Microbiología

Ciencias Ambientales. Microorganismos. Tinciones. Análisis de aguas. Leguminosas. Eucariotas

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PRÁCTICAS DE MICROBILOGÍA

Lunes, 10 de octubre

1.- Normativa de seguridad a tener en cuenta mientras se trabaja en el laboratorio (fotocopia de prevención de riesgos en laboratorios).

Trabajando con microorganismos es muy importante tener estos aspectos bien claros ya que el material a utilizar (que no va a ser nuestro caso) puede ser patógeno.

-La higiene y el orden tienen que ser máximos durante la realización de las distintas prácticas. Nunca debemos olvidarnos de lavar bien las manos antes de salir del laboratorio y mientras estemos dentro no debemos ingerir ningún alimento (mascar chicle, beber,…) ni poner nada en contacto con la boca.

-Procuraremos trabajar en condiciones de esterilidad máxima; para ello trabajaremos cerca de la llama.

2.- Aparatos a utilizar en el laboratorio:

-Destiladora: nos proporciona agua pura que vamos a utilizar.

-Horno Pasteur.

-Estufa: la utilizaremos para poner a incubar los distintos cultivos de microorganismos que vayamos a realizar.

-Autoclave: este instrumento nos permite realizar los procesos de esterilización necesarios. Funciona a una sobrepresión de 1 atm consiguiendo vapor de agua a temperaturas cercanas a los 150C para que la esterilización sea completa en un tiempo de aproximadamente 20 min.

-Microondas.

-Frigorífico y máquina de hielo.

-Campana de flujo.

-Máquina de baño maría.

3.-Manejo del microscopio

Martes, 11 de octubre: Preparación de 100ml de medio de cultivo.

1.-Material

-Vaso de precipitados.

-Botella de vidrio.

-Placas de Petri.

-Probetas.

-Cinta indicadora.

-Autoclave.

-Medidor de pH.

-Agua.

-Nutrientes: -0.1g de triptona.

-0.5g de extracto de levadura.

-0.1g de NaCl.

-2g de agar (medio sólido).

2.-Procedimiento:

a) Coger un vaso de precipitados y llenarlo con una cantidad de agua de aproximadamente 75ml.

b) Pesar las cantidades indicadas de los componentes que van a proporcionar los nutrientes al medio de cultivo. Verterlos en el vaso de precipitados y agitar hasta que se disuelvan los componentes.

c) Pasar el contenido del vaso de precipitados a una probeta y enrasar con agua a 100ml.

d) Ajustar el pH con el pH-ímetro a 7.5:

-si la medida es superior añadiremos unas gotas de ácido (HCl) a la vez que se agita la mezcla para que sea homogénea.

-si la medida es inferior añadiremos unas gotas de base (NaOH) del mismo modo.

e) Verter el contenido en una botella para medio de cultivo.

f) Pesar el agar y añadirlo en la botella para obtener el medio sólido.

g) Cerrar la botella sin llegar al tope máximo de la rosca ya que en el autoclave va estar sometida a presión.

h) Pegar en la botella cinta indicadora y escribir con un marcador permanente el nombre del medio de cultivo.

i) Introducir en el autoclave a 120C y 1atm de presión durante 20min.

j) Retirar del autoclave la botella transcurrido el tiempo indicado e introducir en el baño maría para que se vaya enfriando hasta 50-60C y poder manipularlas sin ningún problema.

Jueves, 13 de octubre: Manejo de microorganismos-siembra

Al trabajar con microorganismos lo haremos bajo estrictas condiciones de esterilidad, en nuestro caso siempre cerca de la llama del mechero.

Los medios de cultivo pueden ser:

-Sólidos: pueden estar en placas de Petri o en tubos.

En los tubos el agar está inclinado, se denomina slant.

-Líquidos.

Los microorganismos sembrados en medio sólido con agar suelen crecer sobre la superficie del medio que para ellos el líquido, el agua del que toman los nutrientes.

Cada colonia proviene de una única célula, esto se asume de forma general porque en realidad no siempre es así ya que las parejas, cadenas, tétradas y demás asociaciones se dividen en grupos.

La célula progenitora se divide hasta hacerse microscópicamente visible.

1.-Técnicas de sembrado:

Antes de comenzar a sembrar colocaremos todo el material que vayamos a utilizar de tal manera que tengamos todo al alcance y colocado.

SIEMBRA EN SLANT: es una técnica de sembrado en masa ya que no hay individualidad de los microorganismos. Puede realizarse en dos zonas:-

-picopato: crecen los microorganismos aerobios.

