Medios de cultivo

Biotecnología. Microorganismos. Bacterias. Gases. Fotosíntesis. Agar sangre

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

Laboratorio de Microbiología

PRÁCTICA #4

Elaboración de los Medios de Cultivo”

“ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO”

OBJETIVO:

Uno de los principales objetivos de esta práctica es el de conocer la elaboración de un medio de cultivo y llevarla a cabo. Así como también aplicar conocimientos anteriores

FUNDAMENTO:

DISEÑO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos.

1.- Aporte de nutrientes

La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial además de los requerimientos nutricionales del microorganismo.

2.- pH

Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:

Utilización de carbohidratos ----> Producción de ácidos orgánicos ----> Acidificación

Catabolismo de proteínas ----> Producción de materiales nitrogenados ----> Alcalinización

Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampón. Uno de los más utilizados en microbiología es la combinación de KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH de aproximadamente 6,8.

3.- Necesidades de gases

Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:

i.- Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.
ii.- Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
iii.- Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre.
iv.- Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.


Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio.

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de O2.
B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2.
C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.

4.- Suministro de luz

Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación ya que la luz es su fuente de energía. Esta fuente de iluminación no debe plantear problemas de variación de temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor.

5.- Control de la temperatura

El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas, y la velocidad con que se efectúan estas reacciones está influída por la temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en los siguientes grupos:

i.- Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima es alrededor de los 15° C.
ii.- Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C.

iii.- Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.


6.- Otros requerimientos

Halófilas
: bacterias que para su crecimiento requieren altas concentraciones de sal (10 - 15%). Son aquellas bacterias aisladas del mar y ciertos alimentos.

Otras bacterias, como las aisladas en las fosas marinas, requieren presiones superiores a las normales.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

1.- Estado:

A.- Medios líquidos
B.- Medios sólidos
: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una concentración del 1,5%.
C.- Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.


2.- Composición:

A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autotrofos; adiccionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

Agar sangre:

Apto para el crecimiento de la mayoría de los microorganismos de importancia clínica y para estudiar su propiedad hemolítica. Se usa una base nutriente y sangre ovina estéril al 5%.

El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de elección para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especies bacterianas.

Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sódico y 5% de sangre.

La aportación de caseina y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y péptidos de cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran varíedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen rápidamente, así como los del género Candida. Tambìén permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.

El cloruro sódico proporciona electrolitos esenciales. La adición de sangre de carnero desfibrinada enriquece la base y lo hace un medio adecuado para realizar la prueba del factor CAMP.

Permite así mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actúan sobre los glóbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemólisis beta, produce un halo transparentealrededor de la colonia hemolítica), parcial (hemólisis alfa, coloración verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteración (hemólisis gamma).

La producción de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como pH o atmósfera de incubación.

Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmósfera enriquecida en CO2.

Si se añade al medio el 0,5% de telurito potásico es muy útil par el cultivo y aislamiento selectivo de Corynebacterium diphteriae, Candida albicans, Listeria y estreptococos.

PROCEDIMIENTO:

  • pesar el medio según las indicaciones del envase, (staphylococus 110 44.7gr y agar sangre 12gr)

  • Calentar agua

  • Vaciar el medio a un matráz Erlem Meyer y disolverlo.

  • Calentarlo con agitación hasta que se haga translucido, cuidando que no ebulla demasiado y así evitar que se derrame.

  • Se prepara para esterilizar y se pone a esterilizar a 15 lbs / 15 min.

  • ya estéril, esperar a que baje la temperatura hasta poderla soportar con las manos, ya que si se enfría demasiado se gelatiniza.

  • Vaciar el medio a las cajas de petri, dejándola en la campana esteril, abiertas hasta que se enfríe.

  • se deja enfriar, después se tapa y se almacena en un refrigerador previamente envueltas en papel hasta su uso.

  • MATERIAL:


    • agua

    • staphylococus 110

    • agar sangre

    • sangre

    • autoclave

    • cajas de petri

    • vaso de precipitado

    • matraz

    • parrilla

    • balanza

    • espátula

    • agitador

    • algodón

    • gasa

    • tape indicador


    OPERACIONES Y RESULTADOS:

    Se preparó el medio en un matraz de acuerdo a las instrucciones del envase y se dejo enfriar hasta que el alumno lo pudo soportar con las manos y de vació en las cajas de petri; después se dejó hasta que enfríe y gelifíque. Se tapan las cajas de petri y se envuelven en papel almacenadas hasta que se vayan a utilizar en un refrigerador.

    En la presente práctica se prepararon exitosamente los medios de cultivo tanto de agar sangre como de staphylococus para poderse utilizar en la siguiente practica.

    CONCLUSIÓN:

    En esta práctica se puede concluir que el alumno elaboro de manera correcta los medios entes mancionados y podran ser utilizados en la proxima clase.