 en el baño maría a 45ºC.

5º verter el contenido de cada uno de los tubos homogeneizados de nuevo en tres placas marcadas con los números 1, 2 y 3, esperar que solidifique el medio.

6º En la placa número 3 se obtendrán colonias aisladas.

• Por agotamiento: Hay cuatro modos:

• Siembra en estrías o zig-zag

1º Se deposita el inoculo en el extremo superior de la polaca.

2º Se siembra con el asa a partir del inoculo con un movimiento de zig-zag cada vez más amplio (en la línea media de la placa alcanza su máxima amplitud), para ello el asa debe contactar suavemente con la superficie del medio (no se debe presionar demasiado pues se agrietaría).

3º La siembra se efectuará hasta la zona distal del comienzo, donde se obtendrán colonias aisladas.

• Siembra en estrías múltiples

1º Se deposita el inoculo en el extremo de la placa.

2º Con el asa se reparten en varios tramos siguiendo el borde de la placa. Entre cada tramo se debe flamear el asa.

3º Los segmentos seguidos definen un poliedro regular. El último tramo se efectuará hacia el interior, donde se obtendrán las colonias aisladas.

• Siembra en los cuatro cuadrantes

1º Se divide la placa en cuatro cuadrantes (se puede rotular con rotulador de vidrio en la parte superior).

2º Se deposita el inoculo en la parte superior de uno de los cuadrantes y se siembra por estrías.

3º Sin flamear el asa se repite la operación en los tres cuadrantes, en cada uno de ellos se siembra el inoculo adherido al cuadrante anterior. Tenemos colonias aisladas en el cuarto cuadrante.

• Siembra en tres giros

1º Se siembra en estría la mitad de la placa.

2º Flamear el asa.

3º Se gira la placa 90º, sembrando en estría la mitad superior de la misma.

4º Se repiten los pasos 2º y 3º.

5º Las colonias aisladas aparecen en la zona sembrada en último lugar.

6.- ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS COLONIAS

El estudio morfológico se hace tanto macro como microscópicamente.

1.- Estudio macroscópico

Cuando una bacteria se cultiva en medio sólido se desarrolla una colonia. La morfología de dicha colonia y su entorno en relación con el medio donde se desarrolla es un dato orientativo y puede servir para identificar al microorganismo.

El aspecto de la colonia puede recordar algún objeto denominándose de la misma forma.

Hay que tener en cuenta que una bacteria puede dar colonias distintas en función del medio (ejemplo: salmonella en agar makonki da colonias distintas que en agar SS). El estudio de la morfología de colonias es solo orientativo, puesto que en determinados medios especies distintas pueden dar colonias similares.

Las colonias aisladas en placa se pueden clasificar atendiendo a:

• Forma: puntiforme, circular, filamentosa, ameboide, rizoide y fusiforme.

• Elevación: plana, convexa y umbonada.

• Borde: entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso y enrollado.

• Superficie: lisa, rugosa, brillante y mete.

• Color: relacionado con el medio de cultivo y el metabolismo del microorganismo.

• Consistencia: para determinarla es necesario tocar la colonia con el asa (mantecosa, grumosa)

Las colonias aisladas en agar inclinado pueden ser: filiformes, equinuladas, perladas, difusas, arborescentes y rizoides.

• Entorno colonial: Las modificaciones del entorno colonial más significativas son las hemólisis producidas en agar sangre (presencia de una zona de eritrocitos lisados alrededor de una colonia). Es un dato que resulta útil en la identificación inicial de ciertas bacterias, sobre todo Estreptococos. Pueden existir tres tipos de hemólisis:

• Hemólisis : La colonia está rodeada de una zona de eritrocitos parcialmente lisados frecuentemente acompañada de color marrón-verdoso o pardusco.

• Hemólisis : Las colonias están rodeadas de una zona clara del color del medio base lo que indica lisis completa de eritrocitos.

• Hemólisis : no se observa hemólisis aparente.

• Olor: Es otra característica que facilita la identificación del entorno colonial (aunque son muy subjetivos)

BACTERIAS	MEDIOS DE CULTIVO	OLOR
Pseudomonas	MK	Jabón
E.Coli	MK	Levadura de cerveza o pan
Proteus	MK	Fétido
Salmonella	Agar SS	Semen

2.- Estudio Microscópico

Está relacionado con el tamaño, forma y agrupación de las bacterias (visto en tema 2)

TEMA 8.- RECUENTO DE MICROORGANISMOS

1.- Introducción

El recuento de microorganismos es la determinación del número de microorganismos presentes en una muestra. Frecuentemente es conveniente su determinación pero además de la dificultad que presentan los resultados no permiten excesiva fiabilidad.

2.- Clasificación de las técnicas

1.- METODOS INDIRECTOS: Son aquellos en los que no se encuentran el número de microorganismo sino que se calcula a partir de otros parámetros. Los dividiremos en 3 grupos:

a.- Determinación analítica de moléculas: pertenecientes al microorganismo. Por ejemplo: proteínas, ADN…

b.- Métodos Gravimétricos: basados en la determinación del peso seco.

c.- Métodos Turbidimétricos: son los más utilizados.

2.- METODOS DIRECTOS: En ellos a cada uno se considera una unidad. Hay 3 tipos:

a.- Métodos directos totales: determinación del número de microorganismos vivos y muertos. Son métodos microscópicos y entre ellos destacamos:

• método de Breed o recuento de extensiones teñidas,

• método de Wright

• método de recuento en cámara.

b.- Directos culturales: contabilizan únicamente los microorganismos vivos, el mas utilizado: recuento de viables en placa.

c.- Semidirectos totales: por medio de contadores electrónicos de partículas.

Los más rápidos son los turbidimétricos y semidirectos. Su inconveniente es que requiere un aparataje sofisticado y no distingue entre microorganismos vivos y muertos.

3.- RECUENTO EN CAMARA

(apuntes Isabel López, 1º lab.)

4.- MÉTODO DE EXTENSIONES TEÑIDAS

• Fundamento: Se basa en contar los microorganismos de un volumen determinado de suspensión de los mismos tras la extensión y tinción de ésta. El método a desarrollar es el de Breed.

• Material: Portas, mechero, pipeta de 10 l, equipo de tinción, estufa y microscopio.

• Reactivos: Azul de metileno y suspensión de microorganismos.

• Técnica:

• Marcar un porta un cuadrado de 1cm de lado con ayuda de papel milimetrado.

• Invertir el porta y depositar en el cuadrado 10 l de la suspensión.

• Dejar secar al aire o en estufa.

• Fijar a la llama.

• Teñir con azul de metileno 3 minutos.

• Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.

• Contar los microorganismos existentes en 25 campos distintos situados en la diagonal.

• Resultados e Interpretación: Para el cálculo del microorganismo se tiene en cuenta:

A= Área del cuadrado marcado (100mm2)

C= Volumen de suspensión utilizada (10 l)

R= Radio del campo del microscopio (mm)

S= Superficie del campo del microscopio (r2)

V= Volumen de suspensión del microorganismo contada en 25 campos (l)

N= Número total de microorganismos contados en 25 campos

A __________ C

S.25 ________ V ! V = CS25/A = 10 r2 25 / 100 = 2.5 r2

V ___________ N

S.25 ________ X ! X= N / V = nº microorganismos / l

• Observaciones al método: La suspensión de microorganismos debe ser homogénea por todo el cuadrado, si no se desecha la preparación. En lugar de azul de metileno se puede utilizar cualquier colorante de la tinción simple (nigrosina, sudan IV, etc.)

5.- Recuento de viables en placa

• Fundamento: basado en que un microorganismo da lugar en un medio de cultivo a una colonia visible, por tanto el número de colonias contadas será igual al número de microorganismos existentes inicialmente.

• Material: pipeta de 1 ml, tubo de ensayo y placa de petri.

• Reactivos: solución salina estéril, medio de cultivo para el microorganismo y suspensión del microorganismo.

• Técnica:

1.- Tomar 1ml de la solución problema, homogeneizarla y añadirlo a 9 ml de solución salina estéril (suspensión 1/10).

2.- Homogeneizar.

3.-Tomar 1ml y pasarlo a otro tubo con 9ml de solución salina estéril (suspensión 1/100).

4.- Repetir la operación.

5.- De cada dilución se siembran un mínimo de tres placas estériles. Depositar en cada una 1ml del inóculo correspondiente y agregar 10ml de medio de cultivo, imprimiendo un movimiento de rotación con el fin de homogeneizar la muestra.

6.- Dejar solidificar e incubar a una temperatura adecuada según el tipo de microorganismo.

7.- Contar las placas cuyo número de colonias este entre 30-300.

• Resultado e interpretación: En primer lugar se calcula la media aritmética de las colonias contadas en las placas seleccionadas, esta se multiplica por la inversa de la dilución a la que se ha efectuado el recuento, con lo que se obtendrá el número de microorganismos viables por ml de muestra.

• Observaciones al método: El error más habitual radica en que una colonia se forma a partir de más de un microorganismo. No obstante tiene ventajas frente a los anteriores, no cuentan los microorganismos muertos o partículas contaminantes indistinguibles de los microorganismos en los recuentos microscópicos.

Si se dispone de material suficiente se preparan 10 placas, de este modo los resultados estadísticos son más representativos.

Hay que homogeneizar la muestra perfectamente.

El medio y las condiciones de cultivo deben ser las idóneas para el microorganismo estudiado.

Una alternativa empleada para el recuento de viables consiste en utilizar un asa calibrada con la que se siembra en placa.

TEMA 9.- DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN

1.- Conceptos básicos

• Asepsia: ausencia de microorganismos conseguida por métodos físicos.

• Antisepsia: ausencia de microorganismos conseguida por métodos químicos.

• Desinfección: técnica de saneamiento encaminada a eliminar elementos patógenos.

• Esterilización: técnica de saneamiento encaminada a eliminar cualquier forma de vida patógena, no patógena o formas de resistencia como esporas.

• Desinfectante: sustancia antimicrobiana que no puede aplicarse sobre superficies vivas.

• Bactericida: sustancia que destruye a las bacterias.

• Bacteriostático: sustancia que impide el crecimiento y multiplicación de las bacterias.

Desinfectante

Se utiliza para destruir las formas de vida patógenas, el ideal es el que más se aproxime al concepto de esterilización, pero están muy lejos de conseguirlo. Según el microorganismo sobre el que actúe se denomina:

• Bactericida, si destruye bacterias.

• Viricida, si destruye virus.

• Funguicida, si destruye hongos.

Normalmente los desinfectantes son bactericidas y los antisépticos son bacteriostáticos.

Hay que tener en cuenta que muchos desinfectantes cuando se utilizan de forma errónea pueden estimular el desarrollo de los organismos al seleccionarse las cepas más resistentes que son las más virulentas.

Esterilización

Un objeto puede estar desinfectado pero no esterilizado, mientras que el objeto esterilizado esta desinfectado también.

Experimentalmente se comprueba que la esterilización no destruye el 100% de los microorganismos. Sólo se conseguirá la asepsia con temperaturas y tiempos muy elevados (que son inoperantes).

Para que el método de esterilización sea útil debe destruir el 99,99% de los microorganismos.

Antes de desinfectar o esterilizar hay que limpiar bien el material de restos de materia orgánica ya que estos dificultan dicho proceso.

Vamos a aclarar dos conceptos:

• Material estéril: Es aquel objeto que tras ser esterilizado sigue manteniendo esta propiedad en el tiempo a la hora de ser utilizado, pues se le han aplicado medidas para ser estéril.

• Material esterilizado: Ha sido esterilizado y en el momento de usarlo ya no se conserva la esterilidad, ya que no se le han aplicado las medidas para conservarlo.

2.- MÉTODOS DE DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN

1.- MÉTODOS FÍSICOS

a.- Métodos Térmicos

Factores que influyen en la muerte de microorganismos por calor

1.- Número de microorganismos: Al aumentar en número de microorganismos aumentará la intensidad del tratamiento aumentando la temperatura o el tiempo.

2.- Naturaleza del microorganismo: Las formas vegetativas son más sensibles que las esporas.

3.- Temperatura: Al aumentar la temperatura hasta cierto límite aumenta la efectividad y rapidez.

4.- Tiempo de actuación: Generalmente el tiempo de actuación se relaciona con la temperatura, jugando con ambos. Si se aumenta la temperatura disminuye el tiempo y si disminuye el tiempo se aumenta la temperatura, es decir, con frecuencia estas dos variables se comportan de forma inversa.

5.- Tiempo de duración: Hay que tener en cuenta la suma de:

• Tiempo de penetración: Tiempo necesario para que el material adquiera la temperatura de esterilización.

• Tiempo de calefacción: Tiempo requerido para que dicha temperatura destruya la población microbiana.

• Tiempo de seguridad: Se asigna de forma arbritaria.

Los sistemas enzimáticos de las bacterias tienen una temperatura óptima para actuar, pero por encima y por debajo de dicha temperatura también siguen viviendo, son las temperaturas máximas y mínimas. Por ejemplo en E.Coli el intervalo de temperatura oscila entre 8º-47ºC y en N.Gonorreae 30º-40ºC. Según esto, los intervalos de temperatura pueden ser grandes o pequeños en función de los microorganismos.

Se pueden distinguir:

• Bacterias psicrófilas: Intervalo de temperatura oscila entre 0º-30ºC. Ejemplo: Pseudomonas.

• Bacterias mesófilas: Intervalo de temperatura oscila entre 20º-45ºC. Son las más numerosas y patógenas. Incluyen:

• 20º-24ºC: gérmenes saprofitos y parásitos de plantas superiores.

• 35º-45ºC: gérmenes saprofitos y parásitos del hombre y animales superiores.

• Bacterias termófilas: Temperatura óptima está por encima de los 45ºC. Habitan en suelo y aguas termales.

El frío no mata a los microorganismos sino q impide su reproducción.

Se dan 2 tipos de métodos térmicos:

• CALOR HUMEDO: Puede ser a través de H20 o vapor.

• H2O

• Ebullición: en el lab. Se utiliza poco no es muy fiable en el sentido estricto, no es un método de esterilidad ya que no destruye a las esporas. Consiste en introducir el material en H2O húmeda durante unos 10 minutos.

• Pasteurización: no mata las formas de resistencia, es muy útil en tecnología de alimentos. Ej: leche. Podemos distinguir 2 tipos de pasteurización:

• pasteurización alta: se consigue con Tª de 72-75 º durante 15 minutos.

• Pasteurización baja: se consigue con Tª de 63º durante 30 minutos.

• Tindalizacion: es un método de esterilizaciones sucesivas, se utiliza en microbiología cuando existen problemas de contaminación en el autoclave. Consiste en esterilizaciones repetidas a lo largo de 3 o 4 días. Teóricamente no se deben alcanzar Tª superiores a 100º y durante este intervalo no se debe abrir el aparato que se somete a la tindalizacion. El objetivo es destruir esporas cuando germinan, así como evitar contaminación con microorganismos resistentes. La tindalizacion se lleva a cabo a 65º durante 30 minutos cada día, durante 4 días. El resto del tiempo se mantiene a 30-35º.

• Uperizacion: es muy útil en industrias alimentarias, se realiza a una Tº aproximada de 150º durante 1-5 segundos. No se alteran las propiedades organolecticas (son atributos, aquellas que podemos apreciar a través de los sentidos, ej: color, olor, sabor) y se produce esterilización.

• VAPOR

• A chorro: se alcanzan Tª de hasta 100º, es un método poco utilizado en microbiologia.

• Autoclave: es un recipiente cilíndrico que se cierra herméticamente. Externamente lleva un manómetro, un reloj de Tª y otro para el tiempo. En el interior tiene un cestillo donde se introduce el material a esterilizar. La esterilización se puede conseguir a 1 atm. 20 minutos a 120 º. No abrir hasta que la presión no este en cero.

• CALOR SECO:

• Flameado: poner algo a la llama.

• Incinerado: se lleva a cabo en crematorios.

• Horno pasteur o poupinel: la esterilización se consigue a 180º 2 h. o 160º en 3h y media.

La esterilización se lleva a cabo: se preparan los instrumentos a esterilizar que deberán estar debidamente protegido. Se introduce en la estufa, se conecta y se selecciona la Tª en el termostato y el tiempo en el reloj (si lo hubiera). Comenzara a contabilizar cuando alcance la Tª deseada, transcurrido el tiempo se desconecta el interruptor y dejamos que baje la Tª, los materiales que se pueden esterilizar por este método son: porcelana, vidrios y no para m.c. , plástico.

b.- Radiaciones

• Ionizantes: son fundamentalmente R. alfa y R. gamma. Destruyen las bacterias al actuar los ac. Nucleicos y enzimas. Presentan un poder de penetración alto.

• No ionizantes: son R. UV no son muy útiles porque son poco penetrantes, solo aseptizan la superficie.

2.- METODOS MECANICOS

• Filtros: con poro de menor tamaño que las bacterias por lo que las retienen, se hacen con barro y otras sustancias, generalmente los virus pueden atravesarlos.

• Ultrasonido: consiste en introducir en tanques de distintos tamaños que contienen líquido desinfectante. Una vez puesto en marcha el dispositivo comienza a vibrar a gran velocidad ocasionando pequeñas burbujas que entran en todos los recodos consiguiendo eliminar todos los microorganismos. Es un método poco utilizado ya que es aro y poco practico.

• Agitación: se lleva a cabo por perlas de vidrios.

3.- SALES MINERALES

• Medios hipotónicos: colocar una bacteria en este medio tiende a coger H2O hasta estallar. Esto es solo teoría ya que en la práctica la pared bacteriana la protege.

• Medios hipertónicos: colocar una bacteria en este medio pierde H2O hasta deshidratarse, con lo que se frena la multiplicaron pero no se destruye.

4.- COMPUESTOS QUIMICOS: van a producir la destrucción de todos los microorganismos patógenos.

Todo buen material de desinfección debe cumplir:

1º) matar al mayor nº de gérmenes o al menos a todos los patógenos.

2º) ser económico y de fácil adquisición.

3º) no ser corrosivo (material), toxico (para personas, animales o plantas) ni irritantes para los tejidos.

4º) que posea un alto poder de penetración.

5º) olor agradable.

6º) estabilidad y homogeneidad de composición y difusión.

Las técnicas mas empleadas para su uso son:

• inmersión

• loción

• nebulizacion

• pulverización

Los desinfectantes y antisépticos más utilizados son:

• Compuestos inorgánicos

• Detergentes catiónicos: se utilizan derivados del R-NH4 , los más empleados son:

• Cloruro de Benzalconio

• Cetrimida

Se suelen emplear para la limpieza y desinfección de paredes, ropa, etc.

• Detergentes aniónicos: como por ejemplo el uridilsulfato sódico.

• Metales pesados: son derivados del mercurio, la más conocida es la mercromina que generalmente se emplea como antiséptico.

• Halógenos: existen dos tipos:

• Derivados del cloro: se utilizan en forma de gases o hipoclorito (lejía). Se utilizan principalmente para el saneamiento de aguas.

• Derivados del yodo: se utilizan en solución alcohólica como la tintura de yodo (Betadine).

• Agentes oxidantes: como el agua oxigenada.

• Compuestos orgánicos

• Alcoholes: se utilizan como antiséptico y desinfectante sobre el filo de algunas superficies. Se emplea el etanol o alcohol etílico para tejidos y metanol para superficies que no vayan a estar en contacto con la piel.

• Fenoles: se utilizan para la desnaturalización de proteínas. Los más utilizados son el resorfinol, hexaclorofeno, zotal, etc. muy utilizada es la clorohexidina que se puede considerar lo más parecido a un antiséptico ideal, junto con el Betadine, ya que actúa sobre gram + y -, hongos, virus, etc.

• Aldehídos: se utilizan principalmente vapores de formol y glutaraldehído.

• Oxido de etileno: es un gas tóxico que con el aire forma una molécula explosiva, por lo que se utiliza en cámaras de oxido de etileno a 4-6 atm. y mezclado con un gas inerte como dióxido de carbono queda adsorbido en el material por lo que una vez estabilizado hay que airear dicho material.

Presenta un gran poder de penetración y se aplica a cualquier material resistente al calor y que no puede desinfectarse por otros métodos. Ej: instrumentos para endoscopia, plásticos termolábiles, cauchos, etc.

El material esta disponible para ser utilizado a las 48 horas después de su esterilización y deberá conservarse estéril en bolsas cerradas por procedimientos termoeléctricos. La duración de la esterilización es de aproximadamente 6 semanas.

• -propiolactona: es un líquido muy tóxico que se utiliza para esterilizar material sensible al calor.

Podemos generalizar y decir:

• que para esterilizar se utiliza:

• Calor.

• Radiaciones.

• Formol

• Glutaraldehído.

• Oxido de etileno.

• .propiolactona.

• que para desinfectar se utilizan:

• ácidos y álcalis.

• Algunos halógenos.

• Glutaraldehído.

• que como antisépticos se utilizan:

• Detergentes.

• Metales pesados.

• Derivados halogenados.

• Agentes oxidantes.

• Alcoholes.

• Fenoles.

Actualmente son ampliamente empleadas mezclas de desinfectantes para aumentar la potencia o espectro de acción. Las asociaciones más utilizadas son:

• Clorhexidina con cetrimida

• Mercuriales orgánicos con detergentes aniónicos y fenoles.

3.- CONTROLES DE ESTERILIDAD

Sirven para comprobar la eficacia del proceso de esterilización. Podemos distinguir:

a.- De tipo Físico: Son sistemas de control incluidos en sistemas de esterilización. Ejemplo: manómetros, termómetros, vacuómetros (miden el vacío) y registros gráficos de distintos parámetros.

b.- De tipo Químico: Son cintas adhesivas en las que se produce un cambio de color si se ha estilizado bien.

c.- De tipo Biológico: Sistemas comerciales en forma de cápsula cerrada en cuyo interior hay esporas. Dichas cápsulas tras haber sido sometidas a esterilización se incuban a 40º-45ºC durante 48-64 horas y se procede a la lectura donde la germinación y cambio de color indicará en cada caso que no se ha producido condiciones de esterilización.

4.- EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE. DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE FENOL (práctica)

• Fundamento: Se puede determinar la potencia de un desinfectante problema utilizando como patrón el fenol. Para ello se compara el poder germicida a distintas concentraciones.

• Material: Tubos de ensayo, pipetas de 2 y 5 ml, gradilla, asa de siembra, estufa de cultivo, cronómetros o relojes.

• Reactivos: Fenol, desinfectante problema, caldo nutritivo y microorganismo problema.

• Técnica:

• Se preparan 4 tubos con 5 ml de cada una de las diluciones crecientes del desinfectante a titular. Las diluciones son: 1/100, 1/200, 1/400 y 1/800.

• De la misma forma se preparan 4 tubos con 5ml de cada una de las diluciones crecientes de fenol (patrón) cuya concentración es el doble del antiséptico problema. Las diluciones son: 1/50, 1/100, 1/200 y 1/400.

• Se llevan los todos los tubos al baño maría a 37ºC durante 5 minutos.

• Se añade a cada tubo 1.5ml de la suspensión de microorganismos problema.

• Pasados 5 minutos se toman de cada tubo un asa y se siembra en caldo nutritivo. Se efectúa la misma operación a los 10 y 15 minutos.

• Se incuba durante 48 horas a 37ºC en estufa. El crecimiento puede verse por turbidez, cambio de color, precipitado blanco lechoso, etc.

• Resultados e Interpretación: El coeficiente final es la relación existente entre el inverso de la mayor dilución del desinfectante problema que no inhibe los microorganismos en 5 minutos de contacto pero sí en 10 minutos y la mayor dilución del fenol que se comporta igualmente.

TEMA 10.- TIPACIÓN BIOQUÍMICA

1.- Introducción.

2.- Clasificación.

3.- Requerimientos nutritivos. Factores V y X.

4.- Pruebas del metabolismo hidrocarbonado (oxidativo y fermentativo).

• O-F de Hung y Lesión.

• Producción de ácido- gas.

• -D-Galactosidasa.

1.- INTRODUCCIÓN

Los microorganismos como seres vivo tienen su propio metabolismo:

• Anabolismo: relacionado con síntesis para lo que se requiere energía.

• Catabolismo: relacionado con degradación con ganancia de energía.

Estas reacciones vienen regidas por unos biocatalizadores de naturaleza proteica denominados enzimas, los cuales son característicos para cada germen, por lo que la detección “in vitro” del conjunto de estos enzimas es de gran utilidad en el proceso de identificación microbiológica.

La presencia de enzimas se investiga de dos formas:

• Sembrando el microorganismo en un medio que contenga el sustrato a investigar con posterior incubación en condiciones adecuadas. Ej: prueba de Hung y Leifson o la reducción de nitratos.

• Cultivando previamente en un medio que o contenga el sustrato y posteriormente se pone en contacto con él. Ej: prueba de la oxidasa, de la catalasa.

La tipación bioquímica puede realizarse sobre un cultivo puro. El número y tipo de pruebas bioquímicas a realizar sobre el germen depende de los primeros datos del examen microbiológico:

• morfología del germen y sus colonias.

• características tintoriales.

• medios donde crecen, etc.

2.- CLASIFICACIÓN

(fotocopias)

3.- REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS. FACTORES V y X.

Algunos microorganismos son muy exigentes nutricionalmente y requieren para su desarrollo la presencia de sustancias específicas llamadas factores de crecimiento, vitaminas, aminoácidos, factores de la coagulación, etc. El ejemplo más conocido en bacteriología es el de Haemophylus que precisa del factor X, V o ambos para desarrollarse de forma óptima.

Las bacterias Haemophylas crecen bien en sangre entera, la cual aporta ambos principios:

• Factor X o hemina: es una sustancia termoestable derivada de la Hb.

• Factor V o coenzima I (NAD): es una sustancia termolábil.

• Fundamento: FV y FX por ser hidrosolubles difunden rápidamente en medio sólidos como el agar, si se depositan tiras de papel de filtro impregnadas en estos factores en un medio dificultorio de los mismos se puede conocer la necesidad de F V y X del microorganismo estudiado, observando el desarrollo de las colonias alrededor de las tiras.

• Material: placa de petri, asa, pipeta Pastear, pipeta calibrada y tubos estériles.

• Reactivos: medio deficiente de F V y X, como agar Mueller-Hilton, caldo infusión de cerebro corazón, tiras de papel de filtro impregnadas en F V y X respectivamente y microorganismos.

• Técnica:

1.- A partir de un cultivo puro del microorganismo problema preparar una suspensión de 2-3 ml de caldo infusión cerebro corazón (BHI).

2.- Realizar con esta suspensión una siembra de inoculación en una placa con agar Mueller-Hilton, preferiblemente por la técnica de Kirby Bauer.

3.- Colocar una tira con el FV y otra con el FX en la superficie del agar presionando suavemente, deben estar separadas por 1 cm.

4.- Incubar a 37ºC 18-24 horas.

• Resultados e interpretación

Se observa si existe crecimiento alrededor de las tiras:

• 1º Caso: microorganismo requiere FX.

• 2º Caso: microorganismo requiere FX.

• 3º Caso: microorganismo requiere ambos factores.

Si el microorganismo estudiado es Haemophylus se cultivará en una atmósfera del 5-10% de CO2.

4.- PRUEBAS DEL METABOLISMO HIDROCARBONADO

La utilización por un microorganismo de los hidratos de carbono tiene lugar por alguno de estos procesos:

• metabolismo oxidativo

• metabolismo fermentativo

La oxidación de hidratos de carbono es un proceso aeróbico y lo realizan los microorganismos aerobios obligados o estrictos.

La fermentación es un proceso anaeróbico efectuado por microorganismos aeróbicos y anaeróbicos facultativos.

Las diferencias entre el metabolismo oxidativo y fermentativo están presentes en el esquema siguiente:

	Metabolismo fermentativo	Metabolismo oxidativo
Producción de ácido	Aeróbica y anaeróbicamente	Aeróbicamente
Producción de gas	Pueden producirlo	No
Grado de acidez	Alto	Bajo
Fosforilación de glucosa	Sí	No
Último aceptor de e- en la cadena respiratoria	Sustrato orgánico	Oxígeno

Las pruebas del metabolismo hidrocarbonato son:

1.- PRUEBA O.F. DE HUNG Y LEYSON

• Fundamento: Se basa en que el metabolismo oxidativo sólo produce ácido en la superficie del medio mientras que en el fermentativo el ácido es producido en todo el medio, incluso en las zonas de anaerobiosis; además en caso de aparición de gas éste sólo se forma en el metabolismo fermentativo.

La formación de ácido se detecta por el viraje de un indicador de pH mientras que la de gas por la aparición de burbujas dispersas, grietas o porque el medio se despega del fondo.

La prueba se puede realizar sobre distintos HC, los más utilizados son glucosa, lactosa, sacarosa y maltosa.

Entre las principales aplicaciones de esta prueba están:

• Diferenciar géneros intestinales:

• Enterobacterias: fermentan la glucosa

• Pseudomonas: oxidan la glucosa

• Moxarella, Alcalígenas, Acinetobacter: ni fermentan ni oxidan la glucosa

• Diferenciar géneros de la familia Micrococaceae:

• Staphylococo: fermentan la glucosa

• Micrococus y Planococus: oxidan la glucosa

• Material: Tubos de cultivo, hilo de siembra, pipeta de 10 ml, algodón, mechero y estufa de cultivo.

• Reactivos: Medio básico de Hung y Leyson, parafina o vaselina estéril, solución de HC al 10% y microorganismo.

• Técnica:

1.- Agregar al medio básico de Hung y Leyson un 10% de la solución de HC con lo que se obtiene una dilución final del 1%.

2.- A partir de un cultivo puro y joven de microorganismo problema se toma una muestra con el hilo. Se siembra en picadura 2 tubos con el medio H-L. Un tercer tubo no inoculado actuará como control negativo.

3.- Calentar uno de los dos tubos cultivados para que el CO2 del medio se desprenda y se sella con 1-2 ml de vaselina o parafina fundida para mantener la anaerobiosis.

4.- Se incuba a 37ºC durante 48-72 horas y en algunas ocasiones se requieren hasta 14 días de incubación.

• Resultados e Interpretación: Si se forma ácido el medio virará de verde a amarillo. La producción de gas se verá en burbujas, grietas, elevación del medio, etc.

La interpretación de resultados posibles se detalla en el siguiente esquema:

	Tubo abieto	Tubo cerrado
Fermentación anaerogénica	Amarillo	Amarillo
Oxidación	Amarillo	Verde
No oxidación ni fermentación	Verde	Verde
Oxidación y fermentación	Amarillo	Amarillo

El tubo de control siempre será de color verde quede cerrado o abierto.

• Observaciones al método: Para microorganismos con requerimientos nutritivos se agrega al medio básico de H-L un 2% de suero o 0.1% de extracto de levadura. En esta prueba se puede observar la movilidad del microorganismo ya que hará un zig-zag en el medio.

2.- PRODUCCIÓN ÁCIDO-GAS

• Fundamento: Se basa en el viraje del indicador de pH al producirse ácido. La producción de gas se detecta por la retención de éste en una campana de Durham. Al igual que en la prueba O.F. se puede realizar sobre distintos HC. Su aplicación fundamental es la investigación de la capacidad degradativa de un HC por el microorganismo.

• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, campana de Durham, pipeta de 10 ml, algodón, mechero y estufa de cultivo.

• Reactivo: Agua de peptona, solución al 10% de HC, solución al 1% de rojo fenol y microorganismo.

• Técnica:

1.- Mezclar 900 ml de agua de petona, 100 ml de solución de HC al 10% y 1ml de la solución de rojo de fenol al 1%.

2.- Llenar 2 tubos de ensayo con la campana de Durham con 5ml del medio preparado.

3.- Esterilizar en autoclave.

4.- A partir de un cultivo joven y puro de un microorganismo tomar una muestra con el asa. Se inocula en uno de los tubo mientras que el otro actúa de control negativo.

5.- Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.

• Resultados e Interpretación: Si se produce ácido el medio virará de color rojo a color amarillo. La producción de gas se detecta en la acumulación de éste en la campana de Durham.

• Observaciones al método: La campana de Durham de estar llena de caldo nutritivo en el momento de incubar ya que la sola presencia de un burbuja de gas indica la formación del mismo si queremos ver la presencia de ácido y gas a partir de lactosa por medio de Enterobacterias. El medio descrito se sustituye por el caldo McKonkey que lleva lactosa. En la preparación del medio de cultivo se puede sustituir el rojo de fenol por otros indicadores a la misma concentración, como: azul de bromotimol o púrpura de bromocresol.

3.- PRUEBA DE LA -D-GALACTOSIDASA

Determina la capacidad de fermentar la lactosa. Los microorganismos que fermentan la lactosa de forma activa poseen dos enzimas:

• Lactosa permeasa: localizada en la membrana celular y relacionada con el transporte de la lactosa.

• -D-galactosidasa: enzima intracelular capaz de desdoblar la lactosa en glucosa y galactosa.

Según actúen sobre la lactosa los microorganismos se clasifican en:

• Fermentadores activos de lactosa: poseen ambos enzimas y la catabolizan rápidamente (antes de 24 horas)

• No fermentadores de lactosa: carecen de ambos enzimas y no penetran en la célula ni es degradada la lactosa.

• Fermentadores tardíos de lactosa: carecen de lactosa permeasa pero pueden fermentar la lactosa porque tienen -D-galactosidasa. Estos microorganismos en presencia de altas concentraciones de lactosa son capaces de permeabilizarse ligeramente a la lactosa y fermentarla entre 2-15 días.

La principal aplicación de esta prueba es la diferenciación de Enterobacterias: da positiva esta prueba E.coli, Yersinia, Klebsiella y Shigella y la da negativa Salmonella y Proteus.

• Funadamento: Se puede detectar el enzima -D-galactosidasa empleando ortonitrofenil--D-galactopiranósido (ONPG), compuesto de estructra similar a la lactosa en el que la glucosa ha sido sustituida por el ortonitrofenol, el cual liberado en medio alcalino, por acción de la -D-galactosidasa, produce un color amarillo. Esta reacción se produce en un intervalo máximo de 24 horas.

( La lactosa se pone en contacto con el microorganismo; si el microorganismo posee la -D-galactosidasa desdoblará la lactosa, si no la posee no la desdoblará).

• Material: Tubo de ensayo, asa de siembra y baño o estufa a 37ºC.

• Reactivos: Solución tamponada a pH 7 de ONPG y microorganismo.

• Técnica:

1.- A partir de un cultivo puro preparar una suspensión densa de microorganismo en 0,5ml de suero fisiológico estéril.

2.- Añadir una gota de tolueno a la suspensión y mezclar. (Así se consigue la liberación de la -D-galactosidasa de la bacteria).

3.- Agregar 0,5ml de solución tamponada de ONPG.

4.- Incubar a 37ºC y leer antes de 24 horas.

• Resultados e Interpretación:

• ONPG positivo: color amarillo. Algunos microorganismos lo producen en 5-10 minutos, la mayoría antes de 1 hora.

• ONPG negativo: incoloro. No se debe interpretar como negativo antes de 24 horas de incubación.

• Observaciones al método: La solución de ONPG se puede sustituir por tabletas o discos comerciales.

Los microorganismos ensayados en esta prueba deben provenir de un medio con lactosa (ej: kliger).

La solución de ONPG recién preparada debe ser incolora y se puede emplear un control positivo (E.coli) y otro negativo (Proteus).

La solución debe conservarse en frascos de olor topacio a 4ºC y antes de emplearse se debe atemperar a 37ºC para redisolver el fosfato que cristaliza durante la conservación.

Es importante utilizar un inóculo concentrado para obtener una elevada concentración de enzima y así acelerar la velocidad de reacción.

TEMA 11.- TIPACIÓN BIOQUÍMICA II

1.- Metabolismo proteico

• Hidrólisis de la gelatina.

• Producción de sulfhídrico.

• Prueba de las descarboxilasas.

2.- Pruebas enzimáticas.

• Prueba de la oxidasa.

• Prueba de la catalasa.

• Prueba de la coagulasa.

• Pruebas de la ureasa.

• Prueba de reducción de nitratos.

1.- METABOLISMO PROTEICO

1.- Hidrólisis de la gelatina

Las proteínas exógenas son muy grandes para entrar en la célula bacteriana por tanto para poder ser utilizadas deben hidrolizarse con enzimas extracelulares de tipo proteolítico.

Estas enzimas son secretadas por ciertas bacterias y esta capacidad es utilizada para su tipación.

El catabolismo de las proteínas por enzimas proteolíticas es un proceso en dos etapas:

1º proteínas + H2O proteinasa polipéptidos.

2º polipéptidos H2O + proteinasa aminoácidos.

Con esta técnica se permite diferenciar distintas especies, como por ejemplo Psudemonas aurogenosa(da +), Serratia (da +) y Listeria monocitogenes (da -).

Debemos tener en cuenta que la gelatina entre 20-25ºC es sólida y a temperaturas superiores a 28ºC se licua.

• Fundamento: Se siembra en picadura un tubo con gelatina nutritiva, observándose la licuefacción por la acción de las gelatinas.

• Material: Hilo, tubos, algodón, mechero, pipeta 10ml, estufa de cultivo.

• Reactivos: Medio gelatina nutritivo y microorganismo.

• Técnica:

1.- Se preparan dos tubos con gelatina nutritiva estéril. Para su llenado se licua el medio tras lo cual se solidifica con inmersión en hielo.

2.- A partir de un cultivo joven y puro de microorganismo problema se toma una muestra con el hilo.

3.- Se siembra en picadura 1 tubo, el otro se punciona con el hilo estéril (actuará como control -).

4.- Incubar a 22-25ºC de 1-14 días.

• Resultados e interpretación:

• Hidrólisis de gelatina +: se produce una zona de licuefacción con ensanchamiento en la línea de punción.

• Hidrólisis de gelatina - : no se produce ensanchamiento en la línea de punción.

2.- producción de sulfhídrico (H2S)

• Fundamento: Algunos microorganismos son capaces de liberar azufre en forma de H2S (gas) como producto final de la acción metabólica sobre proteínas con aminoácidos azufrados.

Dan reacción + : Proteus vulgaris y Proteus mirabilis.

Dan reacción -: Proteus morganii y Proteus rettegeri (permite distinguir distintos especies de Proteus)

También permite distinguir distintas Pseudomonas.

• Técnica:

1.- A partir de un cultivo joven y puro del microorganismo problema se toma una muestra con el hilo.

2.- Se siembra en el medio AHP (Agar con Hierro y Peptona).

3.- Incubar a 37ºC durante 18-24 horas.

• Resultados e interpretación:

• Sulfhídrico + : ennegrecimiento del medio.

• Sulfhídrico - : no ennegrecimiento del medio.

3.-PRUEBAS DE LAS DESCARBOXIDASAS

Son un grupo de enzimas capaces de atacar el grupo carboxilo de los aminoácidos para formar aminas con desprendimiento de CO2.

Este proceso se realiza en anaerobiosis.

Cada descarboxilacion es específica de un aminoácido: lisina, arginina y ornitina son los 3 aminoácidos más utilizados en la tipacion bioquímica:

LISINA --------------------- CADAVERINA + CO2

(LDC= Lisina descarboxidasa)

ORNITINA ----------------- PUTRESCINA + CO2

(ODC= Ornitina descarboxidasa)

ARGININA -------------- CITRULINA + NH3 --------- PUTRESCINA + CO2

(ADC= Arginina descarboxidasa)

Son pruebas importantes para el estudio de las Enterobacterias. En los 3 procesos se produce una alcalinización del medio con desprendimiento de CO2.

• Fundamento: Si a un medio base (medio general) con un indicador de pH se le añade los aminoácidos correspondientes al enzima estudiado y posteriormente se le añade el microorganismo, el viraje del indicador del pH indicará la alcalinización del medio y por tanto la presencia del enzima estudiado

DC

R - CH - COOH !!!!! R - CH2 -NH2

% CO2 básico (ANAEROBIOSIS)

NH2

Amarillo Rojo púrpura

• Material: Tubo de ensayo y asa.

• Reactivos: Caldo de Moeller para descarboxilasa, aminoácidos ensayados, parafina o vaselina estéril y microorganismo.

• Técnica:

1.- Se preparan 4 tubos:

• T1 (C) 5 ml Caldo Moeller ! Control

• T2 (L) 5 ml Caldo Moeller + L. Lisina (1% con respecto al caldo)

• T3 (O) 5 ml Caldo Moeller + L. Ornitina (1% con respecto al caldo)

• T4 (A) 5 ml Caldo Moeller + L. Arginina (1% con respecto al caldo)

2.- A partir de 1 cultivo joven y puro del microorganismo problema se inoculan los 4 tubos.

3.- Sellarlos con 2-3 ml de parafina estéril (aprox. 1 cm de altura).

4.- Incubar 35º C 18-24 horas.

• Resultados e interpretación: Si el aminoácido es descarboxilado se forman aminas que alcalinizan el medio dando un color rojo púrpura (la prueba es +). Si la prueba es - el primer tubo es de color amarillo.

NOTA: el pH del caldo de Moeller es igual a 6.

2 .- PRUEBAS ENZIMATICAS

1.- PRUEBA DE LA OXIDASA

La oxidasa es el enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxigeno, en general se detecta en los microorganismo aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella.

Se denomina también citocromo oxidasa y sirve para diferenciar Pseudomonaceae de los miembros oxidasa negativa de Enterobacteriaceae.

Ayuda a diferenciar entre los géneros Moraxella + y Neiseria + de Acinetobacter -.

• Fundamento: consiste en la utilización de indicadores susceptibles de ser oxidados en presencia de oxidasa.

Estos tienen la propiedad de ser incoloros en estado reducido y colorearse al ser oxidados (cesión de electrones a la oxidasa).

Entre los indicadores más utilizados se encuentran los derivados de la parafenilendiamina que por acción de la oxidasa dan indofenol.

• Material: Placa de petri, mechero, estufa de cultivo, papel, placa de cultivo, asa, pipeta de 10 ml y pipeta Pasteur.

• Reactivos: Agar sangre, microorganismo y reactivo oxidasa de Kovacs.

• Técnica:

1.- Cultivar el microorganismo problema en una placa de petri con agar sangre.

2.- Colocar un papel de filtro de 6 cm2 en la placa de petri vacía y estéril.

3.- Depositar 2-3 gotas del reactivo oxidasa de Kovacs en el centro del papel.

4.- Recoger con el asa una colonia de la placa con agar sangre y extenderla en el papel.

5.- Leer el resultado a los 5-10 sg.

• Resultados e interpretación:

• Oxidasa + : aparición de color negro púrpura (violeta).

• Oxidasa - : no se produce color.

2.- PRUEBA DE LA CATALASA

La catalasa es una enzima que actúa sobre el peroxido de hidrogeno (H2O2) según la reacción:

catalasa

2 H2O2 -------------------------------- 2H2O2 + O2 (gas)

BURBUJAS

El H2O2 se forma como producto terminal oxidativo de la degradación aeróbica de los hidratos de carbono. Si se acumula es toxica para los microorganismos y produce la muerte por lo que la catalasa es imprescindible para su desarrollo.