-picadura: crecen los microorganismos anaerobios.

Procedimiento:

-Esterilizar el asa de siembra en la llama (en el punto donde se une la parte de llama azul con la parte amarilla).

-Abrir la placa donde tengamos el cultivo que queremos sembrar cerca de la llama para evitar que se contamine.

-Coger una colonia con el asa de siembra.

-Cerrar la placa.

-Abrir el tubo donde vamos a realizar la siembra cerca de la llama y pasar la boca del mismo suavemente por la llama para acabar con los posibles organismos que pueda tener.

-Realizar el sembrado introduciendo el asa de siembra en el tubo empezando por la parte inferior de la superficie del medio e ir agitando el asa suavemente hacia la parte superior manteniendo siempre el asa en contacto con el medio (sembrado en el picopato).

-Esterilizar otra vez la boca del tubo y cerrar.

-Esterilizar el asa de siembra.

-Rotular el nombre del cultivo con un marcador permanente.

-Introducir el cultivo en la estufa a incubar durante 24h.

SIEMBRA EN AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO: se utiliza para mantener la individualidad de los microorganismos.

-Esterilizar el asa de siembra.

-Abrir la placa con las colonias cerca de la llama.

-Coger una colonia con el asa.

-Cerrar la placa.

-Coger la placa donde tengamos el medio en el que vamos a realizar la siembra y abrirla cerca de la llama.

-Empezar sembrando en una “esquina” dibujando una estría.

-Esterilizar el asa.

-Realizar otra estría empezando en el final de la primera estría y girando la placa.

-Esterilizar el asa.

-Realizar otra estría del mismo modo y repetir el procedimiento unas 3 ó 4 veces más, siempre esterilizando el asa entre una y otra estría.

-Cerrar la placa y rotularla con el nombre del cultivo.

-Poner en la estufa a incubar.

Si se realiza correctamente obtendremos un microorganismo aislado.

2.- Determinación del número de ufc´s de una suspensión microbiana.

Ufc´s: unidades formadoras de colonias.

Esta técnica se utiliza para determinar la carga microbiana de un medio determinado, es decir, el número de microorganismos viables presentes en la muestra.

p.ej: yogur fresco­!108 ufc´s/ml

-Las ufc´s se calculan realizando diluciones en tubos eppendorf utilizando como diluyente una solución isotónica de NaCl al 9%.

a) Con una micropipeta coger un volumen de 900µl de la solución isotónica e introducirla en un tubo eppendorf.

b) Con una micropipeta coger un volumen de 100µl de la suspensión microbiana e introducirlo en el tubo donde depositamos la solución.

Esta primera dilución será la 10-1.

c) Coger 100µl de la dilución preparada e depositarlos en otro tubo eppendorf , añadir 900µl de solución isotónica.

Esta será la dilución 10-2.

d) Coger 100µl de la dilución interior y añadirle 900µl de solución obteniendo así la dilución 10-3.

e) Por último preparar del mismo modo la dilución 10-4.

f) Una vez realizadas las diluciones se cogen 100µl de cada una de ellas y se siembran en placas de Petri con la ayuda de un asa Digrasky (se prepara con una pipeta Pasteur a la que se le aplica calor con la llama en determinados puntos para que quede la siguiente forma ).

g) Marcar en cada una de las placas el número de la dilución que hemos sembrado.

h) Incubar a 37C en la estufa durante toda la noche.

Lunes, 17 de octubre:- Recuento de ufc´s. Tinciones.

El recuento de las ufc´s se realizará en las placas que hemos sembrado con las diluciones de la práctica anterior.

Para realizar el recuento escogemos una placa que tenga entre 30-300 colonias:

  • Suponer que en la placa 10-4 tiene 300 colonias:

  • 10-4! 4 x 300 colonias = 1.200 colonias

    100µl___________________________1.200 colonias

    1.000µl________________________12.000 colonias

    12.000 colonias x 1/10-4 = 120.000.000 colonias/ml.

    Tinciones:

    1.- Azul de metileno: es una tinción simple.

    a) Extensión: coger microorganismos con el asa de siembra previamente esterilizada y extenderlos en un porta tras haber puesto una gota de agua.

    b) Fijación con medios físicos, en este caso calor: pasar el porta cerca de la llama suavemente hasta que se evapore todo el agua; utilizar una pinza para coger el porta y evitar posibles quemaduras.

    c) Colocar el porta sobre la rejilla situada en sobre un bol.

    d) Cubrir el porta con azul de metileno.

    e) Esperar durante 5 minutos.

    f) Lavar bien con agua.

    g) Secar al aire

    h) Observar al microscopio poniendo una gota de aceite de ricino en el porta.

