GENOMICA DE LOS HONGOS FORMADORES DE MICORRIZA

La importancia de las micorrizas

Aproximadamente cien mil especies de hongos han sido descritas hasta ahora, y aproximadamente el 10% de estas obtienen nutrientes al vivir en una estrecha asociación con otros organismos tales como plantas, animales y humanos. Muchas infecciones por hongos son parasíticas y pueden causar enfermedades severas mientras que otras por el contrario son simbiosis mutualistas beneficiosas para el organismo huésped. En este último grupo se encuentran las infecciones causadas por hongos micorrícicos que infectan la raíz de muchas especies forestales y de importancia económica (Tunlid & Talbot 2002).

Nuestra comprensión de hongos parasíticos y simbiontes infectan sus huéspedes, incluyendo los organismos del reconocimiento del huésped, desarrollo de estructuras de infección, control de reacciones de defensa del huésped y penetración - colonización de los tejidos es limitado (Martin 2001; Tunlid & Talbot 2002).

La simbiosis entre hongos pertenecientes a Glomeromycota y plantas involucra cerca de dos tercios de todas las especies, lo que le confiere tiene una importancia ecologica muy grande, entre estos se encuentra Glomus intraradices (endomicorriza) que se encuentra en ecosistemas temperados y tropicales. Existen cerca de 150 especies descritas entre los Glomeromycota y cerca de 200000 especies vegetales involucradas en la simbiosis, los hongos pertenecientes a este orden presentan características muy particulares como el ser cenocíticos, multinucleados, asexuales y simbiontes obligados no específicos (Martin et al 2004).

Las micorrizas - características génicas y adelantos

Desde que se completó la secuenciación del genoma Saccharomyces cerevisiae en 1996, el proceso de la secuenciación de otros genomas fúngicos ah sido limitado. A comienzos del 2002 se publicaron las anotaciones del genoma de la levadura Schizosaccharomyces pombe y la terminación de otros proyectos de secuenciación de hongos esta por completarse. Entre esas especies se cuentan el hongo filamentoso Neurospora crassa , los patogenos humanos Candida albicans , Cryptococcus neoformans y el fitopatógeno Magnaporthe grisiae. Las colecciones de información de secuencia genómica y de ESTs de otros hongos simbióticos y parásitos que infectan humanos, otros animales y plantas está en aumento (Tunlid & Talbot 2002).

Comparados con el tamaño genómico de otros eucariotas tales como animales y plantas, los genomas de los hongos son pequeños. S. cerevisiae y S. pombe tiene tamaños genómicos de 13.7 Mb y 13.8 Mb respectivamente, mientras que como excepción se encuentra Ashbya gossypii con 8.9 Mb. Otros hongos basidiomicetes y ascomicetes filamentosos tienen genomas de entre 13 - 42 Mb. A partir de esto se

puede decir que los genomas de los hongos son aproximadamente un tercio de Caenorhabditis elegans y Arabidopsis thaliana, y un orden de magnitud menos que el del arroz (Oriza Sativa). Además los genomas de los hongos tiene una mayor densidad genica y una baja proporción de secuencias repetitivas, así por ejemplo, S. cerevisiae presenta un gen por cada 2 Kb, mientras que Neurospora crassa, cuyo genoma es mayor contiene un gen por cada 4 Kb. La densidad génica de M. grisiae esta estimada en uno por cada 4.2 Kb, y para el hongo ectomicorrícico Paxillus involutus, uno cada 2.8 Kb (Tunlid & Talbot 2002).

Los genomas de los hongos formadores de micorriza arbuscular tienen tamaños y estructuras inusuales. El tamaño estimado para sus genomas es de 100 - 1000 Mb, lo cual es significativamente mas grande comparado con los de ascomicetes y basidiomicetes. La proporción de G - C (Guanina y Citosina) es significativamente mas bajo (30 - 35%) que le rango de (40 - 56 %) reportado para otros hongos. Comparado con otros hongos los genomas de los glomaleanos tienen una mayor proporción de citosina metilada (mC), un hecho que explica la evolución de los grandes genomas ricos en adenina y timina de estos hongos (Tunlid & Talbot 2002).

La divergencia nucleotídica puede reducir los eventos de recombinación entre repeticiones, y por lo tanto lleva a la acumulación de DNA que no codifica en los genomas de los hongos de micorriza arbuscular (Tunlid &Talbot 2002).