Entre sus aplicaciones se encuentra la diferenciación de:

• Staphylococo, Bacillus, Listeria monocitogenes ! positivo

• Estreptococo, Micrococo, Clostridium ! negativo

• Fundamento: Se basa en poner en contacto el microorganismo posible productor de catalasa con un sustrato natural (H2O2) y observar la presencia del enzima por la aparición de gas.

• Material: Porta, pipeta pasteur, asa y mechero.

• Reactivos: Agua oxigenada al 30% y microorganismo.

• Técnica:

1.- Recoger con un asa una colonia de 18-24 horas.

2.- Colocar en un porta.

3.- Agregar sobre el microorganismo una gota de agua oxigenada al 30%.

• Resultados e interpretación:

• Catalasa + ! formación inmediata de burbujas de O2.

• Catalasa - ! no aparecen burbujas.

• Observaciones al método: No utilizar m.c. que tengan hematíes. Ej.: agar sangre, agar chocolate, puesto que estos contienen catalasa por lo que podrían producir falsos negativos.

El agua oxigenada es inestable y se descompone con la luz, por ello hay que mantenerlo en refrigerador y en frascos opacos.

3.- PRUEBA DE LA COAGULASA

Enzima producida por ciertos microorganismos que es capaz de coagular en plasma. Se utilizan para diferenciar Staphyloocos Aereus de otras especies.

• Fundamento: Consiste en poner en contacto el microorganismo problema con el plasma para observar la coagulación de este por la acción de la coagulasa.

• Material: Tubo de hemólisis, pipeta de 0,5 ml., asa, mechero, baño, estufa de cultivo.

• Reactivos: Plasma humano o plasma de conejo y microorganismo.

• Técnica:

1.- Colocar en un tubo de hemólisis estéril 0,5 ml. de plasma

2.- Agregar 0,5 ml de un cultivo de 18-24 h en medio liquido del microorganismo problema. En caso de partir de un medio sólido, tomar con el asa 2 o 3 colonias y emulsionarlas en el plasma.

3.-Homogeneizar con rotación suave en los tubos.

4.- Incubar al baño Mª a 37º. Observar cada 30 min. si hay coagulación, durante 4 h. Si a las 4 h no hay coagulo visible se deja en estufa de cultivo a 37º durante 24 h.

• Resultados e interpretación:

• Coagulasa + ! formación de coagulo.

• Coagulasa - ! no formación de coagulo.

• Observación al método: la prueba se puede realizar mezclando una gota de plasma más una gota de microorganismo en un porta. Si la reacción es + se detecta un precipitado en forma de aglutinado blanco.

4.- PRUEBA DE LA UREASA

La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica denominada ureasa dando carbonato amonico como producto final con la consiguiente alcalinización del medio:

ureasa

NH2-CO-NH2 + H2O ----------------- CO2 +2NH3 ! CO3 (NH4)2

ROJO

• Fundamento: Se basa en el viraje del indicador de ph debido a la alcalinización del medio por el carbonato amonico producido por la acción de la ureasa sobre la urea del cultivo.

• Material: Tubos de cultivo, asa, pipeta de 10 ml, estufa de cultivo, mechero, algodón.

• Reactivos: Microorganismo agar uera de Christensen.

• Técnica:

1.- A partir de un cultivo puro y joven se toma una muestra con el asa.

2.- Inocular en la superficie del tubo con agar urea de Christensen.

3.- Incubar a 37º hasta detectarse el viraje del indicador. Si no se produce el viraje en 6 días la prueba será negativa.

• Resultados e interpretación:

• Urea + ! color rojo rosado.

• Urea - ! no se produce viraje del indicador.

5.- PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS

Algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos utilizan nitrato como último aceptor de electrones en su metabolismo. Este proceso de reducción de nitratos es producido por una enzima, nitratasa o nitrato reductasa, pudiendo originar diversos productos finales: nitritos, nitrogeno molecular, oxido nítrico, oxido nitroso, amoniaco,etc. La formación de uno u otro depende de la especie bacteriana, lo más común son nitritos y nitrogeno molecular.

La reducción de nitratos consiste en la detección de los productos de reducción al ser excretados al medio por el microorganismo.

Se utilizan para la identificación de especies de Haemophylus y Neisserias.

• Fundamento: Puesto que los productos finales de la reducción más común son los nitratos y nitrógeno molecular, la prueba constará de dos fases:

• Detección de nitritos por una reactivo colorimétrico.

• La no aparición de color en la primera fase puede significar:

• No se ha reducido el nitrato, se comprueba añadiendo un agente reductor, con lo que se desarrolla la reacción colorímetrica de la primera fase.

• El nitrito se ha reducido a nitrógeno molecular, el cual se detecta por la campana de Durham (si el medio es líquido) o por la formación de grietas (si el medio es sólido).

• El nitrito se ha reducido a otros productos nitrogenados. Ej: oxido nitrico.

• Materiales: Tubo, asa, pipeta 10ml., campana de Durham, algodón, mechero, estufa de cultivo.

• Reactivos: Caldo con nitrato, reactivo A (alfanaftilamina al 0.5%), reactivo B (ácido sulfanilico al 0.8%), Zn en polvo y microorganismo.

• Técnica:

1.- A partir de un cultivo joven y puro se toma un amuestra con el asa.

2.- Inocular un tubo con caldo con nitrato, otro sin sembrar actuará como control - , en ambos se pone campana de Durham.

3.- Incubar a 37ºC durante 12-24 horas.

4.- Agregar 1ml. de reactivo A y 1 ml. De reactivo B. Si se desarrollará color antes de 30 segundos se da por finalizada la prueba, en caso contrario añadir al tubo un pellizco de polvo de Zn.

• Resultados e interpretación:

Si la prueba es positiva:

• Reducción a nitritos, aparición de color rojo o rosado al añadir el reactivo A y B.

• Reducción a nitrógeno molecular, acumulación de gas en la campana de Durham.

• Reducción a otros productos nitrogenados, si al añadir el polvo de Zn no se desarrolla color.

TEMA 12.- TIPACIÓN BIOQUÍMICA III

El IMVIC son 4 pruebas de identificación bioquímica que hacen referencia a:

• I ! Indol: Se utiliza en el metabolismo proteico.

• M ! Rojo de Metilo: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado.

• V ! Voges-Proskauer: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado.

• C ! Citrato: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado.

Estas pruebas son muy útiles en el estudio de Enterobacterias ( E.Coli, Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia).

1.- PRUEBA DEL INDOL

• Fundamento: Estudia la utilización de prótidos por parte de un microorganismo, en concreto determina la capacidad de desdoblar indol de la molécula de triptófano. El triptófano es un aminoácido que puede ser degradado por ciertas bacterias para originar distintos metabolitos indólicos . El triptófano por acción de una enzima, la triptofanasa, da lugar a determinados metabolitos indólicos como: indol, escatol o indol acético).

El indol es detectado por un reactivo que produce coloración al reaccionar con él.

Las diversas enzimas intracelulares que intervienen en el proceso reciben el nombre de triptofanasa.

• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón, mechero y estufa de cultivo.

• Reactivos: Agua de peptona, ractivo indol de Kovacs o reactivo indol de Ehrlich, éter etílico (dietiléter) y microorganismo.

• Técnica:

a.- Método de Kovacs

1.- Sembrar el microorganismo en un tubo con agua de peptona.

2.- Incubar a 37ºC 24-48 horas.

3.- Agregar 5 gotas del reactivo indol de Kovacs.

4.- Agitar muy suavemente y dejar reposar unos minutos.

b.- Método de Ehrlich

1.- Sembrar el microorganismo en un tubo con agua de peptona.

2.- Incubar a 37ºC 24-48 horas.

3.- Añadir 1ml del éter etílico y esperar a que éste suba a la superficie.

4.- Añadir 5 gotas del reactivo de Ehrlich resbalando por la pared del tubo.

• Resultados e Interpretación:

• Indol +: Anillo rojo en superficie.

• Indol -: Color amarillento.

• Observaciones al método: El reactivo indol de Kovacs debe ser fresco (refrigerar a 4ºC varios días), si se deja a T ambiente variará el color de amarillo a castaño siendo menos sensible.

2.- PRUEBA DEL ROJO DE METILO

• Fundamento: Investiga la capacidad de un microorganismo de producir ácidos como metabolitos finales del proceso de fermentación de azúcares. Emplea como indicador el rojo de metilo.

Los microorganismo rojo de metilo positivo producen ácidos estables con elevada concentración de H+ cesando toda la actividad metabólica.

Los microorganismos rojo de metilo negativo también producen ácidos pero en menor concentración porque existe una recesión hacia la neutralidad debido a la degradación de ácidos orgánicos y posible formación de compuestos de NH4.

• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón, mechero y estufa de cultivo.

• Reactivos: Medio de Clark y Lubs, solución de rojo de metilo y microorganismo.

• Técnica:

1.- Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de Clark y Lubs.

2.- Incubar a 37ºC 48-72 horas.

3.- Añadir 5 gotas de rojo de metilo.

4.- La lectura se efectúa inmediatamente después de añadir el indicador.

• Resultados e Interpretación:

• Rojo de metilo +: Color rojo intenso en superficie.

• Rojo de metilo -: Color amarillo en superficie.

• Observaciones al método: No interpretar nunca una prueba si el medio no se ha incubado como mínimo 48 horas. Si la lectura se efectúa antes los resultados serán falsos positivos, dado que los rojo de metilo - no habrán tenido tiempo suficiente para metabolizar los productos ácidos iniciales acumulados por la fermentación de la glucosa.

El viraje de rojo de metilo a pH 4.5 da color rojo y a pH 6.3 da color amarillo.

Si no hay rojo de metilo empleamos:

• Rojo Fenol, a pH 6.8 da color amarillo y a pH 8.4 da color rojo.

• Azul de Bromotimol, a pH 6 da color amarillo y a pH 7.6 da color azul.

• Púrpura de Bromocresol, a pH 5.2 da color amarillo y a pH 6.8 da color púrpura.

3.- PRUEBA DE VOGES PROSKAUER

• Fundamento: Consiste en determinar la capacidad de un microorganismo de producir un metabolito neutro llamado acetil metil carbinol o acetoína como producto intermediario derivado del metabolismo de la glucosa. En presencia de oxígeno atmosférico y álcalis, la acetoína es oxidada a diacetilo que es un sustrato que genera un compuesto coloreado al añadirle los reactivos adecuados.

• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón, mechero y estufa de cultivo.

• Reactivos: Medio de Clark y Lubs, solución naftol, solución KOH al 40% y microorganismo.

• Técnica:

1.- Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de Clark y Lubs.

2.- Incubar a 37ºC 48-72 horas.

3.- Agregar al cultivo en orden: 0.5 ml de naftol y 0.5 ml de KOH.

4.- Agitar el tubo suavemente y mantenerlo inclinado casi horizontal con el fin de favorecer la oxidación de la acetoína por el oxígeno atmosférico.

5.- Dejar reposar el tubo 10-15 minutos antes de interpretar la prueba.

• Resultados e Interpretación:

• Voges Proskauer +: color rojo-rosado en la superficie antes de 1hora.

• Voges Proskauer -: color amarillo, a veces aparece color cobrizo al mezclar los reactivos.

4.- PRUEBA DEL CITRATO

• Fundamento: Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono. El medio contiene citrato (como fuente de carbono) y sales de amonio inorgánico (como fuente de nitrógeno).

Los microorganismos citrato + crecen en este medio alcalinizándolo debido a:

• formación de amoniaco por desdoblamiento de las sales de amonio

• producción de carbonatos y bicarbonatos por degradación de citrato

• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón, mechero y estufa de cultivo.

• Reactivos: Medio de Kosser (medio líquido en tubo), medio citrato de Simons (agar inclinado), medio citrato de Christensen (agar inclinado) y microorganismo.

• Técnica:

1.- Se preparan 2 tubos con el medio elegido. Se inocula uno de ellos, mientras que el otro servirá de control -.

2.- Incubar 48-72 horas a 37ºC. Los tubos estarán destapados para que el CO2 se evapore libremente. Leer después de 48 horas de incubación.

• Resultados e Interpretación:

• Medio Kosser:

• Positivo: turbidez en el tubo

• Negativo: no turbidez en el tubo

• Medio Citrato de Simons

• Positivo: color azul intenso en superficie

• Negativo: no hay cambio de color

• Medio Citrato Christensen

• Positivo: color rojo o rosa con crecimiento de microorg en superficie

• Negativo: no cambio de color ni crecimiento de microorganismo.

TEMA 13.- COCOS POSITIVOS. ESTAFILOCOCOS Y ESTREPTOCOCOS.

STAPHYLOCOCO

1.- Introducción (Morfología y características).

2.- Aislamiento

3.- Pruebas de Identificación

• Esquema.

• Prueba de la catalasa.

• Prueba de la coagulasa.

• Prueba de hemólisis.

• Prueba de sensibilidad a la Novobiocina.

• O-F de Hung y Lesión.

• Prueba de la ureasa.

• Actividad de la fosfatasa.

• Prueba de la desoxirribonucleasa.

• Prueba de la pirrolidonilamidasa.

• Sistemas comerciales (API).

4.- Estructura antigénica

• Péptidoglucanos.

• Ácidos teicoicos.

• Proteína A.

• Factor de aglutinación.

• Polisacáridos.

5.- Enzimas y Toxinas:

• Toxinas

• Hemolisinas.

• Leucocinas o leucotoxinas.

• Enterotoxinas.

• Toxina exfoliativa.

• Toxina responsable del shock toxico.

• Enzimas:

• Coagulasa.

• Fibrinolisina.

• Hialurodinasa.

• -lactamasa o penincilasa.

• Lipasas, esterasas, proteinazas, catalasas y nucleasas.

6.- PATOLOGÍA:

• Infecciones superficiales.

• Infecciones intestinales (enterotoxina).

• Infecciones hematológicas.

• Infecciones respiratorias.

• Localizaciones varias.

7.- Infecciones Hospitalarias (Nosocomiales).

8.- Diagnóstico

• Directo.

• Indirecto.

9.- Sensibilidad antibiótica

1.- INTRODUCCIÓN

Son cocos gram + que se pueden encontrar aislados, en parejas, tetradas, cadenas cortas y racimos de uva.

La mayor parte de las especies son aerobias o anaerobias facultativas. Son inmóviles, no esporuladas y no capsulados.

Desde el punto de vista bioquímico son catalasa + , oxidasa - y fermentadores de azucares.

Crecen bien en los medios habituales, Ej: agar sangre o chocolate (para ver hemólisis) o en caldo de trioglicolato o infusión cerebro- corazón.

Son bastante resistentes a la acción del calor (50ºC 30 min.) y a la acción de las sales biliares y NaCl, sin embargo se lisan por la acción de ciertos antibióticos y se inhiben con productos químicos como hexaclorofeno.

Se engloban junto con los géneros no patógenos: Micrococus, Planococus, Estomacocus dentro de la familia Micrococaceae.

El género Estafilococo se compone actualmente de 27 especies. El hábitat normal de éstas es variado, principalmente a nivel de piel y mucosas, Ej: Estafilococos capitis, E. Hominis, E. Haemoliticus (se encuentra en axilas y pubis) E. Auricularis.

Las especies que se asocian a infecciones humanas o animales son Estafilococos aureus, epidermis y saprofiticus.

2.- AISLAMIENTO.

Los medios utilizados son:

• Champman.

• Agar Cham-Manitol.

• Baid-parker.

Éstos son muy selectivos por tener altas concentraciones de NaCl.

También se puede realizar su aislamiento en medios con sangre para el estudio de su hemólisis. En el agar sangre aparecen colonias lisas de color amarillento o blanco.

El material de estudio puede ser pus, sangre, esputo y LCR.

3.- PRUEBAS DE IDENTIFICACION

1.- Esquema ( fotocopias )

2.- PRUEBA DE LA Catalasa (ya explicada)

Nos permite diferenciar:

• Streptocoo (-)

• Staphylococo (+).

3.- prueba de la Coagulasa (ya explicada)

Permite diferenciar:

• Staphylococo Aureus (+)

• Staphylococo Saprofitico y Staphylococo Epidermis (-).

4.- Prueba de hemólisis (ya explicada)

Distingue:

• Staphylococo Aureus (+)

• Staphylococo Saprofitico y Staphylococo Epidermis, no producen hemólisis.

5.- Sensibilidad a la Novobiocina

Sirve para diferenciar

• Staphylococo Epidermis (sensibilidad +, resistencia - = si muere)

• Staphylococo Saprofitico (sensibilidad -, resistencia +, = no muere).

• Medio de cultivo utilizado es Mueller - Hinton.

• Reactivos: discos de Novobiocina.

• Método:

1.- Inocular superficialmente un microorganismo en una placa de cultivo

2.- Dejar reposar 15 min. A Tª ambiente

3.- Depositar en el centro de la placa un disco de Novobiocina.

4.- Incubar 24 h 35º.

• Lectura: aquellos Staphylococos que son inhibidos por discos de Novobiocina son de la especie de Staphylococo Epidermis, los no inhibidos son Staphylococos Saprofitico.

6.- Prueba O - F (ya explicada)

Staphylococo Aureus son fermentadores de azucares.

7.- prueba Ureasa ( fotocopias )

• Staphylococo aureus ! Variable: en función de la cepa puede dar (+) o (-) a la ureasa.

• Staphylococo epidermis ! (+)

• Staphylococo saprofitico ! (+)

8.- prueba Desoxirribonucleasa.

• staphylococo aureus ! (+)

• Staphylococo epidermis y Staphylococo saprofitico ! (-)

9.- prueba de la Actividad fosfatasa.

10.- prueba de la Pirrolidonilamidasa.

11.- Sistemas comerciales (API)

Son sistemas múltiples de pruebas de identificación basadas en pruebas bioquímicas, enzimáticos y de sensibilidad (pruebas de antibiogramas).

Consisten en tiras con microcúpulas que contienen los sustratos deshidratados.

Se inocula la suspensión del microorganismo en cada una de ellas y tras la incubación se leen los resultados directamente o por revelado con reactivos.

Las reacciones + se traducen en un perfil numérico con el que se acude a un manual que identifica la especie.

4.- ESTRUCTURA ANTIGENICA

Los Staphylococos presentan en su estructura un importante contenido antigénico que está implicado en el mecanismo de patogeneicidad de estos microorganismos. Las principales estructuras antigénicas están en la pared y las más importantes son:

• Peptidoglucanos: Es un polímero polisacárido formado por un compuesto N - acetilmuranico y N-acetilglucosamida que desempeña un papel importante en la patología de la infección ya que:

• Induce la producción de IL (interleucinas).

• Induce la producción de Ac opsonizantes por los monolitos humanos.

• Atrae leucocitos.

• Activa el C'.

• Posee actividad endotoxica.

• Ac. Teicoicos: (visto en pared bacteriana).

• Proteína A: Es una proteína de 42.000 Dalton que aparece en muchos Staphylococos aureus. Se encuentra unida de forma covalente al peptidoglucano. Estas proteínas son capaces de anclarse en la región FC de las Ig G humanas y de activar el C'.

• Factor de aglutinación: También conocido como coagulasa. Se encuentra pegado a la superficie externa de Staphylococo aureus y fija fibrinógeno mediante una reacción no enzimática.

• Polisacáridos: Algunos Staphylococos aureus poseen una cápsula polisacárido situada en la parte externa de la pared celular capaz de inhibir la fagocitosis por los leucocitos polimorfonucleares.

5.- ENZIMAS Y TOXINAS

El efecto más o menos patogénico e Staphylococo aureus para hombre dependerá de:

• Ag presentes principalmente en la pared.

• Toxinas.

• Enzimas.

A.- TOXINAS

• Hemolisina: de composición proteica y en general lisa con facilidad los eritrocitos, además de tener efectos tóxicos sobre células como macrófagos y GB. Debido a esta propiedad estas exotoxinas son conocidas como citotóxicas. Son en general muy sensibles al calor y se conocen un total de cuatro que son:

• Alfa- hemolisina o alfa-toxina: ataca los hematíes produciendo una hemólisis total alrededor de las colonias en medio agar sangre o agar chocolate. Por vía subcutánea es dermonecrótica, con ella se pueden hacer vacunas.

• ß-toxina o ß-hemolisina: responsable de la hemólisis parcial de hematíes.

• Gamma hemolisina: interviene en lesiones y heridas pero tienen poca importancia patógena, no producen hemólisis.

• Delta toxina: tiene una acción detergente sobre membranas biológicas y se le ha asociado un papel en la diarrea aguda en algunas infecciones staphylocócicas.

• Leucotoxinas o Leucocidinas: son responsables de matar leucocitos polimorfo nucleares y macrófagos proporcionando una gran resistencia a las bacterias.

• Enterotoxina: son responsables de intoxicaciones alimentarías de las que se conocen 6 serotipos distintos (A ! F). Se trata de toxinas termoestables y resistentes a la acción de jugo gástrico, uniéndose posteriormente a los receptores nerviosos del tubo digestivo y actuando sobre el centro del vomito, lo que origina numerosos vómitos, nauseas y diarreas. La intoxicación alimentaría no cursa con fiebre.

• Exfoliativa: engloba 2 toxinas responsables de los daños dermatológicos que tienen lugar en el síndrome de la piel escaldada provocando una lesión caracterizada por una aparición de ampollas.

• Toxina responsable del Shock Tóxico: se ha observado que es más común en mujeres que utilizan tampones.

B.- ENZIMAS

• Coagulasa: coagula en el plasma sanguíneo al activar el fibrinógeno, así pues la coagulasa interviene en la formación del coagulo.

• Fibrinolisinas o Staphyloquinasas: destruyen los coágulos sanguíneos formando microémbolos que facilita la diseminación del trombo, es decir, ejercen un efecto opuesto a la coagulasa.

• Hialurodinasa: disocia la sustancia fundamental del tejido conjuntivo facilitando la penetración del Staphylococo.

• ß-Lactomasa o penicilasa: rompe el anillo ß-lactamico de las penicilinas apareciendo resistencia a las penicilinas.

• Lipasas, esterasas y proteinasas: que hidrolizan lípidos, esteres y proteínas.

• Catalasa y Nucleasa: la nucleasa produce la ruptura de ácidos nucleicos. Catalasa (ya explicada).

6.- PATOLOGIA

Estudio de las enfermedades producidas por Staphylococos.

a.- Infecciones superficiales: Principalmente producen:

• forúnculos

• Ántrax.

• problemas en la piel que producen muerte del tejido.

• heridas

• quemaduras.

• infección en el acné.

b.- Infecciones intestinales: relacionadas con:

• vómitos

• nauseas

• diarrea

• mal esta

• a veces fiebre

La producen las enterotoxinas.

c.- Infecciones hematológicas: dando lugar a:

• bacteriemia

• se le ha atribuido a Staphylococo aureus el Síndrome de Shock Tóxico caracterizado por fiebre, erupción descamativa, hipotensión y afectación multisistémica (daños en distintos órganos).

d.- Infecciones respiratorias:

• sinusitis

• laryngitis

• faringitis

• bronquitis

• neumonía.

e.- Localizaciones varias: Puede dar:

• artritis

• endocarditis

• pericarditis

• meningitis

• neumonía

• osteomielitis

7.- INFECCIONES HOSPITALARIAS O NOSOCOMIALES

Staphylococo aureus constituye el principal patógeno dentro de Staphylococos. Se le denomina el microorganismo “dorado” ya que produce un pigmento de color amarillo. Aproximadamente entre un 2 - 40 % de adultos son portadores nasales y un 10 % de las mujeres lo llevan en la vagina.

Hay un grupo de población que son más propensos a ser colonizados por Staphylococo aureus: personal sanitario, adictos por intravenosa, diabéticos y pacientes tratados por hemodiálisis.

Es importante señalar el Staphylococo epidermis que es causante de bacteriemia y endocarditis infecciosa, peritonitis, osteomielitis, infección del tracto urinario.

El Staphylococo saprofitico es un agente ideológico de infecciones importantes del tracto urinario en mujeres jóvenes sexualmente activas.

8.- DIAGNOSTICO

• Directo: vamos a hacer dos subgrupos:

• Infecciones no intestinales: se recoge la muestra en condiciones de asepsia de pus, exudados superficiales, LCR, sangre.

Se realiza un Gram, se cultiva en agar sangre y se realizan pruebas bioquímicas como catalasa y coagulasa.

• Infecciones intestinales: la toma de muestra se hace de los alimentos sospechosos y no de heces (ya que en condiciones normales puede aparecer Staphylococo aureus en heces (flora habitual)).

Se busca la enterotoxina y no se cultivan gérmenes ya que no es el productor de la enfermedad. También se investigan los portadores.

• Indirectos: no se suele hacer, si se quisiera buscar Ac frente a antihemolisinas, antileucocinas o anticoagulantes (lo que se busca son Ac frente Ag específicos)

9.- SENSIBILIDAD ANTIBIOTICA

La sensibilidad de Staphylococo aureus a los antibióticos ha disminuido de forma importante en los últimos años. Poco después de la introducción de la penicilina G apareciendo cepas de Staphylococos que destruyeron el antibiótico por las penicilasas.

En pacientes con cepas de Staphylococo productoras de penicilasa la penicilina no es eficaz.

La introducción de las tetraciclinas y eritomicinas que se mostraron efectivas en el tratamiento poco después de ser comercializadas se aislaron numerosas cepas hospitalarias, resistentes a estos antibióticos.

La introducción de las penicilinas semisinteticas no ha resuelto el problema. Así la resistencia a ampicilina es del orden del 85% igual que la amoxicilina.

El desarrollo de las penicilinas semisintéticas resistentes a la penicilasa como la meticilina, oxacilina, doxacilina han resuelto en parte el problema.

Hoy en día los antibióticos mas utilizados son Vancomicina, Rifampicina y Ciprofloxacina siendo muy útil las Cefalosporinas y Aminoglucósidos.

STREPTOCOCO

1.- Introducción (Morfología y Características)

2.- Aislamiento

3.- Pruebas de Identificación

• Prueba S.F. o glucosa azida

• Prueba de la Bacitracina

• Prueba de sensibilidad a Optoquicina

• Solubilidad en bilis

• Prueba Voges Proskauer

• APIs

• Otras pruebas:

Catalasa

Oxidasa

Fermentación de HC, etc.

4.- Estructura Antigénica

• Ag de pared específico de grupo (LANCEFIED)

• Proteína M

• Otros Ag

5.- Clasificación

•  hemolíticos

• Grupo D:

Enterococos

No Enterococos

•  hemolíticos:

Streptococo viridans

Streptococo pneumoniae

6.- Enzimas y Toxinas

• Enzimas:

Fibrinolisina o streptoquinasa

Hialuridinasa

Desoxirribonucleasa

Proteinazas

• Toxinas:

Toxina eritrógenica

Hemolisina : O y F

7.- Patología

• Streptococo pyogenes:

• Tejidos (eripsipela)

• Infecciones locales

• Enfermedades poststreptocócicas no supurativas

• Streptococo agalactiae

• Streptococo grupo C

• Streptococo viridans

• Streptococo pneumoniae

• Streptococo grupo D

8.- Diagnóstico

9.- Sensibilidad a los antibióticos

1.- INTRODUCCIÓN

Son cocos gram + agrupados en cadenas o parejas, inmóviles, no pigmentados, no esporulados, con o sin cápsula.

Pueden ser saprofitos o patógenos en función de su ubicación.

En los cultivos viejos la bacteria puede perder su carácter gram + y aparecer como gram -.

Bioquímicamente son : catalasa -, oxidadsa -, fermentan lo HC, no producen gas, indol ni SH2.

2.- AISLAMIENTO

Son aerobios y anaerobios facultativos pero crecen mejor en medios que presenten un 10% de CO2. Su temperatura es de 15-45ºC siendo la óptima 37ºC.

Los medios de cultivo son:

• M. Generales: agar sangre y agar chocolate.

• M. Enriquecimiento: caldo tripticasa de soja e infusión cerebro corazón.

• M. Selectivos: contienen antibióticos (Ab) que inhiben el desarrollo de la flora acompañante. Ej: agar columbia-colistina-nalidixílico.

• M. Selectivos de enriquecimiento: favorecen el desarrollo de Streptococos inhibiendo el desarrollo del resto de microorganismos. Ej: glucosa azida (inhibe bacilos gram -) y violeta de cristal (inhibe Staphylococos).

En agar sangre se comprueba la hemólisis (ver hemólisis).

3.- PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

1.- Prueba de S.F. o de la glucosa azida

• Fundamento: Consiste en comprobar el crecimiento de microorganismo en presencia de azida sódica y en su caso la capacidad de fermentar la glucosa.

• Reactivos: El medio de cultivo (m.c.) es el caldo S.F. el cual es selectivo para Streptococo fecalis y Enterococo.

• Técnica:

1.- Se inocula el microorganismo cogiendo con un asa una colonia de 24horas y se pone en el caldo S.F.

2.- Se incuba a 38ºC y se realiza la lectura a las 24 horas.

• Resultados: Si hay turbidez en el medio la prueba el positiva con crecimiento bacteriano. La modificación del color indica fermentación de la glucosa.

2.- PRUEBA DE LA BACITRACINA

• Fundamento: Los Streptococos  hemolíticos del grupo A se distinguen de los demás porque son sensibles a la bacitracina.

• Reactivos: Se utiliza como m.c. agar sangra al 5% y como reactivos discos de bacitracina.

• Técnica:

1.- Inocular por diseminación de superficie un placa de agar sangre con la suspensión de microorganismo problema.

2.- Dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

3.- Colocar con unas pinzas estériles un disco de bacitracina. Incubar a 37ºC 24 horas.

• Resultados: Los Streptococos  hemolíticos del grupo A inhiben el crecimiento alrededor del disco con un diámetro de 10-18 mm. Los demás Streptococos no inhiben si crecimiento.

3.- PRUEBA DE LA SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA

• Fundamento: El crecimiento de Streptococos pneumoniae se inhibe por la optoquina, mientras que no afecta a otros Streptococos.

• Reactivos: El m.c. utilizado es agar sangre de cordero o humano y discos de optoquina.

• Técnica:

1.- Empapar un hisopo con una suspensión de Streptococo, inocular la palca y dejar reposar a temperatura ambiente.

2.- Depositar presionando un disco de optoquina para favorecer el contacto con el medio (algunos autores consideran importante añadir al disco una gota de agua destilada para favorecer el crecimiento del halo de inhibición).

3.- Incubar a 35ºC durante 18-24 horas.

• Resultados: El crecimiento de Streptococo pneumoniae queda inhibido con más de 15 mm de halo de inhibición alrededor del disco.

NOTA: Si la zona de inhición es menor de 15mm es indispensable confirmar que es un neumococo con una prueba de solubilidad en bilis.

4.- PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS

• Fundamento: Se basa en la capacidad de determinadas especies (spp) bacterianas de lisarse en medios con sales biliares. Los más utilizados son desoxicolato sódico y taurocolato sódico al 2%. Ambos provocan un descenso en la tensión superficial que unido a la acción de enzimas autolíticas destruyen las células. El efecto de esta enzima autolítica se pone de manifiesto sobre colonias viejas de Streptococo pneumoniae crecidas en medio sólido.

• Técnica:

1.- A 5ml de un cultivo de 24 horas se añade 0.5ml de solución de sales biliares al 10%.

2.- Agitar la mezcla con cuidado e incubar a 35ºC.

• Resultados: Si antes de 3 horas de incubación se produce aclaramiento del contenido del tubo se interpreta como soluble en bilis, tendremos Streptococo pneumoniae. Si permanece turbia se interpreta como insoluble en bilis por lo que tendremos otros Streptococos.

NOTA: Es esencial el control del pH, ya que si las condiciones son ácidas se puede producir un precipitado del desoxicolato.

5.- PRUEBA DEL VOGES PROSKAUER

6.- OTRAS PRUEBAS

7.- APIs

4.- ESTRUCTURA ANTIGÉNICA

1.- ANTÍGENO DE PARED ESPECÍFICA DE GRUPO

Se trata de un carbohidrato localizado en la pared de muchos Streptococos que ha permitido una clasificación serológica en los llamados grupos de LANCEFIED. Esta especificidad serológica de HC específico de grupo viene determinada por un amino-azúcar, así los Streptococos del:

• Grupo A: tienen como amino-azúcar la ramosa N-acetilglucosamina

• Grupo B: tienen como amino-azúcar la ramosa glucosamina

• Grupo C: tienen como amino-azúcar la ramosa N-acetilgalactosamina

• Grupo D: tienen como amino-azúcar la ramosa ácido glicerolteicoico

• Grupo F: tienen como amino-azúcar el glucopiranosil-Nacetilgalactosamina

2.- PROTEÍNA M

Se trata de un antígeno proteico que pertenece a la pared celular y constituye el principal factor de virulencia de Streptococo pyogenes.

Aparece como proyecciones similares a pelos que emergen de la pared y su presencia io ausencia condiciona la virulencia de las cepas.

En el caso de que no exista en el huésped Ac contra esta proteína, las cepas de Streptococo pyogenes con proeteína M son capaces de resistir la acción de los fagocitos polimorfonucleares.

Esta proteína también está implicada en la adherencia a células epiteliales.

Existen más de 80 tipos distintos de estos Ag, por lo que una persona se puede infectar repetidamente con cepas de Streptococo pyogenes con distintas proteína M en su pared.

3.- OTROS ANTÍGENOS

Son las sustancias T y R localizadas en la pared celular y nucleoproteínas. En el Streptococo pneumoniae su presencia en la cápsula polisacárida impide que sean ingeridos por fagocitos. Además es antigénica de modo que los Ac frente a la cápsula del pneumococo confieren inmunidad.

Existen más de 80 tipos distintos de Ag capsulares.

5.- CLASIFICACIÓN DE LOS STREPTOCOCOS

(Ver fotocopias tabla 6.3)

En general, los Streptococos se pueden clasificar en función de:

• Comportamiento antigénico frente a distintas pruebas biológicas

• Por el tipo de hemólisis

• Por pruebas bioquímicas.

El resultado es la clasificación en tres grupos importantes:

•  hemolíticos: corresponden a distintos grupos denominados con letras del alfabeto griego

• Grupo D: pueden ser Enterococos y no Enterococos

•  Hemolíticos: Se encuentran el Streptococo viridans y Streptococo pneumoniae.

6.- ENZIMAS Y TOXINAS

A.- Toxinas: tienen capacidad antigénica:

• T. Eritrogénica: provoca el exantema de la escarlatina y erisipela. Es antigénica y da lugar a la formación de una antitoxina específica.

• Hemolisinas o estreptolisina: destruyen los hamatíes y podemos distinguir dos tipos:

• Estreptolisina O: proteína que se inactiva en presencia de oxigeno. Los anticuerpos dirigidos contra ella se denominan ASO, ASLO o AEO (serian antiestreptolisina o ). Cuando un individuo tiene un titulo superior a 250u, sugiere una infección reciente por Estreptococos.

• Estreptolisina S: resistente a la acción del oxigeno. No tiene acción antigénica.

B.- Enzimas:

• Fibrinolisina o estreptoquinasa: transforma el plasminógeno en plasmina (sustancia responsable de la lisis de lisina) ha sido utilizada por vía intravenosa para el tratamiento de embolias y trombosis.

• Hialudinasa: desdobla el ácido hialurónico del tejido conjuntivo, favoreciendo la diseminación del coco. También induce anticuerpos específicos. Se ha facilitado para la absorción de medicamentos.

7.- PATOLOGÍA

1.- streptococos pyogenes : del grupo A, produce enfermedad por:

• Invasión de tejidos: es el agente etiológico de la erisipela (inflamación aguda de la piel con afectación de vasos linfáticos cutáneos, cursa con fiebre elevada y escalofríos), el área afectada suele ser la cara y en ocasiones tronco y extremidades.

También puede producir sepsis; la infección puede afectar al recién nacido. También puede ocasionar celulitis, linfagitis y miositis (mio-músculo).

• Infecciones locales: la fundamental es faringitis, es más benigna en niños que en adultos. La toxina puede provocar inflamación de tejidos que bloquean el paso de aire y producir asfixia. También puede dar lugar a pioderma y procesos de endocarditis, otitis, meningitis y neumonía.

• Enfermedades postestreptococicas no supurativas: fiebres reumáticas y glomerulonefritis. Se trata de procesos autoinmunes por reacciones cruzadas por Acs. dirigidos contra Streptococos que se unen a las células del riñón y en ocasiones a las del miocardio formando inmunocomplejos en estos órganos. Estos complejos atraen las células defensivas del huésped que son las que originan daño. Se conocen como no supurativas porque en los órganos afectados no se encuentran presentes los microorganismos ni existen reacciones inflamatorias.

2.- streptococos agalactiae:

Pertenecen al grupo B de Lancefied. Produce - hemólisis y forma parte de la flora normal del tracto genitourinario, encontrándose en la vagina de las mujeres sanas, desde donde pasa al recién nacido en el momento del parto. Es el agente etiológico más frecuente de sepsis y meningitis neonatal.

También se ha visto implicado en osteomielitis, infección del tracto urinario, heridas, endocarditis y neumonías. Se asocia a infecciones oportunistas.

3.- streptococos del grupo C:

Aparecen como saprofitos en la rinofaringe, tracto gastrointestinal y vagina. En raras ocasiones puede actuar como patógeno dando lugar a faringitis, endocarditis, glomerulonefritis, bacteriemia, etc. Pueden provocar sepsis en el parto.

4.- streptococos viridans

Son saprofitos del tracto respiratorio y gastrointestinal (placa dental, orofaringe, etc.), sin embargo se les ha considerado como patógenos oportunistas, siendo la principal causa de endocarditis bacteriana aguda.

Las especies implicadas con mayor frecuencia son:

• S.mutans (principal agente etiológico de la caries dental)

• S.sanguis I, II.

Las especies del grupo viridans también pueden producir abscesos, neumonía y otras infecciones supurativas.

5.- streptococos neumoniae

Se agrupan en parejas (diplococos) rodeadas de una cápsula, siendo por tanto inmóviles, capsulada y no esporuladas. Para evidenciar la virulencia del neumococo se buscan las cápsulas con tinta china o con Acs-anticapsulares específicos, provocando un precipitado de la cápsula que se denomina hinchazón de la cápsula o reacción de Quelluns.

Es el agente productor de neumonía neumococica, proceso en el que hay una reacción de tipo inflamatorio en las áreas pulmonares donde se desarrolla el germen lo que conlleva una vasodilatación de los capilares de la zona con salida del plasma, hematíes y leucocitos, lo que supone una solidificación por coagulación. Clínicamente se presenta con diseña, fiebre, dolor pleural, tos productiva, edemas y mal estar general.

Su poder patogénico se debe a la capacidad que tiene para multiplicarse en los tejidos e inducir la reacción produciendo fibrosis, siendo ésta una reacción de tipo cocatricial producida por el tejido conjuntivo en la zona afectada en respuesta a un agresión.

También produce sinusitis, otitis, meningitis, etc.

La principal fuente de infección son las gotículas.

6.- streptococos del grupo D

Pueden ser ,  o  hemolíticos, resisten bien los agentes externos, incluso los antibióticos. Se dividen en :

• Enterococos, corresponden a S.fecalis y S.faecium entre otros. Son saprofitos del intestino del hombre (apareen normalmente en heces, vagina y cavidad oral). Son agentes etiológicos de endocarditis, bacteriemia, infección del tracto urinario, SNC, heridas, abscesos intrabdominales. En ocasiones el origen de infecciones nosocomiales.

• No enterococos, corresponden a S.bovilis, S.equinus que afectan a vacas y caballos.

7.- DIAGNÓSTICO

• Directo: se emplea agar sangre para ver las hemólisis y posteriormente se hacen las pruebas bioquímicas.

• Indirecto: a través de estudios serológicos buscando el ASLO (antiestreptolisina O).

8.- SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA

• Streptococo pyogenes: sensible a penicilina y eritromicina.

• Streptococo agalactiae : sensible a penicilina, ampicilina, cefalosporina y vancomicina. Los aminoglucoxidos se usan combinados con la penicilina para el tratamiento de la endocarditis ya que actúan de forma sinérgica.

• Enterococos: son los Estreptococos más resistentes, presentan resistencia a cefalosporinas y penicilina, la mayor parte son también resistentes a las tetraciclinas, aminoglucoxidos, clidamicina, cloranfenicol y sulfamidas.

Son sensibles a : imipenem, ciprofloxacina y vancomicina.

• Neumococos: el fármaco de elección es la penicilina, aunque existen cepas resistentes a este antibiótico.

La mayor parte de Streptococos son sensibles a la cefotaxima.

9.- OTROS COCOS GRAM +

• Pediococos y leuconstoc, son catalasa - . Su principal característica es la resistencia a la vancomicina.

• Lactococus, se usa en la industria lactea y es una especie no patógena.

• Gemella, produce procesos de endocarditis.

TEMA 14.- COCOS GRAM NEGATIVOS. NEISSERIA Y BRAHNAMELLA (MORAXELLA).

NEISSERIA

1.- INTRODUCCIÓN.

2.- CULTIVOS.

3.- CLASIFICACIÓN DE LAS NEISSERIAS

• Neisseria meningitidis.

• Neisseria gonorreae.

• Otras

4.- NEISSERIA MENINGITIDIS

• Poder antigénico.

• Patología.

• Epidemiología.

• Toma de muestras.

• Pruebas químicas y serológicas.

• Vacunas y tratamiento.

5.- NEISSERIA GONORREAE:

• Poder antigénico.

• Patología.

• Epidemiología.

• Toma de muestras.

• Pruebas químicas y serológicas.

• Vacunas y tratamiento.

6.- MORAXELLA CATARRHALIS

1.- INTRODUCCIÓN.

Son anaerobios estrictos, se presentan en parejas (diplococos), dentro de los leucocitos polimorfonucleares con aspecto de riñón o grano de café.

Son inmóviles y pueden presentar cápsula (+ virulentos).

Algunos pueden producir pigmentos de naturaleza carotenoide y color amarillo.

Bioquímicamente son catalas (+), oxidasa (+) y fermentadores de hidratos de carbono con producción de ácido sin gas.

Muy importante a tener en cuenta son los métodos serológicos (inmunofluorescencia, aglutinación, fijación del complemento, precipitación, ELISA, etc.).

2.- CULTIVOS.

Son aerobios y crecen a temperaturas aproximadas de 37ºC, cesando el crecimiento por debajo de 30ºC. La adicción al medio de un 5-10% de CO2 favorece el crecimiento.

Es importante tener en cuenta que se inhibe con la presencia de ácidos grasos y sales presentes en el agar.

Son microorganismos sensibles que no resisten a la desecación ni a la exposición prolongada a la luz, en estas condiciones elaboran enzimas autolíticos que conducen a su destrucción.

Existen distintos medios:

• Medios normales de aislamiento: agar sangre y chocolate.

• Medios selectivos: Thayer-Martin, que llevan antibióticos (para destruir otras bacterias gram + y - ) y antifúngicos (para destruir hongos). También es selectivo el medio New York City (NYC).

Los antibióticos que pueden llevar son: colistina (inhibe bacilos gram -), vancomicina (inhibe los bacilos gram +), etc.

Hay una modificación de Thayer-Martin que lleva trimetroprim que inhibe Proteus.

