Microbiología

Grupos microbianos. Microorganismos. Células. Citología. Microbios. Procariotas. Eucariotas. Microscopio. Metabolismo microbiano. Genética. Agentes antimicrobianos

  • Enviado por: Manuel
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1. Análisis comparativo de los principales grupos microbianos.

Las células se pueden dividir en dos grandes grupos: las procariotas (del griego, núcleo primitivo) y las eucariotas ( del griego, núcleo verdadero). Las células eucariotas contienen un núcleo formado por una membrana nuclear que contiene en su interior múltiples cromosomas y un aparato mitótico que garantiza el reparto equitativo de estos últimos, una vez que se han replicado, a cada una de las doscélulas hijas. El cromosoma único procariota no precisa un aparato mitótico y no está rodeado por una membrana nuclear.

Otra notable diferencia es que, en los genes de las eucariotas abundan los intrones (regiones no traducidas) que están prácticamente ausentes en las procariotas. Aunque esta característica parecía indicar que los genes procariotas son más primitivos, es llamativo el hecho de que los intrones también son raros en las células eucariotas de las levaduras. Por ello, se ha propuesto que los intrones aparecieron en fases tempranas de la evolución con objeto de acelerar la recombinación de dominios proteicos y expandir el genoma, pero que en los organismos que dedican la mayor parte de su energía a la replicación celular el coste de mantenimiento de los intrones no justifica sus ventajas.

Las mitocondrias de las células eucariotas y los cloroplastos que llevan a cabo la fotosíntesis en los vegetales son parecidos a bacterias en cuanto a la estructura circular simple de sus cromosomas y en cuanto al yamaño, secuencias de RNA y sensibilidad a los antibióticos de sus ribosomos. Parece que estas estructuras han evolucionado a partir de procariotas que penetraron en las células eucariotas estableciendo una simbiosis. La gran abundancia de ejemplos de endosimbiosis que se conocen actualmente apoyan esta suposición: en el interior de las células de muchos protozoos, vegetales y animales se encuentran bacterias típicas, capaces de vivir de forma independiente, llevando a cabo procesos beneficiosos para el hospedador. Algunos ejemplos son la digestión de la celulosa en insectos y la fijación del nitrógeno en las raíces vegetales.

Los procariotas y los eucariotas se encuentran separados por ungran salto evolutivo siendo la evolución de los últimos la agregación, diferenciación y especialización celular, más que en cambios radicales del diseño celular. Por ello, las levaduras se utilizan ampliamente para el estudio de la genética molecular de los eucariotas, ya que presentan las ventajas experimentales de los organismos unicelulares.

Quimiorganótrofo: Se engloban en esta denominación a todos aquellos microorganismos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de energía (donador de electrones) a partir de reacciones de oxidorreducción en este tipo se engloban la mayor parte de las bacterias. Ejemplos de estas organismos son: Protozoos, Hongos y la mayoría de las bacterias no fotosintéticas.

Quimiolitótrofos: Se llaman así a todos los microorganismos que utilizan compuestos inorgánicos como fuente de energía (donadores de electrones) su fuente de carbono es el CO2 son bacterias que usan hidrógeno, azufre ,hierro y desnitrificantes . No existe sin embargo un mecanismo común de oxidación química ,inorgánica , entre los integrantes de este grupo. Los diferentes sustratos son oxidados por diferentes complejos enzimáticos y por distintas vías y la oxidación de un compuesto inorgánico reducido no es una propiedad única limitada a los autótrofos. Ejemplos de este tipo de bacterias son : Nitrobacter , Thiobacillus denitrificans y Alcaligenes .

Fotoautótrofos: Se denominan así a todos los organismos que utilizan la luz como fuente de energía y al CO2 como fuente de carbono y sus dadores de electrones son compuestos inorgánicos como el H 2S ó el S. Un claro ejemplo de este tipo de organismo son las Tiobacterias verdes y púrpuras y las algas eucariotas .

Fotoheterótrofos: Estos organismos se caracterizan por usar la luz como fuente de energía pero su fuente de carbono deja de ser el CO2 para que pasen a ser compuestos orgánicos como la glucosa , malato , peptona . Dentro de esta clasificación se encuentran las bacterias púrpuras que no usan azufre.

Aunque una especie particular puede pertenecer solamente e uno de los cuatro tipos nutricionales , algunas muestran una gran flexibilidad metabólica y modifican sus modelos metabólicos para adaptarse a los cambios ambientales. Por ejemplo, muchas bacterias púrpuras no del azufre se comportan como heterótrofos fotoorganotróficos en ausencia de oxígeno , pero oxidan moléculas orgánicas y funcionan quimiotróficamente con niveles de oxígeno normales. Cuando hay poco oxígeno , la fotosíntesis y el metabolismo oxidativo pueden funcionar simultáneamente . Esta clase de flexibilidad parece y confusa , pero aporta al organismo en cuestión una ventaja segura si las condiciones ambientales cambian con frecuencia .

3.2. Tipos de medios de cultivo que se emplean para el aislamiento y crecimiento de los microorganismos.

Los microorganismos se cultivan en agua que contiene los nutrientes apropiados que hemos añadido, a esta disolución acuosa se denomina medio de cultivo. Los nutrientes que están presentes en el medio de cultivo proporcionan a la célula microbiana los ingredientes requeridos para que produzcan más células como ella misma. Además de una fuente de energía, que puede ser un compuesto orgánico o inorgánico, o luz, un medio de cultivo debe tener una fuente de carbono de carbono y de nitrógeno junto a otros nutrientes necesarios. Los medios de cultivo se pueden preparar para ser usados en estado líquido o como geles semisólidos. Un medio de cultivo líquido puede pasar a estado semisólido por adición de un agente solidificante, que normalmente es el agar. Los medios de cultivo con agar se disponen en cajas circulares de vidrio o plástico, con tapadera , que se llaman placas de Petri , donde las células microbianas pueden crecer y formar masas visibles denominadas colonias.

Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto sólo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados. Además, los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar agua y alimentos, en microbiología industrial y otras actividades. Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. El conocimiento del hábitat normal de un microorganismo es a menudo útil para elegir un medio de cultivo apropiado, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural. Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos específicos o para facilitar la identificación de una especie en particular. En estos casos, la función de un medio estará también determinada por su composición.

Medios sintéticos o definidos

Algunos microorganismos, particularmente los autótrofos fotolitótrofos, como cianobacterias y algas eucariotas, pueden crecer en medios relativamente sencillos, que contienen CO2 como fuente de carbono (a menudo incorporado como carbonato o bicarbonato sódico) nitratos o amonio como fuente de nitrógeno, sulfatos, fosfatos y diversos minerales. Esta clase de medios en que se conocen todos los componentes se denominan medios definidos o medios sintéticos. Muchos heterótrofos quimioorganotróficos pueden crecer también en medios definidos con glucosa como fuente de carbono y una sal de amonio como fuente de nitrógeno. Los medios definidos se emplean ampliamente en investigación, pues a menudo se quiere conocer qué está metabolizando el microorganismo experimental.

Ejemplos de medios definidos:


Medio BG -11 para cianobacterias

NaNO3

K2HPO4

MgSO4 · 7H2O

CaCl2 · 2H2O

Ácido cítrico

Citrato amónico férrico

EDTA (sal de Na2Mg)

Na2CO3

Solución de metales traza

PH final de 7.4

Medio para Escherichia coli

Glucosa

Na2HPO4

KH2PO4

(NH4)2SO4

MgSO4 · 7H2O

CaCl2

FeSO4 · 7H2O

PH final de 6.8-6.0

Cantidad (g/L)

1.5

0.04

0.075

0.036

0.006

0.006

0.001

0.02

  • mg/L

  • Cantidad (g/L)

    1.0

    16.4

    1.5

    2.0

    200.0 mg

    10.0 mg

    0.5 mg


    Medios complejos

    Los medios que contienen algunos ingredientes cuya composición química se desconoce se denominan medios complejos . Estos medios son muy útiles, pues un único medio complejo puede ser suficientemente rico para satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos. Además, los medios complejos se necesitan porque a menudo se desconocen los requerimientos nutricionales de un microorganismo en particular, por lo que no se puede elaborar un medio definido. Esto sucede con muchas bacterias exigentes, algunas de ellas son capaces de necesitar un medio que contenga sangre o suero.

    Los medios complejos contienen componentes como peptonas, extracto de carne y de levadura. Las peptonas son hidrolizados de proteínas obtenidos de la digestión proteolítica parcial de carne, caseína, harina de soja, gelatina y otras fuentes proteicas. Sirven como fuente de carbono, energía y nitrógeno. Los extractos de carne y de levadura son medios líquidos de carne de vacuno y de levadura de cerveza, respectivamente. El extracto de carne contiene aminoácidos, péptidos, nucleótidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales. El extracto de levadura es una fuente excelente de vitaminas del complejo B y de compuestos de nitrógeno y carbono. Tres medios complejos utilizados comúnmente son :

  • Caldo nutritivo

  • Caldo de soja triptonado

  • Agar MacConkey.

  • Si se necesita un medio sólido para cultivar microorganismos en superficie, se puede solidificar un medio líquido añadiendo agar. El agar es un polímero sulfatado compuesto principalmente por D- galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y ácido-D-glucurónico. El agar es un buen agente solidificador porque, una vez que se funde en agua hirviendo, puede enfriarse hasta una temperatura de 40 a 42 oC, sin endurecerse, y no fundirá de nuevo hasta que no se alcance una temperatura de 80 a 90 oC. El agar es también un agente endurecedor excelente porque la mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo.

    A veces se utilizan otros agentes solidificantes. Por ejemplo, se usa gel de sílice para cultivar bacterias autótrofas en medios sólidos en ausencia de sustancias orgánicas, y para definir las fuentes de carbono en bacterias heterótrofas, añadiendo al medio varios compuestos orgánicos.