    2.- GRAM:- tinción diferencial

    a) Realizar la extensión y fijación del mismo modo que en la tinción anterior.

    c) Colocar el porta en la rejilla situada sobre el bol.

    d) Tratar con cristal violeta durante 2min.

    e) Lavar con agua las dos caras del porta.

    f) Tratar con lugol (solución de KI2) durante un minuto.

    g) Lavar con agua.

    h) Tratar con etanol (C2H5OH) añadiendo cuatro gotas; este es el punto crítico de la tinción diferencial:

    Gram + ! violeta

    Gram - ! rojo

    i) Lavar con agua.

    j) Teñir con safranina (colorante de contraste que permite ver los gram -) durante 30 segundos.

    k) Lavar con agua.

    l) Secar al aire.

    m) Observar al microscopio añadiendo una gota de aceite de ricino.

    Martes, 18 de octubre:- Análisis de aguas.

    Se realiza mediante microorganismos indicadores que deben de cumplir una serie de características:

    -Debe ser indicador en todos los tipos de aguas.

    -Siempre debe estar presente cuando haya patógenos intestinales.

    -El microorganismo indicador debe sobrevivir más que el patógeno.

    -No debe dividirse en el agua porque sino daría una carga microbiana mayor que la normal.

    -Deben existir pruebas altamente específicas para determinar su presencia y con una alta sensibilidad (capaces de detectar una baja concentración de microorganismos).

    -El análisis debe ser lo más sencillo posible.

    -E microorganismo testigo debe ser inocuo.

    -El grado de contaminación del agua donde se encuentra la bacteria elegida debe guardar relación con la contaminación fecal.

    El análisis de agua, se utiliza como indicador fecal del contenido en coliformes

    Coliformes: enterobacterias, gram - no esporuladas que fermentan lactosa.

    Son anaerobios facultativos:

    Escherichia coli: indica contaminación fecal (restos de organismos de sangre caliente)

    Enterobacter aerogenes

    Klebsoella pneumoniae: puede tener origen ambiental.

    Existen varias formas para detectar coliformes:

    -FILTRACIÓN POR MEMBRANAS: método recomendado por la FDA.

    Consiste en filtrar 100µl de agua por una membrana.

    -DETECCIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP): fue recomendado por la OMS.

    Se basa en la detección de medios selectivos o diferenciales.

    Se emplean 15 tubos clasificados en 3 grupos:

    5 tubos: 2x (medio concentrado 2 veces)

    5 tubos: 1x

    5 tubos: 1x

    Se utiliza como medio el caldo de McConkey que contiene:

    Peptona de Caseína

    Lactosa

    Sales biliares

    Púrpura de Bromocresol: indicador de pH

    El caldo de McConkey es un medio:

    -selectivo: sólo permite el crecimiento de un grupo, las sales biliares inhiben la presencia de gram +.

    -diferencial: sólo lleva lactosa como fuente de carbono por lo que sólo permite la presencia de microorganismos que fermentan lactosa; la fermentación acidifica el medio que se vuelve amarillo.

    Los coniformes generan gas que se percibe en las burbujas que se genera en la campana de Durham (tubito situado en el interior de los tubos 2x)

    Procedimiento: en nuestro caso utilizaremos una muestra de agua recogida en el río Bernesga.

  • Inocular los 5 tubos 2x con 10ml del agua de muestra (coger utilizando siempre el pipetero).

  • Inocular los 5 tubos 1x con 1ml de agua de muestra.

  • Inocular los 5 tubos 1x con 100µl de agua de muestra.

  • Fase presuntiva: incubar los tubos a 37ºC durante 24 horas en la estufa.

    Una vez transcurrido el tiempo de incubación los tubos que resulten positivos presentan las siguientes características:

    -color amarillo

    -gas en la campana Durham.

    La determinación de la carga de coniformes se realiza mirando unas tablas que indican el número más probable.

    En la fase presuntiva los tubos positivos suelen seguir dos caminos al inocular un tubo positivo en 2 medios McConkey:

    1º/ a 44ºC durante 24h: si el resultado es positivo identifica fecales (sólo Escherichia coli puede fermentar lactosa a esta temperatura).