Estas bacterias se localizan en las mucosas de los tractos respiratorio, digestivo y genitourinario del hombre y los animales.

Únicamente las especies de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorreae se consideran patógenos para el hombre.

3.- CLASIFICACIÓN DE NEISSERIAS

Se pueden distinguir tres grupos:

Neisseria meningitidis: Producen meningitis y son muy difíciles de cultivar siendo necesario un medio específico y una temperatura de 35-37ºC. Se denomina meningococo.

Neisseria gonorreae: Se le denomina gonococo. Son muy exigentes, requieren cultivos muy específicos y una temperatura de 35-37ºC. En muchos casos su crecimiento se ve favorecido por un aporte de CO2 del 5-10%.

Neisserias saprofitas: Se encuentran en el aparato genital y en la rinofaringe. Son microorganismos poco exigentes. Crecen a temperatura de 22-35ºC. Resisten bien a los agentes externos. Crecen en medios generales. (Ej: N. subflava, N. lacatamica y N.sicca).

4.- NEISSERIA MENINGITIDIS

A.- PODER ANTIGÉNICO.

El polisacárido capsular producido por N.meningitidis ha conducido a la clasificación de este microorganismo en 13 serogrupos.

El diagnóstico de N.meningitidis puede realizarse por la detección de los Ag capsulares en muestras orgánicas (LCR, suero, etc)mediante técnicas de aglutinación e inmunofluorescencia que transmiten un diagnostico precoz.

El meningococo posee además otros determinantes antigénicos como las proteínas de membrana, los pilis y liposacáridos (responsables de la mayor parte del proceso de infección meningocócica).

B.- Patología

El hombre es el único huésped natural para el meningococo.Se encuentra frecuentemente en la nasofaringe de individuos sanos portadores, los microorganismos se adhieren a las células faringeas con los pilis.

El cuadro clínico comienza con rinofaringitis leve que afecta sobre todo a los niños, ya que en adultos aparece Ac protectores frente al meningococo. De esta faringitis leve se evoluciona a una forma más severa pudiendo complicarse a bronquitis. Si el meningococo pasa a sangre puede dar lugar a una sepsis meningococica que va acompañada de petequias, cefaleas, fiebres altas y fracaso suprarrenal dando lugar a un síndrome denominado Waterhose-Friederichen.

Puede pasar a LCR alcanzando las meninges y provocando meningitis con un cuadro caracterizado por la rigidez de nuca, cefaleas y vómitos en escopetazo, fiebre, etc.

El microorganismo meningococo puede producir artritis y con menor frecuencia neumonía, faringitis y uretritis.

C.- Epidemiología

La meningitis por Neisseria meningitidis suele ocurrir en brotes epidémicos. Los niños entre 6 - 12 meses y adolescentes son los que se afectan con mayor frecuencia.

Un individuo puede tener colonizada su nasofaringe por el meningococo y no desarrollar síntomas ni infecciones (portador).

En periodos interepidemicos de 5 a 30 % de la población puede ser portadora.

En épocas de epidemia los portadores aumentan hasta un 70 - 80 %.

El contagio será por vía aérea, siendo muy importante los factores de agregación.

D.- Toma de muestra

Podemos hacer:

• Hemocultivo se existe sepsis.

• Frotis faringeo para buscar portadores.

• LCR mediante punción lumbar: Se toman 2 tubos y se transportan inmediatamente al laboratorio. Se centrifugan los tubos:

• Con el sedimento se realiza un gram o azul de metileno, puede haber cocos que si son gram (-) será meningitis meningococica y si son gram (+) habrá que cultivar y hacer la prueba de la catalasa que si es (+) será Staphylococo y si es (-) meningitis pneumococica (producida por Estreptococo pneumoniae).

Si aparecen bacilos en el gram, si son BAAR indica meningitis tuberculosis (producida por Micobacterium tuberculosis).

• Con el sobrenadante se estudiara albúminas, Ig así como polisacáridos capsulares o reacciones inmunológicas. También se pueden observar polimorfonucleares, glucosa disminuida y cloruros normales o disminuidos.

En personas afectadas por Neisserias meningitis el LCR es turbio, purulento y con abundantes meningococos.

E.- Pruebas bioquímicas y serológicas

• Bioquímicas ! catalasa (+), oxidasa (+) y fermentación de hidratos de carbono.

• Serologicas ! inmunofluorescenia directa y ELISA.

F.- Vacunas y tratamientos

Existen vacunas en caso de epidemias produciendo una inmunidad de grupo. Las hay frente a los serogrupos A y C pero no contra B que es la que con más frecuencia origina epidemias.

El antibiótico de elección es la penicilina, en individuos alérgicos a estos se administra cefalosporina.

El estado de portador no se puede erradicar con penicilina porque ha creado resistencia, es necesario administrar rifanticina.

Un nuevo antibiótico lactamico distinto de la penicilina y cefalosporina es el moxalactan, ha dado buenos resultados y se difunde rápidamente por el LCR.

5.- NEISERIA GONORREAE

A.- Poder antigénico

Es una bacteria con una composición antigénica compleja y capaz de modificar para eludir la R.I. del huésped.

Entre los componentes antigénicos se encuentran los pilis que permiten adherirse a las células epiteliales del huésped y evitar la fagocitosis. Posee también varias proteínas con carácter antigenico:

• Proteína I o POR: forman parte de la superficie dando lugar a la formación de poros a través de los cuales entra en la célula ciertos nutrientes.

• Proteína II u OPA: mantiene la adherencia y la ayuda a anclarse en las células del huésped.

• Proteína III o PMR: se asocian a las proteínas POR para formar los poros de la superficie celular. Posee liposacáridos con carácter antigénico y endotóxico.

B.- Patología

Neisseria gonorreae tiene apetencia por las mucosas principalmente por las urogenitales.

Los cuadros clínicos son:

• Gonorrea o Blenorragia Típica: es una E.T.S. que afecta a la mucosa urogenital produciendo sudoración purulenta, disuria (dolor en la micción), puede conllevar a esterilización o estrechecimiento en vías urinarias. Es un microorganismo muy infectivo (con un solo contacto es posible padecer la enfermedad).

En el varón es mas frecuente la uretritis gonocócica con la denominada dota matinal o militar.

El periodo de incubación es de 2 - 15 días, la infección puede ascender y dar cistitis, prostatitis y orquitis, en la mujer puede cursar sintomáticamente, puede producir uretritis, cistitis, cervititis, endometritis u osferitis, peritonitis, salpintigitis. Puede llegar a producir esterilidad.

• Enfermedad Gonocócica Atípica: localizada en faringe y región anorectal.

• Septicemias: mas frecuentes en mujeres sintomáticas caracterizada por lesión en la piel, Ej.: papulas, pústulas y en extremidades (artritis, principalmente en tobillos y muñecas).

• Oftalmia neonatal: Puede aparecer en raras. Es una conjuntivitis purulenta del recién nacido que al pasar por el conducto del parto se infecta, puede producir ceguera. La prevención hasta hace unos años era con nitrato de plata, hoy se utilizan colirios de penicilina.

C.- Epidemiología

Es una enfermedad de distribución mundial transmitida casi exclusivamente por transmisión sexual y principalmente por mujeres portadoras crónicas asintomáticas.

D.- Toma de muestra

En el hombre la muestra será tomada del pus de la gota matinal. En la mujer de la mucosa vaginal y del cérvix y en los homosexuales en el recto y uretra.

En septicemias la toma de muestra puede ser sangre y muestra faríngea.

E.- Pruebas bioquímicas y serológicas

Se realizan las mismas pruebas que Neisseria meningitidis.

• Bioquímicas ! catalasa (+), oxidasa (+) y fermentación de hidratos de carbono.

• Serologicas ! inmunofluorescenia directa y ELISA.

F.- Vacunas y tratamientos

Con penicilina o ampilicilina se crea resistencia, se suele sustituir por cefalosporinas. Es conveniente administrar simultáneamente cefalosporinas con tetraciclina o eritomicina, debido a la concomitancia de infecciones (varias infecciones a la vez por parte de más de un microorganismo) por Clamidias.

En el neonato la gonococia ocular se trata con nitrato de plata con instilación en el saco conjuntival. También se puede tratar con antibióticos.

6.- MORAXELLA CATARRHALIS.

Se habla de Moraxella o Brahnamella. Es catalasa y oxidasa (+), no fermentan ningún azúcar, dan positiva la DNAasa, reduce nitratos, lo que la diferencia de las Neisserias.

Produce la enzima butiratoesterasa y -lactamasa.

Crecen bien en medios habituales como agar sangre y chocolate.

Su temperatura óptima es de 35ºC y la incubación puede hacerse en una atmósfera con CO2.

Las colonias son blanco grisáceas en agar sangre o chocolate.

Estas bacterias pueden formar parte de la flora normal del tracto respiratorio superior de individuos sanos. No obstante se ha aislado como patógeno en ciertas infecciones, como: septicemia, meningitis, endocarditis,y en infecciones otorrinolaringologicas.

Brahnamella catharralis es responsable del 10-15% de los casos de otitis media y es un agente etiológico importante de sinusitis. Los individuos más susceptibles a padecer esta infección son los ancianos y los niños.

Las cepas productoras de -lactamasa se consideran resistentes clínicamente a la penicilina, ampicilina y amoxicilina (los antibióticos que tienen un anillo -lactamico esta enzima lo rompe y se hacen resistentes).

Son sensibles a amoxicilina-clavulanico y ampicilina-sulfbactem.

TEMA 15.- COCOBACILOS GRAM NEGATIVO.

Haemophylus

1.- INTRODUCCIÓN.

2.- CLASIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN.

• Dependencia del factor X y V.

• Pruebas bioquímicas.

• Pruebas serológicas.

3.- HAEMOPHYLUS INFLUENZAE.

• Patología

• Tratamiento.

4.- HAEMOPHYLUS DUCREY.

• Patología

• Tratamiento.

5.- AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO.

• Toma de muestras.

• Tinciones.

• Medios de cultivo.

• Pruebas bioquímicas y serológicas.

1.- INTRODUCCIÓN.

El género Haemophylus está formado por bacterias gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, inmóviles y no esporulados.

Algunas especies poseen cápsula. Son parásitos obligados del tracto respiratorio superior del hombre y animales, llegando a constituir hasta un 10% de la flora acompañante de la orofaringe en los individuos sanos.

Las especies del género Haemophylus fermentan los hidratos de carbono con producción de ácido, producen nitratos y la mayor parte son catalasa y oxidasa (+) .

El crecimiento viene condicionado por la presencia en el medio de factor V y X. El factor V a diferencia del X no se encuentra libre en sangre, para liberarlo deben romperse las células sanguíneas por calentamiento.

Los medios de cultivo son agar sangre y chocolate que deben incubarse a 35-37ºC y en atmósfera de un 5-10% de CO2. También se puede emplear como medio específico Levinthlal.

2.- CLASIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN.

Existen distintas especies del género Haemophylus, las principales desde el punto de vista patógeno para el hombre son H. influenzae y H. ducrey.

Para la identificación de las especies nos basamos en:

• Dependencia del factor V y/o X.

• Pruebas bioquímicas. (ver cuadro).

• Pruebas serologicas, aglutinación el látex y prueba de hinchamiento capsular.

3.- HAEMOPHYLUS INFLUENZAE

a.- Patología

Es una bacteria que parasita exclusivamente al hombre localizándose en el tracto respiratorio superior. Accede a dicho tracto por inhalación colonizando las mucosas. Hasta un 80% de personas pueden ser portadoras sin que desarrollen síntomas clínicos.

Es capsulado (virulento) y se ha observado que la cápsula está formada por polisacáridos distintos que según sus características se diferencian en 6 serogrupos (a!f). En España es más frecuente la de tipo b.

Este microorganismo es junto al neumococo (Streptococo neumoniae) uno de los agentes etiológicos más frecuentes de otitis media bacteriana y sinusitis aguda.

Puede invadir el torrente circulatorio y alcanzar las meninges (produciendo meningitis) o localizarse en articulaciones (produciendo artritis). Es la causa más frecuente de meningitis en niños menores de 5 años. En recién nacidos es muy rara la infección ya que poseen Ac maternos frente a este microorganismo.

También afecta a ancianos y adultos debilitados por procesos gripales. Ocasionalmente puede producir epiglotitis con obstrucción respiratoria aguda y un desenlace fatal si no se recurre a traqueotomía.

Este microorganismo está implicado como agente etiológico de neumonía principalmente en niños y adultos con infección pulmonar o historia de alcoholismo.

b.- Tratamiento

En ausencia de tratamiento puede ser mortal en el caso de meningitis y epiglotitis.

El tratamiento de elección son ampicilina y cloranfenicol, aunque últimamente existen cepas resistentes y se recomiendan las cefalosporinas.

A partir de los 18 meses de vida los niños se pueden vacunar frente a Haemophylus b.

4.- HAEMOPHYLUS DUCREY

a.- Patología

Es el agente etiológico del chancro blando o chancroide (ETS), caracterizado por la presencia de úlceras en los genitales y zona perianal.

El periodo de incubación es de 7 días, siendo una enfermedad muy similar a la sífilis.

b.- Tratamiento

A base de eritromicina.

5.- AISLAMIENTO Y DIÁGNOSTICO BACTERIANO

a.- Toma de muestras

Se realiza en condiciones totalmente asépticas a través de exudados faríngeos esputo o líquido purulento en caso de infección de las vías respiratorias.

En caso de meningitis se saca LCR por punción lumbar.

b.- Tinciones

Generalmente tinción de gram o tinción negativa para el estudio de la cápsula.

c.- Medios de Cultivo

Principalmente agar sangre o agar chocolate a los que añadimos discos con FV y FX y algún Ab para hacer más selectivo el medio.

d.- Pruebas bioquímicas y serológicas

• Pruebas bioquímicas: (ver cuadro)

• Pruebas serológicas: principalmente pruebas de precipitación y aglutinación.

Brucella

1.- INTRODUCCIÓN.

2.- AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO.

• Estudio microbiológico:

• Toma de muestras.

• Pruebas bioquímicas.

• Estudio serológico:

• Test de seroaglutinación o de Wright.

• Test de Coombs antibrucella.

• Test de rosa de bengala.

• Prueba de la introdermorreacción con la melitina.

• Otras.

• Medios de cultivo.

• Técnicas de cultivo:

• Técnica de castañeda.

• Técnica de isolator.

3.- EPIDEMIOLOGÍA.

4.- PATOLOGÍA.

5.- TRATAMIENTO.

1.- Introducción y Clasificación

Son cocobacilos gram negativos, inmóviles, no esporulados y aerobios estrictos. Algunos pueden presentar cápsula.

Se observan agrupados en parejas o en cadenas cortas.

Su temeperatura óptima de crecimiento es 37ºC y algunas especies necesitan presencia de CO2.

Son catalasa +, la mayoría dan la prueba de la oxidasa +, reducen NO3- y fermentan escasos HC.

Las especies del género Brucella son parásitos obligados de animales y algunos producen infección en el hombre.

Son bacterias de largo crecimiento y se destruyen con facilidad son temperaturas de pasteurización (aprox. 70ºC).

2.- AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

No es fácil evidenciar la clínica de la brucelosis, debido a que en muchas ocasiones y sobre todo al principio de la enfermedad, ésta es difusa (no hay síntomas claros de brucelosis) siendo necesario los estudios microbiológicos y serológicos.

a.- Estudio microbiológico

• Toma de muestra: La recogida de muestra de los productos en los que se sospecha presencia de Brucella son principalmente sangre y en ocasiones líquidos orgánicos como pus y LCR.

De la muestra de sangre se realiza hemocultivo, de vital importancia ya que la brucelemia (paso de Brucella a sangre) está presente en las primeras fases de la brucelosis, sobre todo en manifestaciones febriles, teniendo en cuenta que un resultado negativo de hemocultivo no excluye en principio la enfermedad.

• Pruebas bioquímicas: Se realizará al menos la prueba de la catalasa y oxidasa (+), así como la prueba del indol, gelatina, voges proskauer y rojo de metilo (-). También se realizan otras pruebas ( ver cuadro 12.3)

b.- Estudio serológico

Las pruebas más importantes son:

• Test de seroaglutinación o test de Wright: Consiste en diluciones sucesivas del suero problema en el medio que contiene antígeno purificado específico (el Ag de la Brucella), por lo que los títulos positivos (aglutinación) indicarán un contacto previo con la Brucella si este es superior a 1/80. Los títulos de brucelosis en fase aguda están alrededor de 1/320.

En casos de cronicidad los títulos suelen ser muy bajos e incluso negativos, ya que en este tipo de pacientes aparecen muchos anticuerpos no aglutinantes (incompletos) que deberán ser detectados por otras pruebas (test de Coombs).

• Test de Coombs antibrucella: Sirve para detectar anticuerpos incompletos. Es una técnica muy específica y útil en Brucellas crónicas. Su negatividad no excluye brucelosis.

• Test de rosa de Bengala: Es una prueba muy rápida de aglutinación y su negatividad no excluye brucelosis.

• Prueba de la introdermorreacción con la metilina: Consiste en una inyección intradérmica en el brazo o antebrazo de un filtrado autolisado con bacterias muertas, pero con efecto antigénico y otra inyección de carácter intradérmico (testigo calentado a 100ºC) en el otro brazo, que actúa de control (-). Transcurridas 8 horas se efectuará la lectura, si la reacción es (+) aparecerá una zona roja y edematosa de 3 o más cm. de diámetro en el lugar donde se aplicó el autolisado.

• Otras: fijación del complemento, radioinmunoanálisis, etc.

c.- Medios de cultivo

La Brucella es un microorganismo intracelular, por lo que necesitan compuestos nutricionales. Existen muchos medios para el aislamiento de Brucella:

Medios líquidos: como el caldo tripticasa, el caldo de hígado, caldo de brucella, etc.

Medios sólidos: como el agar tripticasa, agar de brucella, etc.

Medios selectivos: que contienen antibióticos, como el medio de Kurdas y Mose, Forwel o Jones-Morgan.

Las colonias de Brucella son pequeñas y transparentes y son de dos tipos morfológicos:

• Colonias lisas o S: son transparentes y corresponden a cepas virulentas cuya virulencia corresponde a dos factores virulentos: factor A y M, que son de naturaleza polisacárida.

• Colonias rugosas o R: no son patógenas.

En la tinción de gram para Brucella se recomienda prolongar el tiempo de contacto con la safranina y resuspender las colonias sospechosas con una gota de solución salina fenicada al 1%, depositándolo en el portaobjetos con el fin de evitar el peligro de contaminación para el personal del laboratorio.

d.- Técnicas de cultivo

Las muestras de sangre se cultivan siguiendo dos técnicas:

• Técnica de Castañeda: Utiliza un medio bifásico (medios que tienen una fase líquida y otra sólida en un mismo frasco). El medio líquido permite el enriquecimiento previo de la Brucella y el medio sólido sirve para la siembra. Esta técnica tiene las siguientes ventajas:

• manipilación sencilla.

• frascos de cierre hermético que dificultan la contaminación.

• los frascos pueden llevar CO2.

• conservación indefinida y transporte cómodo.

El volumen de sangre que se siembra no debe superar el 20% del volumen del medio. El frasco se incuba a 35-37ºC en posición vertical y a las 48 horas se inclina para que la fase líquida impregne la fase sólida y se incuba nuevamente en posición vertical.

El hemocultivo se observa cada 2-3 días hasta un total de 30 días.

• Técnica de Isolator: En un sistema de lisis-centrifugación realizado en el mismo tubo. La sangre inoculada se lisa por la acción de detergentes y se somete a concentración por centrifugación. El sedimento se siembra en medio sólido. Esta técnica tiene como ventajas:

• lisa las células sanguíneas, por lo que permite una mayor recuperación de patógenos intracelulares.

• se acorta el tiempo de aislamiento.

• mayor número de resultados positivos.

Inconvenientes: la tasa de contaminación es mayor al no tratarse de incubación en recipientes cerrados, sino en placas de agar.

3.- EPIDEMIOLOGÍA.

La brucelosis es una típica zoonosis en la que el hombre es un huésped accidental. Las posibles fuentes de contaminación son:

• Contagio directo por:

contacto con animales infectados

inhalación de aerosoles

inoculación

contacto con mucosas principalmente en personas que trabajen con animales

• Contagio indirecto por ingestión de leche y derivados no pasteurizados.

Es importante destacar el peligro que corre el personal del laboratorio que se puede infectar por:

• contacto con piel y mucosas.

• inhalación de aerosoles.

• inoculación accidental con agujas contaminadas.

Por ello siempre que se sospeche Brucella hay que extremar las condiciones de trabajo.

Recomendaciones:

• Trabajar en campana de seguridad.

• Usar ropa protectora.

• No oler ninguna placa de cultivo.

• Tirar directamente las jeringas del hemocultivo al contenedor.

4.- PATOLOGÍA

El periodo de incubación de la Brucella es de 1-6 semanas; en este tiempo la Brucella se multiplica en el interior de las células en el retículo endoplásmico y de aquí pasa a sangre y tejidos donde se producen granulomas y abcesos. Es característico el polimorfismo de la enfermedad y la recaída en los primeros meses.

Es frecuente que la infección se localice en distintos órganos ( hígado, músculo, huesos, etc).

La Brucella melitensis causa un acusado neurotropismo (tendencia por SNC).

En humanos las complicaciones más frecuentes es la osteomielitis.

La Brucella es el agente productor de brucelosis, fiebre de malta o fiebres ondulantes. Comienza con fiebre, debilidad, dolores óseos y sudoración. La fiebre aumenta por la tarde y disminuye por la noche apareciendo una sudoración con olor a paja mojada..

La enfermedad se disemina por vía linfática alcanzando los ganglios linfáticos, bazo, hígado y vértebras donde se forman nódulos granulomatosos.

5.- TRATAMIENTO

Dado que se trata de un microorganismo intracelular y las reacidas son frecuentes, los tratamientos han de ser prolongados principalmente por tetraciclinas-estreptomicinas. También es útil la rifancitina y la doxiciclina. En ninos menores de 14 años se usa trimetroprimsulfametoxazol.

Bordetella.

1.- INTRODUCCIÓN.

2.- CLASIFICACIÓN Y ESPECIES MÁS IMPORTANTES.

3.- AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO.

• Toma de muestras.

• Medios de cultivo.

• Tinciones.

• Pruebas bioquímicas y serológicas.

4.- EPIDEMIOLOGÍA.

5.- PATOLOGÍA.

6.- TRATAMIENTO Y PROFILAXIS.

1.- INTRODUCCIÓN

Es un bacilo gram -, capsulado, móvil o inmóvil, no formador de esporas y se considera parásito estricto.

Crece en células epiteliales ciliadas del tracto respiratorio.

Son muy sensibles al calor y desecación y sobrevive muy poco fuera del hombre.

2.- CLASIFICACIÓN Y ESPECIES MÁS IMPORTANTES

La especie más importante es Bordetella pertusis. (ver cuadro 12.4)

3.- AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

a.- Toma de muestras

Se toma en condiciones asépticas con una torunda impregnada en alginato cálcico a través de esputos o incluso con un escobillón de la zona nasofaríngea. También se puede tomar la muestra por expectoración en placa en un medio específico para Bordetella pertusis denominado Bordet-gengou.

Las placas se incuban a 35ºC en atmósfera húmeda y CO2 opcional.

Las colonias a los 5-7 días de incubación son pequeñas y de color blanco perlado (similar a gotas de Hg)

b.- Tinciones

Se realiza tinción de gram, de esporas y de cápsula.

c.- Pruebas bioquímicas y serológicas

• Pruebas bioquímicas: (ver cuadro 12.4)

• Pruebas serológicas: Consiste en la búsqueda de Ac de Bordetella aglutinante mediante reacciones de precipitado del suero del paciente con suero específico. Suelen emplear técnicas de ELISA, fijación de C e inmunofluorescencia. Son muy útiles en la fase terminal de la fase catarla y paroxística cuando el microorganismo disminuye su número (en fase precoz es más útil el cultivo).

4.- EPIDEMIOLOGÍA

La enfermedad que produce se denomina tos ferina. El periodo de incubación es de 7-10 días. La fuente de infección es el enfermo, generalmente niños menores de 5 años.

Se transmite por vía respiratoria al toser, estornudar, hablar, etc.

5.- PATOLOGÍA

Bordetella pertusi posee una enterotoxina dermonecrótica y estimulante de la tos. Produce la tos ferina y la enfermedad comienza con un periodo catarral que dura 1-2 semanas. Es un catarro débil con fiebre y tos muy contagiosa.

Se continúa con periodo paroxístico o espasmódico en el cual tras una inspiración profunda se producen de 10-12 golpes de tos breves pero periódicos. Bruscamente se produce una inspiración profunda de carácter sibilante (silbido) que se asemeja al canto de un gallo (se denomina tos coqueluchoide).

El tórax queda fijo en inspiración y el niño aparece cianótico volviendo a producir otra serie de golpes de tos.

El mecanismo de la tos es mixto:

• Central: por acción de la enterotoxina en el centro de la tos

• Periférico: por el esputo viscoso y filante y la compresión de los bronquios.

Se observa un aumento de linfocitos y también puede estar acompañada de vómitos.

Puede haber fiebre por asfixia.

En lactantes es frecuetne la apnea (ausencia de respiración), cianosis y estertor (inspiración forzada).

Los niños mayores o adultos inmunizados presentan solamente síntomas catarrales o ligera bronquitis.

6.- TRATAMIENTO Y PROFILAXIS

• Tratamiento: a base de eritromicina. La administración de antibiótico en la fase previa catarral erradica los microorganismos. Cuando la enfermedad ha entrado en su fase paroxística la administración de antibiótico no bloquea el progreso de la misma. Se recomienda entonces la oxigenoterapia para evitar lesiones cerebrales.

• Profilaxis: durante el primer año de vida se debe vacunar a los niños frente a Bordetella Pertussi, se administra la vacuna DTT (Difteria, Tétanos y Tos ferina).

Francisella tularensis.

1.- INTRODUCCIÓN.

2.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.

• Toma de muestras.

• Estudios microbiológicos y serológicos.

3.- PATOLOGÍA.

4.- TRATAMIENTO.

1.- Introducción

Es un cocobacilo gram - aerobio y anaerobio facultativo y no esporulado, responsable de una enfermedad zoonótica llamada Tularemia. Forma parte de la flora orofaringea normal de un gran número de animales salvajes, desde donde pasa al hombre por varias vías:

• Contacto con cadáveres de animales infectados.

• Inhalación de aerosoles.

• Ingestión de carne contaminada.

• Picaduras de moscas, mosquitos y garrapatas que actúan de vectores de las bacterias.

2.- Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestras ! la toma de sangre se realiza de las heridas, esputo y sangre.

• Estudios serologicos y microbiológicos ! en cuanto a los estudios microbiológicos: tinción de gram y tinción de fluorescencia.

• Medio de cultivo ! Thaller - Martin y agar sangre enriquecidos con glucosa y cisteína a 37º.

• Pruebas bioquímicas: catalasa - y producción de sulfhídrico.

• Pruebas serologicas: pruebas de aglutinación y test de introdermoreacción en la piel.

3.- Patología

Tiene un periodo de incubación de 3-4 días. El paciente tiene fiebre, escalofríos, dolor de cabeza y linfoadenopatias. La forma mas común de la enfermedad es la Tularemia ulceroglandular, en la que se observa una lesión localizada en la puerta de entrada de las bacterias menos habituales, son las Tularemias Oculo-Glandular y Orofaríngea asociado a infecciones en ojos y faringe.

Si la infección se produce por inhalación de aerosoles se verán afectados los pulmones dando lugar a Tularemia Pulmonar.

La ingestión de carne contaminada dará lugar a Tularemia Tifoidal (infección sistémica con alta tasa de mortalidad).

4.- Tratamiento

Principalmente estreptomicina.

Pasteurella.

1.- INTRODUCCIÓN.

2.- ESPECIES MÁS IMPORTANTES.

3.- PATOLOGÍA.

4.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.

1.- Introducción

Son cocobacilos gram - no esporulados, anaerobios facultativos capsulados y patógenos para algunos hombres y algunos animales.

2.- Especies mas importantes

Existen seis especies siendo la más importante Pasteurella Multocida.

3.- Patología

Tiene una estructura capsular de acción enterotoxica dando un efecto virulento principalmente en infecciones locales afectando a la piel.

El foco de infección es a través de las heridas, de aquí pasa s sangre ocasionando bacteriemia, a veces en enfermedades crónicas de origen pulmonar se han observado sobre infecciones originando cuadros de neumonía.

También se ha visto implicada en Meningitis.

4.- Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestra: de heridas

• Tinciones: gram principalmente

• Medio de cultivo: agar sangre dando colonias pequeñas y traslucidos que desprenden olor a champiñón.

• Pruebas bioquímicas: oxidasa, catalasa, Indol, nitratos +. Las colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas.

• Pruebas serologicas: aglutinación.

• Tratamiento: penicilina.

KINGELLA

Cocobacilo gram - forma parte de la flora normal de la orofaringe del hombre y rara vez produce daño en este.

Se ha aislado en bacteriemia y en lesiones de piel y huesos.

El tratamiento: penicilina, gentamicina y cloranfenicol.

ACTINOBACILLUS

Son cocobacilos gram - inmóviles y oxidasa +, forman parte de la flora oral habitual de un gran numero de animales domésticos.

El hombre se infecta por inoculación de esta bacteria generalmente por mordeduras.

Una de las especies más importantes es Actinobacillus Actinomycetemcomitans, se le ha asociado a peridontitis destructiva de los adolescentes. Se considera patógeno oportunista y es sensible a la penicilina.

TEMA 16.- BACILOS Y COCOBACILOS GRAM POSITIVOS

1.- BACILLUS

• Introducción

• Especies más importantes

• Bacillus anthracis

• Epidemiología

• Patología

• Carbunco cutáneo

• Carbunco pulmonar

• Carbunco intestinal

• Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestra

• Tinción

• Medios de Cultivo

• Pruebas biquímicas

• Pruebas serológicas

• Tratamiento

• Bacillus cereus (intoxicación alimentaria)

2.- LISTERIA

• Listeria monocitogenes

• Introducción

• Patología

• Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestra

• Tinciones

• Medios de cultivo

• Pruebas bioquímicas

• Pruebas serológicas

• Tratamiento

3.- Corynebacterium

• Introducción

• Especies más importantes ! Corynebacterium difteriae

• Patología y profilaxis

• Aislamiento y características bioquímicas

• Tratamiento

4.- OTROS

• Erysipelothrix rhusiopathiae

• Kurthia

• Lactobacillus

1.- BACILLUS

A.- INTRODUCCIÓN

La familia Bacillaceae comprende los géneros Bacillus y Clostridium que son bacilos gram (+) formadores de esporas (Clostridium lo estudiaremos en un capítulo aparte de anaerobios).

El género Bacillus comprende numerosas especies ampliamente distribuidas en la naturaleza pero sólo unas pocas tienen importancia patológica, entre ellas destaca B.cereus y B. Anthracis.

Se caracteriza por crecer la mayor parte a 37ºC en medios generales. Son aerobios y facultativos (pueden crecer en condiciones anaerobias) y esporulados.

B.- ESPECIES MÁS IMPORTANTES

Bacillus anthracis

• Epidemiología: Es una zoonosis principalmente siendo una enfermedad profesional de pastores, veterinarios, mataderos, etc. El germen entra a través de rasguños, heridas, inhalaciones, etc.

• Patología: Es el microorganismo causante del Carbunco o Ántrax; hoy en día no se suele dar en países industrializados pero sí en subdesarrollados.

En un bacilo gram (+) que se agrupa en parejas o cadenas, con bordes cortantes, con aspecto de tiza o caña de bambú, capsulado, esporulado e inmóvil.

Se puede transmitir por inhalación por lo que se deberá realizar un aislamiento.

Forma una exotoxina de carácter proteico con una acción muy tóxica y junto a presencia de cápsula proporciona a estas bacterias propiedades antifagocitarias.

El carbunco humano tiene lugar tras el primer contacto con animales infectados que tras un periodo de incubación de 2-3 días da lugar a:

Carbunco cutáneo o Pústula maligna: El poder patógeno se debe a la exotoxina que da lugar a una pápula que se transforma en vesícula luego en pústula y posteriormente en úlcera necrótica cubierta por una costra negra; a partir de ésta se propaga por vía linfática provocando linfagitis y septicemia. Los más habitual son formas benignas que se curan con facilidad tras un tratamiento adecuado.

Carbunco pulmonar: Cursa con edema pulmonar u pulmonía debido a la inhalación de polvo contaminado con esporas. También se le denomina como la enfermedad de los cardadores de lana.

Carbunco intestinal: Conlleva dolor abdominal, vómitos, diarreas, etc debido a la ingestión de alimentos contaminados. Es la más rara y grave.

• Aislamiento y características bioquímicas:

• Toma de muestra: se coge a partir de la pústula o también del esputo. Se realizara un hemocultivo (septicemia).

• Tinciones: gram, esporas y cápsula.

• Medio de cultivo: medios generales como sangre, dando lugar a colonias grandes en forma de melenas de león o cabezas de medusas.

• Pruebas bioquímicas: (esquema, fotocopias: tabla 10.1 y 10.2)

• Pruebas serologicas: inmunofluorescencia

• Prueba de la Antracina: Es una prueba de introdermoreaacion, la cual será positiva si da una reacción eritomatosa de al menos 8 ml de diámetro a las 24 h.

• Tratamiento: Penicilina y alternativamente tetraciclina, cefalosporina, cloranfenicol y aminoglucosidos.

BACILLUS CEREUS

Agente capaz de producir toxiinfecciones mediante el aislamiento en alimentos y heces del paciente.

Es resistente a los beta-lactamicos, y sensibles a los aminoglucosidos, vancomicina y clindamicina.

2.- LISTERIA

Existen 8 especies siendo la más importante Listeria monocitogenes.

A.- PATOLOGÍA

Se han descrito una gran variedad de manifestaciones clínicas, entre ellas, las importantes son: sepsis o meningitis neonatal, sepsis o meningitis en pacientes inmunodeprimidos (particularmente en transplantados de riñón) y sepsis puerperal (después del parto) o enfermedad gripal en la gestación.

Se ha observado que se desarrolla en personas que tienen bajas las defensas pudiendo producir la muerte.

Listeria monocitogenes es capaz de crecer en el interior de las células del sistema retículo endotelial lo que le permite vivir en macrófagos confiriéndole una extraordinaria resistencia frente a agentes antibacterianos(Ab). Además este mecanismo le va a facilitar su diseminación.

Posee una estructura antigénica específica correspondiente a Ag flagelares (Ag H) y Ag somáticos (Ag O).

B.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

• Toma de muestra: Sangre, LCR, esputo, etc.

• Tinción: Gram

• Medios de Cultivo: Medios enriquecidos con ambiente microaerófilo (10% de CO2) a 37-42ºC. Se puede sembrar en agar sangre para conocer su grado de hemólisis. Listeria nopresenta ni cápsula ni esporas, pero sí flagelos en disposición peritrítica. Su distribución es ubicua (en todas las partes, agua, tierra, ser humano, aire, etc) y se ha aislado asociado a numerosas enfermedades de peces, mamíferos, plantas, etc.

• Pruebas bioquímicas: Catalasa, ONPG, esculina (+); oxidasa, coagulasa, decarboxilasa, ureasa (-); movilidad (+) a 22ºC. (ver cuadro 10.2)

• Pruebas serológicas: Principalmente pruebas de aglutinación en el que se evaluará el título de las aglutininas H de las muestras del suero del paciente. También se realizan técnicas de fijación de C' cuyo título se da como positivo a partir de 1/10. También técnicas de inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, test de alergia por introdermoreacción, etc.

C.- TRATAMIENTO

Principalmente ampicilina y eritromicina.

3.- CORYNEBACTERIUM

A.- INTRODUCCIÓN Y ESPECIES MÁS IMPORTANTES

Comprende un grupo de cocobacilos gram positivos, no esporulados, generalmente inmóviles y pueden contener gránulos metacromáticos que se tiñen irregularmente. Son pleomórficos y lo más característico es que adoptan una posición en empalizada o letras chinas.

Están muy distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora normal del hombre; algunos autores los denominan difteromorfos.

Son erobios facultativos o microarófilos. La especie más represantiva es Corynebacterium difteriae que junto con Corynebacterium ulcerans y Corynebacterium pseudotuberculosis son los únicos que pueden producir toxinas o ser patógenos. Las demás especies son patógenos oportunistas.

B.- PATOLOGÍA Y PROFILAXIS

El Corynebacterium difteriae produce la difteria que es una enfermedad infecciosa aguda causada por cepas que producen toxinas.

La vía de entrada es la mucosa respiratoria donde se multiplica y produce la exotoxina que causa necrosis en los tejidos vecinos provocando una respuesta inflamatoria con formación de la pseudomembrana diftérica.

La toxina puede afectar al corazón y nervios periféricos. El periodo de incubación es de 3-5 días y teniendo en cuenta el punto de entrada se produce faringitis o amigdalitis con fiebre y/o diseña (dificultad respiratoria). Esto se debe a la pseudomembrana que provoca una obstrucción de las vías aéreas produciéndose un edema (hinchazón por retención de líquidos) localizado en el cuello, denominado “cuello de toro”, provocando un taponamiento de las vías respiratorias que puede llevar a la asfixia lo que se denomina “crup diftético”.

Si hay una difusión de la toxina se pueden producir alteraciones hepáticas, renales,etc.

Su efecto patógeno se encuentra directamente relacionado con dos tipos de Ag:

• Ag O: es un polisacárido termoresistente y responsable de reacciones cruzadas con micobacterias.

• Ag K: es un Ag proteico sensible a la Tª y responsable de da la reacción de hipersensibilidad.

Otros factores de patogenocidad:

• Hialurodinasa: causa la infección sobre las células.

• Exotoxina

• Glicoliticos: muy toxico y causa muerte celular.

En cuanto a la profilaxis: la vacuna DTT.

C.- Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestra: vías respiratorias.

• Tincones: gram, corpúsculos metacromáicos.

• Medio de cultivo: Loeffler que da colonias grisáceas pequeñas con bordes irregulares.

• Pruebas bioquímicas: (ver tabla 10.3)

• Prueba de la Toxigenicidad: Puede realizarse in vivo o in vitro.

• In vivo ! se inyecta introperitonalmente una suspensión con el corinebacterium difteriae a un animal de experimentación (cobaya) y a un control al que se le inyecta además antitoxina difterica, al cabo de 2 días si la cepa de la suspensión fuese toxígena se producirá una infección.

• In vitro ! se lleva a abo por medio de un test de inmunodifusion radial en placa, la prueba será positiva si aparece el precipitado en el pocillo.

D.- Tratamiento

Penicilina y eritromicina.

4.- OTROS

Erysipelothrix Rhusiopathiae

Solo tiene una especie, es muy frecuente como patógeno en los cerdos y otros animales. Produce la Erisipela Porcina. En el hombre puede producir una lesión inflamatoria en la piel que generalmente afecta a manos y a dedos que se denomina Erysipeloide.

Las lesiones presentan un borde eritomatoso elevado y puede complicarse con septicemia y endocarditis. La adquisición en el hombre esta vinculado con contactos de tejidos animales: matarife, carniceros, pescadores, pescaderos, etc. aunque también puede estar presente en suelos contaminados.

Diagnostico: muestra de biopsias de las lesiones de la piel y hemocultivos. Crece bien en los medios habituales (agar sangre, chocolate). La característica mas llamativa es la producción de sulfhídrico en el medio TSI (triple sugar iron) hay que relacionarlo con el Kligler.

Características bioquímicas: catalasa negativa, oxidasa negativa, movilidad negativa, sulfhídrico positiva, nitratos negativa, glucosa positiva, lactosa positiva, xilosa negativa, manitol negativa, sacarosa negativa.

Kurthia

Lactobacillus

Son bacilos gram positivos, pleomórficos, normalmente inmóviles, microaerófilos y catalasa negativos. Reciben este nombre porque el producto principal de su metabolismo es el ácido láctico. Destacan algunas especies como el bacilo de Doderleim presente en la flora vaginal.

Otras especies forman parte de la flora intestinal como el Lactobacillus acidofilus. Especialmente se ha aislado en casos de neumonía, sepsis o infección del tracto urinario. Son sensibles a muchos betalactámicos.

TEMA.- 17 MICOBACTERIUM Y ACTINOMICETOS

1.- Introducción.

2.- Micobacterium

• Introducción.

• Procesamiento de las muestras para el estudio de micobacterias.

• Aislamiento y características bioquímicas.

• Realización de baciloscopias.

• Patogenicidad.

• Especies más importantes: M.tuberculosis y M. Leprae.

3.- Micobacterim tuberculosis

3.1 Patología.

3.2 Epidemiología.

3.3 Prueba de la tuberculina.

3.4 Tratamiento.

4.- Micobacterium leprae

4.1 Patología: lepra tuberculoide y lepra lepromatosa.

4.2 Epidemiologia.

4.3 Prueba de la lepromina o mitsuda.

4.4 Toma de muestras.

4.5 Tratamiento.

5.- Actinomicetos

5.1 Introducción.

5.2 Especies más importantes.

5.3 Aislamiento y características bioquímicas.

5.4 Patología.

5.5 Tratamiento.

1.- Introducción

De acuerdo con la última edición del manual de Bergey`s Micobacterium se encuentra en la sección 17 dentro de los Actinomicetes, el orden actinomiceto presenta ocho familias de las que dos resultan importantes para el ser humano por su interés clínico:

• Micobacteriaceae.

• Nocardiaceae.

2.- Micobacterium

2.1.- Introducción

Los Micobacterium son bacilos rectos o ligeramente curvados de 0.2- 0.6 m, son aerobios, inmóviles y no esporulados. Siendo típico de estos microorganismos la pared, ya que se encuentra altamente enriquecida por ácidos micólicos y en general componentes céreos, de tal forma que para su coloración se necesitan colorantes de alta capacidad tintorial así como calor para facilitar su penetración ya que este tipo de microorganismos se tiñen muy difícilmente. Una vez teñidos son altamente resistentes a la decoloración ácida, por todo ello son llamados BAAR, que es la principal diferencia con los demás microorganismos.

La presencia de estos componentes en la pared ofrecen a las micobacterias resistencia a la desecación y acción de decolorante, desinfectante y de agentes antibacterianos.

Así el colorante verde malaquita y el antibiótico penicilina se emplean en medios habituales de aislamiento de Micobacterium.

Son gérmenes muy distribuidos en la naturaleza, pueden ser saprófitos del agua, suelo, etc. , incluso afectar al hombre causando infecciones graves y en ocasiones crónicas como la lepra.

De las 57 especies que se conocen al menos 25 se han aislado en infecciones del hombre.

Se tiñen difícilmente con gram pero cuando lo hacen responden a gram + , aunque su principal característica es su capacidad BAAR.

Las micobacterias se pueden clasificar :

• Atendiendo a su velocidad de crecimiento.

• Morfología colonial.

• Y a la propiedad de desarrollar pigmentos de naturaleza carotenoide en determinadas condiciones.