    Algunos medios complejos comunes


    Caldo nutritivo

    Peptona (hidrolizado de gelatina)

    Extracto de carne

    Caldo de soja triptonado

    Triptona (producto pancreático digerido de la caseína)

    Peptona(Producto digerido de semilla de soja)

    Glucosa

    Cloruro sódico

    Fosfato dipotásico

    Cantidad (g/L)

    5

    3

    17

    3

    2.5

    5

    Agar MacConkey

    Producto digerido pancreático de gelatina

    Producto digerido pancreático de caseína

    Producto digerido de tejido animal

    Lactosa

    Sales biliares

    Cloruro sódico

    Rojo neutro

    Cristal violeta

    Cantidad(g/L)

    17.0

    1.5

    1.5

    10.0

    1.5

    5.0

    0.03

    0.001

    13.5


    Tipos de medios

    Los medios como el caldo y el agar de soja triptonado se denominan medios para fines generales porque mantienen el crecimiento de muchos microorganismos. La sangre y otros nutrientes especiales se pueden incorporar a estos medios para favorecer el crecimiento de heterótrofos exigentes. Estos medios especiales se denominan medios enriquecidos.

    Los medios selectivos favorecen el crecimiento de microorganismos particulares. Las sales biliares o colorantes como la fucsina básica y el cristal violeta favorecen el crecimiento de las bacterias gramnegativas, al inhibir el crecimiento de las grampositivas sin afectar a las primeras. Los agar Endo, eosina-azul de metileno y MacConkey, tres medios que se emplean extensamente para detectar E. coli y bacterias próximas en suministros de agua y otros medios, contienen colorantes que inhiben el crecimiento de las bacterias grampositivas. También se pueden aislar las bacterias incubándolas con nutrientes que puedan utilizar de forma específica. Un medio que contenga solamente celulosa como fuente de carbono y energía es bastante eficaz para aislar bacterias que digieren celulosa. Las posibilidades de selección son infinitas y existen y existen docenas de medios selectivos especiales disponibles.

    Los medios diferenciales son medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa de los microorganismos, según sus características biológicas. El agar sangre es tanto un medio diferencial como un medio enriquecido. Sirve para distinguir entre bacterias hemolíticas y no hemolíticas. Las bacterias hemolíticas producen zonas claras alrededor de sus colonias debido a la destrucción de los eritrocitos. El agar MacConkey es tanto diferencial como selectivo. Como contiene lactosa y el colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de la lactosa aparecen de color rosa a rojo y son fácilmente distinguibles de las colonias no fermentadoras.

    Crecimiento en medios selectivos y diferenciales

    Tomando como punto de partida las características de crecimiento en medios de aislamiento primario, un microbiólogo realiza subcultivos de un patógeno desconocido en varias docenas de medios de cultivo útiles para el diagnóstico. Gran parte de estos medios se presentan en forma de pruebas comerciales miniaturizadas que contienen distintos medios en pocillos separados y que se han inoculado a la vez.

    La batería de medios incluye medios selectivos, diferenciales o ambos al mismo tiempo. Un medio selectivo es aquel en el que los compuestos han sido añadidos selectivamente para inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos y no de otros. Un medio diferencial es aquel en el que se ha añadido una clase de indicador, generalmente un colorante, que permite al microbiólogo diferenciar entre distintas reacciones químicas que se producen durante el crecimiento. Por ejemplo, el agar eosina-azul de metileno (EMB) se utiliza como medio selectivo y diferencial. El agar EMB se utiliza para el aislamiento de enterobacterias Gram negativas. La presencia del azul de metileno inhibe a las bacterias positivas Gram positivas; aunque se desconoce su mecanismo de acción, se sabe que pequeñas cantidades de este colorante inhiben eficazmente el crecimiento de la mayor parte de las bacterias Gram positivas. La eosina es un colorante que responde a los cambios del pH, virando del incoloro al negro en condiciones de acidez. El medio agar EMB contiene lactosa y sacarosa pero no glucosa como fuentes de energía. Las bacterias fermentadoras de lactosa, Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter, acidifican el medio y las colonias son de color negro con un brillo verdoso. Las colonias de los no fermentadores de lactosa como Salmonella, Shigella y Pseudomonas, son translúcidas o rosadas.

    La identificación de un organismo obliga a realizar una batería de pruebas en las que pueden cuantificarse multitud de diferentes reacciones bioquímicas. Estas pruebas miden la presencia o ausencia de enzimas que participan en el catabolismo del sustrato o sustratos que se añaden al medio diferencial. La fermentación de los azúcares se mide incorporando indicadores de pH que cambian de color en medio ácido. La producción de gas hidrógeno y/o dióxido de carbono durante la fermentación del azúcar se analiza observando la producción de gas en viales de recogida de gases o en agar. La producción de sulfuro de hidrógeno puede revelarse en un medio con hierro férrico. Si se genera sulfuro, el hierro férrico se acompleja con el H2S para formar un precipitado negro de sulfuro de hierro. La utilización de ácido cítrico,un ácido de seis carbonos que contiene tres grupos ácidos carboxílicos, se acompaña de una elevación del pH, de tal manera que la adición al medio de prueba de un colorante específico vira el color cuando se dan condiciones alcalinas. Se han desarrollado cientos de pruebas diferentes para uso clínico pero solamente se utilizan rutinariamente unas 20.

    Los resultados de estas pruebas diferenciales para un patógeno desconocido se archivan en un ordenador, y un programa especial permite decidir, con los resultados obtenidos, el agente etiológico del que se trate. Para la mayoría de los microorganismos, se necesitan tan sólo tres o cuatro pruebas para hacer una identificación inequívoca. Cuando a pesar de ello existen dudas de identificación, puede recurrirse a técnicas de identificación más sofisticadas, sobre todo cuando varios patógenos con características de crecimiento similares, presentan regímenes de quimioterapia diferentes.

    2.Pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Tinción de Gram.

    Bacterias grampositivas

    Son un tipo de célula procariota cuya pared está compuesta básicamente por peptidoglicano y carece de la membrana externa. Debido a esto después de la tinción de Gram aparecen de color púrpura.

    Bacterias gramnegativas

    Se trata de un tipo de célula procariota cuya pared contiene relativamente poca cantidad de peptidoglicano, pero que contiene una membrana externa compuesta por lipopolisacáridos, lipoproteínas y otras macromoléculas complejas. Por medio de la tinción de Gram las bacterias presentan un color rojo.

    Pared celular de las bacterias grampositvas

    Con frecuencia, la gruesa pared celular de las bacterias grampositivas está constituida principalmente por cadenas de peptidoglicano, a menudo unidas por puentes peptídicos. Sin embargo, estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicoicos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato. Aminoácidos como D-alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los glicerol y ribitol. Los ácidos teicoicos están comunicados al peptidoglucano mediante un enlace covalente con el hidroxilo seis del ácido N-acetilmurámico, o a los lípidos de la membrana plasmática; en este caso se denominan ácidos lipoteicos. Los ácidos teicoicos parece que se extienden hasta la superficie del peptidoglucano y, como están cargados negativamente, contribuyen a dotar a la pared celular grampositiva de su carga negativa. Las funciones de estas moléculas están todavía por aclarar, pero pueden ser fundamentales para mantener la estructura de la pared. Los ácidos teicoicos no están presentes en las bacterias gramnegativas.

    Pared celular de las bacterias gramnegativas

    La pared celular de las bacterias gramnegativas es mucho más compleja que la de las grampositivas. La capa delgada de peptidoglucano, próxima a la membrana plasmática, no constituye todo el peso de la pared. El peptidoglucano puede estar en forma de gel, más que como una capa compacta.

    La membrana externa está situada por fuera de la capa fina de peptidoglucano. La proteína de membrana más abundante es la lipoproteína de Braun, o lipoproteína de mureína, una proteína pequeña unida covalentemente al peptidoglucano subyacente e incluida en la membrana externa por su extremo hidrófobo. La membrana externa y el peptidoglucano están tan unidos por esta lipoproteína que pueden aislarse como una unidad.

    Otra estructura que puede dar resistencia a la pared gramnegativa y mantener la membrana externa en su posición es la zona de adhesión. Las membranas externa y plasmática parece que están en contacto directo en muchos lugares en la pared gramnegativa. Las zonas de adhesión pueden ser regiones de contacto directo o posiblemente, de verdaderas fusiones de membranas.

    La pared celular de los procariotas: peptidoglicano y moléculas relacionadas.

    Dada la concentración de solutos que se alcanza en el interior de la célula bacteriana, se desarrolla una considerable presión de turgencia, que se ha estimado en 2 atmósferas en una bacteria como Escherichia coli; esta es una presión similar a la de un neumático de coche. Para resistir esta presión las bacterias necesitan paredes celulares, que además son las responsables de la forma y rigidez de la célula.

    La pared celular de las Gram negativas está compuesta por varias capas y es bastante compleja, mientras que la pared de las Gram positivas está formada fundamentalmente por un tipo de molécula y es mucho más ancha.

    Peptidoglicano

    En la pared celular de una Bacteria hay una capa rígida que es responsable de la resistencia de la pared celular. En la mayoría de Bacteria existen capas adicionales que se sitúan en el exterior de ésta. La capa responsable de la rigidez en las paredes de Gram positivas y Gram negativas es muy similar en su composición química. Se le denomina peptidoglicano(o mureína) y está formada por dos derivados de azúcares N-acetilglucosa y N-acetilmurámico, y un pequeño grupo de aminoácidos que incluyen L-alanina, D-alanina, D-glutámico y lisina o en otros casos ácido diaminopimélico. Estos componentes se unen entre sí para formar una estructura que se repite a lo largo de la pared y que se denomina tetrapéptido del glicano. La estructura básica del peptidoglicano está constituida por una fina lámina en la que las cadenas de azúcares se conectan entre sí por puentes, formados por aminoácidos. Los enlaces glucosídicos que unen los azúcares en las cadenas de glucano son muy fuertes, pero estas cadenas por sí solas no son capaces de conferir rigidez en todas las direcciones. De ahí que sólo cuando se entrecruzan a través de puentes peptídicos se logra la rigidez característica de la pared. El número de puentes peptídicos que se forman no es igual en todas las Bacteria y es característico de cada tipo, siendo precisamente las paredes más rígidas aquellas con mayor número de puentes intercatenarios. En las Gram negativas los puentes se establecen por lo general mediante enlaces peptídicos directos del diaminopimélico y la D-alanina. En Bacteria Gram positivas habitualmente se establece mediante el enlace de varios aminoácidos cuyo número y tipo dependen de los diferentes organismos.