Otra característica única de los hongos de micorriza arbuscular es la presencia de esporas unicelulares vegetativas grandes que contienen de varios cientos a miles de núcleos. Estos hongos parecen haber sido asexuales por los últimos 4000 millones de años, en la ausencia de recombinación, se ha propuesto que los hongos de micorriza arbuscular evolucionaron hasta desarrollar la capacidad de contener muchos genomas genéticamente divergentes. Al utilizar hibridización fluorescente in situ (FISH) en los núcleos provenientes de esporas de Scutellospora castanea se demostró que una población de núcleos genéticamente diferentes coexiste en un hongo individual (Tunlid &Talbot 2002).

Además, empleando análisis filogenéticos se ha mostrado que la variación genética que ocurre dentro de un individuo de micorriza arbuscular se ha desarrollado a traves de acumulación de mutaciones en un genoma esencialmente clonal con algunos eventos de recombinaciones poco frecuentes (Tunlid &Talbot 2002).

Perspectivas

En los próximos años, numerosos genomas fúngicos se han programado para su secuenciación, debido principalmente al Fungal Genome Initiative del Whitehead Institute. Esta iniciativa ha propuesto secuenciar hasta 44 genomas que incluyen modelos bien estudiados, importantes para la salud humana, fitopatógenos y especies mutualistas (Paxillus involutus y Tuber borchii). De cualquier manera, no se han secuenciado genomas micorrícicos y ninguno de ellos esta en la lista final del instituto Whitehead, por lo tanto la resolución de secuenciar los hongos Glomus intraradices y Laccaria bicolor, asociados al árbol Populus trichocarpa (Martin et al 2004) reviste de gran importancia por consistir en el primer proyecto de secuenciación a gran escala de micorrizas.

Los árboles en general son organismos experimentales difíciles debido a su gran tamaño y tiempo de generación, por ello se ha centrado la atención en especies comerciales como Populus trichocarpa; durante la ultima década Populus se ha convertido en la planta leñosa modelo debido a su tamaño genómico relativamente modesto, recursos genéticos extensos, rápido crecimiento inicial, facilidad de propagación clonal y protocolos de transformación rutinarios (Martin et al 2004).

Por otro lado se encuentra Laccaria bicolor perteneciente al orden Tricholomataceae, que se caracteriza por cambiar entre saprofitismo y ectomicorricismo. Este hongo es importante porque sirve como modelo de evolución de especificidad ecológica y de hospedero, porque se asocia con árboles de ecosistemas temperados.

Metodologías para el estudio de los genes fúngicos

La mayor dificultad para el análisis de la expresión génica de hongos de micorriza arbuscular es el crecimiento simbiótico del hongo, lo cual limita la cantidad de material disponible que solo se puede aislar de hifas e hifas extraradicales; en adición, la cantidad de material fúngico dentro de la raíz es muy poco comparado con otras interacciones planta-microorganismo de manera que solo 1% del mRNA extraído de raíces altamente colonizadas genera que el descubrimiento de genes de reducida expresión sea muy bajo. Con la ayuda de la tecnología del PCR muchas de las limitaciones se han superado de manera que a partir de pocas cantidades de mRNA se han construido librerías de cDNA (Franken & Requena 2001; Clapp et al 2002).

La identificación de los genes de micorriza arbuscular fue aproximada por medio de la transformación fúngica en los primeros intentos de aislamiento de genes por Forbes en 1998, teniendo en cuenta que en comparación con otros hongos filamentosos, la espora contiene más de 2000 núcleos y por lo tanto la deleción de los genes de los genes de interés no es factible (Franken & Requena 2001).

Las secuencias reportadas en bases de datos como BLASTX y BLASTN entre otras, han surgido a partir del aislamiento y caracterización aleatoria de DNA aislado de micelio extraradical (el cual solo esta contaminado por genes mitocondriales y nucleares si es que se empleará el rDNA) creando ESTs (Peter et al 2003). Sin embargo, un gran conjunto de datos se necesita analizar para poder señalar diferencias estadísticamente significativas en el nivel de expresión a partir de la frecuencia de la secuencia de los ESTs (Tunlid &Talbot 2002). La selección diferencial es otro método empleado basado en las diferencias de concentración de especies de ácidos nucleicos entre dos o mas muestras y esta enfocado a aislar mRNAs transcritos diferencialmente, con esta aproximación se han aislado nuevos genes vegetales y de micorriza arbuscular (Martin et al 2004).