Según estos puntos Runyon dio los siguientes grupos:

• Micobacterium fotocromógenos: desarrollan color cuando se exponen a la luz (pigmento amarillo-anaranjado)

• Micobacterium escotocromógenos: desarrollan color en la oscuridad.

• Micobacterium no cromógenos: de crecimiento lento ( más de 1 semana).

• Micobacterium crecedores rápidos: (menos de 7 días)

Posteriormente se vio que esta clasificación no era perfecta puesto que existen micobacterias que pueden clasificarse en más de un grupo.

Otros autores realizan otra clasificación dividiendo a las micobacterias en dos grupos importantes:

• Bacilos de Micobacterium cultivables en medios artificiales, con crecimiento más bien lento y que en función de su cuadro clínico que producen en el hombre se dividen en:

• Especies que producen tuberculosis en el hombre y animales (Micobacterium tubercolisis y Micobacterium bovis)

• Especies de micobacterias atípicas de crecimiento muy lento y que pueden presentar un poder patógeno en el hombre distinto de tuberculosis y lepra.

• Bacilos de Micobacterium no cultivables en medios artificiales y patógenos para el hombre (Micobacterium leprae)

2.2.- PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA EL ESTUDIO DE MICOBACTERIAS

La mayor parte de las muestras que se procesan para micobacterias proceden del tracto respiratorio (esputos, líquido pleural, broncoaspirado), orina, LCR, biopsias, etc.

El procesamiento de muestras requiere un paso inicial que es una concentración por medio de centrifugación (muestras más peligrosas). La mayor parte de las muestras contaminadas por flora acompañante que crece más rápido que las micobacterias puede inhibir el desarrollo de éstas, por ello las muestras deben ser sometidas a un proceso de homogenización-descontaminación previo a las siembra.

La homogenización de esputo es necesario para fluidificar la muestra, normalmente muy mucosa, para ello se utilizan mucolíticos como N-acetilcisteína o el detergente lauril-sulfatosódico.

La descontaminación se lleva a cabo con ácido o álcalis, a pesar de que las micobacterias son muy resistentes a estos agentes únicamente sobreviven de un 10-20% de la población inicial. El tiempo de contacto de NaOH no debe ser mayor a 15 minutos.

Los líquidos estériles cono el LCR no necesitan del proceso de homogenización ni descontaminación y pueden sembrarse directamente.

El proceso de descontaminación se lleva a cabo en cabinas de seguridad.

2.3.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

• Toma de Muestras: esputo, LCR, broncoaspirado, etc.

• Tinciones: principalmente Ziehl-Nielsen y Auramina-Rodamina.

• Medios de Cultivo: Lowenstein-Jensen que contiene huevo y verde malaquita y antibióticos, como penicilina, para inhibir el crecimiento de otros microorganismos.

Miedlebrook

Hoy se utilizan medios de cultivo radiométricos siendo el más utilizado Bactec-TB. Este sistema contiene un medio liquido de soporte de crecimiento de micobacterias suplementado con Ab y que contiene un sustrato marcado con C14. Las micobacterias al crecer metabolizan el sustrato y liberan CO2 marcado radiactivamente que puede ser detectado. La principal ventaja de este método es el acortamiento del tiempo de crecimiento de micobacterias.

Cuando se emplean medios de cultivo convencionales deben cultivarse a 35ºC en oscuridad y en atmósfera húmeda con 5-10% de CO2 durante 1 semana, y después se pone a atmósfera normal.

• Pruebas bioquímicas: Test de la niacina, reducción de nitratos, catalasa, hidrólisis de Tween 80, test de la arilsulfatasa, reducción de telurito e inhibición del crecimiento por la hidracida del ácido tiofeno2-carboxílico. Hoy en día se han desarrollado nuevas técnicas que permiten la determinación de especies en pocas horas. Las más empleadas son: técnicas de sondas genéticas de ADN y análisis cromatográfico de lípidos de la pared celular.

• Pruebas serológicas: principalmente precipitación, aglutinación, fijación de complemento.

2.4.- REALIZACIÓN DE BACILOSCOPIAS

Una vez recogida la muestra debe hacerse un proceso de concentración-descontaminación y una tinción BAAR.

El hallazgo de BAAR en un frotis no es diagnóstico definitivo de infección bacteriana pero permite:

• Un diagnóstico de presunción de tuberculosis.

• Seguimiento del paciente que está siendo tratado con antituberculosos, pudiéndose saber cuando la baciloscopia de vuelve negativa.

Para la realización de la extensión se recoge una mínima parte de esputo y cubrirá las 2/3 partes de la superficie, no deben ser gruesas pues dificultarían la visión.

Cuando se observa una tinción de Ziehl-Nielsen se recomienda hacer una valoración cuantitativa de los bacilos presentes en la muestra. El objetivo se debe colocar en un extremo de la preparación y se recorre toda una línea. Si se observan aproximadamente 100 campos se cuentan los BAAR encontrados. Si se han visto 50 BAAR no es necesario continuar y se informa como 50/1L (50 bacilos en una línea del porta). Si el número está entre 10 y 50 se informa con X/1L, siendo X el número de bacilos contados. Si el número de bacilos es menor de 10, habrá que observar 2 líneas más, un total de 300 campos, expresándose el número de BAAR como X/3L. Otra de comunicar la información es por semicuantificación (sistema de cruces).

El examen microscópico es subjetivo y el microscopista que carece de experiencia puede cometer errores, por lo que es necesario conocer las causas más frecuentes de los falsos positivos y negativos:

• Falsos positivos:

• Restos de comida en esputo

• Fibras de algodón

• Ralladura del porta

• Precipitados de colorante

• Falsos negativos:

• Mala realización del frotis ( grueso, no haber cogido la zona más purulenta, mala fijación, mala decoloración)

• Fallo del microscopista

2.5.- PATOGENICIDAD

Los bacilos tuberculosos virulentos contienen una serie de componentes celulares que dañan los tejidos del huésped. Son ceras, fosfolípidos, proteínas, polisacáridos y ácidos glucólicos.

También producen factores tóxicos como cera-D y factor cord (denominado factor cuerda o cuerda serpentina, ya que al microscopio tiene disposición de largas cuerdas) cuya presencia está relacionado con la virulencia.

3.- MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS

3.1.- PATOLOGÍA

Es un bacilo denominado Bacilo de Koch. Es capaz de crecer en el interior de las células retículo-endoteliales sin ser destruidas.

Llega al organismo por inhalación aunque excepcionalmente por ingestión de alimentos contaminados o heridas en la piel. Tras una única exposición es menor el riesgo de desarrollar la infección (3-5%), siendo necesarias exposiciones repetidas para que aumente esta probabilidad junto con una inmunidad deteriorada por parte del huésped.

Cuando el M.tuberculosis llega al huésped por inhalación produce una infección primaria o primoinfección tuberculosa que actúa sobre el pulmón y más concretamente a nivel de los alvéolos provocando una intensa reacción inflamatoria que produce exudación. Estos bacilos pueden llegar a los vasos linfáticos, ganglios y retornar a la circulación venosa originando focos metatásicos en distintos órganos.

Si no hay tratamiento a tiempo el tubérculo que se origina en el pulmón se va desarrollando evolucionando a necrosis caseosa (masa amorfa y homogénea generalmente debida a proteínas coaguladas formada por estructura de tejidos en descomposición; es similar a un queso en su aspecto). El tubérculo que se forma está constituido en su parte central por células gigantes en cuyo interior se encuentran los bacilos, una parte intermedia de carácter epitelial y con apenas bacilos y una parte periférica que contiene abundantes linfocitos, monocitos y bacilos tuberculosos. Esto va acompañado de fiebre, sudoración nocturna, adelgazamiento, tos con esputos purulentos y en fases avanzadas hemoptisis (expulsión de sangre por la boca procedente de las vías respiratorias bajas).

Además de la lesión primaria también podemos hablar de tuberculosis post-primaria o reacción secundaria que ocurre tras una reactivación de la lesión primaria.

Histológicamente hablamos de que micobacterium puede producir dos tipos de lesiones:

• Exudativas: son propias de la etapa inicial apareciendo lesión inflamatoria aguda con edema y acumulación de polimorfonucleares alrededor del bacilo tuberculoso. El cuadro se asemeja a la neumonía. Puede curar espontáneamente, producir necrosis tisular p evolucionar hacia una lesión productiva.

• Lesión productiva granulomatosa: consiste en un granuloma crónico formado en la zona central por células gigantes y bacilos, una zona intermedia de carácter epitelial y zona periférica con linfocitos y macrófagos.

3.2.- EPIDEMIOLOGÍA

Se difunde por las gotículas y esputos de individuos y animales, también por contaminación de alimentos (tuberculosis intestinal) y por heridas.

Los bacilos pueden sobrevivir hasta 6 semanas en esputos y se destruyen a la luz solar en poco tiempo.

Su mayor incidencia está en grupos sociales de bajo nivel, malnutridos y sin condiciones higiénicas.

La tuberculosis es una enfermedad importante a nivel en países subdesarrollados y en grupos marginados de países industrializados. El M.tuberculosis produce cada año de 5-8 millones de nuevos casos, siendo el responsable de 2-3 millones de muertes en el mundo.

En el M.tuberculosis la fuente de infección es el hombre a nivel del tracto respiratorio; en el caso de M. Bovis la vía de entrada es respiratoria por la tos de la vaca o por ingestión de la leche no pasteurizada o de la carne procedente de una vaca tuberculosa.

La tuberculosis afecta principalmente a las personas inmunideprimidas: alcoholicos, ancianos, drogadictos, pacientes con SIDA.

3.3.- PRUEBA DE LA TUBERCULINA

Permite diferenciar entre individuos infectados y no infectados.

• Prueba positiva: indica que el individuo ha estado en contacto con M.tuberculosis y es portador de micobacterium en los tejidos. No implica que exista infección activa en ese momento pero existe el riesgo de adquirir la enfermedad por reactivación de dicho foco primario.

• Prueba negativa: no se corre el riesgo de reactividad.

A la prueba de la tuberculina también se le llama prueba de Mantoux, que consiste en una inyección intradérmica de DPP (derivado proteico purificado); a las 48-72 horas se mide el grado de induración de la zona. Tradicionalmente se consideraba positivo cuando el diámetro es mayor o igual a 10 mm. Actualmente se siguen las siguientes pautas para considerara positivo el test:

• Diámetro " 10 mm en pacientes menores de 35 años.

• Diámetro " 15 mm en pacientes de 35 años o más.

• Diámetro " 5 mm en individuos en contacto con pacientes tuberculosos e infectados con VIH.

3.4.- TRATAMIENTO

Los fármacos antituberculosos que se usan normalmente son isoniazida, etanbutol, rifampicina y estreptomicina. Para evitar la aparición de resistencia se lleva a cabo la politerapia.

Los tratamientos son largos, de 6-12 meses, ya que las bacterias son muy resistentes a agentes terapéuticos; no se debe olvidar que son microorganismos intracelulares y que el acceso del antibiótico se dificulta la propia composición caseosa de las lesiones tuberculosas.

Las micobacterias que producen lesiones cutáneas se tratan con cirugía. Las infecciones por otras micobacterias distintas de tuberculosis se denominan micobacteriosis.

4.- MICOBACTERIUM LEPRAE

4.1.- PATOLOGÍA

Agente etiológico de la lepra. Se trata de una especie que no se puede cultivar en el laboratorio por lo que se conoce muy poco sus características microbiológicas. Se ha observado que el único reservorio es el hombre con auténtica predilección por las terminaciones nerviosas.

Son BAR aislados en parejas o masas, se pueden inocular en animales siendo el armadillo la especie más receptora. Sí existen pruebas serológicas para la lepra.

Es un bacilo inmóvil, rectilíneo, que se encuentra en la mucosa nasal, dermis y biopsias de lesiones de individuos con lepra.

Son bacilos no esporulados, no flagelados ni capsulados. En el hombre da lugar a la lepra que es una enfermedad caracterizada por lesiones granulomatosas crónicas. Es de lenta evolución que ocasiona lesiones desfigurantes y mutilantes en las zonas más frías del cuerpo ya que el bacilo posee gran afinidad por el tejido cutáneo y nervioso. Aparecen maculas pálidas y nódulos grandes llamados lepromas acompañados de anestesia local. La afección de la cara da lugar a la caída de la cola de la ceja y a la destrucción del tabique nasal, es lo que se denomina “facies leonina” o “cara de león”. La lepra se puede manifestar de dos formas:

• Lepra tuberuloide: de evolución benigna y con tendencia a quedar latente con maculas cutáneas, grave afectación nerviosa y prueba de la lepromina positiva.

• Lepra lepromatosa: de curso maligno con aparición de nódulos cutáneos, amputación y prueba de la lepromina negativa.

4.2.- Epidemiología

Generalmente se necesitan más de un contacto con enfermos de lepra activa. El material mas infeccioso son las secreciones nasales y el periodo de incubación es de 2-6 años. Es una enfermedad difícilmente de determinar por su elevado periodo de incubación. Su periodo de invasión es poco específico y con síntomas raros no asociables a la lepra. A veces se presenta picor, hormigueo, perdida de la sensibilidad en manos y pies y a partir de aquí de forma lenta y progresiva lesiones cutáneas. Suele durar toda la vida y su evolución más o menos grave dependerá del grado de inmunidad del huésped.

4.3.- Prueba de la lepromina o Mitsuda

Existe una prueba que indica el estado inmune del individuo frente a la enfermedad que se denomina Mitsuda. Se toma un extracto de la lesión leprosa y se pasa por el autoclave, posteriormente se inyecta en el antebrazo. Puede ocurrir después de 25 días:

• Aparece una induración de más de 25 mm de diámetro: Esto indica que estamos frente a un organismo inmunizado frente a micobacterium.

• Induración de menos de 3 mm: individuos sensibles por no haber tenido contacto o por tener una lepra lepromatosa.

• Induración entre 3-5 mm: son de resultado dudoso (nos fijaremos en la sintomatología).

4.4.- Toma de muestra

Se realiza un raspado de la mucosa del tabique nasal o se hace una biopsia de un leproma en la oreja, ganglio nervioso o trozo de nervio afectado.

4.5.- Tratamiento

Se utilizan sulfanos y rifampicinas.

5.- ACTINOMICETOS

5.1.- Introducción

Son bacilos gram positivos aunque se tiñen con dificultad siendo mas característico porque algunas especies son baar positivo debido a la composición de la pared celular (ácidos micólicos y componentes céreos), dan positiva la prueba de la catalasa y el microorganismo se ve de forma variable dependiendo de los géneros, pudiendo ser: cocobacilos, filamentosos…

La morfología filamentosa se asemeja a la de los hongos, de ahí el nombre de actinomiceto. Estos microorganismos se encuentran en el suelo, plantas y vegetales generalmente, aunque también pueden aislarse en piel, orofaringe y tracto gastrointestinal del hombre y animales.

El hombre puede infectarse por inhalación o contacto de una herida, son inmóviles no esporulados y no capsulados.

5.2.- Especies más importantes

(ver fotocopias tabla 11.2)

5.3.- Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestras: esputo, secreciones virulentas, LCR, liquido pleural.

• Tinciones: gram positivas (se ven con dificultad) principalmente BAAR, Niehl- Ziensen y Rodamina-Auramina positivas.

• Medios de cultivo: agar infusión cerebro corazón, Mueller Milton y medio de Lovestein - Jensein. La Tª de cultivo 20-27 º que impide que se desarrollen otras bacterias.

• Pruebas bioquímicas: (tabla 11.2)

• Pruebas serologicas: fijación del complemento, Elisa, aglutinación, precipitación.

5.4.- Patología

Cualquier infección pulmonar causada por estos microorganismos se considera nocardiosis. Gran parte de los estudios de nocardiosis parecen apuntar a infecciones de carácter oportunistas, es decir que se requiere de una enfermedad subyacente previa o que el paciente esté inmunológicamente debilitado.

El género Nocardia no producen toxinas pero tiene en su pared bacteriana una alta proporción de lípidos muy relacionados con su virulencia ya que le van a conferir a las bacterias alta resistencia frente a los sistemas de defensa del huésped. Tiene la capacidad de crecer y multiplicarse en el interior de los tejidos y macrófagos de aquí que se hayan considerado parásitos intracelulares.

Las manifestaciones clínicas mas frecuentes son:

• Nocardiosis pulmonar: causada por Nocardia, asteroides que producen lesiones pulmonares con abscesos, inflamación diseminada semejante a la tuberculosis, pudiendo dar áreas de necrosis y a partir de aquí la diseminación general por sangre a otros órganos. También pueden diseminarse por el sistema linfático, rara vez puede afectar al hígado, bazo y miocardio, pero cuando afecta puede ser grave o mortal, se le denomina pulmón del granjero como consecuencia de hipersensibilidad a Ag de los actinomicetos.

• Nocardiosis cutáneo: generalmente se debe a la manipulación de tierra y plantas contaminadas con actinomicetos apareciendo celulitis pustular.

• Micetomas: infección crónica supurativa cutánea y subcutánea que afecta a tendones, huesos y músculos. La localización más frecuente son las extremidades. El origen puede ser la inoculación de las bacterias procedentes del suelo o vegetación. Es una enfermedad típica en climas tropicales principalmente la especie Brasiliensis.

5.5.- Tratamiento

Trimetropin- Sulfametosazol combinado con Rifampicina y aminoglucosidos.

En el caso de micetoma y otras formas graves de Nocardiosis cutánea es necesario recurrir a la intervención quirúrgica además de la administración de antígenos.

TEMA 18.- MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

1.- INTRODUCCIÓN

2.- SIGNOS CLÍNICOS DE INFECCIÓN POR ANAEROBIOS

3.- CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ANAEROBIAS

4.- BACTERIAS ANAEROBIAS ESPORULADAS. GÉNERO CLOSTRIDIUM

4.1.-Introducción

4.2.-Clasificación

• Acción neurotoxica.

• Acción histológica.

• Acción sobre el aparato digestivo.

• Responsables de cuadros purulentos.

5.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

6.- TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE, ETC.

1.- INTRODUCCIÓN.

Todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o mantenerse en contacto con el oxigeno a la presión atmosférica se consideran anaerobias o anaerobias estrictas.

A estos microorganismos se les considera que tienen un metabolismo anoxibiotico, es decir incapaz de utilizar el oxigeno como aceptor final de electrones, utilizando como aceptor sustratos orgánicos.

Se sabe que estas bacterias no tienen cierto enzimas llamados metaloporfirinicos que en los mecanismos aerobios transportan oxigeno.

Nos encontramos bacterias anaerobias para los que la presencia de oxigeno es altamente toxica o bactericida, mientras que para otras bacterias es bacteriostático de tal forma que cuando se establezcan de nuevo las condiciones de anaerobiosis las bacterias crecen.

Las bacterias anaerobias forman parte de la flora normal (tabla 16.1) y dan lugar a patologías.

2.- SIGNOS CLÍNICOS DE INFECCIÓN POR ANAEROBIOSIS

(Ver tabla 16.2)

3.- CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ANAEROBIAS

(Ver tabla 16.1)

4.- BACTERIAS ANAEROBIAS ESPORULADAS. GÉNERO CLOSTRIDIUM

4.1.- Introducción

Dicho género tiene más de 30 especies y muchas son peligrosas para el ser humano. Este género se caracteriza por la formación de toxinas que responden a sustancias proteicas solubles.

4.2.- Clasificación

Se clasifican en los siguientes grupos:

• De acción neurotoxica, en este grupo se encuentra Clostridium tetanis (produce tétanos) y Clostridium botulium (produce botulismo).

• De acción histotóxica, en este grupo se encuentra Clostridium perfringes (produce gangrena gaseosa) y otros Clostridium.

• De acción sobre el aparato digestivo, destacaremos el Clostridium perfringes, Clostridium dificille y Aclostridium.

• Responsables de cuadros purulentos, destacaremos a Clostridium pyogenes, Aclostridium, Clostridium perfinges y Clostridium ramosum.

Clostridium Tetanis

Es un bacilo gram +, pequeño, con capacidad de formar esporas terminales dando a las bacterias un aspecto de cerillas o palillo de tambor. Su hábitat se encuentra fundamentalmente en la tierra y en intestinos de hombres y animales.

Posee 3 toxinas de acción neurotoxica y son transportados por vía sanguínea hasta el SNC bloqueando la liberación de neurotransmisores, esto origina convulsiones y parálisis apareciendo a nivel periférico en exceso de liberación de acetilcolina en el músculo esquelético que constituye el cuadro clínico característico de parálisis, así mismo se ve alterado el sistema contracción relajación muscular, de forma que este entra en una fase de contracción y no se recupera (rigidez tetánica).

Para que se produzca el tétano es necesario que el microorganismo se encuentre en condiciones de anaerobiosis. Tras una herida mas o menos profunda ya sea cortante, punzante, mordedura, arañazo, quemaduras, úlceras por decúbito e incluso heridas superficiales como rozaduras que se pudieran infectar y formar costra facilitan la infección anaerobia.

Si las condiciones son favorables el periodo de incubación es de 5 - 7 días y se origina la reacción patógena. Podemos hablar de 2 formas clínicas:

• Local

• Tetánica, que es la más grave.

El tétanos afecta principalmente a países subdesarrollados, es importante el diagnostico precoz y las medidas profiláctica (vacunas DTT). De no ser así el índice de mortalidad es muy elevado.

Clostridium Botulium

Son bacilos gram +, anaerobios estrictos, grandes, no capsulados, móviles, debido a su flagelación peritrica. Presentan esporas de carácter subterminal y en general es capaz de formar toxinas, las toxinas que se denominan con letras (A ! G). Las más peligrosas y potentes para el hombre son las neurotoxinas A, B. y E.

Clostridium Botulium presenta una estructura antigénica típica debida a los Ag flagelares y a los Ag de esporas.

Se encuentra ampliamente distribuido en muchos ambientes como aire, suelo, alimentos. Si las condiciones son las adecuadas las esporas germinan facilitando la proliferación de Clostridium Botulium. Es importante destacar su presencia en las conservas y pescados.

El efecto patógeno es debido a dichas neurotoxinas y son venenos biológicos que se conocen muy bien, una pequeña cantidad del microorganismo es suficiente para causar la muerte. Las condiciones para que germine la espora será de anaerobiosis, Tª aproximada 30º C y un pH neutro o ligeramente ácido.

Estas toxinas son de carácter proteico y termolabiles, de tal forma que se destruyen con facilidad a Tª altas (100ºC 15 min., 70º C 30 - 60 min.)

La toxina puede llegar al hombre a través de alimentos contaminantes, en el tubo digestivo producirá in situ una toxiinfección alimentaria.

A partir de aquí a través de vía sanguínea y linfática llega al sistema nervioso periférico donde actúa sobre terminaciones nerviosas bloqueando la liberación de acetilcolina y originando como consecuencia parálisis del músculo esquelético, así como otras manifestaciones neurológicas como: visión borrosa, fotofobia, disfagia, sequedad en boca y faringe y debilidad en los músculos incluyendo los respiratorios que pueden llegar a paralizarse y en muchas ocasiones es frecuente la muerte por fallos respiratorios y arritmias cardiacas.

Su periodo de incubación está en torno a las 16-36 horas después de la ingestión de alimentos contaminados. Los cuadros más graves se originan a las 24-48 horas.

Algunos autores hablan del Botulismo del lactante que se produce por la elaboración de toxinas en el colon tras la ingestión de esporas. El cuadro clínico puede ser desde leve a grave y se manifiesta por dificultad muscular, en la alimentación, estreñimiento, disminución del reflejo de succión e insuficiencia respiratoria.

El diagnóstico del botulismo es fundamentalmente clínico ya que el microbiológico puede retrasarse. Se puede mostrar presencia de toxinas en sangre por pruebas serológicas.

El tratamiento consiste en combatir los síntomas, limpieza a fondo de heridas, administración de antitoxina botulínica y Ab. También fármacos relacionados con el funcionamiento de al acetilcolina.

Clostridium que afecta a los tejidos. Clostridium perfringes

Es un bacilo gram positivo y anaerobio estricto. Se caracteriza porque está ampliamente distribuido por la naturaleza, especialmente en el suelo cuya concentración habitualmente sobrepasa las 50 mil bacterias /gramos de tierra, especialmente en tierras húmedas y abonadas con estiércol.De aquí a través de heridas puede pasar al hombre produciendo gangrena gaseosa. Es poco frecuente pero muy grave.

La gangrena gaseosa consiste en necrosis tisular (muscular)y signos de toxicidad sistémica debido a la producción de toxinas histológicas. Se caracteriza por un intenso dolor en la herida seguido de aparición de lesiones cutáneas como edemas, ampollas, etc, que se extienden rápidamente y evolucionan a necrosis y destrucción celular.

El diagnóstico se realiza por cuadro clínico y presencia en tinción de gram realizada principalmente en pus o tejidos afectados.

El tratamiento es quirúrgico y altas dosis de penicilina.

Existe una toxina , que es la principal responsable de este daño, y otras toxinas  y H que son responsables pero en menor medida.

Clostridium que afecta a tracto digestivo. Clostridium perfringes

Además de provocar gangrena gaseosa puede dar lugar a infección toxialimentaria producida por ingestión de carne contaminada. En el intestino delgado germinan las esporas dando un cuadro característico con diarreas, vómitos, dolor abdominal, etc, pudiendo llegar a estados de shock.

El cuadro es generalmente benigno y el diagnóstico se realiza mediante detección del microorganismo en el alimento o heces del paciente.

Clostridium responsable de cuadros purulentos. Clostridium pyogenes

Suele ir acompañado de otras bacterias anaerobias. Las toxinas no actúan ejerciendo efectos patógenos salvo cuando hay complicaciones.

5.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

• Toma de muestras: Se ha de realizar en condiciones de asepsia.

• Tinciones: Tinción gram y de esporas (Clostridium tetani)

• Medios de cultivo: Medios específicos como agar TSM a base de carne, sangre, huevos, tripticasa trisulfato y neomicina.

• Pruebas bioquímicas: Se utilizan muchas siendo las más importantes: hidrólisis de gelatina, producción de indol y pruebas de fermientación de HC.

• Otras pruebas de identificación:

• Para Clostridium tetani: pruebas de inoculación en animales, cromatografía de gases, HPLC, etc.

• Para Clostridium perfringes y Clostridium botulium: las mismas que para Clostridium tetani además de RIA e inmunofluorescencia.

6.- TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE, ETC.

La incubación se lleva a cabo con un sistema de campana, la atmosfera anaerobia se consigue mediante la introducción en la misma de un sobre generador de gas (CO2) y un catalizador.

Se incluirá siempre un medidor de anaerobiosis, que cambia de color en ausencia de aire, para comprobar que el sistema ha funcionado.

El sobre generador de gas se activa introduciendo en él 10 ml de agua del grifo, lo que da lugar a la liberación de H2 y CO2. El oxígeno del interior de la campana se une al hidrogeno y forma agua que se deposita en forma de gotas en las paredes del recipiente. El CO2 generado procuce el crecimiento de algunos anaerobios.

Los sobres e indicadores de anaerobiosis son de un solo uso.

(Ir a la pregunta 6 de las fotocopias)

TEMA 19.- RICKETTSIA, CLAMIDIAS Y MICOPLASMA.

1.- FAMILIA RICKETTSIACEAE

• Introducción.

• Géneros y especies más importantes:

• Rickettsias: R. Prowazekii, R. conorii y R. rickettsi.

• Coxiella burnetii.

• Ehrlichia.

1.3 Aislamiento y características bioquímicas

2.- CLAMYDIAS

2.1 Introducción.

2.2 Especies más importantes: C. tracomatis, C. psitacci y C. pneumoniae.

2.3 Tratamiento.

2.4 Aislamiento y características bioquímicas.

3.- MICOPLASMA.

3.1 Introducción.

3.2 Micoplasma neumoniae.

3.3 Micoplasma genitalis: Ureaplasma urealiticum y M. Hominis.

3.4 Acholeplasma.

3.5 Aislamiento y características bioquímicas.

4.- FORMAS L

1.- FAMILIA RICKETTSIACEAE

1.1.- Introducción.

Son microorganismos procariotas que precisan de células vivas para poder desarrollarse, es decir son microorganismos intracelulares que se encuentran adaptados a un parasitismo celular.

Morfológicamente son cocos o cocobacilos gram - que presentan una dotación enzimática muy escasa de ahí que necesiten microorganismos o células a las que parasitar.

Producen en el hombre enfermedades epidémicas o endémicas transmitidas por vectores (piojos, pulgas, ácaros, etc.).

Esta familia comprende 4 géneros importantes:

• Rickettsias.

• Coxiella

• Ehrlichia.

• Rochalimaea.

1.2.- Géneros y especies más importantes

Rickettsias.

Son cocobacilos gram - y cuyo diámetro es igual a 0,3-0,5m y 0,8-2m de longitud. Dentro de estas tenemos:

• Rickettsias prowazekii: produce el tifus epidémico, lo transmite el piojo, la vía de entrada en el hombre a través de la picadura que tras el rascado produce la penetración. El periodo de incubación es de 1-3 semanas, los síntomas que produce son: escalofríos, fiebres muy altas, dolores generalizados e inflamaciones que afectan sobretodo a capilares, arteriolas y vénulas, así como a piel y músculo. Pueden crear estados obstructivos que dificulten la corriente sanguínea debido a la formación de nódulos y en casos graves pueden provocar gangrena en extremidades. Lo más probable es que en la piel aparezcan manchas rosadas que luego se vuelven papulosas y petequiales. Esta enfermedad es transmitida de persona a persona produciendo gran epidemias en guerras. Puede ser grave (incluso muerte) en condiciones adversas.

Tratamiento: tetraciclinas y cloranfenicol, siendo muy importante y decisivo la lucha contra el piojo (vector) con insecticidas.

Puede presentarse recaídas al cabo de muchos años llamándose entonces enfermedad de Brill-Zinsser.

• Rickettsias conorii: produce la fiebre botonosa, se transmite a través de la garrapata. Es una enfermedad endémica en la cuenca mediterránea, en general es de curso benigno y da lugar a manchas negras en el lugar donde muerde la garrapata. Sus síntomas en primer lugar es macular y posteriormente papular y botonosa. La enfermedad se mantiene durante 8-20 días.

Tratamiento: tetraciclinas.

• Rickettsia Rickettsi: Produce la llamada fiebre de las montañas rocosas, transmitida por garrapatas, periodo de incubación 3- 6 días aparecen fiebres muy altas que presentan mialgias y manchas negras en la zona de picadura.

COXIELLA BURNETTI

Produce la llamada enfermedad de la fiebre Q. La vía de entrada principalmente por inhalación aunque puede haber otros.

Es un microorganismo bacilar de pequeño tamaño de 0,3 micrómetros de diámetro y o, 4-1 micrómetros de longitud. Afecta al ganado, presentando un tropismo especial por las placentas siendo excretado en el parto.

Las manifestaciones clínicas son síntomas generales del estado febril, mialgias y afectación pulmonar en la mitad de los casos, por lo que se considera agente de neumonía atípica, puede dar también afectación hepática.

El tratamiento es cloranfenicol y tetraciclinas.

1.3.- Aislamiento y características bioquímicas

En estados de fiebre las Rickettsias se mantienen abundantemente en sangre, así pues será la muestra de elección.

A partir de sangre heparinizada y centrifugada se usará el sedimento para obtener una muestra mas concentrada. Posteriormente realizaremos:

• Tincion directa: Ej.; Giemsa, apareciendo la Rickettsias de color púrpura. Tincion de Jiménez: que se ven de color rojo sobre fondo verde. Si hacemos un gram se verán negativo. También podemos realizar técnicas de inmunofluorescencia.

• Medio de Cultivo: se pueden inocular en cultivos celulares o embriones de pollo.

• Pruebas serológicas: principalmente reacciones Ag - Ac, las pruebas mas usadas son las seroaglutinación, inmunofluorescencia indirecta y la técnica de Weil - Félix que consiste en que a partir de diluciones de suero problema con esta bacteria ponerlas en contacto con una cantidad fija de Ag de Rickettsia.

2.- CLAMYDIAS

2.1.- Introducción

Son microorganismos procariotas que hasta hace poco se consideraban más bien virus que bacterias. Son procariotas intracelulares estrictos ya que no pueden sintetizar ATP.

Morfológicamente son cocos gram -, inmóviles y tienen 2 tipos de ácidos nucleicos: ADN y ARN, se multiplican por división binaria, dato que aleja a las Clamydias de los virus.

2.2.- Especies más importantes

(ver tabla 12.2)

Clamydia Tracomatis

Puede producir distintas enfermedades:

• Tracoma: que es una queratoconjuntivitis, causa más importante de ceguera en el mundo, principalmente en países subdesarrollados.

• Linfogranuloma venéreo: que es una E.T.S. para su detección se realiza inmunofluorescencia.

Clamydia Psitacci

Puede producir neumonía atípica, la transmisión suele esta mediada por contacto con aves, el diagnostico principalmente es por fijación del complemento.

Clamydia Pneumoniae

Es un patógeno de reciente descubrimiento que produce neumonía.

2.3.- Tratamiento

Sulfamidas.

2.4.- Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestra: secreciones oculares o genitales según el caso.

• Tinciones: Giensa, Jiménez, Gram.

• Técnicas citológicas: para observar células del epitelio conjuntivas y genital con el fin de verificar los gránulos ricos en glucogeno.

• Cultivos: embriones de pollo aunque ésta técnica no es muy frecuente por el riesgo de infección en el laboratorio.

• Pruebas serológicas: principalmente radioinmunoensayos y fijación del C´.

3.- MICOPLASMA

3.1.- INTRODUCCIÓN

Da los microorganismos más pequeños y se caracteriza porque carece de pared celular. Presenta división binaria.

El carecer de pared celular le confiere una serie de propiedades tales como:

• sensibilidad a la presión osmótica del medio en que se encuentra que puede facilitar su lisis

• pleomorfismo

• resistencia a antibióticos como cefalosporinas y penicilina

• no se tiñen con gram

Están ampliamente distribuidos en la naturaleza y pueden afectar al hombre, principalmente Micoplasma neumoniae.

Requiere medios enriquecidos y apartir de medios líquidos pueden visualizarse en microscopio óptico de campo oscuro o contraste de fase.

Las colonias son típicas por su forma de huevo frito.

Los principales géneros son:

• Micoplasma

• Ureplasma

• Acholeplasma

3.2.- MICOPLASMA NEUMONIAE

Principal agente causal de neumonías atípicas, con un periodo de incubación de aproximadamente 3 semana considerando que es un microorganismo de lento crecimiento.

Los síntomas son fiebres, mialgias, cefaleas y tos no productiva afectando principalmente a los escolares. En muchas ocasiones la infección es subclínica (no tiene síntomas claros) o de neumonía suave, pero este micoplasma puede permanecer varios meses en el tracto respiratorio tras la infección.

Existen otros micoplasmas que son flora normal como Micoplasma salivarium, Micoplasma orale y Micoplasma buccale.

La infección por Micoplasma neumoniae no presenta distribución estacionaria (no depende de las estaciones del año). La enfermedad requiere un contacto estrecho. Puede tener pronóstico benigno y aparecer manifestaciones extrapulmonares como por ejemplo erupciones cutáneas.

3.3.- MICOPLASMA GENITAL

Comprenden este grupo Ureplasma urealyticum y Micoplasma hominis. Forman parte de la flora normal de las mujeres el 60% de Ureaplasma y el 20% de Micoplasma hominis. Se consideran patógenos oportunistas produciendo enfermedades uretrales y vaginales como vaginitis, prostatitis, etc. Pueden producir fiebre en el postparto.

3.4.- Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestras: mucosa faringea, secreción uretral, exudados, esputo, sangre, etc, según la patología.

• Tinción: de Giemsa principalmente, también tinción en campo oscuro con nigrosina. No se hace gram porque carece de pared celular.

• Medio de cultivo: medios específicos a 37ºC y ambientes aerobios.

• Pruebas serológicas: inmunofluorescencia, RIA, fijación de complemento.

4.- FORMAS L

No hay que confundirlas con micoplasma aunque tienen en común carecer de pared celular. Son variantes de bacterias en los que ha ocurrido pérdida de pared celular, que se puede inducir mediante sustancias que inhiben la síntesis de la pared.

TEMA 20.- VIBRIOS, CAMPYLOBACTER Y GÉNEROS RELACIONADOS

1.- VIBRIOS

1.1.- Introducción

1.2.- Especies más importantes

1.3.- Poder patógeno

1.4.- Patología

1.5.- Tratamiento

1.6.- Aislamiento y características bioquímicas

2.- CAMPYLOBACTER

2.1- Introducción

2.2- Especies más importantes

2.3.- Aislamiento y características bioquímicas

2.4.- Patología

2.5.- Tratamiento

3.- HELICOBACTER PILORI

3.1.- Introducción

3.2.- Métodos de detección

• Directos

• Indirectos

• Prueba de la urea rápida

• Prueba de la urea respiratoria

• Pruebas serológicas

3.3.- Poder patógeno

3.4.- Patología y Tratamiento

4.- AEROMONAS

4.1.- Introducción

4.2.- Patología

4.3.- Tratamiento

4.4.- Aislamiento y características bioquímicas

5.- PLESIOMONAS

1.- VIBRIOS

1.1.- INTRODUCCIÓN

Son bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, de morfología curva, no esporulados y móviles gracias a su flagelación lofótrica.

Crece bien en medios generales y son oxidasa positivo, prueba que nos va a permitir diferenciarlos de las Enterobacterias.

Aguantan bien elevadas concentraciones de NaCl, por lo que se le denominan bacterias halofíticas y su crecimiento se facilita en medio alcalino.

Reducen nitratos a nitiritos.

Se hallan muy distribuidos en la naturaleza. Son bacterias acuáticas que habitan en ríos, lagos, etc.

De las 34 especies conocidas sólo 11 se han aislado en el hombre.

1.2.- ESPECIES MÁS IMPORTANTES (ver tabla 14.2)

• Vibrio parahaemolyticus: Vive en ambientes marinos y se transmite al hombre a través de alimentos como el pescado y el marisco. En el hombre produce cuadros gastrointestinales graves.

• Vibrio fluvialis: Produce cuadros gastrointestinales a través de alimentos como el pescado y el marisco.

• Vibrio alginolyticus: Se asocia a conjuntivitis y otitis.

• Vibrio vulnificus: Agente causal de infección de heridas traumáticas causadas en ambientes marinos.

• Vibrio cholerae: Es el más patógeno para el hombre. Es el agente etiológico del cólera. Provoca diarreas graves hasta llegar a la deshidratación, shock hipovolémico y si no hay tratamiento la muerte.

1.3.- PODER PATÓGENO (Vibrio cholerae)

Presenta 3 componentes antigénicos responsables de su virulencia:

• Ag somático O: Termoestable y de naturaleza polisacárida.

• Ag flagelar H: Termolábil.

• Exotoxinas: Son enterotoxinas de naturaleza proteica y sobre la que se desencadena el principal efecto patógeno del cólera.

Las cepas epidémicas de Vibrio cholerae, de las que existen más de 100, se pueden separar en función de sus serotipos siendo los más importantes el 01.

1.4.- Patología (Vibrio cholerae)

El Vibrio cholerae penetra en el organismo por vía oral a tavés de agua y alimentos contaminados, principalmente productos marinos crudos.

Debe se capaz de eludir el medio ácido del estómago, hecho que sucede cuando se ingiere más de 100 millones de gérmenes, circunstancia que se facilita en epidemias sobre todo si se tiene en cuenta que pueden encontrarse 106 gérmenes/ml de agua contaminada.

Además de estas condiciones, Vibrio cholerae deberá traspasar la barrera del estómago para producir diarrea que da lugar a una pérdida de agua y electrolitos que provoca una deshidratación que sin tratamiento puede causar shock hipovolémico y la muerte.

El mecanismo por el que produce la deshidratación es provocado por la enterotoxina que se encuentra en las microvellosidades intestinales. Dicha enterotoxina se divide en dos fracciones: la fracción a y la fracción b. La fracción b es la encargada de seleccionar los receptores específicos a los que se une, y una vez unida la enterotoxina, la fracción a actuará activando una enzima, la adenilciclasa, lo que supone que el ATP de las células que infecta se transforma en AMP. Como consecuencia de las elevadas concentraciones de AMP se producirá una inhibición de la absorción de Na por parte de las células intestinales y una liberación de agua, cloruros, bicarbonatos, K y que en los casos más graves puede perderse de 10-15 litros al día.

El periodo de incubación es de 1-4 días y los síntomas clínicos nauseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea, etc. Las heces contienen moco, células y gran cantidad de Vibrio. La muerte sobreviene en pocas horas si no se restablece l equilibrio electrolítico.

1.5.- TRATAMIENTO

El tratamiento es sintomático y encaminado a la reposición de líquidos. Vibrio cholerae es sensible a tetraciclinas y trimetroprimsulfametoxazol.

El uso de antibióticos ha dado lugar a la aparición de cepas resistentes.

Se trabaja en la elaboración de vacunas.

1.6.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Las muestras de heces que no se procesan inmediatamente se transportan en medio de Cary-Blair donde los Vibrios se mantienen viables hasta 4 semanas. Se debe evitar la exposición al aire ya que son muy sensibles a la desecación.

El vibrio se desarrolla bien en agar sangre y Mckonkey, pero el más selectivo es el medio TCBS (triptona, citrato, bilis y sacarosa) donde Vibrio cholerae crece dando colonias amarillas. También se puede utilizar como caldo de enriquecimiento a partir de heces agua peptonada al 1% de NaCl. El tiempo de incubación es de 16-22 horas a 35-37ºC.

2.- CAMPYLOBACTER

2.1.- INTRODUCCIÓN

Son bacilos gram negativos, cortos, con forma espiral, alas de gaviota o coma. Son microaerófilos, móviles, con un flagelo polar, no esporulados, no fermentan HC y dan posita la oxidasa y catalasa.

Habitan en el tracto gastrointestinal de un gran número de animales. En el hombre se asocia a infecciones gastrointestinales y cada vez más a infecciones extraintestinales como meningitis, endocarditis, artritis, etc, especialmente en pacientes con SIDA.

2.2.- ESPECIES MÁS IMPORTANTES ( ver tabla 14.1)

Las especies más importantes de Campylobacter son:

• Campylobacter jejuni

• Campylobacter coli

• Campylobacter hyointestinalis

2.3.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Hay dos tipos de muestras:

• Muestra de heces

Emplea medios selectivos que poseen antibióticos para reducir la flora acompañante (medio Skirrow, Campy o Buzler).

Uso de atmosfera reducida en oxígeno (ambiente de CO2) y temperatura de 42ºC.

Un medio alternativo para el aislamiento de Campylobacter en heces es filtrar las heces para eliminar los coliformes y otra flora acompañante. Los filtros son de acetato de celulosa y se colocan sobre una superficie de agar, se pone una gota de heces, se incuba toda la noche, se retira el filtro y se vuelve a incubar la placa.

• Muestra de sangre

En sangre se han aislado como agente etiológico se sepsis en pacientes inmunodeprimidos y con SIDA.