    En Bacteria Gram positivas el peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared, aunque pequeñas cantidades de ácidos teicoicos suelen también formar parte de la misma. Si bien se cree que algunas Bacteria poseen una sola capa de peptidoglicano, muchas Bacteria, especialmente las Gram positivas, tienen varias capas de peptidoglicano. En Bacteria Gram negativas el peptidoglicano constituye sólo alrededor del 10% de la pared, estando constituido el resto por una capa compleja. Sin embargo, tanto en Gram negativas como en Gram positivas se cree que la bacteria viene determinada por la longitud de las cadenas de peptidoglicano y el número y tipo de puentes intercatenarios que se establezcan.

    La membrana externa de las bacterias Gram negativas

    Las Bacteria Gram negativas, además del peptidoglicano, poseen, una capa adicional en su pared que está compuesta de lipopolisacárido. Esta capa representa de hecho una segunda bicapa lipídica, si bien hay que decir que no consta solamente de fosfolípidos como la membrana plasmática, sino que contiene polisacáridos y proteínas. Los lípidos y polisacáridos están estrechamente unidos en la capa externa formando estructuras lipopolisacáridas específicas. La presencia des lipopolisacárido justifica que la membrana externa se denomine generalmente capa de lipopolisacárido o simplemente LPS.

    Composición química del LPS

    A pesar de su complejidad, se conoce la estructura química de algunos tipos de LPS. La estructura del polisacárido; consta de dos porciones, el núcleo propiamente dicho y el polisacárido O. En Salmonella, donde se ha estudiado con cierto detalle, el centro o núcleo del polisacárido está compuesto por cetodesoxioctonato(KDO), azúcares de siete carbonos, glucosa, galactosa y N-acetilglucosamina. El polisacárido O está unido al centro o núcleo y consta generalmente de galactosa, glucosa, ramnosa y manosa así como uno o más dideoxiazúcares poco frecuentes como abecuosa, colitosa, paratosa, o tivelosa. Estos azúcares están unidos entre sí formando secuencias de cuatro o cinco unidades que a menudo se hallan ramificados. La repetición deestas secuencias de azúcar da lugar a la formación del polisacárido O.

    La parte lipídica del lipopolisacárido, conocida como lípido A, no es un glicerolípido sino que la conexión de los ácidos grasos a un disacárido compuesto de N-acetilglucosamina fosfato se hace mediante uniones de éster amina. El disacárido está unido al núcleo de polisacáridos O a través del KDO. En la membrana externa, el LPS se asocia a varias proteínas para formar la mitad externa de la estructura de unidad de membrana. En la cara interna de la membrana externa de algunas Bacteria Gram negativas se encuentra el complejo de lipoproteína. Esta lipoproteína es una proteína pequeña, que sirve de anclaje entre la membrana externa y el peptidoglicano. En la lámina externa de la membrana externa, el LPS sustituye a los fosfolípidos que predominan en la lámina interna.

    Endotoxina

    Una propiedad biológica importante de la membrana externa de muchas Bacteria Gram negativas es que resulta habitualmente tóxica para los animales. Bacteria Gram negativas, patógenas para el hombre y otros animales, incluyen miembros de los géneros Salmonella, Shigella y Escherichia, entre otros. La propiedad tóxica de la membrana externa de estas bacterias es responsable de algunos síntomas de infección a los que dan lugar. Estas propiedades tóxicas se asocian a una parte de la capa de lipopolisacárido, más concretamente al lípido A. El uso de endotoxina hace alusión precilamente a este componente tóxico, no obstante, también el LPS de algunas bacterias no patógenas presenta actividad de endotoxina. De ahí que no se requiera que el organismo sea patógeno para que su pared celular contenga elementos tóxicos.

    Tinción de Gram

    Fundamento de la tinción de Gram

    Aunque se han propuesto varias explicaciones sobre los resultados de la reacción de la tinción de Gram, parece probable que la diferencia entre las bacterias gram negativas y gram positivas se deba a la naturaleza física de sus paredes celulares. Si la pared celular se elimina en las bacterias gram positivas, éstas se convierten en gram negativas. El peptidoglucano no se tiñe por sí mismo; más bien, parece que actúa como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida del cristal violeta, y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. Cuando se decoloran a continuación las bacterias gram positivas con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa del peptidoglucano. En consecuencia, el complejo colorante-yoduro se retiene durante la fase corta de decoloración y las bacterias adquieren un color azul-violeta. Por lo contrario, la capa de peptidoglucano de las bacterias gram negativas es muy fina. También es posible que el tratamiento con alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana en las células gram negativas, como para aumentar posteriormente su porosidad. Por estos motivos, el alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana en las células gram negativas, como para aumentar posteriormente su porosidad. Por estos motivos, el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta-yoduro en las bacterias gram negativas.

    5. Esterilización y Desinfección.Tipos.

    Definiciones:

    Esterilización: es el proceso por el que todas las células vivas, esporas viables, virus y viroides son destruidos o eliminados de un objeto o hábitat. Un objeto esterilizado está totalmente libre de microorganismos viables, esporas y otros agentes infecciosos.

    Desinfección: este proceso consiste en la destrucción, inhibición, o eliminación de microorganismos que pueden causar enfermedad. Los desinfectantes son agentes, normalmente químicos, empleados para desinfectar y se utilizan normalmente con objetos inanimados. Un desinfectante no esterilizanecesariamente un objeto, porque pueden permanecer esporas y algunos microorganismos viables.

    El sufijo -cida se agrega cuando se hace alusión a una acción letal, en tanto que -stasis se añade cuando simplemente se trata de inhibir el desarrollo o la multiplicación del microorganismo. Un bactericida destruye bacterias; un germicida o desinfectante es un agente que destruye microorganismos capaces de producir una infección. Un bacteriostático es una sustancia que previene el desarrollo de las bacterias. Un antiséptico se opone a la sepsis o la putrefacción ya sea por acción letal sobre los microorganismos o impidiendo su desarrollo. Este término se emplea con frecuencia para agentes que se aplican de forma tópica sobre tejidos vivos.

    La selección de un procedimiento o agente apropiado está determinada por la situación específica y por hecho de que sea necesario destruir a todos los microorganismos o sólo a ciertas especies. Por ejemplo, la destrucción completa de todos los microorganismos presentes sobre cualquier material o dentro de él es indespensable en los procedimientos quirúrgicos, en la preparación de todos los medios de cultivo y material de vidrio usado en el laboratorio de microbiología y en el envasado de alimentos no ácidos con alto contenido proteico. En el cuidado de personas con enfermedades transmisibles la destrucción del patógeno es necesaria para prevenir la diseminación de la infección a personas susceptibles. Con este propósito una desinfección resulta adecuada y en general se emplea en el procedimiento de limpieza.

    Dinámica de la Esterilización y la Desinfección

    Índice de letalidad de los microorganismos.

    La información referida a la cinética de la destrucción de una población bacteriana es esencial para comprender las bases de la esterilización por agentes letales. Para los microorganismos el único criterio válido de muerte es la pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto en general está determinado por técnicas de siembra en placas que cuantifican, por medio del recuento de colonias, el número de sobrevivientes.

    Cuando se expone una población bacteriana a un agente letal con el tiempo tiene lugar una reducción progresiva en el número de sobrevivientes. La cinética de la destrucción de una población microbiana suele ser exponencial: el número de sobrevivientes disminuye en función del tiempo. Si el logaritmo del número de sobrevivientes se representa como una función del tiempo de exposición se obtiene una línea recta cuya pendiente negativa define la velocidad de destrucción. Sin embargo, el índice germicida sólo nos dice qué fracción de la población inicial sobrevive a un periodo determinado de exposición al agente antimicrobiano. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer el tamaño inicial de la población. Esta relación se expresa de forma matemática por la fórmula :

    K= 1/t log B/b

    Donde B es el número inicial de microorganismos y b es el número que queda luego del tiempo t.

    Aunque la curva logarítmica es conveniente desde el punto de vista matemático y aproximadamente correcta cuando se emplean grandes concentraciones de desinfectantes, para concentraciones más bajas la curva de desinfección es sigmoidea: la velocidad es lenta en los estadios iniciales, luego prosigue con rapidez durante la mayor parte del proceso de desinfección y por último disminuye hacia el final. El aplanamiento de la pendiente hacia el final del proceso es extremadamente importante desde el punto de vista de la esterilización, ya que se traduce en la necesidad de un tratamiento más prolongado o intenso para destruir a los sobrevivientes resistentes que es más probable que estén presentes en una población microbiana inicialmente grande. La experiencia práctica ha demostrado que en ninguna circunstancia es posible extrapolar el índice germicida exponencial a cero y suponer que el tiempo de exposición obtenido por este método garantizará la esterilidad.

    Debido a la forma exponencial de la curva del tiempo de supervivencia, cuanto mayor sea el número inicial de células a destruir más intenso y prolongado será el tratamiento necesario para la esterilización. Además, como podría esperarse, la velocidad de desinfección varía con la concentración del desinfectante. Sin embargo, el efecto de la concentración sobre la velocidad no es constante sino que varía con los diferentes desinfectantes.

    Agentes Antimicrobianos Químicos

    Factores que afectan la potencia desinfectante.