    2º/ a 37ºC durante 24h: si el resultado es positivo confirma fecales.

    La confirmativa se pasa a un medio E.M.B donde obtendremos colonias aisladas y se siembran en dos medios para confirmar:

    -gram -

    -fermenten lactosa

    -presenten morfología bacilar

    !Preparar 5 tubos eppendorf

    900µl de agua estéril + 100µl de muestra

    !Inocular 0'1ml

    RESULTADO: positivo!tubos amarillos y con gas en la campana Dirham.

    Realizar la prueba confirmativa para saber si son fecales o coliformes.

    Los coliformes sobreviven poco tiempo en el agua. Debido a las últimas lluvias se han producido filtraciones.

    Miércoles, 19 de octubre: Sistema miniaturizado para la determinación de microorganismos.

    Esta prueba se basa en pruebas bioquímicas, concretamente en reacciones enzimáticas.

    Las características bioquímicas de un microorganismo son propias, por eso se necesitan un gran número de pruebas para determinar un microorganismo.

    Especie: conjunto de cepas con una serie de características biológicas comunes que se diferencian de otro conjunto de cepas. Deben tener un 97% de ARNr 16s como mínimo.

    SISTEMA API-20: desarrollado por los laboratorios Api.

    Identifica enterobacterias y otros bacilos gram - no exigentes que deben estar en buenas condiciones fisiológicas.

    El sistema consta de 23 pruebas bioquímicas:

    20 en la tira

    3 pruebas auxiliares que sólo se realizan en caso de duda y están indicadas por el manual.

    El sistema miniaturizado consta de:

    *tubitos con los reactivos deshidratados en los que se inocula el microorganismo durante un tiempo. Esto provocará un cambio de color del que deduciremos el número de 7 dígitos que va a identificar el microorganismo.

    *manual: al localizar el microorganismo obtendremos dos parámetros:

    % de identificación: probabilidad de que el microorganismo sea el correcto.

    Índice T: indica como de próximas están las características del microorganismo que estamos identificando a las características propias del taxón de la especie. Varía de 0 a 1 (1 implica todas las características).

    En función de estos parámetros obtendremos 5 niveles de identificación:

    -Excelente: % identificación >99'9%

    Índ. T " 0'75

    -Muy bueno: % identificación > 99%

    Índ. T " 0'5

    -Aceptable: % identificación > 80%

    Índ. T " 0'25

    -Bajo nivel de discriminación: % identificación < 80%

    Índ. T < 0'25

    PROCEDIMIENTO

  • Preparar una suspensión bacteriana:

  • -Coger una colonia con el asa.

    -Suspender la colonia en un tubo con 5ml de NaCl 0'9%.

    -Deshacer la colonia agitándola hasta que no queden grumos.

    b) Crear un ambiente húmedo en la tira para evitar la deshidratación, para ello se crea una atmósfera saturada en vapor de la siguiente forma:

    -Introducir agua en los pocillos de la tira con la micropipeta

  • Inocular la galería, que consta de tubo (parte inferior) y cúpula (parte superior), de la siguiente forma:

  • -Acrónimos con cuadrado: llenar el tubo y la cúpula con suspensión microbiana (VP, CIT, GEL).

    -Acrónimos subrayados: llenar el tubo con la suspensión microbiana y la cúpula con aceite mineral para crear un ambiente anóxico (ADH, LDC, ODC, URE)

    -Resto: llenar el tubo de suspensión microbiana.

    c) Colocar la galería de pie, perpendicular a la mesa, para rellenar los tubos. Soltar el líquido tocando la punta de la pipeta con la pared para no formar burbujas.

    d) Llenar con suspensión las cúpulas de las pruebas subrayadas.

    e) Tapar la galería.

    f) Rotular el nombre en la prueba.

    g) Introducir en la estufa a 37ºC

    Jueves, 20 de octubre: Lectura del sistema API-20

    Hay que formar un número de 7 dígitos:

    *cada 3 pruebas 1 dígito.

    *últimas 2 pruebas 1 dígito.

    Se le asignan los siguientes valores a las pruebas:

    1-2-4/1-2-4/1-2-4/1-2-4/1-2-4/1-2-4/1-2

    El dígito se forma sumando sólo los valores positivos (el máximo valor va a ser 7 y el mínimo 0)

    PRUEBAS:-

    1.- ONPG: identifica -galactosidasa.

    Es un análogo cromágeno de la galactosa.

    Amarillo: +

    Incoloro: -

    2.- ADH: argina deshidrogenasa.