2.4.- PATOLOGÍA

Campylobacter jejuni se ha asociado a infecciones en el hombre asociadas con gastroenteritis con eliminación de sangre por las heces.

El microorganismo se adquiere por vía oral, por la ingestión de comidas o bebidas contaminadas, o por el contacto con aves.

Es sensible al pH gástrico por lo que se debe ingerir un inóculo muy elevado de microorganismo. Se multiplica en el intestino delgado e invade el epitelio, produce inflamaciones, en ocasiones pasa a sangre y origina fiebre. La diarrea que produce se acompaña de dolor intestinal, dolor de cabeza, fiebre, nauseas, etc.

2.5.- TRATAMIENTO

La infección es autolimitada resolviéndose en una semana sin necesidad de administrar antibiótico. Los casos más graves se tratan con eritromicina.

Existe una especie la Campylobacter hyointestinalis que causa infección intestinal y es común en individuos homosexuales.

3.- HELICOBACTER PILORI

3.1.- INTRODUCCIÓN

En 1982, se aislaron por primera vez en pacientes con lesiones gástricas y úlceras peptídicas unos bacilos gram negativos con forma de espiral y gran actividad ureasa.

3.2.- MÉTODOS DE DETECCIÓN

a.- Métodos directos

Helicobacter pilori se encuentra en los pliegues de la mucosa gástrica. Si el estudio no se va a hacer de inmediato es útil como medio de transporte solución glucosada al 20% o solución salina, manteniéndose viable en estos medios durante 5 horas a 4ºC.

Las muestras recibidas pueden usarse para realizar un gram. Las biopsias se cortan en trozos o se machacan en un mortero estéril con solución glucosada al 20% y se siembra en los siguientes medios:

• agar BHI (infusión cerebro corazón)

• agar Müeller-Hinton

• agar Brucella al 1% de almidón soluble,

• agar sangre o chocolate

Para el aislamiento de Helicobacter pilori es importante incluir medios selectivos con antibióticos.

La incubación es de carácter microaerófilo que se puede conseguir con las jarras de CO2 y la temperatura óptima es de 37ºC, no desarrollándose a 25,30 y 42 ºC.

La identificación de Helicobacter pilori se realiza por la tinción de gram y pruebas bioquímicas como catalasa, oxidasa y ureasas positivas, teniendo en cuenta que la temperatura de crecimiento es muy selectiva.

b.- Métodos indirectos

• Prueba de la urea rápida: Un trozo de biopsia se inocula en un medio con altas concentración de urea y un indicador de pH. Un viraje del indicador a un medio alcalino por hidrólisis de la urea es significativo de Helicobacter pilori.

• Prueba de la urea respiratoria: El paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado. Se emplea urea marcada con C13 o C14 que se detecta en un espectrofotómetro de masas.

• Pruebas serológicas: principalmente ELISA para detectar presencia de IgG e IgA en individuos con Helicobacter pilori.

3.3.- PODER PATÓGENO

Se señala al producción de ureasa capaz de crear un entorno alcalino que protege a los microorganismos de la acidez gástrica hasta que se localiza en las capas de la mucosa gástrica. También las proteasas modifican el pH gástrico de la mucosa y disminuyen la capacidad del ácido de difundir al mucus.

3.4.- PATOLOGÍA Y TRATAMIENTO

Helicobacter pilori es el agente etiológico de gastritis aguda y crónica. En relación a ulceras peptídicas se aísla en el 100% de los casos y el ulcera duodenal en el 77% . Parece ser que la presencia del microorganismo no es suficiente para desarrollar la ulcera aunque se cree que colabora.

Es importante tener en cuenta que hasta el 50% de la población adulta es portadora desconociéndose el mecanismo de transmisión.

Tratamiento: Es sensible a succionato de bismuto y sucsalicato de bismuto y muy resistente a antibióticos. El tratamiento es difícil y nunca se emplea monoterapia. Suelen administrarse varios fármacos juntos y aún no se erradica el microorganismo habiendo recaídas.

4.- AEROMONAS

4.1.- Introducción

Son bacilos gram - , anaerobios facultativos, oxidasa + y fermentan la glucosa con o sin producción de gas, la mayor parte son móviles y crecen a temperaturas de 4-40ºC. habitan en aguas dulces y saladas donde infectan a los animales, generalmente peces y anfibios.

En el hombre se asocian a infecciones intestinales en heridas e infecciones sistémicas.

4.2.- Patología

• Produce una diarrea aguda (diarrea del viajero) que suele ser autolimitada.

• Puede dar lugar a celulitis o infecciones de heridas por contacto de mucosas, por la tierra o aguas contaminadas.

• Septicemias en pacientes inmunodeprimidos.

• Otras (endocarditis, peritonitis, meningitis,etc.).

4.3.- Tratamiento

Tetraciclinas, aminoglucosidos y cefalosporinas.

4.4.- Aislamiento y características bioquímicas

• Toma de muestras: líquidos orgánicos (sangre o exudados).

• Medios de cultivo: agar sangre y agar Mc konkey y más selectivos: agar tripiticasa de soja al 5% y agar sangre con ampicilina.

5.- PLESIOMONAS

Comprenden una sola especie que es la sigeloide. Es un bacilos gram -, anaerobio facultativo, móvil o inmóvil, catalasa y oxidasa + que fermenta glucosa sin producir gas y reduce nitratos a nitritos.

La temperatura óptima es de 37ºC aunque crece bien entre 8-44ºC. se aisla bien en el intestino de peces de agua dulce y no sobrevive en agua del mar.

En el hombre se asocia a diarrea en zonas tropicales y subtropicales.

Crece bien en agar sangre y agar SS.

TEMA 21.- ESPIROQUETAS: TREPONEMAS, BORRELIAS Y LEPTOSPIRA

1.- INTRODUCCIÓN A LAS ESPIROQUETAS

2.- TREPONEMAS

2.1.- Introducción

2.2.- Especies más importantes: Treponema pallidum

• Patología

• Epidemiología

• Aislamiento y características bioquímicas

• Tratamiento

3.- BORRELIAS

3.1.- Introducción

3.2.- Especies más importantes

3.3.- Patología

• Fiebre recurrente

• Enfermedad de Lyme

3.4.- Tratamiento

3.5.- Aislamiento y características bioquímicas

4.- Leptospira

4.1.- Introducción

4.2.- Especies más importantes

4.3.- Patología

4.4.- Tratamiento

4.5.- Aislamiento y características bioquímicas

1.- INTRODUCCIÓN A LAS ESPIROQUETAS

Existe una serie de bacterias con morfología espiral y flexible denominadas espiroquetas. Presentan una movilidad característica no asociada a flagelos, sino a un filamento axial que se extiende longitudinalmente por debajo de la envoltura externa.

Presenta una pared muy fina y flexible de naturaleza liposacárida y lipoproteica donde se vana a encontrar la mayor parte de los Ag específicos.

Son gram negativas, pero presentan muchas dificultades para teñirse. Se tiñen con impregnación argéntica, tinción de Giemsa o microscopía de fases. Presentan metabolismo fermentativo u oxidativo siendo aerobios o aerobios facultativos.

Se encuentran muy difundidos en la naturaleza, en el agua, suelo y mucosas del hombre y animales.

Dentro de la familia Espiroquetaceae existen 5 géneros:

• Treponema

• Borrelia

• Leptospira

• Espiroqueta

• Cristipira

2.- TREPONEMA

2.1.- INTRODUCCIÓN

Comprende especies patógenas que afectan al hombre y otras que forman flora normal del tracto intestinal, boca y tracto genital.

Son espiroquetas muy helicoidales, finas, pequeñas y móviles. Son anaerobias facultativas y presentan un metabolismo fermentativo.

Se tiñen difícilmente con gram utilizándose giemsa e impregnación argéntica.

No crece en cultivos “in vitro” y requiren un medio “in vivo”.

2.2.- ESPECIES MÁS IMPORTANTES

La especie más importante es Treponema pallidum, que produce la sífilis. Afecta principalmente a adultos. Es de distribución mundial. Es una ETS, siendo una infección congénita. Produce lesiones destructivas e infecta a todos los tejidos.

• PATOLOGÍA

Es el agente causante de la sífilis. Es un microorganismo que no es capaz de resistir fuera del organismo humano.

La sífilis comienza con un primer contacto (sexual, ETS), con lesiones primarias ricas en treponemas presentes en la mucosa. Después de un periodo de incubación de 10-90 días, con termino medio de 20 días, aparece en la zona genital un chancro primario, es lo que se denomina Periodo primario de Sífilis, con abundantes treponemas que poco después se diseminan por vía sanguínea y linfática a otras localizaciones convirtiéndose en una enfermedad sistémica.

Es frecuente su multiplicación en los ganglios linfáticos próximos a la zona genital originando pequeños tumores. Transcurrido un tiempo corto (2-6 semanas) estos signos desaparecen espontáneamente y entran en fase de latencia. Transcurrido un tiempo (2 meses-2 años) surge la Sífilis secundaria o florida. De forma súbita hay una espiroquetemia en genral muy abundante y que da lugar a manchas en la piel y mucosas muy ricas en treponemas y altamente infecciosas. También se pueden producir lesiones en otros órganos, fiebre, y en ocasiones pústulas o pápulas ricas en treponemas. Si esto se produjese nos encontraríamos con una forma eruptiva, pero la mayor parte de los casos no aparece debido a la fuerte respuesta inmunitaria.

Este cuadro clínico de carácter sistémico remite a las pocas semanas (2-6 semanas) volviendo a entrar en fase de latencia. Transcurrida la fase de latencia (3-30 años), surge la Sífilis terciaria, forma muy grave y mal pronóstico si los pacientes no han sido tratados. El número de treponemas en sangre es muy escaso y abundante en ganglios, hueso, bazo, sistema cardiovascular, SNC, etc. Cuando afecta al SNC se denomina Neurosífilis, formándose también unas lesiones granulomatosas denominadas grummas.

Recientemente de distingue entre:

• Sífilis precoz: menos de 1 año de evolución

• Sífilis tardía: mas de 1 año de evolución

• EPIDEMIOLOGÍA

La transmisión más frecuente es la sexual, pudiendo aparecer lesiones en labios, boca, tronco, etc.

Otra modalidad de transmisión es la transplacentaria, llamada Sífilis congénita, que para evitarla se hace un estudio serológico durante la gestación. También se realiza este estudio a donantes de sangre para evitar contagio por vía transfusional.

En la actualidad han disminuido los contagios por una buena metodología del diagnostico y tratamiento eficaz aunque se está lejos de la erradicaión.

También se le denomina Lues venerium.

• AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

• Toma de muestras: Se realiza exprimiendo el chancro primario o condiloma (mancha que aparece en la piel en la sífilis secundaria)

• Medios de cultivo: No crece en medios “in vitro”, solo en medios “in vivo” como testículos de conejo.

• Tinciones: de Giemsa e Impregnación argéntica.

• Diagnóstico: Puede ser directo o indirecto:

• Directo: Buscamos microorganismos en tinciones.

• Indirecto: Pruebas serológicas donde se busca en el suero del paciente Ac frente Treponema pallidum por medio de distintas pruebas:

• Pruebas reagínicas o no treponémicas: Son baratas, rápidas y ofrecen buena indicación de la actividad de la enfermedad, pero son inespecíficas, ya que dan falsos positivos. También se denominan pruebas cardiolipínicas, ya que el Ag utilizado no el es Ag de treponema sino la cardiolipina, que es un lípido extraído de tejidos de mamíferos (generalmente corazón de buey). Esta prueba es positiva entre las 2-3 semanas de infección no tratada. Existen 2 pruebas:

• Prueba de la floculación o VRDL o RPR: La cardiolipina que actúa de Ag se combina con la reagina (Ac tipo Ig E) que el huésped produce para dar aglutinación visible.

• Prueba de Wassermann o Fijación de complemento: Las reaginas del suero fijan el complemento en presencia de cardiolipinas .

Estas pruebas no treponémicas tienen gran sensibilidad.

• Pruebas treponémicas: Se utilizan para confirmar. Los Ag utilizados son treponémicos y se utilizan: test de fluorescencia, denominada prueba FTA, y de aglutinación (TPHA), que tiene la ventaja de que es sencilla y no necesita microscopio de fluorescencia. También se utiliza ELISA.

• TRATAMIENTO

Penicilina, siendo alternativas eritromicina, cefalosporinas y tetraciclinas.

3.- BORRELIA

3.1 Introducción

Es una espiroqueta de mayor tamaño, con espirales más amplias e irregulares, son móviles y existen especies patógenas para el hombre y animales, originándose fiebres recurrentes y endémicas. Es anaerobio con metabolismo fermentativo y se tiñen con facilidad, son gram - , se cultivan in vitro con medios complejos y enriquecidos.

3.2 Especies más importantes

Todas las bacterias son transmitidas por artrópodos:

• Piojo: dando lugar a Borrellia recurrentis, que provoca fiebres recurrentes a nivel mundial.

• Garrapata: produciendo Borrellia hispanica que produce fiebres recurrentes endémicas en España. También por garrapatas se transmite la Borrellia turicatae y Borrellia hermsii que producen fiebres recurrentes en Estados Unidos. Borrellia burgoloferi produce la enfermedad de Lyme, etc.

3.3 Patología

1.- Fiebres recurrentes:

Se manifiesta como una enfermedad septicémica febril con periodo de incubación de 3-15 días, la fiebre persiste y continua con periodos afebriles de varios días o semanas pudiéndose repetir las recidivas hasta 10 veces en pacientes no tratados. Esto ocurre por las variaciones antigénicas que se van produciendo en el microorganismo.

A causado grandes epidemias en la 2ª guerra mundial con un millón de casos declarados, calculándose en más de 9 millones las infecciones reales. Actualmente es anormal en nuestro país.

2.- Enfermedad de Lyme.

Es una enfermedad cuyo agente etiológico se conoce desde 1981, que produce una reacción inflamatoria que en su inicio aparece como un eritema crónico migratorio (ECM), acompañado de mialgias, fiebre y adenopatías semanas o meses más tarde produce complicaciones como meningoencefalitis, artritis, miocarditis, etc.

Se da en España, pero las dificultades de su diagnóstico hace que se detecten menos casos de los que se podrían esperar.

3.4 Tratamiento

Penicilinas y tetraciclinas.

3.5 aislamiento y Características bioquímicas

Se toma la muestra de sangre en estados febriles y se realiza tinción de gram y giemsa, también se realiza inoculación en animales de experimentación por ejemplo ratas y en ocasiones también se realizan técnicas serológicas.

4. LEPTOSPIRA

4.1. Introducción

Formada por espiroquetas finas con espiras regulares muy numerosas y apretadas con sus extremos ligeramente incursados. Son móviles. Se tiñen débilmente con gram siendo gram - también con Giensa e impregnación argéntica.

Se pueden cultivar in vitro en medios ricos en albúmina y con ácidos grasos. Su metabolismo es oxidativo y necesitan condiciones aerobias.

Existen en la naturaleza Leptospiras saprófitas y parásitas. En el hombre pueden originar lectosporiasis que originan cuadros febriles. El reservorio son animales y de hecho las lectosporiasis se consideran zoonosis.

4.2. Especies más importantes

• Lectospira biflexia: no es patógena para el hombre y es abundante en agua.

• Lestospira interrogans: que da lugar a cepas parasitarias.

4.3. Patología

Presentan cuadros clínicos variados de leves a muy graves y en ocasiones mortales. Tras incubación de 5 días a 3 semanas surge una 1ª fase febril, donde la Leptospira se disemina por el aparato circulatorio originando leptospiremia. Le sigue una 2ª fase de lectospiuria y en algunos casos también aparece en heces. Cuando la gravedad es extrema aparece ictericia, hapetomegalia, hematuria, nefritis, es decir principal afectación renal y hepática.

4.4. Tratamiento

Tetraciclinas, penicilinas

4.5. Aislamiento y características bioquímicas

Toma de muestra sanguínea en periodos febriles. Si la toma es de orina se realizara a los 10 - 15 días de la enfermedad y recién cogida se intentara visualizar la Leptospira por examen directo así como aislarla en medios específicos como Jonhson - Harrys. Esto se realiza inmediatamente ya que la Leptospira se destruye con facilidad. Si la muestra es suero se recurre a muestras inmunológicas para demostrar la presencia de Acs frente a Leptospira como pruebas de fijación de complemento, ELISA, ect.

TEMA 22.- BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES DE GLUCOSA. PSEUDOMONAS.

1.- INTRODUCCIÓN

2.- PSEUDOMONAS

2.1 Características

2.2 Clasificación

• Primer grupo (pigmentos fluorescentes) : P. Aeruginosa, P. Putria y P. Fluorescens.

• Segundo grupo (producen el muermo) : P. Mallei y P. Pseudomallei.

• Tercer grupo (excepcionalmente patógenas) : P. Cepacea, P. Diminuta, P. Maltopila y P. Acidovorans.

2.3 Poder patógeno.

• Antigenos: Ag. somático O, Ag. flagelñar H y Ag. mucoide M.

• Toxinas: enterotoxina y eritrodermica.

• Piocianina.

2.4 Patología.

1º A nivel respiratorio:

• sinusitis, neumonía, faringitis, etc.

2º A nivel del aparato circulatorio:

• endocarditis en drogadictos y personas con SIDA.

3º A nivel del aparato digestivo:

• enterocolitis, principalmente pacientes con SIDA.

4º A nivel del sistema nervioso:

• meningitis en neonatos e inmunodeprimidos.

5º A nivel del aparato urinario:

• pielonefritis.

6º A nivel de la piel:

• infecciones graves por quemaduras.

7º A nivel del sistema osteoarticular:

• artritis.

8º A nivel de ojos y oídos:

• ceguera y sordera.

En casos graves bacteriemia y muerte.

2.5 Aislamiento y características bioquímicas.

3.- OTROS MICROORGANISMOS NO FERMENTADORES DE GLUCOSA.

1.- INTRODUCCIÓN

Son microorganismos que aparecen como saprofitos o como comensales de hombres y animales. En ocasiones se asocian a infecciones afectando sobretodo a inmunodeprimidos. Todos son incapaces de fermentar la glucosa. El principal patógeno es Pseudomona aeruginosa, considerado como el segundo agente patógeno nosocomial después de E.coli.

2.- PSEUDOMONAS

2.1 Características

Son bacilos gram -, aerobios estrictos, oxidasa + y móviles, con flagelación polar a excepción de P. Mallei que es inmóvil. No fermentan los hidratos de carbono, pero pueden usar los azúcares oxidándolos. Es catalasa + y salvo alguna excepción no forman cápsula, no son esporulados.

De 27 especies sólo 8 tienen importancia clínica por el posible efecto patógeno que podrían desencadenar.

2.2 Clasificación

• Primer grupo: se caracteriza por dar pigmentos fluorescentes. Se pueden encontrar de forma saprofita en piel y tubo digestivo, aunque puede crecer en órganos debilitados (quemados, graves infecciones) provocando cuadros graves y mortales (septicemias).

• Segundo grupo: generalmente se asocian a zoonosis, aunque se podrían aislar en el hombre. P. Mallei es el agente causal del muermo (zoonosis transmitida generalmente por equinos que produce alteraciones cutáneas, cuyo agente causal es P. mallei).

2.3 Poder patógeno (Pseudomonas aeruginosa).

Presentan 3 antígenos:

• Antígeno somático O.

• Antígeno flagelar H.

• Antígeno mucoide M.

Presenta también toxinas:

• Enterotoxina, que provoca nauseas, vómitos, dolor abdominal, etc.

• Eritrodermica.

• Y en ocasiones también toxinas con mecanismo de acción parecido a la toxina diftérica que disminuye el consumo de oxigeno.

También es capaz de formar ciertas sustancias, como la piocianina que es un pigmento azulado de acción bactericida o la fluoresceína de color verde amarillo o incluso pigmentos melénicos de color marrón.

2.4 Patología

Dependerá de que los cuadros sean graves o muy graves, del carácter oportunista, es decir, de las características del huésped.

1.- A nivel respiratorio:

• sinusitis

• neumonía

• faringitis, etc.

2.- A nivel del aparato circulatorio:

• endocarditis en drogadictos y personas con SIDA.

3.- A nivel del aparato digestivo:

• enterocolitis, principalmente pacientes con SIDA.

4.- A nivel del sistema nervioso:

• meningitis en neonatos e inmunodeprimidos.

5.- A nivel del aparato urinario:

• pielonefritis.

6.- A nivel de la piel:

• infecciones graves por quemaduras.

7.- A nivel del sistema osteoarticular:

• artritis.

8.- A nivel de ojos y oídos:

• ceguera y sordera.

En casos graves bacteriemia y muerte.

2.5 Aislamiento y características bioquímicas

Se realizará un frotis y tinción de gram (si la pus es azulada se sospechará de la existencia de P. aeruginosa). También tinción de flagelos o tinción con anticuerpos fluorescentes para poder visualizar piocianina o pioverdina. Se cultiva a 37ºC.

Es importante el estudio de los pigmentos pudiendo distinguir 4:

• Piocianina: color azulado que puede adquirir el medio y es característico de P. Aeruginosa es el único que la posee).

• Pioverdina: color verde.

• Eritorgeno: color rojo.

• Melenico: color marrón.

Se pueden presentar distintas colonias:

• R: rugosas.

• S: lisas.

• M: mucoide.

• Medio de cultivo: Agar cetrimida. En otros medios como Mckonkey, agar sangre, podemos ver  hemólisis con olor característico a fruta, debido a la producción de aminoacetofenona, lo que ayuda a su identificación.

• Toma de muestras: generalmente se realiza de cualquier producto patológico de carácter purulento.

Características que ayudan a la identificación de Pseudomonas aeruginosa

1º En agar sangre aparición de colonias azuladas y olor afrutado.

2º Catalasa, oxidasa y reducción de nitratos + .

3º Crecimiento a 42ºC.

4º Oxidación de glucosa y hidrólisis de arginina.

5º Tolerancia a la cetrimida.

TRATAMIENTO

Es resistente a la mayor parte de los antibióticos, excepto aminoglucosidos, carbencilinas y colistina.

3.- OTROS BACILOS GRAM - NO FERMENTADORES DE GLUCOSA.

(Ver pregunta 5 de fotocopia)

TEMA 23.- ENTEROBACTERIAS I

1. INTRODUCCIÓN.

2. CARACTERÍSTICAS MÁS IMPORTANTES.

3. ESTRUCTURA ANTIGÉNICA.

3.1 Antígenos: O, H y K (capsular).

3.2 Toxinas: exotoxinas, endotoxinas, hemolisinas y colimicinas.

4. GÉNEROS.

4.1 Fermentadores rápidos de lactosa.

4.2 Fermentadores lentos de lactosa.

4.3 No fermentadores de lactosa

5. PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

6. AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.

6.1 Medios de cultivo:

• Diferenciales poco selectivos: McKonkey y EMB.

• Diferenciales selectivos: SS, XLD y Hektoen.

• Complejos diferenciales: KIA y TSI.

6.2 Caldos de enriquecimiento:

• Selenito.

• Tetrationato.

6.3 Prueba de la DNAasa.

1.INTRODUCCIÓN.

Son bacilos gram -, aerobios y/o anaerobios facultativos, móviles (con flagelación) o inmóviles que en la última edición del manual de Bergey's se clasifican en la familia Vibrionaceae.

Se caracterizan por ser fermentadores de glucosa, suelen ser huéspedes habituales del tracto gastrointestinal de hombres y animales, produciéndose en muchas ocasiones efectos patógenos, en otros casos puede actuar como saprofito de la flora intestinal.

Se pueden encontrar en agua y suelo y se pueden comportar como oportunistas.

2. CARACTERÍSTICAS MÁS IMPORTANTES.

• Son cocobacilos gram -.

• Aerobios y/o anaerobios facultativos.

• Móviles o inmóviles.

• Oxidasa -.

• Catalasa +.

• Fermentadores de glucosa.

• Reducen nitratos a nitritos.

• Son muy importantes las pruebas del INVIC, KIA y TSI.

• Pueden producir gran cantidad de fermentos como gelatinazas, descarboxilasas, ureasas y galactosidasas.

• Algunos pueden producir sulfhídrico.

• Presentan gran similitud biológica con los vibrios, por eso se estudian conjuntamente aunque los vibrios son oxidasa +.

3.- ESTRUCTURA ANTIGÉNICA

3.1.- ANTÍGENOS

• Antígeno somático O: Termosestable, ligado a la pared bacteriana siendo una endotoxina que presenta una parte proteica responsable del poder antigénico, y una parte lipídica responsable, en parte de la toxicidad.

• Antígeno capsulado K: De naturaleza polisacárida con propiedades antiparasitarias.

• Antígeno flagelar H: De carácter proteico y responsable de la acción patógena de las bacterias.

3.2.- TOXINAS

• Exotoxina: son enterotoxinas.

• Endotoxinas: responsables del shock tóxico.

• Hemolisinas: las producen algunas cepas.

• Colimicinas: susutancias son efecto antibiótico (son tóxicas para las cepas de la misma o distinta especie de las cepas que las producen).

4.- GÉNEROS DE ENTEROBACTERIAS

Las enterobacterias siempre han sido clasificadas en función de su capacidad de fermentar la lactosa. Hay tres grupos:

• Fermentadores rápidos de lactosa: en él se encuentran Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter.

• Fermentadores lentos de lactosa: se encuentran Citrobacter,Serratia, Yersinia y Shigella sonnei. Estos dos grupos de les denomina coliformes por su capacidad de fermentar la lactosa.

• No fermentadores de lactosa: son no coliformes, se encuentran Salmonella, Shigella y Proteus.

5.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS

(Ver tabla 13.2)

6.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

6.1.- MEDIOS DE CULTIVO

Los medios más utilizados son:

1.- Medios diferenciales poco selectivos: Permiten ver las diferencias entre fermentadores y no fermentadores de lactosa. Se utilizan:

• Mackonkey (MK): donde los fermentadores aparecen formando colonias rosas y los no fermentadores colonias incoloras

• EMB (Medio eosina azul de metileno o Levine)

2.- Medios diferenciales más selectivos: Son:

• Agar SS

• Medio XLD

• Medios Ektoen

3.- Complejos diferenciales: Son:

• KIA (agar triple Fe): contiene lactosa y glucosa

• TSI (triple azucar Fe): contiene lactosa, glucosa y sacarosa

Tanto TSI como KIA son medios sólidos en tubo que constan de 2 partes:

a.- Parte superior acabada en pico de flauta que permite ver el crecimiento aerobio

b.- Parte inferior que permite ver el crecimiento anaerobio.

La siembra se hace a partir de una colonia bien aislada, tanto en la inclinación como en el fondo.

Las reacciones que pueden tener lugar y sus interpretaciones son:

Parte aeróbica	Fondo
Alcalino	Ácido	Inclinación roja y fondo amarillo, solo hay fermentación de la glucosa.
Parte aeróbica	Fondo
Ácido	Ácido	Amarillo / Amarillo, fermentación de glucosa y lactosa.
Alcalino	Alcalino	Rojo / Rojo, no hay fermentación.
Alcalino	Sin cambio	Indica inclinación roja / fondo naranja, no hay fermentación de azucares, únicamente utiliza las peptonas.

Los medios KIA y TSI permiten observar si hay producción de gas en cuyo caso aparecerá burbujas de aire o elevación del medio y en ocasiones desquebrajamiento del medio.

A las bacterias productoras de gas se les denomina aerogénicas y las no productoras anaerogénicas.

La producción de sulfhídrico se pone de manifiesto con la aparición de coloración negra, debido a las sales ferrosas como consecuencia de la reacción del sulfhídrico con Fe 3+.

Por tanto KIA y TSI ponen de manifiesto tres características:

• Capacidad para fermentar la lactosa (KIA) o lactosa y sacarosa (TSI).

• Producción de gas por fermentación de azucares.

• Producción de sulfhídrico.

6.2.- Caldos de enriquecimiento

Para que las bacterias se multipliquen y crezcan podemos utilizar caldos de enriquecimiento, ej.:

• caldo selenito ! Salmonella

• caldo tetrationato ! Salmonella y Shigella.

Estos caldos son muy utilizados en las pruebas de heces, se toma con una torunda la muestra y se disuelve en dicho caldo 24 - 48 h.

6.3.- Prueba de la ADNasa

Se realiza sobre un agar que contiene verde de metilo como indicador y ADN como sustrato. Los organismos que producen ADNasa se identifican por la producción de una zona clara alrededor de la colonia.

TEMA 24.- ENTEROBACTERIAS II

1.- SALMONELLA

1.1.- Introducción

1.2.- Epidemiología

1.3.- Acción patógena e interés clínico

• Fiebres tifoideas

• Fiebres paratifoideas

• Infección gastrointestinal

1.4.- Tratamiento

1.5.- Aislamiento y Características bioquímicas

2.- SHIGELLA

2.1.- Introducción

2.2.- Acción patogénica e interés clínico

• Ag O y K

• Exotoxinas (neurotoxina, citotoxina y enteroinvasiva)

2.3.- Tratamiento

3.- ESCHERICHIA COLI

3.1.- Introducción

3.2.- Clasificación según cuadro clínico

• Enteropatógenas

• Enterotoxígena

• Enterohemorrágica

• Enteroinvasiva

3.3.- Profilaxis y tratamiento

3.4.- Aislamiento y Características bioquímicas

4.- YERSINIA

4.1.- Introducción

4.2.- Especies más importantes

• Yersinai pestis (bubónica, pulmonar y septicémica)

• Yersinia pseudotuberculosis

• Yersinia enterocolítica

4.3.- Aislamiento y Características bioquímicas

5.- OTRAS ENTEROBACTERIAS (OPORTUNISTAS)

1.- SALMONELLA

1.1.- INTRODUCCIÓN

El género Salmonella es el responsable de un gran número de gastroenteritis por los alimentos.

Es móvil, con flagelación perítrica, no coliforme, no esporulado y casi nunca capsulado. Tiene un carácter más o menos patógeno según las especies.

1.2.- EPIDEMIOLOGÍA

Las fuentes más frecuentes de infección son las aves (pollos, patos, etc.) y sus productos (huevos).

Los brotes suelen aparecer por ingestión de alimentos que contienen huevos crudos o carnes poco hechas, dado que la Salmonella es sensible al ácido gástrico se tienen que ingerir un gran número de microorganismos (106-109 o/ml. o gr.) para que aparezcan los síntomas, multiplicándose en el intestino delgado.

1.3.- ACCIÓN PATOGÉNICA E INTERÉS CLÍNICO

Su acción patogénica va a ser dependiente de los antígenos estructurales y toxinas. Poseen 3 antígenos:

• Antígeno somático O.

• Antígeno flagelar H.

• Antígeno capsular K.

También posee una endotoxina y una enterotoxina responsable del efecto irritante y en ocasiones citotóxico sobre el tracto intestinal.

Las especies del género Salmonella pueden actuar sobre el hombre y animales, los más importantes son: S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis y S. enteritidis.

Los principales cuadros clínicos son:

a.- Fiebres tifoideas(S. Typhy) y Fiebres paratifoideas(S. paratyphi)

La Salmonella tras ser ingerida llega al intestino delgado y penetra por endocitosis destruyendo parte de la mucosa intestinal. Una vez dentro la Salmonella son fagocitadas por macrófagos originando una primera bacteriemia que tiene una duración de 8-15 días, a partir de aquí hay un comienzo brusco de signos y síntomas de la enfermedad.

La Salmonella en sangre es de nuevo captada por los mononucleares y de aquí pasa al bazo, hígado, etc. produciendo la multiplicación de nuevas Salmonellas, volviendo de nuevo al intestino donde provocan unas placas ulceradas con necrosación denominadas placas de peyer y en casos más graves pueden originar perforación y hemorragias.

Las fiebres pueden alcanzar 40ºC y durar varias semanas. Van acompañadas de dolores de cabeza, anorexia, debilidad, dolor muscular, etc.

El germen se elimina a través de las heces (Salmonella en heces es patógeno)

b.- Infecciones gastrointestinales

Es la infección más frecuente en caso de Salmonella. El periodo de incubación es de 8-48 horas de haber ingerido el alimento contaminado. Aparecen nauseas, vómitos, etc.

El síndrome requiere tratamiento de aproximadamente 6 días. Puede ser que no existan bacterias en sangre , sin embargo sí aparecen en heces.

Las personas más propensas a padecer la infección son niños, ancianos e inmunodeprimidos.

Tras una infección de fiebres tifoideas un 1-3% se vuelven portadores crónicos eliminándolo en las heces durante largos periodos de tiempo.

Desde el punto de vista epidemiológico tiene gran importancia dado que de este modo se contribuye a la diseminación del patógeno.

En las salmonelosis no tifoideas menos del 1% de los pacientes van a seguir excretando el bacilo por heces.

1.4.- TRATAMIENTO

Ampicilina, cloranfenicol, trimetropim, sulfametoxazol y cefalosporinas.

1.5.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Toma de muestras

Se realiza en alimentos contaminados, sangre y heces.

En caso de enfermedades gastrointestinales son importantes los coprocultivos y alimentos sospechosos.

En casos de fiebres tifoideas y paratifoideas las muestras se obtienen de sangre, orina y heces.

2.- SHIGELLA

2.1.- INTRODUCCIÓN

Bacilo gram -, no esporulado, no flagelado, no produce desaminasas, ni gas, ni H2S.

2.2.- ACCIÓN PATOGÉNICA

Se debe a los factores antigénicos 0 y K y a la producción de toxinas, principalmente exotoxinas que presentan propiedades citotóxicas, neurotoxicas y enteroinvasivas.

La toxina esta compuesta por 2 subunidades:

• subunidad b, que actúa adheriendose a las células del epitelio gastrointestinal (efecto enteroinvasivo).

• subunidad a, cuyo mecanismo consiste en el bloqueo de la síntesis proteica (efecto citotóxico que origina un estado de necrosis celular con la consiguiente formación de ulceras, hemorragias y perforaciones, siendo un cuadro clínico muy grave.

Cualquier especie de Shigella al llegar al intestino comienza a ejercer la acción toxica para pasar después al colón complicando el proceso, lo que origina neurosis y en general los signos y síntomas anteriormente descritos.

Los cuadros diarreicos van acompañados de dolor cólico, nauseas, vómitos, fiebre y deposiciones cada vez más sanguinolentas (disentería bacilar), con moco y pus, los más afectados son los niños.

2.3.- TRATAMIENTO

El mismo que para Salmonellas y también fluoroquinolonas.

3.- ESCHERICHIA COLI

3.1.- INTRODUCCIÓN Y CLASIFICACIÓN SEGÚN EL CUADRO CLÍNICO

Bacilo gram negativo, no esporulado, móvil con flagelos períticos, raramente capsulado y su capacidad antigénica se debe a los Ag O y K confiriéndole propiedades antifagocitarias y de resistencia frente a sustancias bactericidas, proporcionándole con ello alto poder invasivo.

También presenta distintos tipos de toxinas, así los cuadros clínicos de las cepas patogénicas para el hombre son más o menos variables según el tipo de toxina que la origina:

• Escherichia coli enteropatógena: forma una enterotoxina citotóxica con cuadros diarreicos en brotes epidémicos que afecta principalmente a niños y lactantes.

• Escherichia coli enterotoxígena: forma una enterotoxina semejante a la del Vibrio cholerae, provocando procesos diarreicos que afecta a niños y adultos. Produce la diarrea del viajero.

• Escherichia coli enterohemorrágica: es similar a Shigella disenteriae que produce procesos diarreicos graves de tipo hemorrágico (sangre).

• Escherichia coli enteroinvasiva: se presenta principalmente en niños y adultos produciendo cuadros diarreicos graves con fiebre, dolor abdominal, diarreas con gran contenido de moco junto con leucocitos y PMN.

En Escherichia coli no se recomienda dar profilaxis antibiótica para diarrea del viajero con el fin de evitar cepas resistentes, sí es conveniente tomar precauciones como tomar agua embotellada, no consumir hortalizas crudas, etc. En caso de padecer esta infección se procederá a la restauración del equilibrio electrolítico.

3.2.- TRATAMIENTO

El tratamiento en lactantes es neomicina y en adultos fluorquinolonas.

3.3.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Escherichia coli es saprofito del tubo digestivo y en general su presencia en agua y alimento es indicativo de contaminación fecal reciente.

A parte de trastornos gastrointestinales puede originar otras lesiones urinarias, biliares, infección de heridas y lesión en meninges principalmente en neonatos.

Es uno de los principales microorganismos productores de infecciones nosocomiales.

En cuanto a las pruebas bioquímicas, destacar:

• las de la tabla 13.2

• las pruebas del IMVIC

• Kliger

4.- YERSINIA

4.1.- INTRODUCCIÓN

Bacilo o cocobacilo gram negativo con flagelación peritrica, moviles a 25 ºC e inmoviles a 37ºC. No fermentan la lactosa, no forman esporas y excepcionalmente pueden presentar capsula.

4.2.- ESPECIES MÁS IMPORTANTES

Son: Yersinia pestis

Yersinia pseudotuberculosis

Yersinia enterocolitica

1.- YERSINIA ENTEROCOLITICA

Afecta principalmente a animales aunque también al hombre y principalmente a niños.

Es un patógenos capaz de crecer a temperaturas de refrigeración (4ºC), por lo que es un microorganismo a tener en cuenta en industria alimentaria.

Se requiere un inóculo de 109 o /gr para adquirir la infección. Tras un periodo de incubación de 4-7 días aparecen síntomas clínicos como: dolor abdominal, fiebre y en ocasiones diarrea. En los casos en los que no hay diarrea se confunde la yersioniosis con apendicitis aguda.

Afecta a niños de 5-15 años y principalmente en Europa.

Es sensible a aminoglucosidos, cloranfenicol y trimetroprim-sulfametoxazol. No se recomienda la utilización de Ab en caso de que los síntomas solo sean gastrointestinales, ya que la infección suele ser autolimitada.

2.- YERSINIA PESTIS

Es el agente causal de la peste en el hombre. Se origina de forma epidémica, da lugar a cuadros agudos y febriles con alta inflamación de ganglios linfáticos, hemorragias internas, petequias y cuadros septicémicos y de neumonía.

Es grave y muy contagiosa aunque para ello es necesario la presencia de ratas y roedores, encargados de su diseminación. Se origina en lugares de salubridad baja.

Los factores de virulencia que determinan la gravedad de Yersinia pestis son:

• Toxina murina: de carácter proteico; bloquea la utilización de oxígeno por parte de ciertas células y en general sólo se liberan al medio cuando muere la bacteria.

• Endotoxinas: liberadas por la bacteria en el transcurso de la enfermedad; están relacionadas con el proceso febril.

• Antígeno V: le confiere propiedades antofagocitarias.

• Coagulasas y fibrinolisinas.

A Yersinia pestis también se le denomina Yersinia bubónica; Llega al hombre a través de pulgas infectadas por ratas con peste. Tras la picadura de la pulga atraviesa los vasos linfáticos y de aquí a los ganglios donde se multiplica formando bubones (inflamación de los ganglios). De aquí pasa a sangre y posteriormente se disemina por bazo, hígado, pulmones, piel y mucosas donde aparecen lesiones con carácter piógeno, hemorrágico, necrótico y edematoso.

En casos graves puede aparecer coagulación intravascular por acción de las coagulasas y hemorragias por acción de las fibrinolisinas, colapso circulatorio, toxemia generalizada y muerte.

Existen varias formas clínicas dependiendo de su localización. Las más importantes son:

• Peste bubónica: Es la más frecuente y tras un periodo de incubación de 3-7 días aparecen los primeros síntomas con escalofríos, vómitos, bubones en ingles, axilas y zona submaxilar. Si no hay tratamiento se produce la muerte.

• Peste pulmonar: Es una complicación de la peste bubónica, produciéndose una afectación pulmonar grave con insuficiencia respiratoria, siendo altamente mortal.

• Peste septicémica: Corresponde a los últimos estadíos de la peste en cualquiera de sus formas, pulmonar o bubónica. Es generalmente mortal.

4.3.- AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

La toma de muestra es a través de exudados purulentos, bubón, sangre, LCR, tejido pulmonar, esputo, etc.

5.- OTRAS ENTEROBACTERIAS OPORTUNISTAS

• Klebsiella, Enterobacter y Serratia producen enfermedades nosocomiales.

• Klebsiella neumoniae es el agente etiológico del 3% de las neumonías de origen bacteriano. Afecta principalmente a individuos con diabetes mellitus y alcohólicos con infección pulmonar crónica.

• Enterobacter se asocia a infecciones de heridas, quemaduras, e infecciones del tracto urinario y respiratorio.

• Serratia coloniza el tracto respiratorio y urinario de pacientes hospitalizados.

• Citrobacter se asocia a infecciones respiratorias y urinarias y, en ocasiones, en neonatos se ha aislado en meningitis.

• Proteus, Morganella y Providencia se han relacionado con enfermedades del tracto urinario; tienen la capacidad de hidrolizar urea con liberación de amoniaco produciendo la alcalinización de la orina que induce a la formación de cálculos renales. La movilidad de Proteus favorece la invasividad del tracto urinario. El género Providencia se ha asociado a bacteriemias en pacientes con catéteres venosos.

TEMA 25.- LEGIONELLA, GARDNERELLA,SPIRILIUM HIMUS,STREPTOBACILLUS MOVILIFORMES Y CALYNMATOBACTERIUM GRANULOMATIS

1.- LEGIONELLA NEOMOFILA

1.1.- Introducción

1.2.- Hábitat natural y patogenia de la infección

1.3.- Interés clínico

1.4.- Aislamiento y Características bioquímicas

1.5.- Tratamiento

2.- GARDNERELLA VAGINALIS

2.1.- Introducción

2.2.- Hábitat natural e interés clínico

2.3.- Aislamiento y Características bioquímicas

2.4.- Tratamiento

3.- STREPTOBACILLUS MOVILIFORME (produce la Fiebre Norverhill)

4.- SPIRILIUM HIMUS (produce la Fiebre de Sodoku)

5.- CALYNMATOBACTERIUM GRANULOMATIS (produce Granuloma inguinal o Donovalosis)

1.- LEGIONELLA NEOMOFILA

1.1.- Introducción

Presenta 29 especies, tres subespecies y distintos subgrupos. De ella Legionella neomofila es el patógeno mas frecuente. Se aisló por 1ª vez en 1976 a partir del tejido pulmonar en un brote de pulmonía ocurrida en un grupo de legionarios de Philadelfia por lo que se conoce como la enfermedad de los legionarios.

Es un bacilo gram -, aerobio, de 0,5 - 2 micras que produce potentes citotóxicas que pueden ser responsables de la lesión tisular del pulmón. La mayor parte de las especies posee flagelos.

Todas las especies son catalasa y gelatina +, en general, no fermentan ni oxida HC y es nitrato - y urea -. Los aminoácidos son su mayor fuente de energía y todas las especies necesitan N - cisteína para su crecimiento.

1.2.- Hábitat natural y patogenia de la infección

El hábitat es el agua y a partir del agua se pueden contaminar residencias, cuarteles, hospitales…

Este microorganismo resiste Tª de hasta 60º C y se a aislado en agua fría y caliente, sistemas de aire acondicionado con desagües. Los aerosoles que se generan en estos ambientes son la principal fuente de infección. Los pacientes de alto riesgo que pueden adquirir en enfermedades a través de esta fuente en los hospitales.