    En contraposición con los agentes quimioterapéuticos que presentan un alto grado de selectividad para ciertas especies de bacterias, los desinfectantes son muy tóxicos para todos los tipos de células. La efectividad de un agente particular está determinada en gran parte por condiciones en las cuales actúa.

    CONCENTRACIÓN DEL AGENTE. Muchos agentes son letales para las bacterias sólo cuando se los usa en concentraciones muy elevadas. Otros en concentraciones muy bajas pueden estimular, retardar o hasta destruir al microorganismo. Sin embargo, la concentración necesaria para producir un efecto determinado, así como es espectro de concentraciones dentro del cual un efecto determinado es demostrable, varían con el desinfectante, el microorganismo y el método de ensayo.

    TIEMPO. Cuando las bacterias se exponen a una concentración específica dell agente bactericida, aun en exceso, no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo sino que más bien se produce una disminución gradual en el número de células viables. Habitualmente se considera que la desinfección es un proceso en el cual las bacterias resultan destruidas en el curso de un período razonable de tiempo, pero existen diferentes opiniones sobre cuál debería ser ese tiempo.

    PH. La concentración del ión hidrógeno influye sobre la acción bactericida al afectar tanto al microorganismo como al agente químico. Cuando las bacterias están suspendidas en un medio de cultivo de pH 7 tienen una carga negativa. Un aumento del pH aumenta la carga y puede alterar la concentración efectiva del agente químico sobre la superficie de la célula. El pH también determina el grado de ionización del producto químico. En general la forma no ionizada de un agente disociable pasa a través de la membrana celular con mayor facilidad que las formas iónicas relativamente inactivas.

    TEMPERATURA. La destrucción de las bacterias por los agentes químicos aumenta junto con la temperatura. A temperaturas bajas, por cada 10 0C de incremento de la temperatura se produce una duplicación del índice germicida. En el caso de algunos agentes, como el fenol, el índice se incrementa de cinco a ocho veces, lo que sugiere una reacción más compleja y la participación de factores adicionales.

    NATURALEZA DEL MICROORGANISMO. La eficacia de un agente determinado depende de las propiedades del microorganismo contra el cual se lo este probando. Las más importantes de estas propiedades consisten en la especie de microorganismo, la fase del cultivo, la presencia de estructuras especiales, como esporas o cápsulas, los antecedentes del cultivo y el número de microorganismos en el sistema en ensayo.

    PRESENCIA DE MATERIALES EXTRAÑOS. La presencia de materia orgánica, como suero, sangre o pus, influye sobre la actividad de muchos desinfectantes y transforma en inertes a sustancias que son muy activas en su ausencia. Estos materiales extraños alteran la actividad del desinfectante de diferentes maneras: absorción superficial del desinfectante por coloides proteicos, formación de un compuesto químicamente inerte o menos activo y unión al desinfectante de grupos activos de las proteínas extrañas. Entre los desinfectantes cuya actividad inhibitoria disminuye en gran medida en presencia de un alto contenido proteico se encuentran los colorantes de anilina, los mercuriales y los detergentes catiónicos. Los compuestos que contienen grupos sulfridilo ocasionan una profunda inhibición sobre los mercuriales; los compuestos de amonio cuaternario son inhibidos por los jabones y los lípidos.

    Mecanismos de acción antimicrobiana.

    Los mecanismos por medio de los cuales las drogan matan o inhiben la multiplicación de los microorganismos son variados y complejos. Con frecuencia se producen alteraciones secuenciales o simultáneas que dificultan la diferenciación entre los efectos primarios y secundarios. Sin embargo, en general todos los efectos observables de los agentes químicos sobre las bacterias son el resultado de alteraciones en sus componentes macromoleculares. Algunos de estos cambios lesionan la membrana celular, otros inactivan de forma irreversible las proteínas y varios inducen un daño profundo en ácidos nucleicos.

    Agentes que lesionan la membrana celular.

    La integridad estructural de la membrana depende de la disposición ordenada de las proteínas y los lípidos que la componen. Los solventes orgánicos y los detergentes alteran esta organización estructural, lo que interfiere sobre la función normal de la membrana celular. El efecto neto es la liberación de pequeños metabolitos de la célula y la interferencia sobre el transporte activo y el metabolismo energético.

    Desinfectantes tensioactivos. Las sustancias que alteran las relaciones energéticas en las interfases al producir una reducción de la tensión superficial o interfásica se conocen como desinfectantes tensioactivos. Los agentes tensioactivos son compuestos que poseen grupos que atraen el agua y grupos que la repelen. La interfase entre la membrana de una célula bacteriana que contiene lípidos y el medio acuoso que la rodea proporciona un sitio blanco susceptible para agentes de este tipo. Los compuestos tensioactivos incluyen sustancias catiónicas, aniónicas, no iónicas y anfóteras. De estos compuestos, los catiónicos y los aniónicos han resultado ser los agentes antibacterianos más útiles.

    Compuestos de amonio cuaternario. Los agentes antibacterianos tensioactivos más importantes son los catiónicos en los cuales un residuo hidrófobo está balanceado por un grupo hidrófilo con carga positiva, como un núcleo de amonio cuaternario. Cuando las bacterias se exponen a este tipo de agentes el grupo con carga positiva se asocia con los grupos fosfato de los fosfolípidos de la membrana, mientras que la porción no polar penetra en el interior hidrófobo de la membrana. La distorsión resultante provoca una pérdida de la semipermeabilidad de la membrana y filtración de compuestos nitrogenados y fosforados contenidos en la célula. Entonces el agente propiamente dicho puede penetrar en la célula y desnaturalizar sus proteínas. La actividad de los compuestos de amonio cuaternario es máxima con un pH alcalino. Aunque estos compuestos son bactericidas para un amplio espectro de microorganismos las especies grampositivas son las más susceptibles. La actividad antibacteriana se reduce en presencia de materia orgánica.

    AGENTES ANIÓNICOS. Entre los detergentes aniónicos se encuentran los jabones y los ácidos grasos que se disocian para dar un ión con carga negativa. Estos agentes, que tienen mayor actividad a un pH ácido, son efectivos contra los microorganismos grampositivos pero relativamente ineficaces contra las especies gramnegativas debido a su membrana externa lipopolisacárida.

    Compuestos fenólicos. En concentraciones bajas estos compuestos tienen una acción bactericida rápida que provoca la pérdida del contenido celular y la inactivación irreversible de las oxidasas y las deshidrogenasas unidas a la membrana. En el momento actual el uso del compuesto madre fenol se limita sobre todo al ensayo de nuevos agentes bactericidas. Ha sido reemplazado como desinfectante práctico por derivados fenólicos menos cáusticos y menos tóxicos.

    La actividad antibacteriana del fenol resulta incrementada de forma considerable por diferentes sustituciones en el núcleo fenólico; los compuestos de mayor importancia son los derivados alquilo y clorados y los difenilos. Muchos de estos derivados no sólo poseen una actividad antibacteriana muy alta sino que además son considerablemente menos tóxicos que el fenol.

    CRESOLES. Estos son los fenoles alquílicos más simples. Son compuestos mucho más activos que el fenol y en general se emplean como una mezcla.

    Compuestos DIFENÍLICOS. Los compuestos difenílicos halogenados presentan propiedades antibacterianas específicas. De estos compuestos el más importante es el derivado clorado, que posee una efectividad contra microorganismos grampositivos, en especial estafilococos y estreptococos.

    Alcoholes. Los alcoholes permiten observar la interacción de los solventes orgánicos con las membranas lipídicas. Desorganizan la estructura lipídica por penetración en la región hidrocarbonada. Además de su efecto sobre la membrana celular, los alcoholes y otros solventes orgánicos también desnaturalizan las proteínas celulares.

    Agentes que desnaturalizan proteínas.

    En su estado natural cada proteína tiene una conformación característica que es necesaria para su funcionamiento adecuado. Los agentes que alteran la conformación de las proteínas por desnaturalización producen un desplegamiento de la cadena polipeptídica de manera que las cadenas se presentan arrolladas o enrolladas al azar y de forma irregular. Entre los agentes químicos que desnaturalizan las proteínas celulares se encuentran los ácidos, los álcalis, los alcoholes, la acetona y otros solventes orgánicos.

    Ácidos y álcalis. Los ácidos y los álcalis ejercen su actividad antibacteriana a través de sus iones H+ y OH- libres, por medio de las moléculas no disociadas o por alteración del pH del medio en que se encuentra el microorganismo.

    Agentes que modifican los grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos.

    El sitio catalítico de una enzima contiene grupos funcionales específicos que se unen al sustrato e inician los episodios catalíticos. La inhibición de la actividad enzimática se produce cuando uno o más de estos grupos funcionales es alterado o destruido. Grupos funcionales importantes de la pared, la membrana o los ácidos nucleicos de la célula son susceptibles a la inactivación.

    Los compuestos que contienen mercurio o arsénico se combinan con grupos sulfhidrilo; el formaldehído, los detergentes aniónicos y los colorantes ácidos reaccionan con grupos amino e imidazólicos; los colorantes básicos, los compuestos de amonio cuaternario y los detergentes catiónicos reaccionan con grupos acídicos. La presencia de materia orgánica y de otras sustancias que contienen grupos reactivos libres reduce de forma marcada la efectividad de agentes cuya toxicidad es el resultado de la combinación con grupos reactivos de los componentes celulares.

    Metales pesados. Las sales solubles de mercurio,arsénico, plata y otros metales pesados envenenan la actividad enzimática formando mercáptidos con los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína.

    Agentes oxidantes. Dentro de este grupo los agentes antimicrobianos más útiles son los halógenos y el peróxido de hidrógeno, que inactivan las enzimas por conversión de los grupos funcionales -SH en la forma oxidada S-S. Los agentes más potentes también atacan grupos amino, grupos indol y el grupo hidroxifenólico de la tirosina.

    HALÓGENOS. El cloro y el yodo se encuentran entre los desinfectantes más útiles. Para ciertos propósitos no tienen parangón. Son únicos entre los desinfectantes en el sentido de que su actividad es casi exclusivamente bactericida y en que son efectivos contra microorganismos que esporulan.

