Todas las reacciones se realizan en dos pasos: eliminación/degradación y rotura. Esta última es igual para cada una de las cuatro mencionadas anteriormente, y consiste en la unión de piperidina en medio básico al carbono anomérico (desplazando una base degradada, si la hay) mediante un doble enlace con el nitrógeno. Se provoca la aparición de un catión y un efecto de inducción electrónica que obliga al azúcar a romper los enlaces con los dos fosfatos que lo flanquean, liberando dos fragmentos de ADN, uno con 3'-fosfato y otros con 5'-fosfato. Este proceso se llama ð-eliminación.

La eliminación selectiva de guanina pasa por una metilación suave con sulfato de dimetilo, que añade un grupo -CH3 en posición N7, pero se tiene que hacer de tal modo que no se metilen todas las bases, sino sólo las necesarias para no romper todas las moléculas por el mismo sitio, ya que sino, no se podría leer ninguna secuencia. El producto de la metilación es un ion amonio que se estabiliza por resonancia con el N9, pero al pasar a medio básico se rompe el anillo y la base se degrada y se hace susceptible de una sustitución por piperidina, que ya se incluye en ese medio alcalino.

La eliminación de purinas consiste en un sencillo tratamiento en medio ácido suave, que hidroliza el enlace N-glucosídico (no todos, de nuevo), como ya se ha visto antes. Esto deja al descubierto el carbono anomérico para su posterior tratamiento con piperidina.

La eliminación de pirimidinas pasa por la degradación del anillo, como el caso de la guanina, pero esta vez con hidracina, que ataca los carbonos 4 y 6 de los anillos de pirimidina y cambiando totalmente la estructura de la molécula. Este cambio la hace susceptible de ser sustituida por piperidina en medio básico. En valores de fuerza iónica cercanas a las fisiológicas, esta reacción se produce con cualquiera de las dos pirimidinas, pero a altas concentraciones de sal (NaCl 2M) se hace específica de citosina.

Después de obtener la colección de fragmentos y someterlos a electroforesis y revelado, hay que hacer notar que no hay carriles para cada base, sino para G, purinas, pirimidinas y C, con lo que no basta con leer una banda detrás de la otra, sino que los sitios donde aparecen dos a la misma altura son bien de G o bien de C, y las bandas que sólo aparecen en los carriles de purinas o pirimidinas se corresponden con A y T, respectivamente. Además, hay que tener en cuenta qué extremo es el que está marcado, porque de ello depende el sentido de la lectura. Si se marca el extremo 5' hay que leer como en el método didesoxi, pero no fabricar luego la complementaria, porque la electroforesis es ya del ADN, no de su complementario, si por el contrario es el extremo 3' el que está marcado, el gel se lee de arriba abajo.

Comparación de métodos.

El método didesoxi es mucha más fácil porque no hay que partir del ADN puro para posteriormente modificarlo, sino que basta con tenerlo. Además, en el método didesoxi se incorpora más radiactividad, con lo que es unas 200 veces más sensible, es más rápido y barato, y con una calidad similar a la hora de secuenciar.

Actualmente se utiliza el método didesoxi unido a la PCR para secuenciar grandes trozos de ADN, porque cada día se fabrican polimerasas mejores mediante ingeniería genética y, además, como se realiza a elevadas temperaturas se evita la formación se estructuras secundarias (pares, islas o bucles GC) que interrumpen la transcripción.

Sin embargo, el método de rotura de cadena se utiliza mucho para realizar estudios de huella o footprinting, para determinar la secuencia que protege un determinado factor de transcripción o proteína de unión a ADN (promotores, reguladores, intensificadores).

Secuenciación de ARN.

Se suelen seguir técnicas de rotura de cadena, con lo que de nuevo obliga a purificar ARN a homogeneidad, lo que a veces es imposible porque el material de partida es muy heterogéneo y los ARN se parecen todos mucho entre sí en sus características físicas. Además, un problema de los ARN es que se desintegran en álcali incluso suave, por lo que hay que buscar otras estrategias para romper la cadena en distintos puntos. Si se sigue un abordaje químico, las reacciones son bastante parecidas a las el método para el ADN:

• G con sulfato de dimetilo.

• Principalmente A, aunque G en proporción baja con pirocarbonato de dimetilo.

• U principalmente, aunque también C con hidracina.

• C con hidracina en alta sal.

El abordaje enzimático con endonucleasas específicas también permite una rotura selectiva de la cadena de ARN, aunque por puntos distintos. Hay muchas diferentes, generalmente derivadas de microorganismos, que se pueden utilizar como mejor convenga. Un ejemplo es éste.

• ARNasa T1: pGp*N. Libera G unida al fosfato del siguiente nucleótido.

• ARNasa U2: pAp*N. Libera A unida el fosfato del nucleótido siguiente.

• ARNasa PhvM: pAp*N y pUp*N. Corta detrás de A y U y se llevan el fosfato del nucleótido siguiente.

• ARNasa BC: pUp*N y pCp*N. Corta detrás de U y C y se llevan el fosfato del siguiente nucleótido.

Todos los fragmentos obtenidos por el método anterior tienen extremos 3'-P y 5'-OH. En el gel de electroforesis se carga cada uno de estos carriles y determinarán la situación de las G, A, A + U y U + C. Lo que no se encuentre en el carril A, pero sí en el A + U será una U, y de modo parecido lo que no se encuentre en el carril A + U, pero sí en el U + C será una C. La resolución de este método, comparándolo con la del ADN, es bastante menor y se permite identificar muchas menos bases en un solo experimento.