Legionella es un parásito intracelular facultativo, se desarrolla en el interior del citoplasma de células respiratorias, en ella se libera enzimas como lipasa, nucleasas, fosfatasas y potentes enzimas proteolíticos que dan lugar a la destrucción celular. En el organismo humano se replica preferentemente en los macrófagos alveolares.

1.3.- Interés clínico

La enfermedad de los legionarios es una neumonía aguda con manifestaciones multisistémicas que pueden presentarse como brotes epidémicas e infecciones nosocomiales. Tiene principal influencia en los meses de verano siendo mas frecuente en el hombre que en la mujer.

El periodo de incubación es de una semana. La enfermedad comienza con fiebre aguda, mialgia, debilidad y tos no productiva. Posteriormente comienza los síntomas respiratorios con esputo sanguinolento o purulento, disnea, dolor pleural, bradicardia, anorexia y en general un cuadro típico de neumonía atípica. También va acompañado de síntomas extrapulmonares como confusión, desorientación, vómitos, nauseas, diarrea…

La radiografía del tórax muestra un filtrado pulmonar y a menudo derrame pleural. Otras alteraciones analíticas es un aumento de creatinina, hipolatremia, hipofosforemia y aumento de transaminasas sin ictericia, aumento de VSG e insuficiencia renal.

Los factores que favorecen la infección son la inmunosupresión, cirugía reciente, edad elevada y tabaquismo.

Además produce un cuadro semejante a la gripe que se denomina fiebre de Pontiac, caracterizado por fiebre, tos, mialgia, dolor torácico, diarrea…

1.4.- Aislamiento y Características bioquímicas

Toma de muestras: Generalmente son respiratorias aunque también existen muestras extrarespiratorias como liquido peritoneal, pericardico, exudados de heridas y en ocasiones hemocultivo.

El esputo es una muestra valida para el cultivo de Legionella ya que no forma parte de la flora normal. Si el paciente no expectora, se tomara una muestra por broncoscopia.

En el transporte se debe evitar el uso con solución salina porque el Na inhibe el crecimiento de Legionella.

En cuanto al diagnostico microbiológico destacaremos:

• Examen directo: se pueden hacer tinciones de gram, giensa, Jiménez aunque son muy útiles las técnicas de inmunofluorescencia directa. El hecho la inmunofluorescencia sea negativa no excluye la enfermedad y es necesario realizar un cultivo.

• Pruebas serológicas: principalmente RIA y ELISA el inconveniente es que no están comercializadas.

• Técnicas de hibridación de ADN con PCR.

En cuanto a los medios de cultivo el más utilizado es: Bcye - . Las placas se incuban a 35º C en atm. De CO2 con humedad, un mínimo de 7 días algunos laboratorios incuban 2 semanas antes de desecharlas como -, la identificación de las colonias se hacen comparándola con una cepa control a las que se dan pases.

1.5.- Tratamiento

Principalmente eritromicina y en ocasiones rifampicina.

2.- GARDNERELLA VAGINALIS

2.1.- Introducción

Se suelen agrupar en bacilos gram - pero se caracterizan por tener una pared laminar no típica de gram + y gram -, por tanto, es un bacilo gram variable, es anaerobio facultativo y oxidasa y catalasa -.

2.2.- Hábitat natural e interés clínico

Se encuentra en flora vaginal de mujeres sanas de un 20 - 70 % este microorganismo desempeña un papel importante en el síndrome de vaginosis bacteriana caracterizado por:

• Exudado vaginal maloliente

• Ph vaginal mayor 4, 5

• Flujo vaginal abundante

• Pruebas de las aminas +. Esta prueba consiste en mezclar una gota de KOH al 90% con una gota de exudado vaginal y si es + se aprecia un fuerte olor a pescado podrido.

• Presencia de células CLUE, que son células epiteliales recubiertas de bacterias.

En vaginosis bacteriana el síndrome se caracteriza por la presencia de al menos 3 de los síntomas expuestos, también se ha descrito bacteriemia debido a Gardnerella vaginalis sobre todo en la fiebre post parto o post aborto. También esta asociado a meningitis neonatal, peritonitis, abscesos hepáticos e infecciones urinarias.

2.3.- Aislamiento y Características bioquímicas

La toma de muestra se realizara de exudado vaginal y es preferible la toma de 2 muestras:

• para examen directo

• para cultivo que se realiza entre 48 - 72 h con medios semiselectivos con agar sangre humana con colistina y ácido nalidísico.

Para su determinación se utilizan pruebas bioquímicas, enzimáticos y cromatografiítas acompañados de APIs.

2.4.- Tratamiento

Metromidazol, clindamicina y gentamicina.

3.- STREPTOBACILLUS MOVILIFORMES

Son bacilos gram - pleomórficos y anaerobios facultativos. Se encuentra en nasofaringe de ratas. El hombre adquiere la infección por mordedura, arañazos de ratas u otros roedores.

Produce la fiebre de Norverhill que se adquiere tras ingerir leche, agua u otra comida contaminada.

La fiebre por mordedura de rata consiste en aparición rápida de fiebre, cefaleas, nauseas y en un 75 % aparecen eritema primero macular papilar en la palma de la mano y planta del pie.

También puede haber diarreas y en la mitad de los pacientes poliartritis migratoria.

En ocasiones existen complicaciones graves como neumonías, meningitis, endocarditis.

Se aísla en hemocultivos y líquido sinovial y crecen en medio con agar sangre y chocolate a 35º

El tratamiento: penicilina, estreptomicina y tetraciclina.

4.- SPIRILiUM HIMUS

Produce la fiebre de Sodoku, se produce por mordedura de rata y la sintomatología va a ser igual que el del Streptobacillus moviliformes.

• CALYNMATOBACTERIUM

Son bacilos gram -, pleomorficos, no móviles y capsulados.

Produce la donovalosis o granuloma inguinal. La enfermedad se adquiere por vía sexual y se caracteriza por aparición de lesiones ulcerosas en el área ano genital y algunas veces también en el área extragenital. La mejor muestra es una biopsia donde se realiza tinción de giemsa. La donovalosis se caracteriza por la presencia de cuerpos de Donovan que consiste en reacciones donde el microorganismo aparecerá como racimos teñidos de azul oscuro o negro en el citoplasma de células mononucleares.

No existen medios de cultivo eficaces.

Tratamiento es penicilina, tetraciclina y gentamicina.

TEMA 26.-IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

1.- PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN

• Epidemiología.(1ª evaluación)

• Morfología.(1ª evaluación)

• Tinciones.(1ª evaluación)

• Pruebas de susceptibilidad.(tema de antibióticos)

2.- SISTEMAS COMERCIALES Y SISTEMAS AUTOMÁTICOS

2.1 Sistemas multipruebas:

• Macrotécnicas: KIA y TSI.

• Microtécnicas: API, Tubos, otros.

• Sistemas rápidos: tiras reactivas, métodos automáticos.

2.2 APIS.

• Introducción.

• Fundamento.

• Material.

• Reactivos.

• Técnica:

1º Preparación de la galería.

2º Preparación del inóculo.

3º Realización de la inoculación.

4º Periodo de incubación.

5º Resultados e interpretación.

API

Es un sistema de 10-20 microtubos que contienen los medios deshidratados. Se cultivan con una suspensión bacteriana que los rehidrata. Durante la incubación el metabolismo del microorganismo origina cambios en el color del medio o bien se produce al añadir reactivos.

La interpretación de estos cambios se produce mediante tablas de lectura u otros sistemas automáticos.

Si la practica la realizamos manualmente obtendremos un perfil numérico que nos servirá para la identificación de microorganismos.

(Ver figura 17.15 y libros de Staphylococos y Enterobacterias)

TEMA 27.- ANTIMICROBIANOS Y PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

1.- CLASIFICACIÓN

2.- CONSIDERACIONES PRÁCTICAS

2.1.- Elección de antibiótocos

2.2.- Controles durante la antibioterapia

2.3.- Fallo en la respuesta

2.4.- Asociación de antibiótocos

3.- ANTIBIÓTICOS EN SITUACIONES ESPECIALES

3.1.- Embarazo

3.2.- Lactancia

3.3.- Antibióticos en insuficiencia renal

4.- DEFINICIONES

4.1.- Antibiótico sensible

4.2.- CMI

4.3.- CMB

4.4.- Coeficiente terapéutico

4.5.- Resistencia

5.- MÉTODOS DE ANTIBIÓTICOS

5.1.- Dilución

• Sólido

• Líquido

5.2.- Difusión. Fuentes de error son debidas a:

• Medio

• Antibióticos

• Microorganismo

• Observador

5.3.- Elucción de discos

6.- RESISITENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS

6.1.- Alteración de permeabilidad

6.2.- Alteración de blanco o diana

6.3.- Inactivación enzimática

6.4.- Reflujo

6.5.- Bloqueo

1.- CLASIFICACIÓN

1.1.- -LACTÁMICOS

En su estructura química presentan un anillo -lactámico.

Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la formación de peptidoglucano componente esencial de la pared celular. Para ello se fijan a las PDP/PFD (proteínas fijadoras de penicilina). Su acción suele ser bactericida y los grupos principales son:

• Penicilinas

• Cefalosporinas

• Carbapenemas

• Monobactamas

• INBIL (inhibidores de -lactamasa)

1.- PENICILINAS

La base se estos compuestos es el 6-amino penicilánico (6-APA).

Dentro de las penicilinas hay varios grupos:

• Penicilina G y V: Se suelen administrar oralmente. Son útiles para gram positivos como neumococo, streptococo, strptococo pyogenes, anaerobios, espiroquetas y enterococo. No es activa frente a enterobacterias. Presenta baja toxicidad y se asocian a procaína y benzatina para prolongar la semivida plasmática (concepto de tiempo de activación de los Ab en el organismo), también se puede unir al probenecid que bloquea su excreción por los túbulos renales.

• Aminopenicilinas: Se destacan la ampicilina y amoxicilina. Son de amplio espectro (pueden actuar sobre gram positivos y gram negativos). Actúan bien sobre enterobacterias aparece resistencia en cepas de Escherichia coli.

• Isoosazolil: Son penicilinas resistentes a penicilasas y son muy útiles como tratamiento de elección para Staphylococos aureus. Las principales son: oxacilina, cloxacilina y meticilina.

• Carboxipenicilinas: Se recomiendan para gram negativos, principalmente para Enterobacterias y Psudomonas. La principal es la carbenicilina.

• Ureidopenicilinas: Muy utilizado frente a enterococos y streptococos, destacando la piperacilina.

2.- Cefalosporinas

El núcleo es el 7-aminocefalosporamico (7-ACA)

Proceden de productos de fermentación de hongos del genero Cefalosporium cuyo anillo básico es el anterior.

Se clasifican por generaciones estando en desarrollo la 4ª generación;

• 1º generación: actúan sobre gram + y tiene una acción moderada sobre gram -. Destacan: cefalotina y cefactor.

• 2º generación: útiles sobre gram - y algunos anaerobios. Destacan cefoxitina y cefamandol.

• 3º generación: aunque disminuye su actividad sobre gram + aumenta sobre gram -. Destaca Cefotaxima. Hoy existen preparados activos sobre vía oral como cefixima.

3.- Carbapenemas

El principal es IMIPENEM. Tiene la siguiente estructura:

Es inestable y destruido por dihidropeptidasas renales por lo que se une a lafilaxtatina para evitarlo. Tiene un gran espectro de acción generalmente todos los cocos gram + y gram -, bacilos gram +, anaerobios y la mayor parte de enterobacterias y algunas pseudomonas son sensibles a él.

Es resistente a Staphilococo Aureus y no se absorbe por vía oral.

4.- Monobactamas:

Son derivados monociclicos cuyo principal representante es aztreonam cuya formula es:

Se caracteriza por tener un espectro más reducido siendo activo solo gram - especialmente pseudomonas y enterobacterias

5.- INBIL

Inhibidor de -lactamasa. Su actividad antimicrobiana es reducida pero su unión irreversible sobre algunos -lactamasa impiden que estos destruyan los Ab -lactámicos por lo tanto estos inhibidores suicidas deben ir asociados a otros Ab -lactámicos proporcionando un aumento de su espectro. Destaca el Ácido clavulanico, cuya estructura es:

1.2.- INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS PROTEICA

Antibióticos que actúan sobre la subunidad 30s de los ribosomas

• Aminoglucósidos: Son antibióticos naturales y semisintéticos. Son potentes bactericidas y pueden derivar de Streptomyces o Micromonospora (son hongos). Los principales aminoglucosidos son: Streptomicina, Gentamicina, Trobamicina, Neomicina, Amikacina.

El mecanismo de acción se centra en el ribosoma en la subunidad 30s, produciéndose una inhibición de la síntesis proteica o proteínas defectuosas por error en la lectura del ARNm. Son muy activos sobre gram - entre ellos Psudomonas, Acinetobacter y sobre gram + como Staphylococo aureus.

Pueden presentar sinergismo con -lactámicos, con los que frecuentemente se asocian.

Las reacciones adversas más importantes son toxicidad renal y auditiva.

• Tretraciclinas: Son antibióticos de amplio espectro bacteriostático que se unen a la subunidad 30S del ribosoma inhibiendo la síntesis proteica.

La más utilizada es la Doxiciclina que presenta un amplio espectro sobre gram - y + (Ej: Brucella, Vibrio, Micoplasma, Micobacterium, Clamidia, etc.).

En la actualidad el nivel de resistencia de Neumococos y Enterobacterias es elevado.

No se utilizan en niños menores de 8 años ya que pueden afectar a la dentición y huesos. Pueden provocar trastornos gastrointestinales y hepáticos.

	5	6	7
Tetraciclina		CH2OH
Clortetraciclina		CH2OH	Cl
Doxicilina	OH	CH3

Antibióticos que actúan sobre la subunidad 50s de los ribosomas:

• Cloranfenicol: Su acción se sitúa en la subunidad 50s del ribosoma, impidiendo la transpeptidación. Su espectro abarca gram - y + (Ej: anaerobios, espiroquetas, micoplasmas, etc.), aunque se suelen reservar para infecciones graves ya que produce toxiinfección medular.

Si: R es NO2 --------- > Cloranfenicol.

R es CH2-SO2----> Tranfenicol

• Macrólidos: Dentro de este grupo tenemos dos principalmente:

• Eritromicina, que procede de Streptomyces. Es un antibiótico de medio espectro que actúa a nivel de la subunidad 50s impidiendo la transpeptidación y translocación, inhibiendo la elongación de la cadena proteica. Su espectro abarca gram + , Micoplasma, Trachomatis, Legionella, siendo resistentes las Enterobacterias.

• Clindamicina, es un antibiótico frente a anaerobios y su espectro, mecanismo de acción y farmacología es parecida a los macrólidos. Se considera por esto compuesto similar a los macrólidos.

1.3.- QUINOLONAS Y FLOXACINAS

Son quimioterápicos que se obtienen por síntesis química; su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la ADN-girasa, enzima necesaria para la duplicación del ADN.

Son bactericidas.

El primero que se introdujo fue el ácido nalidíxico como antiséptico de vías urinarias.

La norfloxacina supuso una ampliación de espectro sobre gram positivos y pseudomonas.

La Ciprofloxacina se puede utilizar en infecciones distintas de las vías urinarias debido a la buena concentración que alcanza en los tejidos. Presenta buena actividad sobre parasitos intracelulares y amplio espectro. Puede actuar sobre Rickettsias, micobacterias, parásitos intestinales y genitales. Se puede utilizar por vía oral. El uso desmedido de las quinolonas llevan a un aumento de la resistencia.

	R1	R2	R3
Ac. Nalidíxico	-CH2-CH3	H	CH3
Norfloxacina	-CH2-CH3	F
Ciprofloxacinol		F

1.4.- GLUCOPÉPTIDOS

Destacan la vancomicina y teicoplamina. Tienen actividad sobre los gram positivos. Presentan toxicidad renal y ótica y no se absorben por oral. Están reservados para infecciones por gram positivos resistentes. Su mecanismo de acción se dirige contra la formación de la pared celular inhibiendo la síntesis de peptidoglucanos.

1.5.- SULFAMIDAS Y TRIMETROPRIM

Ambos inhiben a distintos niveles la síntesis de ácido fólico. Se utiliza el trimetroprim-sulfametoxazol

Las sulfamidas derivan del paraaminobencenosulfamida cuya estructura es:

Suele administrarse por vía oral. No se utiliza en neonatos porque compite con la bilirrubina. Presenta un amplio espectro que comprende gram positivos, gram negativos, actinomicetales, clamidias y algunos parásitos como toxoplasma, plasmodium, etc.

1.6.- NITROIMIDAZOLES

Destaca el metroimidazol que es bactericida. Actúa sobre el ADN y es útil sobre anaerobios y algunos parásitos como triquina, tricomonas y entamoeba.

1.7.- OTROS ANTIBIÓTICOS

• Nitrofurantoína: es un antiséptico de vías urinarias y actúa sobre gram positivos y gram negativos.

• Ácido fusídico: actúa sobre Staphylococos aureus

• Rifampicina: esun antituberculoso; también actúa contra el meningococo, gonococo, clamydias y haemophylus.

• Fosfomicina: de origen español, de amplio espectro que actúa a nivel de la pared celular.

2.- CONSIDERACIONES PRÁCTICAS

2.1.- ELECCIÓN DEL ANTIBIOTICO

Para elegir un fármaco hay que tener en cuenta:

• microorganismo

• condiciones de la infección

• condiciones del paciente

Siempre que sea posible, el tratamiento debe ser elegido o iniciado sólo después de que se haya determinado el agente etiologico; esto nos obliga a un conocimiento de los principales gérmenes implicados en infecciones específicas así como el Ab más específico para cada gérmen.

Un punto importante a tener en cuenta son las condiciones del paciente. Tenemos que considerar la posible historia de hipersensibilidad, estado inmunitario, función hepática y función renal. Una vez determinadas dichas condiciones debemos elegir el Ab que debe cumplir los siguientes requisitos:

• ser el más activo y específico, a ser posible bactericida

• menos tóxico

• más barato

2.2.- CONTROL DURANTE LA ANTIBIOTERAPIA

Son necesarios debido a la aparición de efectos secundarios. Estas medidas son más necesarias en aquellas condiciones en las que se prevea un mayor riesgo por edad, alteración hepática, renal, etc. Estas medidas incluyen controles químicos, hematológicos, bioquímicos, bacteriológicos, etc.

2.3.- FALLOS DE RESPUESTA

Ante este problema se debe plantear de nuevo toda la sistemática relacionada con la elección del Ab. Si las causas son:

• Debidas al germen:

• Que no sea el agente etiológico

• Que presente resistencia

• Que haya sobreinfección (haya más de un microorganismo implicado en la infección)

• Debidas al antibiótico:

• Que no sea el Ab adecuado para el germen

• Que no sea la vía de administración adecuada

• Que no sea la dosis adecuada

• Debidas a características del paciente o de su infección:

• Presencia de cuerpos extraños

• Acceso insuficientemente drenado (la sangre no llega al lugar de infección)

• El paciente no cumple el tratamiento

2.4.- ASOCIACIÓN DE ANTIBIOTICOS

Los objetivos que se persiguen con la asociación de Ab son:

• Aumento del espectro bacteriano

• Evitar la aparición de resistencias

• Conseguir efectos selectivos

Es importante escoger antibióticos con distintos mecanismos de acción, cuya acción tenga un efecto sinérgico a ser posible bactericida. Se deberán administrar por separado y cada uno en su dosis terapéutica.

3.- ANTIBIÓTICOS EN SITUACIONES ESPECIALES

3.1.- Embarazo

Las reglas generales para el uso de Ab en gestación es el siguiente:

• Contraindicación absoluta de drogas antivirales.

• Evitar medicamentos nuevos.

• Evitar fármacos en el 1º trimestre.

• Emplear el menor nº de fármacos en los meses siguientes.

Se considera siempre contraindicado:

• antiviricos

• medicamentos nuevos

• tetraciclinas

Se suele utilizar ampicilina, eritromicina y miconazol.

3.2.- Lactancia

En la leche materna se alcanzaran niveles similares a los sanguíneos con el uso de cloranfenicol, eritromicina, sulfamida y tetraciclinas.

3.3.- ANTIBIÓTICOS en insuficiencia renal

En pacientes con insuficiencia renal se debe evitar los Ab mas tóxicos y los de eliminación exclusivamente renal.

4.- Conceptos

4.1.- antibiótico Sensible

Cuando un determinado Ab alcanza niveles plasmáticos iguales a la CMI en el lugar de la infección.

4.2.- CMI

La mínima cantidad de antibacteriano que inhibe el crecimiento.

• C= concentración

• M= mínima

• I= inhibitoria

4.3.- CMB

Es la concentración mínima bactericida (mata al microorganismo)

4.4.- Coeficiente terapéutico

Es la relación entre la concentración en el lugar de la infección y CMI

4.5.- Resistencia

Es cuando no inhibe el crecimiento.

5.- Métodos de antibiogramas

5.1.- Dilución

• Medio liquido

• Material: tubos estériles, tubos estériles de 13 cm. de largo, 1 cm. de diámetro con tapón de rosca, pipetas y estufa de cultivo.

• Reactivos: solución madre de antimicrobiano, caldo Müeller-Hinton, indicador de pH, suspensión del microorganismo que va a ser un inoculo estándar por la técnica de Kyrby Bauer a 0,5 por la escala de Mc Farlan.

• Técnica:

1.- Preparar diluciones de antimicrobiano a partir de la solución madre por el caldo de Müeller-Hinton.

2.- Se coloca en una serie de tubos de rosca 1 ml de cada solución de antimicrobiano e inoculamos con 1 ml de suspensión de microorganismo.

3.- Incubamos 37 º C 18 - 24 h.

• Resultados e Interpretación: Tras la incubación se debe observar la proliferación bacteriana en cada tubo de la serie. Esta se puede detectar mediante:

• Turbidez en el medio

• Viraje de color en el medio si hemos añadido un indicador de pH.

• Observaciones al método: Las principales desventajas de este método son las diluciones y no se detectan posibles contaminaciones.

• Medio sólido

• Material: tubos estériles, tubos estériles de 13 cm. de largo, 1 cm. de diámetro con tapón de rosca, pipetas, estufa de cultivo y placas de petri.

• Reactivos: solución madre de antimicrobiano, caldo Müeller-Hinton, indicador de pH, suspensión del microorganismo que va a ser un inoculo estándar por la técnica de Kyrby Bauer a 0,5 por la escala de Mc Farlan.

• Técnica:

1.- Preparar en tubos de ensayo distintas diluciones a partir de la madre.

2.- A partir de estas se coloca en otra serie de tubos una parte de solución antimicrobiana por cada 9 de medio de cultivo.

3.- Si se utiliza la técnica de Barry de inoculación se coloca 1 ml de la suspensión de microorganismo, se vierte el contenido de cada tubo sobre una placa de petri y se deja solidificar. Si no se utiliza la técnica de Barry se inocula por cualquiera de las otras técnicas.

4.- Incubar a 37 º C 18 - 24 h

• Resultados e interpretación: Tras la incubación se vera el crecimiento en cada placa y la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento corresponde a CMI.

• Observaciones al método: Las desventajas son las mismas que en el caso anterior. Para gérmenes exigentes debemos sustituir el agar Mueller Milton por medios enriquecidos, por ejemplo agar sangre y chocolate.

5.2.- DIFUSIÓN CON DISCOS

• Fundamento: Se realiza introduciendo discos de antimicrobianos sobre cultivos en placas, la difusión del mismo a través del medio produce un halo de inhibición de crecimiento cuyo diámetro será proporcional a la potencia del antimicrobiano.

• Material: placa de petri estériles de 9 o 15 cm de diámetro, pipetas estériles de 10-20 ml o dosificadores, pinzas o dispensador y regla de precisión.

• Reactivos: agar Müeller-Hinton, discos antimicrobianos y suspensión del microorganismo.

• Técnica:

1.- El medio para el antibiograma es Mueller-Hinton, se hace la preparación y estandarización del inóculo por la escala de Mc Farlan.

2.- Se hace el vertido en placa.

3.- Se siembra el microorganismo (no aislamiento)

4.- Elección del antibiótico. Debe seleccionarse un representante de cada grupo, debemos tener en cuenta para elegirlos:

• Lugar de la infección.

• Bacteria a investigar.

• Características tintoriales del germen.

5.- Implantación de discos que puede ser normal o automático por el sistema multidisco.

Método manual

Se extrae cada disco con unas pinzas estériles y se sitúa en el medio, teniendo en cuenta:

• la distancia mínima entre discos debe ser de 24 mm. para evitar superposiciones de halos.

• se situarán a un mínimo de 15 mm. de los bordes.

Con estas dos premisas en cada placa de 9cm. de diámetro se colocan como máximo 6 discos y en las de 15cm. de diámetro 12 discos.

Una vez depositado cada disco se debe presionar ligeramente con las pinzas para que el disco se fije al agar.

6.- Incubar 18-24 horas a 35-37ºC

7.- Interpretamos los resultados según el halo de inhibición de cada disco.

• Resultados e Interpretación: Cuando el crecimiento de la placa es débil nos podemos ayudar con la reflexión de los rayos de la luz. Si se trata de Proteus la aparición de una ligera niebla sobre los halos no se tiene en cuenta. En ocasiones en los halos de sulfamidas se produce un falso crecimiento que no se considera, se debe a elementos antagonistas.

Debemos tener en cuenta el tipo de medio (pH y composición) y las dimensiones y concentración de los discos antimicrobianos. Una vez puesto el disco no se puede mover.

Fuentes de error.

Pueden ser debidas:

1.- Al medio:

• Al mal estado del medio.

• A que no haya un ajuste de pH del medio.

• Volumen inadecuado de la placa.

2.- Al antibiótico:

• Mala conservación del antibiótico.

• Error en el tiempo de demora de la inoculación.

3.- Al microorganismo:

• Exceso de inóculo.

• Utilización de cultivos viejos.

• Inoculación de más de un microorganismo.

• Excesiva demora en la siembra.

• Condiciones de inoculación inadecuadas.

4.- Al observador:

• En la lectura (en la medida).

• Interpretación.

• Demora de lectura.

5.3 Elución de discos

Se realiza introduciendo discos con antimicrobiano en caldo, éste eluye el disco y alcanza una concentración conocida. Se inocula seguidamente y conociendo la metodología anterior se obtiene la CMI.

Es un método poco útil por lo que se suele utilizar la técnica de difusión.

6.- RESISTENCIA DE LOS ANTIMICROBIANOS

6.1.- Alteración de la permeabilidad

Impide que el agente penetre en la bacteria. Es el mecanismo más frecuente.

6.2.- Alteración del blanco diana

Lugar donde debe actuar el antibiótico.

6.3.- Inactivación enzimática

6.4.- Reflujo

Aunque penetra el antibiótico es excretado de nuevo al exterior.

6.5.- Bloqueo

Impide el paso del antimicrobiano.

TEMA 28.- MICOLOGÍA I

1.- INTRODUCCIÓN

2.- CLASIFICACIÓN

2.1.- Zigomicetos

2.2.- Ascomicetos

2.3.- Basidiomicetos

2.4.- Deuteromicetos

3.- MECANISMOS DE PATOGENICIDAD

3.1.- Hongos patógenos verdaderos

3.2.- Hongos oportunistas

4.- AISLAMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO (Saboraud)

5.- TÉCNICAS DE CULTIVO

6.- IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA

6.1.- Análisis microscópico

6.2.- Análisis macroscópico

7.- IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

7.1.- Auxonograma

7.2.- Zimograma

8.- ANTIFÚNGICOS

1.- INTRODUCCIÓN

Los hongos son microorganismos eucariotas, heterótrofos y de vida saprófita o parasitaria. Pueden crecer como células aisladas (levaduras ) o como filamentos multinucleares (hongos filamentosos con estructura miceliar)

Algunos hongos patógenos para el hombre son dimórficos, pueden crecer como levaduras o como hongos filamentosos (generalmente las levaduras son parásitos).

Los hongos no presentan diferenciación entre raíces y tallos, se denominan talófitos, y dado su carácter eucariota las células fúngicas se asemejan a las células animales y vegetales.

Poseen varios cromosomas rodeados de membrana nuclear.

La pared celular de los hongos está formada por:

• polisacáridos cristalinos (quitina) que le da rigidez y que son responsables de su forma.

• polisacáridos amorfos (mananos y glucanos) que actúan como sustancias de sostén.

Algunos hongos poseen cápsula con propiedades antifagocitarias e inmunológicas.

Las levaduras son hongos unicelulares que salvo raras excepciones se reproducen por gemación. Poseen morfología esférica y elíptica y miden de 3-10 m de longitud.

La unidad estructural de los hongos filamentosos son las hifas que poseen un diámetro de 3-12 m y pueden tener varios centímetros de longitud. Un conjunto de hifas entrelazadas constituyen el micelio que se hace macroscópicamente visible como una colonia fúngica.

En el medio se distinguen dos partes:

• una parte que pentra en el medio de cultivo y se extiende por la superficie siendo la responsable de la nutrición (micelio vegetativo).

• otra parte que se proyecta siempre en la superficie y contiene esporas (micelio aereo o reproductor).

2.- CLASIFICACIÓN

Clase	Reproducción sexual	Ejemplo	Reprodución asexual	Morfología microscopica
Zigomicetos	zigosporas	Rhizopus	Esporangiosporas dentro de esporangios	Micelio sin tabiques o septos
Acomicetos	Ascosporas en el interior de ascas	Estado teleomorfo de la gran mayoría de hongos Ej: Aspergillus	Esporas externas o conidias	Micelios con tabiques o son levaduras
Basidiomicetos	Basidiosporas en la extremidad de basidios	Estado teleomorfo de C. neoformas	Esporas externas o conidias	Micelio con tabiques o son levaduras
Deuteromicetos	Desconocida	Hongos imperfectos verdaderos y estado anamorfo de todos los hongos	Esporas externas o conidias	Micelio con tabiques o son levaduras

Los hongos se reproducen por esporas, de forma que el tamaño de las mismas y la forma de esporulación permite clasificar e identificar los hongos.

Las esporas pueden reproducirse de forma sexual o asexual. Los hongos que poseen reproducción sexual se denominan hongos perfectos y el estado de reproducción sexual teleomorfo. Los hongos que no poseen reproducción sexual que se desconoce son hongos imperfectos y al estado de reproducción se le denomina estado amorfo.

3.- MECANISMOS DE PATOGENICIDAD

Las dos principales barreras fisiologicas para el crecimiento de los hongos en los tejidos humanos son la temperatura y el potencial redox.

La mayor parte de los hongos crecen de forma óptima a temperaturas más bajas que el organismo.

Es importante distinguir entre:

• Hongos patógenos verdaderos, causantes de micosis sistémicas en las cuales la capacidad de adaptación es bastante elevada y se manifiesta por dimorfismo, ejemplo, Histoplasma y Blastomyces.

• Hongos oportunistas, causantes de micosis sistémicas menos virulentas.

La actividad patógena de los hongos depende de la capacidad para adaptarse a los tejidos y resistir a las defensas celulares. En el transcurso de una infección fúngica, la inmunidad celular es la que lucha contra el invasor, mientras que la inmunidad humoral tiene menos importancia.

4.- AISLAMIENTO Y TÉCNICAS DE CULTIVO

En general un medio de cultivo para hongos debe llevar una fuente de carbono y nitrógeno , un soporte sólido (agar) y un indicador de pH.

Los principales medios son:

• Como medios general, agar Saboreaud.

• Como medio de aislamiento, agar Saboreau-cloranfenicol y agar Nickeson (para aislamiento de Candida albicans)

• Medios con fines específicos, enriquecidos con sangre y vitaminas para identificación bioquímica (auxonograma).

La siembra se realiza igual que la de las bacterias y las condiciones de cultivo suelen ser de:

• 20-25ºC para micosis superficiales

• 37ºC para micosis profundas.

El tiempo de incubación es variable:

• Levaduras crecen de 2-3 días

• Hongos oprtunistas como Aspergillus y Penicilium crecen en 2-4 días

• Mayoría de hongos patógenos de 6-15 días

5.- TÉCNICAS DE CULTIVO

Además de las técnicas de cultivo ya conocidas tenemos:

Microcultivos sobre portaobjetos

• Fundamento: En ocasiones es necesario el estudio microscópico de los hongos en su estado natural para su identificación.

• Material: Pipetas estériles, portas, cubres y asas de siembra.

• Reactivos: Agar Saboraud, agua y azul de lactofenol.

• Técnica: Se denomina técnica del portaobjetos modificada por Simón y Collado.

1.- Con una pinza sumergir un porta limpio en alcohol y pasar por la llama.

2.- Dejar enfriar asépticamente en una placa de petri estéril

3.- Depositar en los bordes de la placa de petri unas gotas de agua para mantener la humedad adecuada.

4.- Con una pipeta estéril se deposita de 0.5-1 ml de agar Saboreaud sobre la superficie del porta a 45ºC.

5.- Extenderlo por el método de la cuña y dejar solidificar.

6.- Se siembra tocando el asa cargada en el centro del porta.

7.- Incubar

8.- Una vez desarrollado el hongo se añaden 1-2 gotas de azul de lactofenol. Se coloca un cubre y se observa al microscopio.

6.- IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA

6.1.- ANÁLISIS MACROSCÓPICO

En primer lugar se valora la ubicación de la lesión. Posteriormente se observa el aspecto típico del cultivo para su identificación.

• Los hongos unicelulares crecen formando una capa algodonosa o aterciopelada en la que se estudia la morfología y pigmentación.

• Las levaduras presentan aspecto cremoso similar al de las bacterias.

• Los hongos dimórficos pueden desarrollar ambos tipos de colonias, en general presentan forma miceliar cuando se incuban a 25-30ºC y forma levaduriforme cuando se incuban a 37ºC.

6.2.- Análisis microscópico

• Material: pipeta, cubre, asa y m/o.

• Reactivos: solución aclaradora (KOH) al 10-30%, lo que facilita la disolución de otras células y fibras para conseguir el producto patológico en buenas condiciones, azul de lactofenol.

• Técnica:

1.- Examen directo en fresco sin aclaramiento: Se utiliza para productos patológicos fluidos.

2.- Examen para productos patológicos tras aclaramiento: Se utiliza para productos patológicos sólidos (Ej: pelos, escaras, etc.).

1º Colocar una muestra sobre un porta limpio.

2º Añadir una gota de solución aclaradora

3º Tapar con un cubre y secar suavemente a la llama de un mechero 2-3 minutos. La queratina de la muestra se disolverá.

4º Posteriormente observaremos al m/o.

3.- Examen directo tras coloración:

1º Colocar una gota de azul de lactofenol sobre un porta.

2º Emulsionar la muestra sobre la gota del colorante. Si se realiza un cultivo se toca con el asa humedecida en agua estéril, la colonia se arrastra.

3ºColocar un cubre y observar al m/o.

7.- IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

Son pruebas complementarias al estudio morfológico, se utilizan para el estudio de levaduras patógenas y las principales son:

• Auxonograma

• Zimograma

7.1 Auxanograma

• Fundamento: Son pruebas en las que se estudia la identificación de sustratos carbonados o nitrogenados. El crecimiento de las levaduras en presencia de estos sustratos indicará la asimilación delos mismos. De los dos tipos de auxonogramas el más utilizado es el de hidratos de carbono.

• Material: tubos de ensayo, placa de petri, discos, dosificador, estufa de cultivo.

• Reactivos: agar base levadura, solución de azúcar al 20% en agua destilada (se recomienda 12 azucares), suspensión de levadura en solución salina ajustada al patrón nº 1 de la escala de McFarlan.

• Técnica: (Utiliza los hidratos de carbono por vía oxidativa).

1.- Inocular el medio de cultivo por la técnica de Barry.

2.- Se impregna cada disco con 2 gotas de solución de azúcar correspondiente y se desecan en estufa.

3.- Se colocan los discos en la placa.

4.- Se incuba a 37ºC 24-48 horas.

• Resultados: Alrededor de los discos se formará una zona de crecimiento.

7.1 Zimograma

• Fundamento: Es una prueba de fermentación de azucares, la cual se detecta por producción de gas, es complementaria al auxonograma.

• Material: tubo de ensayo, pipeta 10 ml., algodón graso, campana de Durham, pipeta pasteur, asa y estufa de cultivo.

• Reactivos: caldo de fermentación para levaduras, solución de distintos azucares al 20%, suspensión de levaduras en solución salina ajustada al patrón nº 1 de la escala de McFrlan.

• Técnica:

1.- Preparar una batería de 6 tubos con 9 ml. de caldo.

2.- Añadir 0.5 ml. de solución salina y colocar una campana de Durham.

3.- Esterilizar e inocular añadiendo a cada tubo una gota de suspensión de levadura y homogeneizar.

4.- Incubar a 30-37ºC durante 24-48 horas.

• Resultados: La presencia de burbujas en la campana de Durham será indicativo de fermentación.

8.- ANTIFÚNGICOS

Para el tratamiento de las micosis se dispone de un número reducido de fármacos:

• Anfotericina B: muy utilizado en micosis sistémicas. Los fármacos se unen a la membrana celular del hongo aumentando su permeabilidad. Inconveniente: efectos tóxicos que pueden ser muy graves.

• 5-Fluorcitoxina: es un antifúngico sintético. Se absorbe por vía oral y es una pirimidina fluorada. Es eficaz en el tratamiento de pocas micosis, actúa inhibiendo al síntesis de ácidos nucleicos.

• Derivados azólicos: Miconazol, Clotimazol, Ketoconazol, Fluconazol, Itraconazol. Su acción se debe a la inhibición de a síntesis de esteroles en las membranas celulares. En la actualidad se utilizan casi exclusivamente para Cándida o Cryptococus.

En algunos casos han aparecido resistencias para el tratamiento único de 5-fluorcitoxina.

TEMA 29.- MICOSIS II

Existen más de 50.000 especies de hongos diseminados por el suelo, aire y agua, de los cuales sólo 175 están relacionados con infecciones en seres humanos.

Las micosis humanas las podemos clasificar en :

• Micosis oportunistas.

• Micosis sistémicas.

• Micosis subcutáneas.

• Micosis cutáneas o superficiales.

1.- Micosis oportunistas

Actúan principalmente sobre individuos inmunodeprimidos. Los hongos oportunistas más importantes son:

1.1.- Cándida albicans

La forman hongos levaduriformes y se multiplican por gemación. Está dentro del género Candida aunque existen otras especies (ver cuadro 30.1 de fotocopias)

Puede encontrarse como flora comensal de distintas partes del cuerpo como piel, vagina, tubo digestivo, etc.

Candida albicans causa infecciones en individuos inmunodeprimidos como neonatos y diabéticos.

En mujeres es frecuente la vaginitis, produciendo enrojecimiento y secreción vaginal. Suele suceder en mujeres sometidas a tratamientos prolongados con antibióticos, diabéticas, por embarazo y uso de anticonceptivos orales. También se denomina candidiasis vulvovaginal.

En neonatos es frecuente la candidiasis mucocutánea que puede dar lugar a unas placas en la mucosa bucal, dando la lengua un aspecto lechoso y blanquecino, son las que se denominan placas de Muguet, pueden ser frecuentes en niños mal nutridos.

También aparecen las denominadas aftas que son parecidas a las placas de Muguet y que se han asociado a personas sometidas a tratamientos de quimioterapia o antibióticos durante largo periodo de tiempo, también se ha asociado a avitaminosis, sobretodo de la rivoflamina.

Se desarrolla en la mayor parte de pacientes con SIDA dando candidiasis orofaringea y un alto porcentaje de los mismo s puede dar esofagitis candidiasica.

La erradicación de Candida albicans de la mucosa oral es difícil y las reinfecciones son frecuentes, especialmente en pacientes leucémicos y transplantados pudiendo producir una infección diseminada de desenlace fatal. Los órganos implicados pueden ser hígado, riñón y pulmón.

En pacientes con catéteres venosos y urinarios Candida albicans puede producir endocarditis (se asocia a drogadictos), infecciones urinarias, tromboflebitis y osteomelitis.

También se puede producir candidiasis broncopulmonar como complicación de un proceso broncopulmonar.

Si Candida albicans pasa sangre puede dar candidiasis sistémica.

Candida albicans se diferencia bien de otras especies de Candidas porque en suero produce túbulos germinales (hifas) cuando se incuba a 37ºC (dimorfismo), esto se conoce como la prueba o test de la filamentación.

1.2.- Crytococcus neoformans

Es un hongo levaduriforme característico por presentar una gran cápsula, la presencia de ésta permite el diagnóstico directo a través de muestras clínicas (suero y LCR) con tinta china y aglutinación en látex.

Cryptococcus neoformans es un hongo ampliamente distribuido por la naturaleza, puede producir neumonías, en pacientes con SIDA, da meningitis e infecciones diseminadas.

Una vez que pasa al sistema sanguíneo puede afectar a distintas vísceras y SNC.

1.3.- Aspergillus

Aspergillus= a cepillo. Destaca Aspergillus níger que es el agente etiológico de otomicosis. También destaca Aspergillus fumigatus y Aspergillus flavus que causan infecciones pulmonares.

El aire contiene conidias de Aspergillus por lo que la vía normal de entrada al organismo es a través del tracto respiratorio pudiendo provocar fiebre, disnea, dolor pleural, tos seca, etc.

Puede haber complicaciones a nivel de las paredes de los vasos sanguíneos produciendo trombosis o incluso originar graves hemorragias.

Se encuentra en el suelo y materia orgánica en descomposición.

1.4.- Zigomicetos

Los géneros de mayor interés son Rhizopus, Absidia y Mucor.

Son hongos filamentosos que se caracterizan por poseer grandes hifas no tabicadas que se reproducen de forma asexual por esporangioesporas contenidas en vesículas especiales denominadas esporangios.

Los Zigomicetos son agentes etiológicos de zigomicosis o mucomicosis, infecciones graves en las que el hongo invade paredes arteriales y avanza produciendo embolias y necrosis.

2.- micosis sistémicas (hongos patógenos verdaderos).

Se caracterizan por su dimorfismo (fase miceliar a 25ºC y levaduriforme a 37ºC) y presentan una distribución geográfica restringida.

2.1.- Histoplasma capsulatum

Es el agente etiológico de la histoplasmosis americana. Se trata de una infección del sistema retículo endotelial que se adquiere por vía respiratoria, el principal órgano afectado es el pulmón desde donde se puede diseminar a órganos más profundos.

La variedad africana es Histoplasma capsulatum var. duboisii que difiere de la americana en producir menor implicación pulmonar, siendo frecuente las lesiones cutáneas, subcutáneas y óseas.

2.2.- Blastomyces tipidis

Causa la blastomicosis, que es una infección granulomatosa crónica principalmente en Estados Unidos y África.

La infección primero afecta al pulmón y se disemina a otros órganos principalmente la piel. Es semejante a Blastomyces dermatiditis. Es dimórfico.