    PERÓXIDO DE HIDRÓGENO. En una solución al 3% e l peróxido de hidrógeno es un antiséptico inocuo pero muy débil cuyo uso clínico principal es la limpieza de heridas.

    Colorantes. Algunos de los colorantes del alquitrán de hulla, en especial los trifenilmetanos y las acidrinas, no sólo tiñen a las bacterias sino que además son inhibidores en diluciones muy altas. Dentro del espectro habitual de pH los colorantes básicos son los más efectivos. Presentan una afinidad marcada por los grupos fosfato acídicos de las nucleoproteínas y de otros componentes celulares y son inactivados por suero y por proteínas. Su uso médico actual se limita principalmente al tratamiento de lesiones dermatológicas.

    Agentes alquilantes.

    Los efectos letales del formaldehído, el óxido de etileno y el glutaraldehído resultan de su acción alquilante sobre las proteínas. La inhibición producida por estos agentes es irreversible, como consecuencia de una modificación de las enzimas y la inhibición de la actividad enzimática.

    FORMALDEHÍDO. Entre los agentes que actúan sobre las proteínas el formaldehído es uno de los menos selectivos. Produce la alquilación de los grupos carboxilo, oxhidrilo o sulfhidrilo por reemplazo directo de un átomo de hidrógeno por un grupo hidroximetilo.

    Agentes Antimicrobianos Físicos

    La mayor parte de las bacterias patógenas tienen una tolerancia limitada a las variaciones extremas en su medio ambiente físico y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismo vivo. Otras, en cambio, producen esporas que son muy resistentes a las condiciones físicas deletéreas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor incrementado de supervivencia.

    Calor

    El calor es el método de esterilización más confiable y el de empleo más difundido a nivel mundial; siempre que sea posible debe ser el método de elección. Como ocurre con otros tipos de desinfección, la esterilización de una población bacteriana por calor es un proceso gradual y la cinética de la acción germicida es exponencial.

    El tiempo necesario para la esterilización es inversamente proporcional a la temperatura de exposición. Esta relación se puede expresar por el término tiempo de muerte térmica, que se refiere al tiempo mínimo necesario para destruir una suspensión de microorganismos a una temperatura predeterminada en un medio ambiente especificado. De acuerdo con la ley de acción de masas, el tiempo de esterilización se relaciona de forma directa con el número de microorganismos en la suspensión.

    MECANISMOS DE LA LESIÓN TÉRMICA. La inactivación de las bacterias por calor no puede ser definida en términos bioquímicos simples. Aunque el efecto letal del calor húmedo por encima de una temperatura determinada en general se atribuye a la desnaturalización y coagulación de las proteínas, el patrón del daño térmico es bastante complejo y la coagulación sin duda enmascara otros cambios más sutiles inducidos en la célula antes de que se evidencie la coagulación.

    La producción de rupturas en una hebra de ADN puede ser el primer episodio letal. La pérdida de viabilidad de las células expuestas a una temperatura suave se puede correlacionar con la introducción de estas rupturas.

    El calor también ocasiona una pérdida de la integridad funcional de la membrana y la filtración de pequeñas moléculas y de material absorbente. Este material es de origen ribosómico y aparentemente proviene de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento térmico. Parece exitir una correlación entre la degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas.

    El mecanismo por el cual los microorganismos resultan destruidos por el calor seco es diferente del del calor húmedo. Los efectos letales del calor seco, o la desecación en general, habitualmente se atribuyen a la desnaturalización proteica, al daño por oxidación y a los efectos tóxicos de concentraciones elevadas de electrolitos. En ausencia de agua el número de grupos polares sobre las cadenas peptídicas disminuye y se requiere más energía para abrir las moléculas; de ahí el aumento aparente de la estabilidad del microorganismo.

    Calor húmedo. Los objetos se pueden esterilizar por calor seco aplicado a un horno o por calor húmedo provisto como vapor. De los dos métodos, el calor húmedo es el preferido porque su acción letal es más rápida. La exposición de la mayor parte de las bacterias mesófilas no formadoras de esporas al calor húmedo a 60oC durante 30 minutos es suficiente para la esterilización. La exposición a una temperatura de 80oC durante 5 a 10 minutos destruye las formas vegetativas de todas las bacterias, levaduras y hongos. Entre las células más resistentes se encuentran las esporas del Clostridium botulinum, un microorganismo anaerobio que causa intoxicación alimentaria.

    La aplicación de calor húmedo para la destrucción de las bacterias puede adoptar diversas formas: ebullición, vapor fluyente y vapor por presión. De ellas, el vapor por presión es la forma más eficaz porque permite alcanzar temperaturas superiores al punto de ebullición del agua. Estas temperaturas son necesarias debido a la muy alta resistencia térmica de las esporas bacterianas.

    La esterilización por vapor se realiza dentro de una cámara de presión llamada autoclave. Lo esencial en este tipo de esterilización es que la totalidad del material a esterilizar entre en contacto con vapor saturado a la temperatura requerida durante el tiempo necesario.

    Para la esterilización de ciertos líquidos o materiales semisólidos que son destruidos con facilidad por el calor se recurre aun método de esterilización fraccionada. Este procedimiento llamado tindalización, consiste en el calentamiento del material de 80 a 100oC durante 30 minutos en tres días consecutivos.

    PASTEURIZACIÓN. Como ya se ha indicado la mayor parte de las bacterias vegetativas pueden ser destruidas por exposiciones relativamente breves a temperaturas de 60 a 65oC. Esta temperatura no esteriliza la leche pero sí destruye todas las bacterias productoras de enfermedades que habitualmente son transmitidas por la leche.

    Calor seco. La esterilización por calor seco requiere temperaturas más altas y un periodo más prolongado de calentamiento que la esterilización con vapor. Su empleo se limita sobre todo a la esterilización de material de vidrio y materiales tales como aceites, gelatinas, y polvos, que son impermeables al vapor. La acción letal es resultado del calor conducido por material con el cual entran en contacto los microorganismos y no del aire caliente que los rodea; esto subraya la importancia de un calentamiento uniforme de la totalidad del objeto a esterilizar.

    Congelación

    Si bien muchas bacterias son destruidas por exposición al frío, la congelación no es un método fiable de esterilización. Su uso principal radica en la conservación de los cultivos bacterianos. Los ciclos repetidos de congelación y descongelación son mucho más destructivos para las bacterias que una conservación prolongada a temperaturas de congelación. En el proceso de congelsción de bacterias la formación de cristales de hielo fuera de la célula produce la salida de agua desde el interior de ésta, lo que provoca un aumento de la concentración intracelular de electrolitos y la desnaturalización de las proteínas. La membrana celular se lesiona y tiene lugar una pérdida de compuestos orgánicos intracelulares.

    Radiación

    La luz del sol tiene una apreciable actividad bactericida y desempeña un papel importante en la esterilización espontánea que se produce en condiciones naturales. Su acción desinfectante se debe sobre todo a su contenido de rayos ultravioletas, la mayor parte de los cuales, sin embargo, son eliminados por el vidrio y por la presencia de ozono en la atmósfera exterior. Otros rayos electromagnéticos con una menor longitud de onda, como los rayos x o los rayos , así como los rayos producidos por descomposición radiactiva y por aceleradores iónicos, también ejercen un efecto pronunciado cuando son absorbidos por las bacterias.

    Efectos de la radiación. Sólo la luz absorbida promueve reacciones fotoquímicas. Cuando una molécula absorbe luz, recibe energía en forma de “cuantos”. La energía de un cuanto es inversamente proporcional a su longitud de onda. En la reacción primaria cada molécula de una sustancia absorbente absorbe sólo 1 cuanto de luz. El número de cuantos absorbidos por un sistema biológico es proporcional al producto de la duración por la intensidad de la radiación, así como al coeficiente de absorción del material irradiado. La absorción de un cuanto por un electrón en un átomo produce la activación de la molécula, la que entonces utiliza esta energía extra para cambios químicos, como por ejemplo descomposición y redistribución interna, o la pierde totalmente como calor o fluorescencia.

    La radiación puede tener energía suficiente como para eliminar de manera completa un electrón de un átomo y producir una carga eléctrica o sólo energía suficiente como para llevar a los electrones a un estado de mayor energía.

    Vibraciones sónicas y ultrasónicas

    Las vibraciones sonoras de alta frecuencia, dentro del espectro audible alto y el ultrasónico, proporcionan una técnica útil para la ruptura de las células. Los generadores de ondas sonoras que se emplean ampliamente para este propósito operan dentro de un espectro de frecuencia de 9 a 100 kc/seg. Ninguna frecuencia específica ha demostrado ser unívocamente efectiva, pero en general las ondas ultrasónicas resultan más efectivas a medida que se aumenta la frecuencia.

    La sensibilidad de los microorganismos a las vibraciones sónicas y ultrasónicas varía de manera notable. Los más susceptibles son los bacilos gramnegativos y entre los más resistentes se encuentran los estafilococos, los que requieren largos períodos de exposición. Aunque las vibraciones sónicas son letales para muchos miembros de la población bacteriana expuesta, quedan numerosos sobrevivientes. En consecuencia, el tratamiento con vibraciones sónicas carece de valor práctico en la esterilización y la desinfección.

    Filtración

    El principal método usado en el laboratorio para la esterilización de materiales termolábiles es la filtración. Si bien el tamizaje mecánico desempeña un papel en todos los procesos de filtración, los fenómenos electrostáticos y de absorción y la construcción física del filtro también ejercen un efecto pronunciado. Los tipos más antiguos han sido reemplazados por membranas filtrantes consistentes en discos porosos de ésteres inertes de celulosa. Éstos absorben muy poco del líquido filtrado y por consiguiente son útiles para la esterilización de ciertos materiales que no pueden soportar sin deteriorarse las altas temperaturas que se emplean en la esterilización por calor.