Con los adelantos en biología molecular de la ultima década se ha logrado identificar cualquier micorriza potencialmente hasta especie por medio de PCR-RFLP de los espaciadores internos transcritos del DNA ribosomal nuclear o por secuenciación de DNA;

Resultados a partir de la información que se tiene

Una observación importante a partir de las comparaciones de las secuencias genómicas de los hongos y otros organismo es que una proporción significativa de las secuencias no exhibe similaridad con las proteínas de función conocida presentes en la bases de datos. Por ejemplo, 40-60% de las unisecuencias de ESTs de patógenos de plantas fúngicos muestran poca o ninguna similaridad con proteínas de función conocida; tales genes se han llamado huérfanos (ORFs sin ninguna función conocida) se han encintrado frecuentemente en los genomas de organismos eucariotas modelo. Por ejemplo, se ha calculado que un tercio de todas las regiones codificadoras de proteínas de S. cerevisiae son huérfanos, aunque estos probablemente representan los límites de la investigación empírica de la función celular, desde un punto de vista evolutivo existen dos explicaciones mutuamente no exclusivas para la alta proporción de huérfanos en un organismo: i) pueden representar genes cuya distribución filogenético esta restringida a ciertos linajes evolutivos, y ii) los genes huérfanos pueden representar genes que rápidamente divergen entre especies cercanamente relacionadas. Las proteínas codificadas por tales genes pueden no estar presionados por la evolución de su secuencia o presentar selección direccional, mientras que sus estructura y función puede estar conservada entre organismos distantes (Tunlid &Talbot 2002).

A grandes rasgos, la tasa de reorganización genómica parece ser mas alta en eucariotas que en procariotas, pero parece actuar a una escala mas local que a menudo involucra genes individuales, por lo tanto las translocaciones pueden ser mas raros en los hongos que en bacterias (Tunlid &Talbot 2002).

La filogenia a partir de datos moleculares ha mostrado que los hongos parásitos y simbióticos se encuentran en muchos grupos taxonómicos, lo cual sugiere que estos estilos de vida han aparecido repetidamente dentro del reino. A nivel genómico, hay básicamente tres mecanismos compatibles que pueden explicar la múltiple emergencia y adaptaciones para la simbiosis y parasitismo. En primer lugar, el parasitismo y la simbiosis están asociados con la presencia de genes nuevos, tales genes pueden tener un papel específico durante la infección del hospedero y pueden ser adquiridos por duplicación génica o por transmisión horizontal. Segundo, las adaptaciones para los hábitos simbióticos y parasíticos pueden resultar de diferencias en la regulación de la expresión génica. Tercero, el parasitismo y la simbiosis están asociados a la perdida de genes y la deleción (Tunlid &Talbot 2002).

Otros casos probables de transferencia horizontal de genes en hongos involucran elementos genéticos egoístas no infectivos como plasmados, intrones y transposones; en adición a esto, la transferencia de genes a través de mecanismos similares a la transformación de genes han sido reportados para estudiasen cultivo y suelo estéril. Las bases de la mayoría de estudios hasta la fecha indican que la historia evolutiva de un gen difiere de los genes ancestrales (verticalmente transmitido); sin embargo, en muchos casos existen explicaciones alternativas que se ajustan a las observaciones (Tunlid &Talbot 2002).

La disponibilidad de secuencias genómicas ha hecho posible el construir microarreglos de DNA para el análisis simultaneo de los niveles de expresión de grandes grupos de genes en muchas especies de patógenos y simbiontes fúngicos. El análisis proteómico ofrece la posibilidad de identificar directamente la abundancia de las proteínas, su localización, interacciones y modificaciones post transcripcionales, aunque una cantidad modesta de investigaciones concernientes a las proteínas fúngicas se debe su difícil diferenciación de las vegetales. Actualmente se han usado para el análisis de la expresión de proteínas en las paredes celulares de hongos parásitos, técnicas como el fraccionamiento subcelular con el cual se enriquecen los extractos vegetales con proteínas especificas de interés (Cánovas et al 2004; Harrier 2001; Tunlid &Talbot 2002).