    3.- LDS: lisina.

    4.- ODC: ornitina descarboxilasa.

    Estas tres pruebas si son de color amarillo indican +, lo da un indicador de pH.

    5.-CIT: utiliza como medio agar de Simmons que lleva citrato como fuente de carbono.

    Azul verdoso: +

    Verde pálido: -

    6.- Prueba de producción de H2 S.

    Algunos microorganismos liberan H2 S en la respiración anaeróbica; si hay sales de Fe en el medio se forma un precipitado de color negro.

    Precipitado negro: +

    Incoloro: -

    7.- Prueba de la ureasa, esta enzima permite utilizar a los microorganismos urea como fuente de nitrógeno:

    urea!2NH3 + CO2 ! aumenta el pH

    Rojo anaranjado/ rosa: +

    Amarillo: -

    8.- Prueba del TDA (triptófano desaminasa)

    9.- Prueba del IND (producción de indo)

    10.- Prueba del V P

    Estas tres pruebas necesitan un revelado.

    11.- GEL: gelatinasa, polímero de naturaleza proteica.

    Técnica rápida de la gelatina de Kohn, implica la presencia de un pigmento negro embebido en la gelatina.

    Todo negro: + (gelatina hidrolizada)

    Punto negro: -

    12.- Glucosa.

    13.- Manitol.

    14.- Inositol.

    15.- Sorbitol.

    16.- Ramnosa.

    17.- Sacarosa.

    18.- Melibiasa.

    19.- Amigdalina

    20.- Arabinosa.

    Estas ocho pruebas son las de los carbohidratos, se leen todas de la misma forma, ya que cuando se utiliza alguna de estas fuentes de carbono el medio se acidifica.

    Amarillo: +

    Azul verdoso/ azul: -

    *En el caso de la glucosa también se considera + si el resultado es amarillo grisáceo.

    Pruebas a determinar:

    TDA: el triptófano al desaminarse forma un derivado del pirúvico que se detecta añadiendo FeCl3.

    Marrón rojizo: +

    VP: Voges Proskaver: muy utilizada en enterobacterias que pueden lleva a cabo dos tipos de fermentaciones.

    El 2,3-butanodiol libera acetoína que es detectada x el VP al añadir potasa (KOH) más el acelerador -naftol y e forma un diacetilo que reacciona con sustancias del medio y da un compuesto de color rojo.

    Añadir KOH 10M y -naftol (tóxico por inhalación).

    Rojo: +

    INDOL: detecta triptofanosa que actúa sobre el triptófano liberando indol, ácido pirúvico y amoniaco.

    Añadir reactivo de Kovacks (paradimetil amino pentaldehido) disuelto en alcohol isoamílico.

    Rojo en la fase superior: +

    Incoloro: -

    RESULTADOS:

    1-ONPG +

    2-ADH -

    4-LCD +

    1-ODG -

    2-CIT +

    4-H2S -

    1-URE -

    2-TDA -

    4-IND -

    1-VP +

    2-GEL -

    4-GLU +

    1-MAN +

    2-INO +

    4-SOR +

    1-RHA +

    2-SAC +

    4-MEL +

    1-AMY +

    2-ARA +

    Nº IDENTIFICACIÓN: 5205773

    Manual!resultado: baja discriminación, porcentajes de discriminación:

    K. pneumoniae ___________________ 85'2%

    Enterobacter aerogenes _________ 12'7%

    Klebsiella oxytoca ________________ 1'5%

    Viernes, 21 de octubre: Interacción entre Rhizobium y leguminosas

    La mayor parte del nitrógeno se encuentra en forma molecular N2 (gas) constituyendo el 80% de la atmósfera. Sólo algunos microorganismos son capaces de convertir el nitrógeno para fijarlo:

    N2 ! NH3

    Algunos de los microorganismos que pueden realizar esta acción son los que se unen en simbiosis con las leguminosas, los rizobios.

    Las leguminosas desarrollan nódulos en las raices en los que tiene lugar la fijación de nitrógeno, gracias a esta capacidad pueden crecer en suelos pobres en nitrógeno y contribuyen a su fertilización.

    La familia de las leguminosas, Fam. Fabaceae se divide en tres subfamilias:

    -Papilionoideae: el 95% son noduladas.

    -Mimosoideae: el 85% son noduladas.

    -Caesalpinioideae: el 5% son noduladas.

    Los rizobios pertenecen al grupo de las -proteobacterias, son gram +. Se distribuyen en seis géneros:

    -Sinorhizobium.