    4. Esporulación: Ejemplos de Microorganismos con esporulación y estructura de la endospora bacteriana

    Esporulación

    Una propiedad única de ciertas bacterias es su capacidad para formar endosporas. En cierto momento en el ciclo de la célula vegetativa de los microorganismos formadores de esporas el desarrollo se detiene y la célula sufre cambios progresivos que conducen a la formación de una endospora. Una espora es una estructura latente capaz de sobrevivir durante períodos prolongados y dotada de la capacidad para restablecer el estado vegetativo de desarrollo en condiciones ambientales apropiadas. El proceso implicado en la esporulación, así como la interrupción de la latencia en la espora y la posterior emergencia de una célula vegetativa, representa un ejemplo primitivo de diferenciación unicelular.

    Iniciación de la esporulación

    La esporulación es una respuesta a una carencia nutricional, en especial de una fuente disponible de carbono y nitrógeno. La regulación de la formación de esporas es negativa: la célula elabora un represor a partir de algún ingrediente en el medio que impide la iniciación de la esporulación. Cuando este ingrediente se agota se libera la inhibición y se inicia la esporulación. Se requiere un suministro metabolizable de carbono y nitrógeno para inhibir la esporulación. Si ocurre una deficiencia en el suministro de cualquiera de ellos se libera la inhibición, con lo que se inicia la esporulación .

    El factor específico que regula la iniciación de la esporulación es el trifosfato de guanosina (GTP). Una disminución en el pool de GTP de las células en desarrollo es suficiente para iniciar la esporulación del B. subtilis. Todas las condiciones de deficiencia nutricional conocidas que inician la esporulación producen una disminución del GTP en el momento en que se inicia la esporulación. Dos tipos de carencias nutricionales son responsables de la disminución del GTP en condiciones de limitación de nutrientes: 1) una disminución en el precursor de la purina, P-ribosil-PP, causada por un suministro limitado de carbono y 2) la respuesta estricta a la carencia de aminoácidos, la cual se correlaciona con un aumento en la concentración de los nucleótidos de guanina altamente fosforilados, ppGpp y pppGpp. En condiciones de esporulación, el ppGpp inhibe la función de la inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa, la primera enzima en la síntesis, lo cual explica la disminución de los nucleótidos de la guanina. Existe escasa información concluyente sobre el papel que desempeña este nucleótido en la represión de la esporulación, si bien se ha postulado que la proteína de la unión con GTP puede estar implicada en la señal del mecanismo de transducción.

    Germinación y crecimiento

    También se manifiestan cambios estructurales y fisiológicos simultáneos durante la transformación de una espora latente en una célula vegetativa. El proceso de germinación de la espora consta de tres fases sucesivas:1) un estadio de activación que condiciona a la espora para que germine en un medio adecuado, 2) un estadio de germinación, durante el cual se pierden las propiedades características de la espora latente y 3) un estadio de crecimiento durante el cual la espora se convierte en una célula vegetativa.

    La activación es un proceso reversible que resulta esencial para la germinación de la espora. Las esporas no germinan o lo hacen muy lentamente a menos que sean activadas, ya sea por calor o por diferentes tratamientos químicos. Es probable que la activación implique la desnaturalización reversible de una macromolécula específica pero por es momento no identificada. La germinación es un proceso irreversible desencadenado por la exposición de las esporas activadas a un espectro amplio de nutrientes y estimulantes no nutrientes. La L-alanina es el nutriente germinativo más común; otros incluyen diversos aminoácidos, nucleósidos y glucosa. La germinación es el estadio durante el cual finaliza el estado de latencia . En el curso de los primeros estadios de la germinación se produce una pérdida de la refractilidad, hinchazón de la corteza y la aparición de finas fibrillas nucleares. Junto con estas alteraciones se observa una pérdida de la resistencia a los agentes físicos y químicos deletéreos, un aumento en la concentración de sulfhidrilos de la espora, una liberación de los componentes de la espora y un aumento en la actividad metabólica. La germinación de las esporas no es inhibida por antibióticos que alteran la síntesis de proteínas y de ácidos nucleicos, lo que indica que las enzimas responsables de la germinación ya están presentes en la espora.

    Si bien en el momento actual no resulta claro si se puede proponer un único modelo que explique la respuesta de germinación de la mayor parte de los microorganismos, se ha propuesto un modelo basado en los hallazgos observados con el Bacillus megaterium . De acuerdo con este modelo el shock térmico activa el receptor L-alanina, el cual, debido a sus propiedades estereoespecíficas, es una proteína que es activada de forma alostérica. Después de la activación por la L-alanina el receptor tiene propiedades proteolíticas por lo que convierte la proenzima de una enzima lítica de la corteza que es específica de la germinación en una enzima activa sensible al calor. La perpetración puede representar ya sea la activación del receptor por la L-alanina o la conversión de la proenzima lítica de la corteza en la forma lítica activa. La hidrólisis de la corteza permite la captación de agua y todos los otros sucesos posteriores de la germinación. La enzima lítica de la corteza específica de la germinación es un componente cítrico de este modelo.

    Durante el crecimiento se produce una síntesis de novo de proteínas y de componentes estructurales que son característicos de las células vegetativas. Durante este estadio la membrana del “core” de la espora se convierte en la pared celular de la célula vegetativa. El crecimiento es un periodo de gran actividad biosintética y puede ser inhibido de manera marcada por los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular, de las proteínas o de los ácidos nucleicos.

    Si las esporas activadas por calor germinan en condiciones adecuadas se obtiene un alto grado de sincronización. Esta población sincronizada proporciona sistema modelo para el estudio de la iniciación de los sucesos de transcripción y traducción que se producen la diferenciación. Como la espora carece de ARNm funcional, la conversión de la espora a célula vegetativa durante el crecimiento requiere la transcripción y la síntesis de novo de productos génicos. La aparición de estos productos genéticos es ordenada y está determinada por el tiempo de transcipción de genes particulares. La síntesis de ribosomas comienza temprano, la de la pared celular se inicia más tarde y la síntesis de ADN justo antes de la división de la célula. Durante un ritmo de duplicación del número de células por varias generaciones la iniciación de ciertas enzimas se produce en un momento específico durante cada ciclo de división y da como resultado una duplicación de cada enzima durante sólo una fracción del ciclo total.

    Estructura de la Endospora Bacteriana

    Las endosporas (denominación que obedece a que estas estructuras se forman “dentro” de la célula) pueden observarse con facilidad con el microscopio óptico en forma de cuerpos muy refringentes. Las esporas son muy impermeables a los colorantes por lo que a veces se ven como regiones sin teñir, dentro de las células que han sido teñidas con colorantes básicos como el azul de metileno. Para teñir las esporas deben utilizarse métodos de tinción específicos de esporas. La estructura de la espora tal como aparece al microscopio electrónico varía mucho con respecto a la célula vegetativa. La estructura de la espora es mucho más compleja que la de la célula vegetativa al poseer múltiples capas. La capa más externa es el exosporium, una fina y delicada cubierta de naturaleza proteica. Por dentro de ésta se localizan las cubiertas de la espora que se componen de capas de proteína. Bajo la cubierta de la espora se encuentra el córtex (corteza) que no es más que una capa de peptidoglicano con uniones laxas, y por dentro del córtex está el núcleo o protoplasto de la espora que contiene la pared celular (de estructura similar a la de la célula vegetativa) (pared del núcleo), membrana citoplasmática, citoplasma, nucleoide, etc. Por consiguiente, las esporas se diferencian estructuralmente de la célula vegetativa fundamentalmente en el tipo de estructuras situadas por fuera de la pared del núcleo de la espora. Una de las sustancias químicas que resulta característica de las endosporas y que no se halla en las células vegetativas es el ácido dipicolínico. Este compuesto se ha encontrado en todos las endoporas examinadas y se localiza en el núcleo. Las esporas también son ricas en iones de calcio que en su mayoría se combinan con el ácido dipicolínico. Los complejos calcio-ácido dipicolínico del núcleo de la espora suponen aproximadamente el 10% del peso seco de la endospora.

    Ejemplo de Microorganismos con esporulación:Clostridium botulinum (Botulismo).

    El Botulismo

    El botulismo es el tipo más grave de intoxicación alimentaria; con frecuencia es mortal y se produce después de ingerir alimentos que contenga la enterotoxina producida por la bacteria anaerobia Clostridium botulinum. Esta bacteria vive normalmente en el suelo o en el agua, pero sus esporas pueden contaminar alimentos crudos antes de su recolección o de ser sacrificados. Si los alimentos se elaboran adecuadamente, de forma que las esporas de C. botulinum se destruyan, no surge ningún problema. Pero si quedan esporas viables, pueden iniciar el crecimiento y una pequeña cantidad de la neurotoxina que se produce, puede ser extremadamente tóxica.

    Se conocen al menos siete tipos distintos de toxina botulínica, la mayoría de las cuales son tóxicas para las personas. Las toxinas se destruyen con el calor(a 80oC durante 10 minutos) y de este modo, el alimento adecuadamente cocinado debería ser inocuo, aun cuando originalmente contuviera toxina. La mayoría de los casos de botulismo se producen como resultado de ingerir alimentos que no se han cocinado después de elaborados. Si estos productos contienen la toxina botulínica, la ingestión de una mínima cantidad dará como resultado un tipo de intoxicación alimentaria sumamente peligroso.

    El botulismo infantil se produce cuando se ingieren esporas de Clostridium botulinum, con frecuencia en la miel silvestre. Si la biota del niño no está bien desarrollada, o si el niño está sometido a una terapia antibiótica, las esporas pueden germinar y las células de C. botulinum pueden crecer y liberar toxina. La mayoría de los casos de botulismo infantil ocurren entre la primera semana de vida y los dos meses de edad; el botulismo infantil es raro en niños mayores de seis meses.