Sin embargo, el estudiar los transcriptomas que interaccionan durante una simbiosis nos dicen que genes están siendo transcritos pero no si estos son traducidos a proteína o si los genes constitutivos expresados son modificados post transcripcionalmente de manera diferencial Birch & Kamoun 2000; Batel-Corre et al 2004)

Tecnologías de base molecular han sido particularmente exitosas para estudiar secuencias de DNA ribosomal que han arrojado como resultados una gran variación genética dentro y entre las especies de micorriza arbuscular. El aislamiento y estudio de estas secuencias ha servido para la caracterización molecular de los Glomales, la detección de hongos de micorriza arbuscular en plantas hospedero y dentro de ecosistemas del suelo. Entre las técnicas alternativas de estudio de estos hongos están los RAPDs y la amplificación de secuencias satélite. El estudio funcional de los genes no ribosomales se realiza mediante aproximaciones definidas (targeted molecular approaches) y no definidas (untargeted molecular approaches). La primera involucra la investigación de moléculas con secuencias génicas conocidas y/o proteínas con función conocida. La segunda se refiere a la investigación con base en la presencia y/o ausencia de productos genicos no conocidos de los cuales no es necesario conocer su secuencia (Harrier 2001).

El aislamiento y estudio de los elementos reguladores de los genes de micorriza arbuscular es necesario par el entendimiento de los factores que controlan la expresión génica, para ello se deben construir librerías genómicas libres de procariotas para el aislamiento de estos elementos como la región promotora PGK aislada recientemente (Martin et al 2004).

Perspectivas

La genómica funcional deriva de la disponibilidad de la información de la secuencia de un organismo, de manera que podría ser definida como la aplicación de los métodos de secuenciación automatizada a la biología permitiendo el análisis funcional del genoma, proteoma y metaboloma de un organismo (Talbot 2003). Actualmente no tenemos conocimiento acerca de los mecanismos moleculares que gobiernan los patrones titulares para la simbiosis ni las señales específicas que coordinan el desarrollo conjunto de micelio y raíz, ni de las que posibilitan la continuidad de la asociación. Sin embargo, los análisis de la expresión diferencial por medio de microarreglos (microarrays) y de la subsecuente acumulación de información génica proveniente de la secuenciación nos posibilitará la asignación de funciones a las porciones de DNA de manera que comprendamos paso a paso los eventos de la simbiosis y una visión a nivel ecológico de los factores ambientales que influencian la trascripción diferencial de genes (Martin 2004).

Literatura citada

TUNLID, A. & TALBOT, N. J. (2002) Genomics of parasitic and symbiotic fungi. Current Opinion in Microbiology 5: 513-519

BESTEL-CORRE, G., DUMAS-GAUDOT, E. & GIANINAZZI, S. (2004) Proteomics as a tool to monitor plant-microbe endosymbiosis in the rhizosphere. Mycorrhiza 14: 1-10

MARTIN, F. (2001) Frontiers in molecular mycorrhizal research-genes, loci, dots and spins. New Phytologist 150: 499-507

MELIN, P. (2004) Proteomics as a tool to study microbial interactions. Current Proteomics 1: 27-34

CLAPP, J. P., RODRIGUEZ, A. & DODD, J. C. (2002) Glomales rRNA diversity-all that glistens is not necessarily glomaelan? Mycorrhiza 12 :269-270

PETER, M. et al (2003) Analysis of expressed sequence tags from the ectomycorrhizal basidiomycetes Laccaria bicolor and Pisolithus microcarpus. New Phytologist 159: 117-129

FRANKEN, P. & REQUENA, N. (2001) Analysis of gene expression in arbuscular mycorrhizas: new approaches and challenges. New Phytologist 150: 517-523

HARRIER, L. A. (2001) The arbuscular mycorrhizal symbiosis: a molecular review of the fungal dimension. Journal of experimental botany 52: 469-478

TALBOT, N. J. (2003) Functional genomics of plant-pathogen interactions. New Phytologist 159: 1-10

MARTIN, F. et al (2004) Symbiotic sequencing for the Populus mesocosm. New Phytologist 161: 330-335

CÁNOVAS, F. M. et al (2004) Plant proteome analysis. Proteomics 4: 285-298

BIRCH, P. & KAMOUN, S. (2000) Studying interaction transcriptomes: coordinated analyses of gene expression during plant-microorganism interactions. New Technologies for life sciences a trends guide publicado en linea