2.3.- Coccidioides immitis

Se da en Estados Unidos y América latina, dando infecciones respiratorias a nivel pulmonar que pueden extenderse a piel, estructura ósea y SNC.

2.4.- Parácoccidioides

Afecta al pulmón. La principal variedad es la braliensis.

3.- micosis subcutánea

3.1.- Sporothrix SCHENKII

Produce la esporotricosis, es una infección granulomatosa crónica del tejido subcutáneo.

3.2.- Micetoma

Son lesiones crónicas localizadas en la piel, tejido subcutáneo y el hueso. Pueden estar causadas por bacterias y hongos. Un gran número de especies pueden dar micetomas.

3.3.- Cromomicosis

Es una infección progresiva granulomatosa producida por hongos negros.

3.4.- Lobomicosis

Enfermedad producida por Loboa loboi.

4.- micosis cutáneas y SUPERFICIALES (Tiñas)

Son dermatofitos. Son hongos causantes de infecciones en las porciones queratinizadas de la piel (pelos, uñas…) y que pertenecen a los géneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton.

Cuando se observa con KOH los pelos, uñas o escamas de la piel aparecen como filamentos tabicados ramificados.

La prevalencia de la dermatofitosis en los distintos países varía no solo con la distribución geográfica sino también con el clima, estado inmunológico, nutrición y condiciones higiénicas de la población.

En muchas ocasiones las especies están adaptadas al hombre y no son capaces de infectar a animales. La infección humana se transmite por contacto directo o indirecto (piscinas, cuarto de baño…), estas especies se denominan antropofilicas. Otros dermatofitos tienen como huésped animales y de ellos pueden transmitirse al hombre, son especies zoofilicas. Y otras menos frecuentes se contagian del suelo y reciben el nombre de geofilicas.

A los dermatofitos se le asocian unos cuadros clínicos denominados dermatofitosis o tiñas que se describen tradicionalmente con una base anatómica regional mas que una base etiológica causal; ej.:

• tiña corcoris: infección de la piel en todo el cuerpo

• tiña barbare: infección de la barba

• tiña capitis: infección del cuero cabezudo, cejas y pestañas

• tiña pedis: infección de los pies

Otros hongos superficiales son:

• Trichosporum cuya especie principal es Trichosporum beigelii, que produce la enfermedad llamada “piedra blanca” que afecta principalmente al tallo del pelo dando lugar a la formación de nódulos blandos.

• Malassezia furfur es una levadura que causa pitiriasis versicolor caracterizada por manchas claras y/o oscuras de la piel principalmente en el tronco.

• Piedraza hortae causa la piedra negra, es una infección del tallo del pelo típico de tierras húmedas y tropicales.

TEMA 30.- PARASITOS I. GENERALIDADES

1.- DEFINICIONES

• Comensalismo

• Mutualismo

• Parasitismo

2.- PROPIEDADES QUE CARACTERIZAN LA RELACIÓN HUESPED - PARASITO

3.- CLASIFICACION

4.- EPIDEMIOLOGIA

5.- VIA DE ENTRADA

6.- ACCION PATOGENA

7.- CLINICA

8.- PROFILAXIS

9.- DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO

9.1.- Tracto intestinal

• Cualitativa

• Fresco:

• Frotis

• Técnica de concentración: métodos físicos y métodos bifásicos

• Tinciones

• Cuantitativas (recuento de huevos)

9.2.- Tracto genitourinarios (Trichomonas vaginalis, orina, exudados vaginales)

9.3.- Tracto hematico

• Protozoos

• Leishmania

• Tripanosoma

• Toxoplasma

• Plasmodium

• Helmintos

• Equistosoma/ Echistosoma

• Microfilarias

1.- DEFINICIONES

• Comensalismo: asociaron útil para uno de ellos (asociación de dos seres en los que uno se beneficia y el otro ni se beneficia ni se perjudica)

• Mutualismo: asociación que proporciona ventaja a ambos. También se denomina simbiosis.

• Parasitismo: el parásito se nutre a costa de otro (huésped) el cual carga con la desventaja. Cuando el parásito se sitúa en el interior del huésped se habla de endoparasitismo y si lo hace en la piel o anejos se denomina ectoparasitismo. En ocasiones se habla de infección cuando se refiere al endoparasitismo, que es lo más frecuente, y hablamos de infestación cuando se refiere al ectoparasitismo.

2.- PROPIEDADES QUE CARACTERIZAN LA RELACIÓN HUESPED - PARASITO

• Escaso valor de las vacunas

• Frecuente resistencia a la infección

• Variación antigénica como mecanismo de acción para la defensa del huésped.

• Es frecuente la parasitacion múltiple sobre todo en zonas endémicas.

• Existen pruebas serológicas y cutáneas para la detención de muchos parásitos pero con frecuencia dan reacciones cruzadas.

3.- CLASFICACIÓN

(Ver esquema 21.1)

4.- EPIDEMIOLOGÍA

Las principales vías de transmisión son:

• Directa, por contacto persona a persona, principalmente vía sexual o trasplacentaria

• Fecal-Oral, mediante alimentos, es la vía más común.

• Telúrica, a partir de suelos contaminados.

• Antropozoonosis, el hombre se infecta a través de animales.

• Artrópodos, actúan como vectores.

En la prevalencia de estas enfermedades tiene gran importancia los factores ecológicos (clima, lluvia, etc) y los socioeconómicos y culturales (higiene, alcantarillado) lo que hacen que en muchas ocasiones sean enfermedades exclusivamente tropicales.

5.- VÍA DE ENTRADA

• Digestiva, por ingestión de quistes o huevos.

• Cutánea

• Respiratoria

• Transfusional

• Mucosas, etc

6.- ACCIÓN PATÓGENA

Se basa en los siguientes mecanismos:

• Mecánico: Causan obstrucción. Ej: hidatidosis, fialrias, quistecercosis.

• Traumática: Por migración a través de tejidos (sarna).

• Exfoliadora

• Tóxica: Mediante sustancia químicas que secretan o vehiculizan como enzimas proteolíticas necrotizantes o venenos (ej: arañas, escorpión).

• Citopatógenas: Parásitos que producen destrucción celular (ej: Plasmodium y Leishmania).

• Metaplásica o neoplásica: Como por ejemplo:

• Esquistosoma que produce carcinoma de colon, hñigado, recto o vejiga.

• Fasciola hepática que produce tumores en vías biliares.

• Paragonimus westermani que puede producir tumores pulmonares.

7.- CLÍNICA

Es muy variable y oscila desde el estado de portador asintomático o síntomas leves a manifestaciones graves que pueden provocar la muerte.

Depende del número de parásitos, tamaño, toxicidad y respuesta inmunitaria del huésped.

Suelen presentar enfermedades generales como anorexia, perdida de peso, cefaleas, etc, que pueden cursar de forma aguda, subaguda o crónica.

8.- PROFILAXIS

Se basa en:

• Control de reservorios y fuente de infección, por lo que es necesario conocer su ciclo biológico.

• Saneamiento del medio ambiente.

• Higiene individual y de las viviendas.

• Control higiénico sanitario.

• Control de vectores.

• Quimioprofilaxis

• Programas destinado a aumentar el nivel sociocultural y educación sanitaria.

9.- DIAGNÓSTICO PARASITÓLOGICO

En gran parte se basa en la detección de huevos, larvas o adultos de helmintos y trofozoitos (forma vegetativa) o quistes (forma de resistencia) de protozoos.

La identificación se basa en la morfología a diferencia de las técnicas bacteriológicas en las que las que la pruebas bioquímicas tienen gran importancia.

Además de las técnicas que se vana describir existen pruebas complementarias que pueden ayudar al diagnostico como hemogramas, radiografías, TAC, etc.

(Ver esquema 21.2)

Para el estudio del diagnóstico parasitológico existen pruebas analíticas que se pueden clasificar en:

• Pruebas intestinales

• Pruebas genitourinarias

• Pruebas hemáticas

1.- TRACTO INTESTINAL

• Análisis cualitativo

• Examen en fresco

• Frotis

• Técnicas de concentración

• Métodos físicos

• Métodos bifásicos

• Tinciones

• Análisis cuantitativo (recuento de huevos)

El análisis parasitológico de heces, también llamado coproparasitológico es el que más se utiliza en el laboratorio.

Las técnicas empleadas están orientadas a la búsqueda de formas vegetativas de protozoos así como de huevos, elementos maduros y fragmentos de helmintos.

a.- Análisis cualitativo

FROTIS

• Material: Portas, cubres, pipeta Pasteur y microscopio óptico.

• Reactivos: Solución salina, lugol y MIF.

• Técnica:

Examen de heces no diluidas(heces líquidas, semilíquidas o mucosanguinolentas)

1.- Se toma un fragmento de muestra, el más representativo, con un asa y se coloca sobre el porta.

2.- Se pone un cubre y se observa al microscopio.

Examen de heces consistentes

1.- Se coloca en un porta una gota de solución salina a 37ºC.

2.- Se toma con un asa desde distintos puntos de la muestra pequeñas porciones de la misma y se mezcla y homogeniza con la solución salina.

3.- Se pone un cubre y se observa al microscopio.

• Resultados: Se observa la morfología y la posible movilidad del parásito.

• Observaciones al método: Se puede facilitar la observación en fresco con:

• Lugol: se añade una gota antes de poner el cubre mejorándose la observación de protozoos y huevos. (color amarillento)

• MIF: es un conservador, fijador y colorante. Da buenos resultados en protozoos y huevos de helmintos. Se coloca sobre el porta una gota de solución salina más una gota de MIF. Se pone la muestra, se homogeniza y se coloca el cubre para su observación.

Para extensiones de heces diluidas no poner demasiada muestra pues dificultarái su l ectura ya que el cubre flotaría.

No utilizar objetivo de inmersión de frotis fecales sin cubre.

En determinadas extensiones no utilizar agua destilada pues el parasito es sensible a la presión osmótica.

El procesamiento de muestras debe ser rápido, menor de 30 minutos desde la recogida, si se buscan trofozoitos pues mueren muy pronto. En caso contrario deben utilizarse conservantes añadiendo 3 volúmenes de conservante por 1 volumen de muestra (si tengo 20 gr de muestra añadir 60ml de conservante). Los más utilizados son la Formalina (formol al 5-10%), PVA (alcohol polivinilo) y PAF (fenol-alcohol-formol).

Como la expulsión de parásitos es intermitente se recomienda enviar tres muestras de 2-3 días.

El primer examen que debe realizarse es el macroscópico en busca de parásitos enteros o anotando la consistencia y color de la muestra.

En el examen microscópico la observación comienza con objetivos de menor aumento y hay que ver la preparación completa. Se recomienda utilizar al menos una técnica de concentración, ya que los parásitos pueden estar en un número muy pequeño. También se deberá hacer tinciones permanentes que presenten la ventaja adicional de poder consultarse en cualquier momento y servir de colección.

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN

(Ver fotocopias 3 y 4)

TINCIONES

Generalmente se utiliza la técnica tricromica (Ver fotocopia 5)

b.- Análisis cuantitativo

Si pesamos una cantidad de heces, la diluimos y contamos el número de huevos en un volumen determinado de suspensión podemos conocer la concentración de huevos en heces.

Una técnica especial es la Técnica de Graham (Ver fotocopia 6). Es un método de diagnostico de los oxiuros (lombrices) que consiste en pasar una cinta de celofán por la región perianal a primera hora de la mañana sin haberse lavado. Esta cinta se pega en el porta y se examina al microscopio.

También se pueden observar otras muestra clínicas para la detección de parásitos como esputos, biopsias, LCR, etc.

Existe una serie de técnicas para la determinación de parásitos aunque estas suelen realizarse en laboratorios especializados, ej. cultivos, inoculación en animales, etc.

Las técnicas serológicas están poco desarrolladas, no estando los Ag bien definidos siendo frecuente las reacciones cruzadas y careciendo de sensibilidad muchas veces.

La PCR se basa en la detección del genoma por su gran sensibilidad.

TEMA 31.- PARÁSITOS II

1.- PROTOZOOS.

Clasificación

Se pueden clasificar entre otras cosas en función de su mecanismo de desplazamiento en:

1.- Sarcodinas: Son las amebas, utilizan pseudopodos para el movimiento. Los hay de vida libre o parasitaria.

2.- Ciliofora: Los órganos de locomoción son los cilios, son cortos y numerosos. Son de vida libre y parasitaria. El más representativo en Balantidium coli.

3.- Mastigophora: Son los flagelados. Es una especie de vida libre y parasitaria.

4.- Esporozoos: No presentan órganos de locomoción y alternan fases de reproducción sexual y asexual. Destacan los parásitos del paludismo.

1.- Sarcodinas

Son las amebas

Entamoeba histolitica

El representante más importante de las amebas. Es una ameba intestinal que presenta un tamaño de 10-12 micras y quistes con 4 núcleos, también presenta una vacuola de glucógeno y una o dos varillas que es lo que se denomina cuerpos cromatiodes.

La transmisión de la enfermedad es vía fecal-oral por la ingestión de quistes ya que los trofozoitos son muy sensibles a la desecación.

Manifestaciones clínicas y diagnóstico

La Entamoeba histolitica produce la disentería amebiana que se caracteriza por la aparición de lesiones en el colón (lesiones sanguinolentas). El cuadro clínico se caracteriza por el número y la gravedad de las ulceras que pueden causar abscesos hepáticos.

El tratamiento es a nivel intestinal Diyodohidroxiquim y a nivel de tejidos Metronidazol.

El diagnóstico se basa en la observación de los trofozoitos generalmente quistes que aparecen en heces.

Otras sarcodinas

La mayor parte son comensales, siendo las principales Entamoeba coli, Endolimax nana, Dientamoeba fragilis.

Es importante diferenciar entre Entamoeba histolitica y Entamoeba coli, para ello nos tenemos que fijar en el núcleo de los quistes Entamoeba coli tiene 8 núcleos y Entamoeba histolitica tiene 4, siendo muy importante ver el tamaño y forma de los núcleos y quistes.

2.- Ciliofora

Son los ciliados

Balantidium Coli

Es el protozoo de mayor tamaño, es de forma oval y mide 150 micras. Su forma quistita mide 50-70 micras y produce una disentería sanguinolenta similar a la amebiana, pudiendo existir portador asintomático.

Es capaz de atravesar la mucosa intestinal produciendo perforación intestinal. El principal reservorio es el cerdo.

El diagnostico se basa en la aparición de parásitos en heces.

El tratamiento son tetraciclinas.

3.- MASTIGOPHORA

Son los flagelados. Se dividen en: Intestinales, urogenitales y hemoflagelados.

3.1.- INTESTINALES

El principal parásito flagelado intestinal es la Giardia lamblia. El trofozoito presenta una morfología perecida a una lagrima de frente y de lado se parece a la porción curva de una cuchara (fotocopia). Tiene cuatro pares de flagelos, dos núcleos, dos axonemas y dos cuerpos medianos. Los quistes son redondeados u ovalados y presentan cuatro núcleos, cuerpos medianos y axonemas.

Los quistes son las formas que habitualmente se transmiten por vía fecal-oral, es mas frecuente encontrarlas en niños y zonas tropicales, pudiendo producir desde cuadros diarreicos intermitentes, irritación de las mucosas y mala absorción hasta diarreas asintomáticas.

El diagnostico se basa en la observación de los quistes en las heces. Para visualizar el trofozoito se requieren secreciones duodenales, recientemente se usan métodos de ELISA o inmunofluorescencia.

El tratamiento son tetracilinas y metomidazol

Existen otros flagelados en el tracto gastrointestinal Ej.: Tricomonas hominis, Retrortamonas intestinales etc.…

3.2.- UROGENITALES

El más importante es Tricomonas vaginalis. Es un flagelado cuyo hábitat es la vagina en mujeres y uretra en hombres.

Es una ETS. No produce quistes y el trofozoito tiene de 3 a 5 núcleos, axostilo y membrana ondulante, presentan varios flagelos.

La sintomatología se produce tras incubar 4-28 días y consiste principalmente en picor vulvar y secreciones purulentas. En el hombre generalmente la infección suele ser asintomática.

El tratamiento es con metromidazol o timidazol.

El diagnostico suele realizarse por frotis de flujo vaginal o sedimento urinario.

Es importante que no haya contaminación fecal (fotocopia).

3.3.- HEMOFLAGELADOS

Este grupo comprende una serie de diversos parásitos incluidos en la familia Tripanosomidae, que son los Tripanosomas y Leishmania. Se transmite por vectores invertebrados y presentan variación de tipo morfológico. En función de la localización del flagelo tenemos:

• Tripomastigote: en el extremo posterior y discurre en sentido longitudinal quedando en el extremo libre

• Epimastigote: cercano al núcleo.

• Promastigote: cercano al extremo anterior.

• Amastigote: flagelo muy cortado.

a.- TRIPANOSOMA

TRIPANOSOMA BUCEI

Son los agentes causantes de la Enfermedad del sueño o Tripanosomiasis africana que se transmite por la mosca Tsé - Tsé. En el vector están como epimastigote y tripomastigote siendo esta última la forma que infecta al hombre al ser picado, produciéndose un chancro en el lugar de la inoculación.

La enfermedad se manifiesta tras un periodo de incubación que puede durar semanas o meses con fiebre irregular, linfoadenopatías en la parte posterior del cuello (cervicales), anemias y esplenomegalia. También exantemas eritomatosos y al avanzar la enfermedad se produce letargia, sueño, apatía, coma y muerte.

Existen 2 subespecies, la Gambiensis en África Occidental cuyo reservorio son los animales domésticos y la enfermedad que produce es de curso lento. La otra es Phodensis de África Oriental cuyo reservorio son animales salvajes y de evolución rápida.

El tratamiento es sudamina y pentamicina en las primeras etapas. Metarsoploh cuando hay afectación del SNC.

El diagnostico se basa en la observación del parásito por tinción de Giemsa en sangre, nódulos linfáticos y LCR y métodos serológicos.

TRIPANOSOMA CRUZI

Produce la Enfermedad de Chagas, se da en América principalmente. Es una zoonosis que se transmite por los chinches besucones. En el animal vertebrado se presentan los 4 tipos morfológicos mientras que en el invertebrado esta como epimastigote y tripomastigote. Esta ultima es la forma infectante que se transmite a través de las mucosas o por las heridas de la picadura.

La incubación dura entre 1-2 semanas produciéndose posteriormente fiebre irregular, hepatomegalia, adenopatías, edemas etc., después sigue una fase de latencia tras la cual se pueden producir unas manifestaciones de infección crónica siendo la más característica miocarditis.

El tratamiento son nifurtimos y benzomidazol.

El diagnostico comprende observación en sangre, hemocultivo y xenodiagnóstico (realización del diagnostico a partir del huésped). Este diagnóstico consiste en permitir que chinches no infectados se alimenten de la piel del enfermo que se supone que padece la enfermedad de chagas, posteriormente se estudia el contenido intestinal o las heces de los chinches para identificar la presencia del parásito en sus diferentes etapas del desarrollo.

B.- LEISHMANIA

Es un parásito intracelular obligado, que se transmite por mosquitos en los que están el tripomastigote; en el vertebrado son amastigote.

Se localiza en las células del retículo endotelial de la piel, mucosa, bazo, hígado y medula ósea. En función de su localización se producen distintas manifestaciones clínicas: Leishmaniosis cutáneas, mucocutáneas o visceral.

Diagnóstico general: se basa en el diagnóstico del protozoo mediante tinción de giemsa o siembras. Para formas cutáneas se realiza una biopsia de la piel. En las leishmaniosis viscerales el mejor rendimiento se obtiene por aspirado de médula ósea. Los métodos serológicos principalmente son inmunofluorescencia indirecta.

Los principales grupos de Leishmania son:

Leishmania donovani

Produce la Enfermedad de Kala-azar. Es una enfermedad visceral distribuida en Asia, África y Estados Unidos. Dentro de la Leishmania donovani existe una variedad denominada Leishmania infantum que es endémica en países mediterráneos. Su principal reservorio son los perros y se transmite por el mosquito del género Phlebotomus, afectando a niños.

El periodo de incubación es de 4 meses y los síntomas son: fiebre, hepatomegalia, anemia, leucopenia e hipergammaglobulinemia. Se puede producir un oscurecimiento de la piel que es lo que le da el nombre al Kala-azar (fiebre negra). Tras la enfermedad se produce una inmunidad verdadera.

El tratamiento: derivados pentavalentes de antimonio, como glucantine. Otros fármacos activos son pentamicina, anfotericina B y alocurinol.

Leishmania tropical

Produce Leishmaniosis cutánea del viejo mundo. En el lugar de la inoculación produce una pápula que se ulcera durante semanas o meses. La enfermedad se denomina Botón del oriente.

Leishmania mexicana

Produce Leishmaniosis cutánea del nuevo mundo. Recibe el nombre de UTA o Ulcera de los chicleros.

En el 60% de los casos la afectación se sitúa en la oreja.

Leishmania brasilensis

Se da en America del sur, produce Leishmaniosis mucocutánea. Se conoce como espundia o pianboys.

4.- ESPOROZOOS

Plasmodium

Se distinguen 4 especies:

• Plasmodium falciparum

• Plasmodium ovale

• Plasmodium malariae

• Plasmodium vivax

Son parásitos que producen la malaria o paludismo. Es una de las enfermedades que mayor número de muertes produce en el mundo sobretodo en países subdesarrollados.

CICLO BIOLÓGICO

Comienza con la inoculación de esporozoitos por las hembras del mosquito del género Anopheles. Por el torrente circulatorio se va la hígado donde comienzan las fases exoeritrocitarias primarias. Es un proceso de esquizogonia donde se producen sucesivas generaciones de merozoitos que posteriormente se liberan y se dirigen a los eritrocitos, donde tienen lugar los ciclos eritrocitarios.

El Plasmodium vivax y Plasmodium ovale pueden permanecer en el hígado en fase de latencia como hynozoitos que podrán dar lugar a recaídas.

En los glóbulos rojos van a ir madurando los merozoitos dando lugar a equizontes que por equizogonia dan lugar a nuevos merozoitos que infectan nuevas células. Después de sucesivas generaciones algunos merozoitos se transforman en gametocitos, éstos pueden ser masculinos o femeninos que son ingeridos por el mosquito, en el que tendrá lugar la reproducción sexual por la unión de los gametocitos que dará lugar al zigoto que al crecer forma un ooquiste y al romperse libera cientos de esporozoitos, con lo que se inicia de nuevo el ciclo. (ver fotocopia 9)

MANIFESTACIONES CLÍNICAS

Las fases exoeritrocitarias suelen durar una semana, se liberan los merozooitos a la sangre produciéndose los síntomas típicos del paludismo, que comienza con una fase fría de escalofríos, fiebre alta, anemias, sudoración y esplenomegalia.

La liberación de sucesivas generaciones dará lugar a nuevas fases sintomáticas dependiendo de la duración del ciclo de vida del parásito, aunque esto no siempre es así.

En Plasmodium vivax y ovale los ciclos son de 48 horas, en Plasmodium malariae es de 72 horas y en Plasmodium falaparum es de 36-48 hora, siendo esta ultima la que con mayor frecuencia presenta complicaciones dando lugar a coagulación intravascular diseminada y paludismo celular.

TRATAMIENTO

Cloroquina, siendo también muy útil la profilaxis al viajar a estas zonas. Fármacos alternativos son la quinina, tetraciclinas y falsidal.

EPIDEMIOLOGÍA

Las especies más importantes son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum que son responsables del 95% de la enfermedad. La prevención se realiza por la lucha de contra vectores (mosquito). Hoy en día se están estudiando vacunas frente al parásito.

TINCIÓN

De Giemsa, siendo muy importante la observación de las distintas formas morfológicas.

BABESIA

Es un parásito de sangre transmitido por garrapatas. En el hombre afecta a los eritrocitos dando lugar a la cruz de malta.

Los síntomas son: fiebre, mialgias, hepatoesplenomegalia y anemia hemolítica.

Tratamiento: Cloroquina

TOXOPLASMA FONDII

Es un parásito de distribución mundial cuya infección es frecuente aunque rara vez produce manifestaciones clínicas.

CICLO BIOLÓGICO

El huésped definitivo es el gato donde tiene lugar la reproducción sexual (gametogonia) y asexual (esquizogonia).

Los ooquistes que se encuentran en heces pueden infectar a otros gatos, mamíferos y aves en los que se produce únicamente reproducción sexual formando quistes en el tejido muscular.

El hombre adquiere la infección a través de los alimentos por ooquistes o por carne poco cocinada que da lugar a taquizoitos.

MANIFESTACIONES CLINICAS

La mayor parte de las infecciones son asintomáticas aunque pueden cursar con un cuadro con linfoadenopatías.

Hay que tener en cuenta dos situaciones que cobran gran importancia:

• Infección durante el embarazo, que puede dar lugar a abortos o malformaciones.

• Inmunodeficiencia, frecuente en enfermos con SIDA donde dan cuadros graves que afectan al SNC.

TRATAMIENTO

Sulfamidas, lindamicina, espiramicina, etc

DIAGNOSTICO

En primer lugar métodos histológicos para detectar parásitos en los tejidos y en segundo lugar serología principalmente mediante ELISA e inmunofluorescencia indirecta detectándose Ig G e Ig M específicos frente a Toxoplasma gondii. El parásito también se puede recuperar mediante inoculación en animales principalmente ratones.

CRIPTOSPORIUM

Es una infección importante en pacientes con SIDA que suele cursar con diarreas crónicas de difícil tratamiento.

Su detección se realiza a través de los quistes con tinción de Kinyoun.

NEUMOCISTIS CARINII

Se pueden presentar de forma quistita o extraquística.

La fase quistica presenta en su interior de 2-8 células denominándose esporozoito. Las paredes del quiste se tiñen con colorantes como azul de toluidina.

La fase extraquística se denomina trofozoito. Aparece en personas con SIDA, mal nutridas, neoplásicas, etc. Da manifestaciones pulmonares.

OTROS (Son esporozoos)

• Isospora belli

• Sarcocistis

• Blastocistis hominis

• Microsporium

TEMA 32: HELMINTOS O METAZOOS

1.- INTRODUCCION

Los metazoos o helmintos son gusanos o vermes. Su tamaño puede oscilar entre 1 mm a varios metros. Se dividen en:

1.- Platelmintos o gusanos planos

• Cestodos: segmentados y con varios órganos de fijación, suelen ser hermafroditas.

• Trematodos: no segmentados con forma de hoja, hermafroditas o con sexos separados.

Los platelmintos presentan simetría bilateral y 3 capas: ectodermo, mesodermo y endodermo.

El tubo digestivo carece de ano y suele acabar en intestinos ciegos, excretándose en los residuos por regurgitación por la boca.

2.- Nematelmintos o gusanos cilíndricos

No segmentados y con sexos separados.

2.- PLATELMINTOS

2.1.- TREMÁTODOS

Se conocen como duelas y se clasifican en función de su localización en el hombre en:

• intestinales

• pulmonares

• hepáticos

• sanguíneos.

Morfología

Los tremátodos tienen forma de hoja en general, aunque pueden variar de una especie a otra al igual que su tamaño.

Presentan 2 ventosas, una oral que se continúa con la boca, faringe e intestinos ciegos y otra ventral.

Los adultos son hermafroditas.

(Ver fotocopia 10)

Diagnostico y tratamiento

Se basa en la detección y diferenciación de huevos en heces. El fármaco de elección es el Praziquantel.

Debemos diferenciar distintos tipos de huevos:

• Cilíndricos u ovalados

• Ausencia o presencia de casquete u opérculo

• Presencia o ausencia de espolón y si el espolón se encuentra en posición central o lateral. El espolón en ocasiones se utiliza como mecanismo de defensa.

Clasificación

Los tremátodos los podemos dividir en:

A.- Intestinales

Facialepsis Buski

Se da en las regiones asiáticas afectando al hombre y al cerdo, principalmente a través de las plantas acuáticas donde se enquistan las metacercarias, produce trastornos intestinales con hemorragias, ulceras y edemas.

El adulto puede medir hasta 7 cm.

Schismostoma Ilocanum

Se adquiere por ingestión de moluscos dando cuadros leves.

Heterophyes Heterophyes

Se adquiere por ingestión de pescado poco cocinado.

Metagonimun Yokogawai

Se adquiere por ingestión de pescado poco cocinado.

B.- Hepáticos

Parasitan los conductos biliares del hombre

Fasciola hepática

Es un trematodo de 2 - 3 cm. de longitud y huevos grandes operculados y sin espolón. El parásito adulto se localiza en el hígado y vías biliares en el ganado ovino, bovino y en el hombre.

CICLO BIOLÓGICO

Igual que el general, el segundo hospedador son plantas (berros)ingeridas por el huésped herbívoro (ovejas, vacas, etc.) llegando a las vías biliares donde se desarrolla el gusano adulto.

La sintomatología esta asociada a obstrucción biliar y lesiones hepáticas, produce fiebre y eosinofilia.

El diagnóstico se realiza por detección de huevos en heces y métodos serológicos.

Clonorchis sinensis

Se le denomina duela hepática. Las metacercarias se encuentran en peces, adquiriéndose la infección al consumir pescado poco cocinado. La patología depende de la intensidad y duración de la infección y puede acabar en cirrosis.

C.- PULMONARES

Paragonimus westermani

El ciclo biológico es igual que el general pero el segundo hospedador es el cangrejo. La infección se produce al consumir éste. Las larvas migran al pulmón aunque pueden encontrarse en otro lugares.

La sintomatología suele ser pulmonar, produciendo destrucción tisular, inflamación y hemorragia.

La detección se realiza por detección de huevos en heces o esputo, siendo huevos operculados. También se realizan pruebas serológicas.

Se da principalmente en Asia y África.

D.- SANGUÍNEOS

Schistosoma

Son agentes infecciosos de gran importancia a nivel mundial por su gran prevalencia y producir una enfermedad debilitante crónica.

Los Schistosomas no son hermafroditas y se van a situar en parejas en el sistema venoso (Schistosoma janicum y Schistosoma mansoni) o en el plexo vesical (Schistosoma haematobium).

Los huevos se depositan en pequeñas venas del recto, intestino y vejiga y salen la exterior por las heces u orina, eliminando el miracidio.

Al entrar en contacto con el agua migran a los caracoles que dan lugar a las cercarias llegando al hospedador definitivo. A continuación migran al sistema venoso correspondiente dando lugar a formas adultas iniciando de nuevo el ciclo.

Manifestaciones clínicas y diagnóstico

Este parásito (larvas) puede atravesar la piel humana dando lugar a dermatitis transitoria benigna. Después se produce un cuadro agudo con fiebre, hepatitis, urticaria, hemorragia intestinal, etc.

Una vez puestos los huevos se pueden diseminar a distintos órganos como hígado, pulmones, etc. y en la fase crónica se produce la respuesta inmunitaria a la lesión tisular. Se puede producir cirrosis hepática, glomerulonefritis y existe una elevada relación con carcinoma de recto, hígado y vejiga.

El diagnóstico se realiza por detección de huevos con espolón en orina y heces. Cuando los huevos tienen un espolón en posición central es típico de Schistosoma haematobium , si lo tienen en posición central Schistosoma mansoni y si es pequeño y lateral Schistosoma japonicum. También se hacen pruebas serológicas.

Estos parásitos se dan en África, Asia y América del sur.

2.2.- CESTODOS

Morfología

Están compuestos por:

• Escólex, son órganos de fijación y pueden tener ventosas. Se dice que esta armado cuando presenta una prominencia denominada rostellum o rostelo provista de ganchos.

• Cuello y estrobilo, formado por segmentos denominados proglótides que según van madurando sexualmente se alejan del cuello, así los más cercanos son inmaduros a continuación vienen los maduros y los grávidos cargados de huevos.

Todo el organismo comparte un sistema excretor y nervioso, mientras que no existe un tracto alimentario al estar sujetos a superficies, siendo especialistas en absorción de nutrientes.

Son hermafroditas, sirviendo la estructura uterina de las proglótides para diferenciar algunas especies.

(Ver fotocopia 12)

TENIA SOLIUM

MORFOLOGÍA

Es la tenia del cerdo que puede llegar a medir hasta 2-3 metros en el intestino humano. Presenta un escólex con 4 ventosas y un rostelo con 20-35 ganchos. Las proglótides son más anchas que largas cuando son inmaduras, invirtiéndose las proporciones en los grávidos. Puede haber hasta 100 proglótides. Normalmente existen hasta 10 ramificaciones a cada lado en los segmentos grávidos diferenciándose de la Tenia saginata con más de 15, ya que los huevos son indistinguibles.

Los huevos son de cubierta gruesa y son excretados en heces, pudiendo permanecer viables durante semanas y al ser ingeridos por el cerdo (u hombre)se desarrollan oncosferas que por la sangre se diseminan a distintos órganos o músculos formando cisticercos (enfermedad denominada cisticercosis).

MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y DIAGNÓSTICO

Los síntomas más frecuentes son malestar general, principalmente en niños en los que produce trastornos nerviosos.

El tratamiento es con niclosamida y praziquantel.

El diagnóstico se hace mediante la detección de los huevos o proglótides en las heces.

Más grave es la Cisticercosis por la ingestión accidental de huevos que pueden estar en el agua o alimentos. Los huevos no dan lugar a adultos sino que liberan oncosferas uqe daran lugar a cisticercos en tejidos. En las formas más graves afecta al ojo y al cerebro y requiere además de fármacos tratamiento quirúrgico.

El diagnóstico se basa en técnicas radiológicas, histológicas y serológicas.

TENIA SAGINATA

Se diferencia de la anterior en que el escólex se encuentra desarmado. Alcanza hasta 5 metros y el útero presenta más ramificaciones. Además la cisticercosis no aparece en el hombre sino en el ganado vacuno.

ECHINOCOCCUS GRANULOSUS

Es la tenia del perro. Tiene un escólex armado y tres proglótides (inmaduro, maduro y grávido). La longitud es de 0.5-0.25 cm y el hombre y ganado son los huéspedes intermediarios donde se dan las formas larvarias hasta ingerir los huevos formándose los quistes que aumentan de tamaño progresivamente pudiendo alcanzar hasta 20 cm.

El quiste hidatídico presenta una pared cuticular gruesa que da lugar a una formación de tipo vesicular.

La Hidratosis humana puede afectar a múltiples órganos y la gravedad va a depender de su localización. La rotura de un quiste puede tener consecuencias graves con diseminación de nuevos quistes.

Para prevenir la hidratosis se debe desparasitar a los perros.

El diagnóstico se basa en detectar el parásito con fluorescencia, electroforesis y hemoaglutinación.

El tratamiento es quirúrgico.

ECHINOCOCCUS NANA

Es una tenia enana de 1-4 cm con proglótides 4 veces más anchas que largas. Afecta principalmente a niños. Es cosmopolita (distribución mundial) y presenta manifestaciones clínicas leves.

El tratamiento es con praziquantel niclosamida.

HYMENOLEPSIS DIMINUTA

Es muy raro en el hombre y el diagnostico se basa en detectar huevos en heces.

DIPHYLOBOTRIUM LATUM

Tiene un escólex con dos ventosas alargadas y las proglótides son más anchas que largas. Presentan huevos con casquete que secretan con heces dando lugar a unas oncosferas en las que se encuentran los coracidios que presentan cilios, que penetran en crustáceos donde desarrollan el procercoide (pierde los cilios) que migran a los peces donde se forma la fase adulta.

La infección en el hombre viene por consumo de peces insuficientemente cocinados, sobre todo en países asiáticos y Japón. La enfermedad depende del grado de parasitación, pudiendo cursar con múltiples lesiones en el intestino y anemia debido a que el parásito concentra la vitamina B12.

El tratamiento es con praziquantel y niclosamida.

DIPYLIDIUM CANINO

Afecta a perros y gatos. El diagnóstico se basa en detectar los huevos en forma de paquetes. Ocasionalmente puede afectar al hombre.

3.- NEMATELMINTOS

Son unos gusanos redondos, no segmentados y con simetría bilateral. Pueden ser vertebrados o invertebrados con sexos separados siendo el macho el más pequeño. Se dividen en: intestinales, tisulares y filarias.

3.1.- nematelmintos INTESTINALES

Las formas adultas tienen su habitat final en el intestino, aunque muchos de ellos presentan una migración por tejidos en fase larvaria.

ENTEROBIUS VERMICULARIS

Son los oxiuros, habituales del intestino delgado y ocasionalmente del tracto genitourinario. Son los helmintos que se diagnostican con mayor frecuencia en nuestro medio y tiene distribución cosmopolita.

Las hembras tienen una longitud de 1 cm y los machos de 2-5 cm con el extremo posterior en espiral. Los huevos son resistentes a la desecación y rara vez se ven en heces, ya que la puesta de huevos se hace en la región perianal.

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La sintomatología es leve y consiste en picor anal, insomnio e irritabilidad. En ocasiones produce irritación en genitales de niños.

El diagnóstico se hace con la técnica de Graham

El tratamiento es con mebendazol, que se recomienda para toda la unidad familiar o contactos cercanos.

TRICHURIS TRICHURA

Helminto común en climas húmedos y cálidos va asociado a Ascaris (gusano). Es habitante del ciego y del colon ascendente. También se conoce como tricocéfalo por presentar un extremo anterior muy fino introducido en la mucosa intestinal y un extremo posterior más grueso en la luz intestinal.

El cuadro clínico es leve pero si la parasitación es extensa se producen lesiones en la mucosa, anemias, diarrea crónica, etc.

El diagnóstico se basa en la detección de huevos caracterizado por presentar dos tapones en los dos extremos. Son muy resistentes a la desecación y necesitan un proceso de maduración en el suelo. Posteriormente infectan al hombre por agua y alimentos.

CAPILLARIA PHYLIPPINENSIS

Se sitúa en el intestino delgado a partir de la ingestión de pescado poco cocinado siendo los huevos parecidos a los de Trichura pero con pared estriada.

Puede producir deshidratación (que si no se trata puede ser mortal) y mala absorción.

ASCARIS LUMBRICOIDES

Es el segundo helminto intestinal en prevalencia a nivel mundial después de los oxiuros. Predominan en niños en regiones tropicales y subtropicales.

La infección humana es por ingestión de huevos liberándose las larvas en intestino que sufren migración al pulmón. A los 10 días ascienden a la faringe y son deglutidos desarrollándose la forma adulta en el intestino.

La hembra mide 20 cm y pone 27 millones de huevos que pueden ser fértiles y no fértiles. El hombre mide 16 cm.

El cuadro clínico se presenta si la parasitación es intensa dando lugar a bronconeumonía en fase pulmonar y trastornos intestinales.

El diagnóstico es por detección de huevos en heces.

No es frecuente pero se pueden observar larvas en esputo.

ANCYLOSTOMA

Las especies más importantes son Ancylostoma duodenale, necator y americans.

Las formas adultas se diferencian por la disposición de piezas dentales y estructura de la bolsa copuladora. Son la primera causa de infección en el viejo mundo y la segunda en el nuevo mundo.

Los machos miden 1 cm y las hembras 1-1.5 cm. Los huevos salen por heces y la maduración se realiza en el suelo dando lugar primero a una forma larvaria, posteriormente a otra forma larvaria y la tercera fase que será infecciosa es la que penetra en la piel y migrará al pulmón, de aquí a la faringe donde son deglutidos y pasan al intestino donde anidan las formas adultas.

La transmisión de las larvas se ve favorecida por el hecho de no llevar calzado. La sintomatología que produce es dermatitis que se denomina sarna de la tierra o de la mina. En el pulmón e intestino pueden producir neumonitis o irritación con diarrea y dolor abdominal.

La infección crónica conduce a anemia microcítica o hipocrómica que se ve favorecida por el hecho de que la población donde produce la infección tiene dieta pobre en Fe.

El diagnóstico se basa en la detección de huevos en heces.

El tratamiento es con mebendazol.

STRONGELOIDES STERCOLARIS

Son parásitos con un ciclo muy complejo. Presentan unas larvas filiformes que atraviesan la piel y pasan a sangre, pulmón, faringe donde son deglutidos y pasan al intestino. Pueden producir dermatitis, bronconeumonía y trastornos intestinales que pueden dañar la mucosa causando septicemias mortales.

El diagnóstico es por detección de huevos en heces o esputo aunque es mas probable la detección de larvas.

El tratamiento es con tiabendazol.

3.2.- NEMATELMINTOS TISULARES

Trichinella espirales

Las hembras pueden llegar a depositar 500 huevos. Las larvas son de 1 mm de longitud dando lugar a quistes en el músculo esquelético, miocardio y SNC. Los sitios más frecuentes de localización en los músculos son los intercostales, lengua, laringe, bíceps y músculos oculares.

El hombre suele adquirir la triquinosis por ingestión de carne de cerdo (jabalí, carne de caza, monte) insuficientemente cocinada.

La sintomatología es intestinal con diarrea, dolor abdominal y muscular y lo más grave es la miocarditis y encefalitis aunque esta última es rara.

El diagnóstico es serológico o histológico con detección de larvas en los tejidos.

Larva migratoria visceral

Causada por larvas de Toxocara canis (perro) y Toxocara cati (gato) siendo frecuente en perros y gatos.

El hombre adquiere la infección a través de los huevos del parásito. Las larvas que se liberan sufren migración a distintos órganos, pulmón, ojo, hígado, cerebro, etc.

El diagnóstico es serológico aunque también se pueden observar las larvas por biopsias.

Es muy importante la desparasitación de perros y gatos.

Larva migratoria cutánea

Síndrome causado por las larvas a través de la piel de distintas especies (generalmente Ancylostomas). Como consecuencia se forman túneles en la piel para el desplazamiento de las larvas.

Anisakiasis

Enfermedad causada por la ingestión de larvas por comer pescado poco cocinado.

Dracunculos medinensis

Se da principalmente en África. Los machos miden 2 cm y las hembras 1 cm. Migran a nivel subcutáneo y se ulcera la piel por la liberación de las larvas, cosa que puede ocurrir cuando hay contacto con el agua. Las larvas infectan pequeños animales marinos que son los que transmiten la infección al ser ingeridos por el consumo de agua.

El diagnóstico por lesiones cutáneas en las que se pueden llegar a ver el gusano.

3.3.- FILIARIAS

Aunque se conocen más de 200 especies sólo 7 tienen importancia en el hombre. La característica más importante es que las hembras producen embriones móviles denominados microfiliarias. Los adultos presentan distintas localizaciones, tejido linfático, cavidad pleural, nódulos subcutáneos, etc. a partir de los cuales secretan las microfilarias a la piel o torrente sanguíneo. A partir de la sangre son ingeridos por artrópodos (mosquito) en los que se transforma en larvas infecciones que son inoculadas a huevos huéspedes.

El ciclo se completa en un año.

El diagnostico se basa en la detección de microfiliarias en sangre, piel y otros líquidos

corporales.

El tratamiento: dietilcarbamazina.

TEMA 33.- ARTRÓPODOS

Pueden actuar como parásitos, generalmente ectoparásitos, pero su importancia en parasitología es debido a su acción como vectores.

Presentan un cuerpo dividido en cabeza, tórax y abdomen. Además de parásitos también pueden ser patógenos por su acción mecánica (mordedura).