    El Clostridium botulinum

    Morfología. El C. botulinum es un bacilo grampositivo recto a levemente curvo, con extremos redondeados. Si bien su tamaño varía de forma marcada según las condiciones de cultivo y tipo serotológico. Con frecuencia se observan formas de involución en los medios artificiales. El C. botulinum es móvil con flagelos peritricos. Produce esporas resistentes al calor que tienen una forma ovalada y son subterminales y que tienden a distender a los bacilos. Se producen de manera más estable cuando los microorganismos proliferan en medios alcalinos con glucosa y gelatina a 20 o 25oC; en general no se producen esporas con temperaturas más elevadas.

    El C. botulinum es un microorganismo anaerobio estricto que se cultiva fácilmente en un ambiente anaerobio en los medios de rutina. Los requerimientos nutricionales del microorganismo son complejos, en especial los de las cepas no proteolíticas.

    La resistencia al calor de las esporas del C. botulinum es mayor que la de cualquier otro microorganismo anaerobio; el grado de resistencia a los diversos factores físicos y químicos depende de la cepa y del tipo serológico específicos del microorganismo.

    La especie C. botulinum incluye un grupo muy heterogéneo de cepas que se han dividido en ocho tipos serológicamente diferentes sobre la base del tipo de toxina producida. Las diferencias inmunológicas entre estos tipos son constantes y claras y tienen importancia epidemiológica.

    Propiedades de la toxina botulínica. Las manifestaciones clínicas del botulismo son atribuibles a la toxina del C. botulinum que está presente en los alimentos ingeridos, en el tracto gastrointestinal de los lactantes o en las heridas. La toxina botulínica es una delas toxinas más potentes que se conocen. La temperatura óptima para la producción de la toxina varía mucho dentro de los tipos y a través de ellos. La proliferación y la producción de latoxina comienzan con un espectro de pH estrecho de 7 a 7,3. Si bien el C. botulinum puede proliferar en un medio sintético totalmente definido, la máxima producción de la toxina se logra en medios de cultivo más complejos.

    La toxina botulínica por lo común se clasifica como una exotoxina debido a su potencia y antigenicidad elevadas. Sin embargo, se diferencia de una exotoxina clásica por cuanto no es liberada durante la vida del microorganismo sino que aparece en el medio sólo después de la muerte y la autólisis de éste. Se ignora el papel desempeñado por la toxina en el metabolismo del C. botulinum; el microorganismo puede volverse no toxigénico sin ningún efecto discernible sobre la velocidad de la proliferación. La toxicidad oral de los agregados de mayor peso molecular de la toxina botulínica es mayor que la de los agregados más pequeños. Es atribuible mayor estabilidad de los agregados más grandes ante la exposición prolongada en el tracto gastrointestinal a enzimas que reducen su toxicidad final

    La producción de la toxina botulítica está dirigida por bacteriófagos específicos. La curación del C. botulinum de los bacteriófagos toxigénicos hace que el microorganismo se vuelva no toxigénico. Además es posible convertir un tipo de C. botulinum productor de toxina en otro por medio de la reinfección de las cepas curadas con un bacteriófago diferente. Además tiene especial importancia la observación de que la infección por los bacteriófagos de ciertas cepas de C. botulinum puede convertir al microorganismo en una especie de clostridio diferente.

    3. Crecimiento y división bacterianas.

    3.1. Curva de crecimiento microbiana: fases y tiempo de generación.

    Curva de crecimiento.

    El crecimiento de una población se estudia analizando la curva de crecimiento de un cultivo microbiano. Cuando los microorganismos se cultivan en un medio líquido, crecen normalmente en un cultivo discontinuo o sistema cerrado (batch culture), es decir, se incuban en un recipiente cerrado al que no se añade más cantidad de medio que la inicial; en consecuencia, las concentraciones de nutrientes disminuyen y las de residuos aumentan. Se puede representar el crecimiento de los microorganismos que se multiplican por fisión binaria como el logaritmo del número de células frente al tiempo de incubación. La curva resultante tiene cuatro fases diferentes: 1) de latencia; 2) exponencial; 3) estacionaria; 4) de muerte.

    Fases

    Fase de latencia

    Cuando se introducen microorganismos en un medio de cultivo fresco, normalmente no se produce un aumento inmediato del número de células o de masa y, por ello, este período se denomina fase de latencia. Aunque la división celular no se produce inmediatamente y no hay un incremento neto de masa, la célula está sintetizando nuevos componentes. Una fase de latencia previa al comienzo de la división celular puede ser necesaria por diversas razones. Las células pueden ser viejas y poseer una cantidad reducida de ATP, cofactores esenciales y ribosomas; estas sustancias deben sintetizarse antes de que se inicie el crecimiento. El medio puede ser diferente al anterior donde crecían los microorganismos. En este caso, necesitará nuevas enzimas para usar otros nutrientes. Quizás, los microorganismos hayan sido alterados y necesiten un tiempo de recuperación. Cualquiera que sea el motivo, finalmente, las células se equipan de nuevo, replican su ADN, comienzan a incrementar su masa y por último, se dividen.

    La duración de la fase de latencia varía considerablemente según la condición de los microorganismos y la naturaleza del medio. Esta fase puede ser bastante larga si el inóculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigerado. La inoculación de un cultivo en otro químicamente diferente provoca también una fase de crecimiento exponencial vigoroso a un medio nuevo de la misma composición, la fase de latencia se acorta o no se produce.

    Fase exponencial

    Durante la fase exponencial o logarítmica, los microorganismos crecen y se dividen hasta el nivel máximo posible, en función de su potencial genético, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; es decir, los microorganismos se dividen y duplican en número a intervalos regulares. Como cada célula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar discretos saltos. Durante esta fase, la población es más uniforme, química y fisiológicamente; por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan normalmente en estudios bioquímicos y fisiológicos.

    Fase estacionaria

    Finalmente, el crecimiento de la población cesa y la curva de crecimiento se vuelve horizontal. Las bacterias llegan normalmente a esta fase estacionaria cuando el nivel de población es de aproximadamente 109 células por mL. Otros microorganismos no alcanzan normalmente esta densidad de población; los cultivos de protozoos y algas llegan a menudo a una concentración máxima de 109 células por mL. El tamaño final de la población depende, por supuesto de la disponibilidad de nutrientes y otros factores, así como del tipo de microorganismo que se cultive. En la fase estacionaria el número total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser resultado del equilibrio entre la división y la muerte de las células o, simplemente, que la población deje de dividirse, aunque siga activa metabólicamente.

    Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias razones. Un factor es la limitación de nutrientes; si se reduce intensamente la concentración de un nutriente esencial, la población crecerá lentamente. Los organismos aerobios están limitados a menudo por la disponibilidad de O2. El oxígeno no es muy soluble y puede reducirse tan rápidamente que sólo la superficie del cultivo tenga una concentración de O2 adecuada para el crecimiento. En este caso, las células situadas por debajo de la superficie no podrán crecer, salvo que el cultivo se agite o airee de otra forma. El crecimiento de una población puede también cesar debido a la acumulación de productos residuales tóxicos. Parece que este factor limita el crecimiento de muchos cultivos anaerobios.

    Fase de muerte

    Cambios ambientales perjudiciales, como privación de nutrientes y acumulación de residuos tóxicos, originan la disminución del número de células viables, hecho que caracteriza la fase de muerte. La muerte de una población microbiana, al igual que su crecimiento durante la fase exponencial, es normalmente logarítmica. Este modelo es válido aun cuando el número total de células permanece constante, simplemente porque las células no se lisen después de morir. A menudo, la única forma de decidir si una bacteria es viable consiste en incubarla en un medio fresco; si no crece ni se multiplica, se considera que está muerta.

    Aunque la mayor parte de una población microbiana normalmente muere en forma logarítmica, la velocidad de la mortalidad puede disminuir después de reducirse drásticamente la población. Esto se debe a la supervivencia prolongada de algunas células particularmente resistentes.

    Tiempo de generación

    Crecimiento de poblaciones

    El crecimiento se define como un incremento en el número de células microbianas en una población, lo cual también puede ser medido como un incremento en la masa microbiana. La velocidad de crecimiento es el cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo. Durante este ciclo de división celular, todos los componentes estructurales de la célula se duplican. El tiempo requerido para que a partir de una célula se formen dos células se denomina tiempo de generación. Por lo tanto, el tiempo de generación es el requerido para duplicarse una población de células. A consecuencia de ello, a veces a este tiempo también se le conoce como tiempo de duplicación. Nótese que durante una sola generación, tanto el número de células como el de masa celular se duplica. El tiempo de generación varía ampliamente entre los microorganismos.

    6. Infeccinos y toxiinfecciones alimentarias causadas por microorganismos.Generos y especies mas relevantes.

    Definiciones:

    Infección. Esta conlleva la ingestión del patógeno, seguida del crecimiento del mismo por invasión de los tejidos, liberación de toxinas, o ambos.

    Intoxicación alimentaria. Esta produce síntomas poco después de la ingestión de los alimentos, ya que no es necesario que se multipliquen los microorganismos causantes de la enfermedad. Las toxinas generadas en el alimento pueden estar asociadas a las células microbianas o pueden ser liberadas de ellas.