    -Rhizobium.

    -Azorhizobium.

    -Bradyrhizobium.

    -Allorhizobium.

    -Mesorhizobium.

    Cuando establecen simbiosis pueden formar dos tipos de nódulos:

    -DETERMINADOS: presentes en especies como haba, soja.

    Son nódulos globulares.

    -INDETERMINADOS: presente en especies como el trébol.

    Nódulos alargados con meristemo apical persistente.

    ¿Cómo se establece la relación?

    Existen rizobios capaces de infectar a un rango determinado de especies y otros que pueden infectar cientos de especies.

    La planta emite flavonoides para que el rizobio reconozca si son compatibles y que además atraen a los rizobios hacia la rizosfera (efecto quimiotactal).

    La señal básica de los rizobios son los factores de nodulación (factores NOR).

    Las bacterias se anclan en la punta del pelo de la raíz produciéndose una liberación masiva de los factores de nodulación.

    Se produce el curvi: curvamiento del pelo radical (inducido por los factores NOR).

    Desde la punta del pelo de la raíz se forma el hilo infectivo (crece desde la punta del pelo de la raíz). Está inducido por los factores NOR.

    Simultáneamente se dividen las células del córtex formando un nódulo.

    Los rizobios penetran a través del hilo infectivo donde se dividen, activan y pasan al interior de las células del córtex por endocitosi; una vez dentro se denominan bacteroides.

    Los bacteroides están rodeados por una membrana peribacteroide; al conjunto se le denomina simbiosoma.

    El simbiosoma se divide para dar las distintas morfologías:

    p.ej: alargadas: incrementan su tamaño treinta veces.

    Los nódulos presentan lec-hemoglobina (proteína) que regula la presencia de oxígeno en el nódulo.

    OBSERVACIÓN DE NÓDULOS

    Procedimiento:-

    a) Recoger una leguminosa, en nuestro caso, trébol.

    b) Lavar bien las raíces.

    c) Extraer los nódulos y ponerlos en una placa de Petri con agua durante unos minutos.

    d) Retirar los nódulos y colocarlos sobre un porta.

    e) Aplastar los nódulos con la ayuda de otro porta.

    f) Añadir una gota de agua; realizar primero la extensión y luego la fijación.

    g) Aplicar azul de metileno durante cinco minutos.

    h) Lavar el porta.

    i) Observar al microscopio añadiendo una gota de ricino.

    Lunes, 24 de octubre: Observación microscópica de microorganismos eucariotas.

    Eucariota: nuevo núcleo

    Los microorganismos eucariotas tienen un tamaño más grande por lo que son visibles a 10x o 20x.

    1.-Levaduras: la pared celular es visible.

    Las vacuolas dependen del estado de envejecimiento, cuanto más vieja sea la levadura más vacuolas tendrá.

    Cada vez que la levadura gema deja una pequeña cicatriz que se ve con el microscopio electrónico.

    ¿Cómo se sabe la viabilidad de las levaduras?

    La viabilidad es la capacidad de estar vivo y generar nuevos individuos.

    Procedimiento:-

    a) En un tubo eppendorf depositar 500µl de la suspensión de la quequeremos conocer la viabilidad y 500µl de azul de metileno.

    b) Agitar suavemente durante 10 minutos.

    c) Coger una muestra con la micropipeta y ponerla sobre un porta.

    d) Tapar con un cubre y añadir una gota de aceite de ricino para observar al microscopio.

    Resultado: -levaduras viables: no se tiñen porque la pared celular no es

    permeable.

    -levaduras muertas: se tiñen de azul ya que la pared deja de ser permeable.

    CÁMARA CUENTAGLÓBULOS O CÁMARA DE TOMA.

    Se utilizan para contabilizar los microorganismos.

    2.-Hongos filamentosos: son hongos fitopatógenos.

    -Son como pelos.

    -Son hialinos, es decir, transparentes.

    -Pueden ser septados (tabicados) con pequeñas abertura por las que pueden pasar los núcleos.

    -Pueden ser cenocíticos, con varios núcleos.

    A) Bothrytis cinerea

    Esporulacion semejante a un racimo de uvas.

    Es difícil ver los núcleos, se necesitan tinciones.

    B) Colletocrichum

    Produce antracnosis que causa daños en los árboles frutales.

    Esporula en acérvulos: formas redondeadas de color naranja.

    Las esoporas son alargadas.

    C) Aspergillus sp.

    Esporula en forma de maza.