1.- CLASIFICACION

• INSECTOS

• Dípteros (moscas y mosquitos): Trasmiten bacterias, virus y parásitos. Destacando principalmente los que producen leyhsmaniosis, paludismo, filarias y tripanosomiasis.

• Hemípteros (chinches): Su mordedura puede producir reacción cutánea. Destaca como vector en la enfermedad de Chagas.

• Anoplura (piojos).

• Siphanaptera (pulgas).

• Otros órdenes.

• ARÁCNIDOS

Presentan importancia médica sobre todo por las picaduras de arañas y escorpiones pero el orden que más nos interesa es el de los ácaros, siendo el más importante Sarcoptes scabiei.

También son importantes las garrapatas que son transmisoras de virus, bacterias (Rickettsias) y protozoos (Babesia).

2.- PRINCIPALES ACCIONES COMO PARÁSITOS DE LOS ORTROPODOS

2.1. PIOJOS

Son ectoparásitos que se encuentran muy frecuentemente. Además el piojo humano es el vector de las fiebres recurrentes y del tifus exantemático.

Las principales especies son:

• Pediculus humanos.- Es el piojo humano del cuerpo y cabeza.

• Phthirus pubis.- Es el piojo del pubis. Producen irritaciones cutáneas y picores.

Tratamiento.- Lociones o champús con pernetrina al 1% (lindane). Se aconseja tratar a los contactos cercanos y repetir el tratamiento a los 10 días.

2.2. MIASIS

Infecciones del hombre y animales por larvas de dípteros que se alimentan de tejidos vivos o muertos. Se produce cuando la hembra deposita los huevos en piel, heridas y mucosas.

Según la localización se distinguen formas cutáneas y mucocutáneas. Afecta principalmente a ojos, nariz y oídos. Formas menos frecuentes son las intestinales, pulmón, vagina y uretra.

Tratamiento.- Quirúrgico y paliativo.

2.3. SARNA

Producida por Sarcoptes scabiei. El macho mide 200 m y la hembra 400. Ésta al ser fecundada escarba túneles en la epidermis donde deposita los huevos, de 3-5 huevos diarios, continuando su camino durante 30 días aproximadamente y posteriormente muere.

Produce túneles en espacios interdigitales, antebrazos, codos, axilas, ingles, surcos submamarios, cintura, pliegues del glúteo, genitales, etc. El poder infectante es bajo y requiere un contacto estrecho como familiares y contactos sexuales.

Periodo de incubación: 5-15 dias.

Tratamiento: Lindane.

2.4. DEMOCIDOSIS

Es producida por algunas especies de ácaros del género Demodex (Demodex Follicubrun y brevis) que suelen ser comensales de folículos pilosos y glándulas sebáceas que pueden producir Pitiriasis, acné, queratosis y epiteliomas.

TEMA 34: VIRUS

1.- INTRODUCCION

Desde antes del descubrimiento de los microorganismos se utilizaban virus para cualquier agente productor de enfermedad ya que etimológicamente virus significa veneno.

A finales del s. XIX Ivanosky demostró que una enfermedad el “mosaico del tabaco” se podía transmitir de una planta enferma a otra sana por medio de unos extraños organismos que se machacaban y posteriormente se filtraban. Este agente era capaz de atravesar los filtros que retenían las bacterias, así fueron denominados virus filtrables.

Los virus mejor conocidos son los que afectan a las bacterias siendo denominados por D´Merelle como bacteriófagos o fagos.

Los virus constituyen una clase de agente infeccioso único. Son parásitos intracelulares obligados y tienen unos rasgos verdaderamente distinguidos debidos a su simple organización y su mecanismo de replicación.

Una particicula vírica puede considerarse como un bloque de material genético rodeado por una capa proteica, y a veces de una cubierta membranosa adicional que le protege del medio ambiente, y le sirve de vehículo para la transmisión de una célula huésped a otra.

Los virus se multiplican solo en determinadas células huésped, de acuerdo con ello se subdivide en:

• Virus animales

• Virus vegetales

• Bacteriófagos (virus que afectan a bacterias)

La especificidad de unión depende tanto de las propiedades de la cubierta del virion (unidad formada por el ac. nucleico y la envoltura proteica) como de la presencia de receptores especiales en la superficie celular. Esta limitación desaparece cuando se produce la transferencia es decir, cuando la infección es llevada a cabo por ácido nucleico vírico desnudo.

2.- COMPOSICION QUIMICA DE LOS VIRUS

Básicamente están compuestos por proteínas, ac. nucleico y también pueden contener lípidos e hidratos de carbono.

La proporción relativa de dichos constituyentes es muy variable en los virus.

2.1.- PROTEINAS

Hay que diferenciar:

• Proteínas estructurales: son las que dan forma al virus tienen carácter antigénico lo cual permite identificar a los virus mediante utilización de Acs específicos.

• Proteínas con actividad enzimática: Ej.; enzimas necesarias para la replicación del virus, absorción, penetración…

2.2.- ACIDOS NUCLEICOS

Los virus tienen un solo tipo de ácido nucleico bien ADN o ARN. Este puede estar constituido por una sola cadena monocatenaria o doble cadena bicatenaria. La información genética se halla situada entre 1000 codones (conjunto de 3 bases nitrogenadas que codifican a distintos aa) en virus de menor tamaño y 100.000 los de mayor tamaño. Según el ac. Vírico tenemos:

• ADN monocatenario

• ADN bicatenario

• ARN monocatenario

• ARN bicatenario

2.3.- LIPIDOS

Muchos virus contienen lípidos en su envoltura, la característica fundamental es que son sensibles a disolventes orgánicos perdiendo la infectividad. Por el contrario los virus que carecen de envoltura lipidica en general son resistentes a tratamientos con disolventes orgánicos.

2.4.- HIDRATOS DE CARBONO

Principalmente están formando parte de glicoproteinas las cuales suelen localizarse en la membrana que rodea el virus.

3.- ESTRUCTURA DEL VIRUS

3.1.- ACIDO NUCLEICO

ADN y ARN: monocatenario y bicatenario.

3.2.- ENVOLTURA PROTEICA

Recibe el nombre de capsida (CAP) esta formada por unas subunidades idénticas denominadas capsomeros.

Los capsomeros son proteínas globulares que en ocasiones tienen una parte glucidica que se ensambla entre si dando a la cubierta una forma geométrica.

A su vez los capsomeros están formados por un pequeño número de monómeros. Se suelen presentar 2 tipos de capsomeros:

• Pentagonales (5 monómeros)

• Hexagonales (6 monómeros)

Dejando un espacio de 40 Amstrom.

Atendiendo a la forma de la cápsula se pueden distinguir los siguientes tipos de virus:

• Cilíndricos o helicoidales: los capsomeros que son de un solo tipo se ajustan en torno a una hélice simple del ac. nucleico, Ej.: virus del mosaico del tabaco.

• Icosaedricos: los capsomeros que suelen ser de varios tipos se ajustan formando un icosaedro regular y dejando un hueco central donde se sitúan el ac. nucleico fuertemente apelotonado, algunos presentan fibras proteicas que sobresalen de la capsida, Ej.: Adenovirus en los que se encuentra los del resfriado y faringitis.

• Pleomorficos: presenta una envoltura exterior además de la nucleocapsida (capsida o cubierta que tiene como misión proteger el ac. nucleico) la cual puede ser icosaedrica o cilíndrica, Ej.: virus de la gripe.

• Complejos: poseen además de nucleocapsida prolongaciones y apéndices para facilitar la infección, ej: fagos de la serie T. por lo general responden a la siguiente estructura:

• Una cabeza de estructura icosaedrica que alberga el ac nucleico.

• Una cola de estructura helicoidal que sustituye un cilindro hueco.

• Un collar de capsomeros entre la cabeza y la cola.

• Una placa basal al final de la cola con unos puntos de anclaje que sirven para fijar el virus a la membrana celular. De la placa salen también unas fibras proteicas que ayudan a la fijación del virus sobre la célula hospedadora, Ej.: virus bacteriófagos.

3.3.- ENVOLTURA LIPOPROTEICA

Muchos virus exteriormente a la capsida presentan una envoltura de características similares a la membrana plasmática, doble capa fosfolipidica y proteínas. Muchas de ellas son glicoproteinas que proyectan salientes hacia el exterior llamados especulas.

Se interpreta que la envoltura lipoproteica es un resto de la membrana plasmática de la célula infectada donde se ha formado el virus, (virus de la gripe).

3.4.- REPRODUCCIÓN DE LOS VIRUS

• Fase de penetración en la célula

• Fase de eclipse

• Fase de multiplicación

• Fase de liberación del virus

a.- Fase de penetración en la célula

Consta a su vez de 2 etapas: la adsorción o fijación del virus en la superficie celular y la penetración a través de la membrana.

Hay una especificidad en la fijación de un virus en la membrana de célula hospedadora, porque se ha de producir la unión entre determinadas proteínas de la cápsida vírica y determinadas glicoproteínas de la membrana plasmática. A lo largo de un proceso evolutivo cada virus ha ido adquiriendo los sitios de unión específicos para adherirse en la membrana de un determinado tipo celular.

b.- Fase de eclipse

Corresponde a un tiempo después de la penetración en que el virus parece desaparecer pues no se advierte ningún indicio ni de su presencia ni de su actividad.

Lo que ocurre es que se produce un desensamblaje de piezas del virus y su ácido nucleico en las estructuras celulares aptas para los procesos de replicación y trascripción. Esta fase es variable para unos virus y otros y termina con la síntesis de ARNm necesario para la síntesis de las proteínas que actuarán en la multiplicación del virus.

c.- Fase de multiplicación del virus

Consiste tanto en la replicación del ácido nucleico como en la síntesis de proteínas de la cápsida. Los ácidos nucleicos y proteínas recién sintetizadas se ensamblan rápidamente produciéndose nuevas partículas víricas.

d.- Fase de liberación del virus

Consiste en la salida de nuevas partículas del virus que podrán infectar nuevas células iniciando de nuevo el ciclo.

4.1.- MODALIDADES DE PENETRACIÓN EN LA CÉLULA

a.- VIRUS COMPLEJOS

Producen una rotura en la membrana bacteriana en uno de los puntos de anclaje gracias a la presencia de algunas moléculas de enzimas hidrolíticas. A través de la rotura, el tubo central inyecta el ácido nucleico vírico quedando la cápsula vacía en el exterior de la bacteria. La presencia de la cápsida en la superficie bacteriana es un buen indicio de que la bacteria ha sufrido infección vírica.

b.- VIRUS SIN ENVOLTURA LÍPIDICA

Se introducen en células con cápsida, lo cual puede realizarse de 2 maneras:

• Penetración directa: después de la fijación el virus abre una brecha en la membrana y se introduce en el citoplasma.

• Por endocitosis: la membrana forma un invaginación en torno al virus, llegando a formar una vesícula que penetra en la célula. Formada la vesícula el virus abre una brecha en la membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolíticas que él mismo transporta penetrando así en el citoplasma.

c.- VIRUS CON ENVOLTURA LIPÍDICA

Burlan la barrera de la membrana celular porque su envoltura lípidica se funde con la membrana ya que tiene la misma naturaleza. Esta fusión de la membrana puede realizarse en 2 lugares:

• Fusión en la superficie de manera que el virión penetra en el citoplasma.

• Fusión con un lisosoma, se forma una vesícula por endocitosis a la que se une un lisosoma para dirigirle la partícula introducida, entonces la cubierta lípidica del virus se funde con la membrana del lisosoma y el virión escapa hacia el citoplasma.

4.2.- MODALIDADES DE FASE DE ECLIPSE

a.- CICLO ORDINARIO

El ácido nucleico vírico procede inmediatamente a la transcripción de su mensaje genético en los ARNm necesarios para su multiplicación y prosigue rápidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el más extendido en la naturaleza.

b.- CICLO LISOGÉNICO

el ADN vírico se cierra en los extremos dando lugar a un ADN circular que se inserta en el ADN bacteriano en un lugar específico en el la secuencia de nucleótidos bacterianos es semejante a alguna región del ADN vírico. La bacteria prosigue sus funciones vitales sin que el virus realice ninguna acción y cuando el ADN bacteriano se duplica también lo hace el vírico, de manera que el genoma del virus pasa a las dos bacterias hijas. La multiplicación bacteriana puede seguir durante generaciones sin que el virus se manifieste, pero ante una alteración de las condiciones ambientales el ADN vírico se separa del bacteriano y prosigue las restantes fases del ciclo infeccioso produciendo la muerte de la bacteria y nuevos ejemplares del virus. Un ejemplo de este ciclo son los virus de las verrugas y algunos retrovirus que producen algún tipo de cáncer.

4.3.- MULTIPLICACIÓN DE LOS VIRUS

Consta de la replicación de su material genético, de la transcripción de su mensaje en moléculas de ARNm y de la traducción del mensaje para producir proteínas víricas, tanto las que se forman para la cápsida como las proteínas enzimáticas necesarias para el ensamblaje de las piezas del virión y algunas funciones necesarias para el virus.

Los ribosomas y la mayor parte de los enzimas que los ácidos nucleicos víricos utilizan en estos procesos son los de la célula infectada.

4.4.- MODALIDADES DE LIBERACIÓN DEL VIRUS

Tras su multiplicación los nuevos virus saldrán con capacidad de infectar nuevas celulas. Así tendremos:

a.- CICLO LÍTICO

Se da en la mayor parte de los bacteriófagos y muchos otros que no tienen cubierta lipoproiteica. Los virus no abandonan la célula hospedadora hasta que se ha producido su muerte por agotamiento de los recursos necesarios para sus funciones vitales, en ese momento se produce la lisis de la célula y los viriones escapan libres al medio.

b.- INFECCIÓN PERSISTENTE

Los nuevos virus no esperan a la muerte de la célula hospedadora para abandonarla sino que van saliendo de la célula al mismo tiempo que se van produciendo, de manera que la célula puede seguir viva y produciendo nuevas partículas vivas. La liberación puede hacerse:

• Directamente: en aquellos virus sin envoltura lipoproteica por medio de una brecha en la membrana o por exocitosis (salida de sustancias al exterior celular)

• Gemación: en virus con envoltura lipoproteica se rodean de porciones de membrana plasmática que acaba separándose de la célula y constituye la cubierta lipoproteica del virus.

5.- LISOQUIA

Hasta ahora todos los bacteriófagos descritos provocan lisis celular, por lo que son considerados virulentos, pero puede presentarse otra relación en que el virus se adapte una vez haya infectado al huésped y no provoque su muerte. Este fenómeno de denomina lisoliquia.

A la célula bacteriana que contiene el material genético del virus pero que no se reproduce sin producir fagos se conoce como cepa lisoliquia.

El material genético del virus que está en el interior de la bacteria se denomina profago y al virus capaz de inducir lisoliquia, virus atenuado.

6.- PATOGENÉSIS

La infección vírica puede tener muchos efectos sobre el organismo, los cuales pueden oscilar desde una infección asintomática hasta una infección aguda o la inducción a un cáncer.

Las consecuencias de la infección dependen de ciertos factores:

• Vías de transmisión.

• Efectos sobre la función celular.

• Vía de multiplicación.

• Respuesta del huésped, etc.

6.1.- Alteraciones celulares producidas por infección vírica

a.- Efecto citopático

Consiste en alteraciones morfológicas de la célula que en general causan su muerte. Los factores que contribuyen al desarrollo son:

• Efecto sobre la síntesis de macromoléculas celulares: Los virus que contienen ADN inhiben la síntesis de ADN de la célula del huésped pero no del ARN de la bacteria ni de las proteínas hasta periodos posteriores en el ciclo de multiplicación. Por lo contrario muchos virus con ARN inhiben la síntesis de proteínas y de ARN en las células huésped en los primeros periodos del ciclo de multiplicación.

• Alteración en los lisosomas: Que pueden causar destrucción celular.

• Alteración de la membrana celular: Las células infectadas por virus pueden incorporar proteínas víricas en el interior de la membrana celular adquiriendo antígenos delos viriones y reacciona con anticuerpos o con linfocitos inmunes convirtiéndose en blanco de la destrucción inmunológica. En ocasiones la célula alterada adquiere la capacidad de adsorber glóbulos rojos, es lo que se denomina hemoadsorción. En otras ocasiones células infectadas se fusionan con las no infectadas y después dela disolución de las membranas forman células gigantes denominadas policariocitos.

• Un aumento de la concentración de viriones o de proteínas de la cubierta vírica puede iniciar la formación de alteraciones citopáticas sin replicación del virus infeccioso.

b.- Desarrollo de cuerpos de inclusión

Los cuerpos de inclusión son masas intracelulares de nuevo material, pueden formarse por:

• grandes acumulaciones de material vírico obstruyen la estructura y función de la célula y causan la muerte.

• en ocasiones son cicatrices dejadas por una anterior multiplicación vírica.

c.- Inducción a alteraciones cromosomicas.

d.- Transformación celular

Una consecuencia sorprendente de la infección por ciertos virus moderados con la producción de tumores y leucemias.

7.- FACTORES INMUNOLÓGICOS

7.1.- Anticuerpos

Los anticuerpos presentes en el suero y en los líquidos extracelulares proporcionan la protección principal contra la infección vírica. El grado de protección se relaciona directamente con el nivel de anticuerpos neutralizantes.

La inmunidad de larga duración con persistencia de Acs. circulantes es el resultado de una infección con cierto número de virus, especialmente los que producen viremia (diseminación del virus por vasos sanguíneos y linfáticos), es extremadamente raro que la persona sufra un segundo ataque, por el contrario las infecciones localizadas agudas sin viremia especialmente enfermedades respiratorias (gripe) no dejan inmunidad persistente y son frecuentes nuevas infecciones.

7.2.- Inmunidad celular

Es importante por intervenir en la recuperación vírica, mantiene el estado de superación de las infecciones víricas latentes, por ejemplo herpesvirus.

7.3.- Factores inespecíficos

Son factores que actúan más bien de forma indiscriminada sobre todos los virus.

8.- CUADROS DE ENFERMEDAD

Los virus causan 3 cuadros básicos de infección:

8.1.- Localizada

La multiplicación vírica y lesión celular permanece localizada cerca de la zona de entrada (piel en verrugas, aparato respiratorio en gripe, etc.).

8.2.- Diseminada

Se desarrolla a través de unos pasos secuenciales:

• El virus sufre multiplicación en la zona de entrada y en ganglios linfáticos regionales.

• El virus se esparce por circulación sanguínea y vasos linfáticos (viremia primaria).

• Llega a órganos adicionales donde se multiplica.

• El virus se disemina en los órganos afectados (viremia secundaria).

• Se multiplica en los órganos afectados donde causa una lesión celular y patológica.

8.3.- Inaparente

Pueden desarrollarse infecciones víricas transitorias sin causar enfermedad abierta (son aquellas en que el virus ha diseminado ampliamente en el organismo y se alcanza un máximo en sangre y bazo).

En la producción de infecciones inaparentes se hallan implicados ciertos factores:

• Naturaleza del virus, los virus atenuados ocasionan infección inaparente.

• Grado de inmunidad.

• Fracaso del virus en alcanzar el órgano diana.

9.- MÉTODOS DE VIROLOGÍA CLÍNICA

El diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales se basa en 3 métodos:

9.1.- Microscopía electrónica

Como el cultivo de virus esta reservado para laboratorios especializados.

9.2.- Métodos serológicos

Con ellos se intenta detectar un aumento significativo del titulo de anticuerpos para un determinado virus en el curso de una enfermedad.

9.3.- Cultivos celulares

Donde distinguimos:

• Cultivos celulares primarios: proceden directamente de tejidos y suelen tener una morfología epitelioide o fibroblástica.

• Cultivos celulares secundarios: proceden de repetidos pases de los anteriores. Estos cultivos tienen una vida limitada pero en ocasiones se consiguen células alteradas que van a ser capaces de crecer indefinidamente dando lugar a una línea celular, que es el método más utilizado en la actualidad.

Las más conocidas son: Hela, Hep-2 y KB, derivadas de carcinomas humanos.

10.- MEDIOS DE CULTIVO

Para mantener las mismas condiciones fisiológicas de presión osmótica, pH, así como las concentraciones adecuadas de iones orgánicos esenciales in vitro como in vivo se precisa una solución de sales equilibradas (BSS) que es la base de todos los medios de cultivo químicamente definidos.

Algunos medios contienen glucosa que proporciona los hidratos de carbono necesarios.

Los medios que se emplean en cultivo celular son los siguientes:

• BSS de Hanks.

• BSS de Earle, con mayor capacidad del tampón que el anterior.

• BSS suplementado con vitaminas, aminoácidos y otros nutrientes para formar medios sintéticos.

Los medios disponibles en el mercado más utilizados son:

• Nº 199.

• BME (Medio Basal de Earle).

• MEM ( Minimum Esential Médium).

11.- CLASIFICACIÓN (Ver fotocopia)

Las clasificaciones de los virus son complicadas y generalmente se basa en 3 puntos:

• Naturaleza del ácido nucleico, si es ADN o ARN y si este ácido nucleico es monocatenario o bicatenario.

• Simetría, si es helicoidal, icosaedrica, compleja, pleomorfica, etc.

• Si presenta o no envoltura.

TEMA 35: VACUNAS

1.- INTRODUCCION

Las vacunas son preparados obtenidos a partir de microorganismos que han perdido su eficacia para desencadenar la enfermedad y que una vez se administrados producen en la persona una inmunidad frente a la enfermedad de que se trate previniendo de este modo la transmisión de la infección.

Las vacunas son preparados inocuos y que no causan por regla general efectos secundarios de importancia, por ello es importante que exista una amplia cobertura de vacunación en toda la población para que la inmunidad colectiva haga que disminuya el número de personas que padecen determinadas enfermedades infecciosas.

2.- CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS VACUNAS

Las dos propiedades principales que deben reunir una vacuna son la seguridad y la eficacia protectora. Esta última a su vez esta íntimamente relacionada con la inmunogenicidad. Otras cualidades importantes son la estabilidad frente a los factores ambientales en especial la Tª y la luz y un coste de producción bajo.

Las cinco propiedades fundamentales que debe reunir una vacuna son:

• Seguridad: es una propiedad fundamental en cualquier vacuna ya que estas deben de ser seguras incluso en individuos inmunodeprimidos lo cual no quiere decir que no puedan tener efectos secundarios.

• Inmunogenicidad: es la capacidad de un agente infeccioso de inducir inmunidad específica.

• Eficacia protectora: hace referencia a los resultados o beneficios de salud proporcionados por una vacuna o individuos vacunado cuando ésta es aplicada en condiciones ideales.

• Eficiencia: consiste en relacionar los resultados de salud de un programa de vacunación con los recursos movilizados para el desarrollo del programa, es decir, la efectividad vacunal.

• Estabilidad: es la resistencia a la degradación física de las vacunas que hace que mantenga sus propios inmunógenos.

3.- BASES INMUNOLOGICAS DE LAS VACUNAS

La inmunidad se desarrolla en el ser vivo cuando penetra en él una sustancia antigénica y esta provoca la producción de Acs por parte de los LB (inmunidad humoral) y la sensibilización de los LT que actúa a través de macrófagos y factores citotóxicos (inmunidad celular).

La inmunidad se puede adquirir natural o artificialmente.

• Inmunidad natural: puede ser activa y pasiva;

• Activa: se adquiere a través de una infección o enfermedad.

• Pasiva: se adquiere a través de los Acs de la madre que pasan al hijo por medio de la placenta o la leche.

• Inmunidad artificial: puede ser activa y pasiva;

• Activa: se consigue por medio de las vacunas estimulando la activación de Acs. El grado de inmunidad producido por una vacuna depende de la eficacia del Ag, de la naturaleza del Ag, dosis aplicada, vía de administración, reacciones individual.

• Pasiva: se administra directamente Acs (Ig y sueros) que permiten una respuesta inmediata frente a la infección al evitar el tiempo de latencia entre la inoculación del Ag y la presencia de los Acs correspondientes. Hay que tener en cuenta que tras unas semanas se pierde la protección porque los A son metabolizados por el receptor. Algunas Ig de probada eficacia son antitetánica, antihepatitis A, antihepatitis B, antirubéola (en embarazadas), antisarampiosa (indicada especialmente en embarazadas, niños y adultos debilitados), etc.

4.- RESPUESTA PRIMARIA Y SECUNDARIA

La primera exposición de un huésped a un Ag inmunógeno se denomina inmunización primaria. La respuesta inmunitaria que le sigue (débil y de corta duración) es la respuesta primaria.

La segunda exposición al mismo Ag inmunógeno se conoce como inmunización secundaria y la respuesta generada más lenta y duradera que la 1ª es la respuesta secundaria anamnesica o booster.

La medición de la respuesta humoral (Ac séricos) es mas fácil que la respuesta celular (LTh y LTc) de ahí que la mayoría de los estudios sobre la cinética inmunitaria se hallan relacionado con la inmunidad humoral. Los resultados son extrapolables a la inmunidad celular ya que ambas son paralelas.

4.1.- Respuesta primaria

Se puede dividir en 4 fases:

• 1ª fase: periodo de latencia: es el tiempo que transcurre entre la exposición al Ag y la detección de Ac en el suero. Los humanos dura de 5 a 10 días este es el tiempo que los LTh y LB tardan en ser activados es decir, en tomar contacto con el Ag proliferador y diferenciarse.

• 2ª fase: exponencial: es esta fase se produce un incremento exponencial en la concentración de Ac en el suero reflejando un importante incremento en el nº de células plasmáticas secretoras.

• 3º fase: fase de estabilidad: durante esta etapa el titulo de Ac permanece estacionado reflejando un equilibrio entre la producción y la degradación de Ac.

• 4º fase: fase de declinación: en esta ultima fase la concentración de Ac decrece progresivamente como reflejo del declive de la respuesta inmunitaria, no se produce nuevas células plasmáticas y las existentes mueren o dejan de producir Ac reflejando la progresiva eliminación del Ac.

En la respuesta primaria la 1ª clase de Ac detectados es por lo general Ig M, la cual en algunos casos es la única Ig producida. Si se secreta Ig G su aparición se acompaña de una rápida detección en la producción de Ig M.

4.2.- RESPUESTA SECUNDARIA

La reexposición al mismo Ag al cabo de un tiempo induce una respuesta inmune secundaria mucho más intensa y duradera que la primaria. El periodo de latencia es más corto (1-3 días). El incremento del título de Ac es más rápido y los niveles alcanzados son más elevados continuando la producción durante un largo periodo de tiempo. Además las dosis requeridas de Ag es menor y los Ac producidos son mayoritariamente de clase IgG .

Esta cinética más rápida, intensa y duradera de la respuesta secundaria se debe a que en ella intervienen las células Th2 y los LB de memoria producidas en grandes cantidades durante la respuesta inmune primaria. Precisamente lo que distingue a la respuesta primaria de la secundaria es la memoria inmunológica generada durante la respuesta primaria, la cual es específica y de larga duración. (ver tabla 4.2 y 4.3).

5.- CLASIFICACIÓN DE LAS VACUNAS

5.1.- CLASIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA

Según su composición y forma de obtención podemos distinguir:

• Vacunas con microorganismos vivos: Se denominan también vacunas atenuadas. Contienen microorganismos que han perdido su virulencia, bien mediante inoculaciones sucesivas en animales, por cultivo en líneas celulares o por medio de manipulación genética. Estas vacunas producen respuesta inmune (humoral y celular) de intensidad y duración mayor que las logradas con microorganismos muertos. En general es suficiente con una dosis y la inmunidad dura de por vida. Ejemplo: polio oral, rubéola, sarampión, BCG (tuberculosis), parotiditis y fiebre amarilla.

• Vacunas con microorganismos muertos: Se denominan vacunas inactivadas. Estas vacunas pueden ser de 3 tipos:

• Con virus y bacterias completas: que han sido inactivados por medios físicos (calor) o químicos (formol). Se recurre a este método cuando no se conoce exactamente la fracción inmunizante. Ejemplos: tos ferina, gripe, polio parenteral, fiebre tifoidea, cólera y rabia.

• Con Ag purificados: solo contienen una parte del germen, los Ag inmunizantes. A este grupo pertenecen las vacunas antimeningocócicas A y C, antihaemophylus influenzae B, antineumocócica y antihepatitis A y B obtenida a partir de polisacáridos de la cápsula bacteriana.

• Con toxoides y anatoxoides: las toxinas eliminadas por algunas bacterias se inactivan previamente por medio de calor, radiaciones ionizantes, formol, etc, e inducen la formación de Ac (antitixinas). Ejemplo: vacunas antitetánica y antidiftérica. El poder estimulante de vacunas antitóxicas se incrementa asociándolas a las vacunas bacterianas correspondientes o a sustancias coadyuvantes como hidróxido de aluminio, que enlentece la absorción del Ag con lo que facilita la capacidad inmunizante de éste. (ver cuadro 5.1.)

5.2.- CLASIFICACIÓN SANITARIA

• Vacunas sistémicas: Son aquellas incluidas en el calendario vacunal de una comunidad. Son las siguientes:

• Vacuna contra la difteria: La eficacia de las medidas preventivas ha conseguido la eliminación en los países industrializados. La difteria se transmite por contacto íntimos con enfermos o portadores a través de secreciones. Un 90-95% de los vacunados con 4 dosis de DTP adquieres niveles séricos de antitoxina diftérica que persiste inalterada durante 5 años. Las dosis se administran a los 2,4 y 6 meses de edad.

• Vacuna contra el tétanos: Las dosis se inyectan a los 2,4,6 y 18 meses y a los 6 y 14 años de edad.

• Vacuna contra la tos ferina: La tos ferina se contagia a través de secreciones. La inmunogenicidad es superior al 85% con tres dosis. Administración puede ser intravascular o subcutánea. Las dosis se inyectan a 2,4,6 y 18 meses y a los 6 años de edad.

• Vacuna contra la poliomielitis: La poliomielitis es una enfermedad vírica que presenta un amplio abanico de manifestaciones clínicas; puede ser asintomático o producir enfermedad febril inespecífica, meningitis y enfermedad paralítica pudiendo causar la muerte. La vía principal de transmisión es fecal-oral aunque también es posible por secreciones respiratorias y vía transplacentaria. La enfermedad puede contraerse a cualquier edad siendo los niños más susceptibles. En la vacuna de la polio oral la serie completa es de tres dosis que induce inmunidad prolongada frente a los 3 polio virus en el 100% de los vacunados. Las dosis se inyectan a los 2,4,6 y 18 meses de edad.

• Vacuna contra el sarampión: el sarampión es una enfermedad vírica transmitida por secreciones nasofaríngeas o gotículas y produce síntomas como fiebre, tos, rinitis, conjuntivitis y exantema (granos por todo el cuerpo). La inmunidad es del 95%.

• Vacuna contra la rubéola: La rubéola es una enfermedad vírica que se caracteriza por exantema, adenopatías y febrícula. Un problema más grave es la rubéola congénita (las anomalías en esta forma pueden ser oftálmicas, cardiacas, auditivas y neurológicas). Inmunidad del 98%.

• Vacuna contra la parotiditis: La parotiditis es una enfermedad vírica caracterizada por hinchazón de las glándulas salivares. Se transmite por gotículas y por contacto directo con la saliva de la persona infectada. La inmunidad es del 97-98%.

• Triple vírica: Constan las vacunas del sarampión, rubéola y parotiditis. La inmunidad es del 95%. Las dosis se inyectan a los 15 meses y a los 6 años.

• Hepatitis B: Se caracteriza por anorexia, nauseas, vómitos, astenia, astromialgias y cefaleas que pueden preceder a la ictericia. El virus se presenta en sangre, fluidos, líquidos orgánicos, lagrimas y saliva. La inmunidad es del 95-98%.

• Vacunas no sistémicas: Se entiende por vacunas no sistémicas aquellas que no están incluidas en el calendario vacunas de una comunidad. Son las siguientes:

• Vacuna contra la tuberculosis (BCG): La tuberculosis se transmite por vía respiratoria. Las personas vacunadas desarrollan una respuesta inmune a las 8-14 semanas tras la vacunación. El efecto protector dura aproximadamente 10 años. Administración por vía intradérmica.

• Vacuna contra el cólera: El cólera se transmite por agua y alimentos contaminados insuficientemente cocinados. La eficacia de la vacuna es de aproximadamente del 50% de la población vacunada. Tiene pobre inmunogenicidad con una corta duración de 6 meses.

• Fiebre amarilla: Producida por un virus. El vector es el mosquito Aedes aegypti, principalmente se da en zonas tropicales y subtropicales. La eficacia de la vacuna es del 100% y mantiene inmunidad durante 10 años.

• Fiebres tifoideas: Se transmite por el agua y alimentos contaminados. La eficacia es del 95-100% y la duración de la inmunidad es de 3-5 años.

• Gripe: Enfermedad viral de transmisión aérea. La eficacia de la vacuna es del 70-80% y se ha observado que la eficacia vacunal decae con la edad.

• Hepatitis A: Producida por el virus VHA que se replica en el hígado y se elimina en grandes cantidades por las heces, por lo que la principal vía de transmisión es la fecal-oral. Se administran 3 dosis y la eficacia protectora es del 95%. La protección se estima que perdura al menos durante 10 años.

• Vacuna contra el meningococo: Causa entre 500 mil y 600 mil muertes al año y afecta principalmente a lactantes y niños pequeños. Se vacuna contra el meningococo A y C y no es válida para el meningococo B. La protección contra el polisacárido A se mantiene durante 4 años después de la inmunización primaria y dosis de recuerdo. La vacuna contra el meningococo C es válida para niños menores de 24 meses. La vacuna bivalente A+C es más efectiva.

• Vacunación contra el neumococo: El único reservorio del microorganismo es el hombre. La diseminación se realiza por vía aérea o de manera indirecta por objetos recién contaminados con secreción de las vías respiratorias. La transmisión interpersonal es común pero la enfermedad entre los contactos causales es poco frecuente. Su eficacia es moderada con resultados que oscilan entre 45-70% manteniéndose niveles detectables de Ac durante 5 años.

• Rabia: Es una enfermedad viral que afecta al SNC y generalmente se transmite por la saliva de mamíferos. También se puede transmitir por aerosoles. Es una zoonosis que actualmente está erradicada en nuestro país.

6.- conservación de las vacunas

Generalmente refrigeradas entre 2-8ºC. Las vacunas atenuadas en la parte menos fría de la nevera y las inactivadas en la parte más fría de la nevera. Siempre es conveniente evitar estantes inferiores, la puerta y zonas cercanas al congelador.

7.- TÉCNICA DE ADMINISTRACIÓN DE VACUNAS

La administración de las vacunas puede ser por vía:

• oral

• intramuscular

• subcutánea

• intradérmica

8.- INTERVALO ENTRE VACUNAS Y OTROS PRODUCTOS INMUNOLÓGICOS

8.1.- INTERVALO ENTRE MÚLTIPLES DOSIS DEL Ag

Los intervalos de tiempo superiores alo establecido en el calendario vacunal no supone que se necesite reiniciar la pauta completa de la vacuna no que se deban administrar dosis adicionales, simplemente se ha de completar la serie establecida.

La administración de vacunas a intervalos de tiempo menores del mínimo recomendado pueden disminuir la respuesta inmune. En algunas circunstancias pueden dar lugar a elevadas reacciones adversas locales o sistémicas, probablemente debido a la formación de complejos Ag-Ac que se han de evitar.

8.2.- INTERVALOS ENTRE VACUNAS E Ig

• Vacunas de microorganismos vivos: En general no se deben administrar simultáneamente con Ig. Constituyen excepciones a esta regla las vacunas de la polio oral, fiebre amarilla y fiebre tifoidea que pueden darse en cualquier momento, antes, después o coincidiendo con algún producto que contenga Ig sin que disminuya de forma significativa la respuesta inmune. El intervalo mínimo que ha de transcurrir entre la administración no simultánea de una vacuna de Ag vivo y una posterior de Ig es de 2 semanas. En el caso de administrar primero las Ig el tiempo que ha de pasar hasta poder dar una vacuna de microorganismos vivos conteniendo virus de sarampión depende de la dosis.

• Vacunas con microorganismos muertos o toxoides: No hay inconveniente en administrar Ig antes, después o simultáneamente. En este último caso se deben poner vacuna e Ig en distintos lugares.

8.3.- Intervalo entre diferentes vacunas

Las vacunas inactivadas no suelen interferir con la respuesta inmune a otras vacunas inactivadas o a vacunas de microorganismos vivos por lo que pueden administrarse en cualquier momento, antes, después o simultáneamente unas de otras. La única excepción sería la administración de vacunas frente a la fiebre amarilla o el cólera que no debe de hacerse a la vez.

En teoría en caso de que no se administre de forma simultanea, la respuesta inmune a una vacuna de Ag vivo podía verse disminuida por la administración de otras vacunas de Ag vivo con un intervalo menor de 30 días, aunque no hay datos que avalen este concepto, de todas formas es preferible espaciar las administraciones al menos 4 semanas.

No hay inconveniente en administrar 2 vacunas de Ag vivos de manera simultánea.

8.4.- Intervalo de las vacunas con otros medicamentos o tratamientos

Es posible que un paciente que acude a vacunarse este sometido a --------------------------------

La combinación de vacunas con productos hematicos o plasma así como el padecimiento de alguna inmunodeficiencia son aspectos muy importantes a la hora de establecer intervalos entre unos y otros, ya que pueden limitar la respuesta de la vacunación.

9.- CONSIDERACIONES GENERALES, SEGURIDAD, PRECAUCIONES Y CONTRAINDICACIONES DE LAS VACUNAS

• No se debe inmunizar en zonas donde se observan signos locales de inflamación.

• Las vacunas reconstituidas si no se utilizan deben desecharse ya que su actividad una vez reconstituidas es de 1 hora.

• Debemos tener en cuenta los beneficios obtenidos tras la inmunización y ver si superan los posibles efectos adversos de la misma, si es así se procederá a la vacunación.

• Contraindicaciones absolutas de la vacunación general

• Si la fiebre es superior a 38 º C

• Enfermedades infecciosas agudas con fiebre superior a 38 º C o trastornos considerados importantes por el medico.

• Alteraciones inmunitarias.

• Niños afectados por trastornos neurológicos evolutivos.

• Hipersensibilidad a los componentes de las vacunas.

• Procesos malignos en fase evolutiva.

• Cardiopatías descompensadas.

• Contraindicaciones en el embarazo: Lo ideal seria que las mujeres estarían debidamente inmunizadas antes de quedarse embarazada. La gestación supone una situación en la que los riesgos de las vacunas aumentan por ello ha de tenerse en cuenta lo siguiente:

• no administrar vacunas vivas

• en general ninguna vacuna en el primer trimestre

• esta indicada la antitetánica en el segundo trimestre

• Contraindicaciones en alergias: La anafilaxia se manifiesta generalmente como consecuencia de una sensibilidad previa a los componentes vacunales tales como: el Ag principal, los componentes animales del medio de cultivo (nuevo), Ab, conservantes, excipientes, estabilizantes,etc.

• Falsas contraindicaciones: Son más numerosas y frecuentes que las verdaderas. Se consideran falsas contraindicaciones:

• niños que están tomando Ab

• esteroides a baja dosis

• dermatosis, eccemas o infecciones cutáneas localizadas

• prematuridad

• historia de alergias inespecíficas

• antecedentes familiares de convulsiones

• lactancia materna

• síndrome de Down

• malnutrición

• calor veraniego

• la madre del niño este embarazada

• historia familiar de muerte súbita infantil

• tratamientos de sensibilización

• diabetes

• Efectos secundarios de las vacunas: Las reacciones vacunales son muy variadas y el pronóstico oscila entre ser una simple molestia hasta graves secuelas o muerte. Las reacciones más frecuentes son leves o moderadas y son muy raras las secuelas permanentes. Se pueden clasificar de la siguiente forma:

• Reacciones locales: Pueden aparecer tras la aplicación de cualquier vacuna más frecuentemente relacionada con la DTT y a la vacuna contra las fiebres tiroideas. Aparece dolor, enrojecimiento, induración, edema, inflamación, etc. en el lugar dela inyección que desaparece espontáneamente, también pueden dar lugar a pápulas y vesículas localizadas. En algunos casos se producen abscesos estériles en el lugar de la inyección, sobretodo tras vacunas de virus inactivados.

• Reacciones sistémicas: Si aplicamos vacunas intramusculares puede aparecer un cuadro de mareo e hipotensión secundaria que no debe interpretarse como un efecto adverso de la vacuna. Tras la vacunación inmediatamente o en un corto periodo de tiempo debe vigilarse la aparición de cualquiera de las siguientes alteraciones:

• Adenopatías.

• Reacción alérgica, considerada como la presencia de urticaria, espasmo bronquial, edema localizado o generalizado.

• Erupción cutánea.

• Anafilaxia, cuadro grave que produce edema de glotis con diseña, estado de shock y colapso cardiovascular o respiratorio.

• Reacción de hipotonía e hipoactividad, definido como la disminución o perdida del tono muscular, palidez, cianosis, disminución o perdida de conciencia con o sin parada cardiocirculatoria.

• Somnolencia.

• Artritis.

• Vómitos o diarreas.

• Trombocitopenia.

• Fiebre.

• Reacciones neurológicas: Se han descrito diversos cuadros neurológicos relacionados con las vacunas aunque no en todos ellos se ha podido demostrar una verdadera reacción causal. Se deben conocer, vigilar y comunicar cualquiera de las siguientes alteraciones:

• Llanto persistente.

• Convulsión.

• Encefalopatías (requiere diagnóstico médico).

• Meningitis (requiere diagnóstico médico).

• Anestesia.

• Parálisis.

• Reacciones secundarias a la mala utilización de las vacunas: Pueden ser debidas a :

• Haber utilizado material o un producto inmunizante contaminado o en malas condiciones de conservación.

• La administración de la vacuna a un grupo de edad inapropiado.

• Administración de la vacuna sin tener en cuenta sus precauciones, vías de administración, posología y calendario vacunal.

• Reacciones de hipersensibilidd.

• Reacciones idiosincrásicas.

10.- Calendario vacunal

(Fotocopia)

11.- Vacunas y viajes INTERNACIONALES

(Fotocopia)

12.- Consideraciones médicas después del viaje

Los síntomas a tener en cuenta para la consulta médica son:

• fiebre de cualquier tipo, especialmente intermitentes.

• Mal estar general con dispepsias y nauseas.

• Diarreas repetidas.

• Tos persistente, especialmente con expectoración.

• Hepatalgia (dolor de hígado), especialmente ictericia.

• Alteraciones urinarias.

• Manifestaciones cutáneas.

• Ulceras principalmente en las áreas genitales y perianales.

13.- Características de la vacuna ideal

• Reproducir una respuesta inmunológica similar a la dela infección natural.

• Efectividad superior al 90%.

• Mínimos efectos secundarios y completamente segura.

• Inmunidad persistente a largo plazo.

• Dosis única y compatible con otras vacunas.

• Administración no invasiva (vía oral preferentemente).

• Administración precoz en los primeros meses de vida.

• Estable a temperatura ambiente.

• Fácil producción y económicamente asequible.

14.- Vocabulario relacionado con vacunas

(Fotocopias)

Microbiología

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