    Principales enfermedades infecciosas transmitidas por los alimentos


    Enfermedad

    Salmonelosis

    Diarrea por Arcobacter

    Campilobacte-riosis

    Listeriosis

    Diarrea y colitis por Escherichia coli

    Shigelosis

    Yersiniosis

    Diarrea por Plesiomonas

    Gastroenteritis por Vibrio parahaemolyti-cus

    Organismo

    S. typhimurium, S. enteritidis

    Arcobacter butzleri

    Campylobacter jejuni

    L. monocytogenes

    E. coli incluido el serotipo O157:H7

    Shigella sonnei, S. flexneri

    Y.enterocolítica

    Plesiomonas shigelloides

    Vibrio parahaemolyti-cus

    Incubación

    8-48 horas

    de 2-10 días

    Períodos variables

    24-72 horas

    24-72 horas

    26-48 horas

    1-2 horas

    16-48 horas

    Alimentos

    Carnes, aves, pescado, huevos

    Aves de corral, prod. Cárnicos

    Leche, cerdo, prod. Aves

    Cerdo, leche, productos Cárnicos

    Carne de ternera picada poco cocinada, leche

    Productos derivados de huevos

    Leche, tofu

    Moluscos poco cocinados

    Mariscos


    Intoxicación alimentaria estafilacócica

    La intoxicación alimentaria más común está causada por el coco Gram positivo Staphylococcus aureus. Este organismo produce varias enterotoxinas que secreta al medio circundante o alimento; si se come el alimento que contiene la toxina, en un plazo de 1-6 horas se observan severas reacciones que incluyen náuseas, con vómitos y diarreas. Se han identificado seis tipos de enterotoxinas de S. aureus : A, B, C1, C2, D y E. La enterotoxina A es la que más frecuentemente está asociada a los brotes de intoxicación alimentaria estafilocócica. El mecanismo de acción de la enterotoxina A es el de un superantígeno e implica la estimulación sistemática de un gran número de células T.

    Las clases de alimentos más comúnmente implicadas en las intoxicaciones alimentarias son los productos cocidos al horno y rellenos de cremas, las aves, la carne, las salsas, las ensaladas con huevo y carne, los flanes y los aliños con nata para ensaladas.

    La intoxicación alimentaria estafilocócica puede evitarse con cuidadosos métodos higiénicos o almacenando los alimentos a bajas temperaturas para evitar el crecimiento microbiano, y eliminando todos los alimentos que hayan permanecido durante algunas horas a una temperatura superior a 4oC.

    Infección alimentaria

    Aunque algunas veces se denomina intoxicación alimentaria, la enfermedad gastrointestinal debida a Salmonella, transmitida por los alimentos, más bien infección alimentaria debida a Salmonella, porque los síntomas sólo aparecen cuando el patógeno se multiplica en el intestino. Los síntomas de la salmonelosis incluyen la aparición repentina de dolor de cabeza, escalofríos, vómitos y diarrea, seguidos de fiebre que dura unos cuantos días. El diagnóstico se hace a partir de los síntomas y cultivando el organismo aislado de las heces.

    El origen último de las salmonelas transmitidas por los alimentos son las personas y los animales de sangre caliente. En el caso de alimentos como los huevos y la carne, el animal que produce el alimento puede ser la fuente de contaminación.

    Detección de microorganismos causantes de enfermedades alimentarias

    Un importante problema del mantenimiento de la seguridad alimentaria es la necesidad de detectar rápidamente los alimentos con el fin de contener los brotes que puedan afectar a grandes poblaciones. Esto es especialmente importante debido a la distribución a gran escala de los alimentos perecederos. Las técnicas de cultivo estándar pueden requerir días o semanas para la identificación positiva de patógenos. La identificación a menudo se ve complicada por el bajo número de patógenos en comparación con la microbiota de fondo. Además, la variada composición química y física de los alimentos puede dificultar el aislamiento. La inmunofluorescencia, las técnicas inmunoenzimáticas, (ELISA) y las técnicas de radioinmunoanálisis han demostrado ser de utilidad. Estas técnicas pueden utilizarse para detectar pequeñas cantidades de antígenos específicos de patógenos.

    Siguen apareciendo nuevas aplicaciones de las técnicas inmunológicas para la detección rápida de patógenos de transmisión alimentaria. Una de las técnicas más nuevas consiste en la utilización de Dyneabs inmunomagnéticas. Esta técnica se basa en la reacción específica de los microorganismos deseados con reactivos inmunológicos ligados a partículas magnéticas. Una vez que se completa la reacción inmunológica, los microorganismos fijados pueden retirarse del alimento utilizando un magneto para someterlos a estudios adicionales. Esto hace posible un enriquecimiento mucho más rápido de los microorganismos deseados, constituye una alternativa al cultivo en medios selectivos, sistema que requiere mucho más tiempo, y se ha utilizado ampliamente para es enriquecimento de patógenos de transmisión alimentaria.

    También está aumentando el uso de las técnicas de identificación molecular. Los métodos básicos de análisis y manipulación del ADN y el ARN. Estos métodos son de utilidad para tres propósitos específicos:1) la detección de la presencia de un único patógeno específico; 2) la detección de virus que no pueden ser cultivados de forma adecuada; 3) la identificación de patógenos de crecimiento lento o no cultivables.

    Los patógenos pueden identificarse actualmente detectando secuencias de bases de ADN o ARN específicas con sondas, que suelen tener una longitud de 14 a 40 bases. Pueden crearse generando fragmentos conendonucleasas de restricción o mediante síntesis química directa. Las sondas se marcan uniéndolas a diversos marcadores enzimáticos, isotópicos, cromógenos o luminescentes/fluorescentes. Una de las principales ventajas de su utilización reside en la velocidad con la que es posible detectar los microorganismos de cultivos.

    Tabla comparativa con las características fundamentales de los principales grupos microorgánicos.


    Característica

    Estructura celular procarióta

    ADN circular

    Núcleo encerrado en una membrana

    Pared celular

    Lípidos de membrana

    Ribosomas

    ARNt iniciador

    Intrones en los genes de ARNt

    Intrones en la mayoría de genes

    Operones

    “Capping” y cola de poli-A del ARNm

    Plásmidos

    Sensibilidad ribosómica a la toxina diftérica

    ARN polimerasas

    Sensibilidad a cloramfenicol, estreptomicina y kanamicina

    Metanogénesis

    Reducción de S0 a H2S

    Nitrificación

    Desnitrificación

    Fijación del nitrógeno

    Fotosíntesis basada en la clorofila

    Quimiolitotrofía(Fe, S, H2)

    Vesículas de gas

    Síntesis de gránulos de reserva de carbono compuestos por poli--hidroxialcanoato

    Bacteria

    Ausente

    Ác. murámico

    Presente

    Uniones éster

    70S

    Formilmetionina

    No

    No

    No

    1(4unidades)

    No

    Archaea

    Ausente

    Ausencia ác.

    murámico

    Uniones éter

    70S

    Metionina

    No

    No

    Varias(8-12 subunidades cada una)

    No

    No

    No

    Eukaria

    No

    No

    Presente

    Ausencia ác. Murámico

    Uniones éster

    80S

    Metionina

    No

    Raro

    Tres(12-14 subunidades cada una)

    No

    No

    No

    No

    No

    No

    No

    No

    No


    Comparación de las células Procariotas con las Eucariotas

    Definición de : Eucariota, Archaea, Bacteria y Eukarya.

    Eucariota. Es un tipo de célula con el núcleo rodeado por una membrana y en la que generalmente existe otra serie de orgánulos intracelulares.

    Archaea. Es un grupo de procariotas filogenéticamente relacionados y distintos del grupo Bacteria.

    Bacteria. Es un grupo de procariotas filogenéticamente relacionados y distintos del grupo Archaea.

    Eukarya. Son todos los organismos eucarióticos.

    Comparación entre las células procariotas y eucariotas. En primer lugar, parece bastante claro que existen diferencias muy marcadas a nivel de la estructura interna en estos dos tipos de células. Las células eucarióticas, por ejemplo, presentan multitud de funciones celulares que corren a cargo de estructuras rodeadas por una membrana.


    Propiedades

    Grupos filogenéticos

    Estructura y función del núcleo:

    Membrana celular

    Nucleolo

    ADN

    División

    Reproducción sexual

    Intrones en los genes

    Estructura y organización del citoplasma

    Membrana citoplasmática

    Membranas internas

    Ribosomas

    Orgánulos membranosos

    Sistema respiratorio

    Pigmentos fotosintéticos

    Paredes celulares

    Endosporas

    Vesículas de gas

    Formas de motilidad:

    Movimiento flagelar

    Movimiento no flagelar

    Microtúbulos del citoesqueleto

    Tamaño

    Procariota

    Bacteria, Archaea

    Ausente

    Ausente

    Molécula única, generalmente circular covalentemente cerrada, no acomplejada con histonas.

    No mitosis

    Proceso fragmentario, unidireccional, no meiosis, sólo se reordenan partes de la dotación.

    Raros

    Habitualmente carece de esteroles; pueden existir hopanoides

    Relativamente sencillas; limitadas a grupos específic

    .

    70S

    Ausentes

    Forma parte de la membrana citoplasmática; ausencia de mitocondrias

    En memb. internas o clorosomas; ausencia de cloroplastos

    Presentes,compuestas de peptidoglicano, polisacárido, proteína, glicoproteína

    Presentes en algunas, termorresistibles

    Presentes

    Los flagelos se componen de un sólo tipo de proteína cuya disposición da lugar a una fibra que se ancla a la pared celular y la membrana; los flagelos rotan

    Motilidad por deslizamiento

    Ausentes

    Pequeña;<2m de "

    Eucariota

    Algas, hongos, plantas,protozos

    Presente

    Presente

    Lineal, formando los cromosomas y se compleja con histonas

    Mitosis

    Proceso regular; meiosis reordenación de la dotación cromosómica completa

    Frecuentes

    Existen esteroles ausencia de hopanoides

    Compleja , aparato de Golgi, retículo endoplasmático

    80S; salvo los ribosomas de las mitocondrias y los cloraplastos que son 70S

    Existen varias

    En las mitocondrias

    En los cloroplastos

    Están presentes en plantas, algas, hongos, polisacárida ausente en animales

    Ausentes

    Ausentes

    Flagelos o cilios; están formados por microtúbulos; no rotan

    Corriente citoplasmática y movimiento ameboide

    Presentes los microtúbulos se encuentran en flagelos

    Más grande; 2 a >100m de diámetro.


    BIBLIOGRAFÍA

    Madigan, Martinko, Parker; T. Brock “Biología de los microorganismos”

    Prescott, Lansing M. “Microbiología”

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    Roger Y. Stanier “Microbiología”

    Zisser Hans “Microbiologí