El principal problema de este método, ya mencionado anteriormente, es que los ARN son muy difícilmente purificables, excepto los muy abundantes, como genomas de virus ARN o los mayoritarios (ARNr y ARNt). El conjunto de ARNm se podría separar con suerte porque tienen una cola de poli-A, pero hay unos 25000 tipos distintos en una célula eucariota, y pescar el que se quiere en una gran mancha de gel es extremadamente difícil. Para pescar ARNm se utiliza la transcripción inversa, que forma una molécula de ADNc más fácilmente secuenciable. Sin embargo, para esto es necesario tener una sonda, es decir, conocer la secuencia que interesa. Ésta se obtiene a partir de la secuencia de aminoácidos de una proteína conocida de la que interesa obtener el gen, que puede traducirse nucleótidos a través del código genético (no olvidar que hay que dejar una base floja en el tercero de cada codón para permitir el tambaleo), y fabricar un cebador con esa secuencia. Otra estrategia es el clonaje por homología, en el que se buscan similitudes con genes o secuencias conocidas, lo que permite clonar una pequeña cantidad de genes con un cierto grado de identidad.

La secuenciación de ARN mediante ADNc permite también caracterizar genes y determinar dónde se producen las transiciones intrón-exón mediante su comparación con la secuencia de ADNg (genómico).

La principal limitación es que la transcriptasa reversa puede introducir errores y depende mucho de las condiciones de transcripción la longitud de la cadena sintetizada. Además, el principal problema es que no se puede contrastar el resultado de la secuenciación de una sola hebra de ARN con la complementaria porque, sencillamente, no la hay, por lo que si se introduce un solo fallo, éste persiste hasta el final y no se corrige hasta que se identifica el gen en el ADN genómico.

Estructura secundaria de ADN.

El modelo de Watson y Crick.

El estudio de la estructura secundaria del ADN arranca desde el modelo de Watson y Crick de doble hélice de ADN. Ellos propusieron su modelo en una coyuntura científica en la que se sabían los siguientes datos:

• Avery y otros investigadores ya habían determinado irrefutablemente que el material genético es el ADN.

• Por esta cualidad debería tener una serie de propiedades:

• Ser perpetuable.

• Llevar información gracias a una complicada estructura.

• Esto permitiría fabricar proteínas tan complejas como las que se conocían.

• La información debía poder ser modulada a algún nivel.

• El modelo debía poder explicar o ser coherente con los fenómenos de mitosis y meiosis.

• También debía poder explicar las mutaciones y la evolución genómica.

• Se conocían las reglas de Chargaff:

• Igual número de A que de T.

• Igual número de C que de G.

• Igual número de purinas que de pirimidinas.

• Por tanto, no existe el tetranucleótido.

• El modelo debería explicar o tener en cuenta los tautómeros de las bases que entran a formar parte del ADN.

• Debería considerar que las bases son hidrófobas y huyen del agua.

• Años antes Pauling descubrió la hélice ð en proteínas, y propuso la primera estructura helicoidal de moléculas biológicas.

• Se conocían datos de cristalografía de ADN.

• Se tenían que considerar los impedimentos estéricos.

• Por estudios de centrifugación se conocía que el ADN era de doble cadena.

• Se conocía la existencia de una esqueleto de azúcar-fosfato, que debería estar expuesto al agua por ser hidrófilo.

• El modelo debería poder sugerir un método para la replicación de ADN.

Datos estructurales.

Los datos de cristalografía de los que disponían Watson y Crick se determinaron a partir de aislado de ADN nuclear en solución y no muy puro. Estos datos se determinan mediante el estudio de la difracción de un haz de rayos X al atravesar una muestra convenientemente tratada y en estado cristalino. Como los rayos X tienen una longitud de onda comparable a la distancia internuclear, la desviación que se provoque y la posterior impresión en una película será representativa de la estructura del material que se traspasa. Si ese material tiene estructura cristalina, es decir, repetitiva, se generará una difracción coherente. En el caso del ADN, las moléculas se pueden estirar y disponerse todas paralelamente de modo que los rayos X incidan perpendicularmente. Los expertos de cristalografía consiguieron determinar algunas de las periodicidades del ADN: cada 3,4 y cada 34 Å, además de una estructura helicoidal. Posteriormente se ha descubierto que estos datos son resultado de un promedio, porque el ADN presenta muchas estructuras distintas, aunque parecidas.

Con los datos disponibles, Watson y Crick determinaron un modelo de ADN que ha sido plenamente demostrado y que, además, se conoce como el tipo mayoritario de ADN en la célula. Éste se estructura como una doble hélice antiparalela (cada cadena va en un sentido) y plectonémico (no se pueden separar estirando solamente de una de las dos cadenas) arrollada a derechas. En ella las bases están en el interior y el esqueleto de azúcar-fosfato en el exterior. En su modelo las bases aparean A con T y C con G, es decir, una purina con una pirimidina y en un plano perpendicular al eje de la hélice, pero que luego se ha visto que tiene un pequeño ángulo de -6º. El apareamiento descrito es el único posible compatible con el modelo de ADN, aunque luego se han determinado otros apareamientos diferentes merced a una configuración distinta de puentes de hidrógeno y tautómeros. El paso de la hélice es de 35,7 Å (cercano a los 34 que se observaban en cristalografía), y la altura de cada residuo es de 3,4 Å, exactamente lo que se observaba en cristalografía. Cada par de bases provoca un giro de 34,3 Å en la hélice, lo que lleva a que cada vuelta tenga 10,5 pb por vuelta. El diámetro de la doble hélice es de 20 Å y es independiente de la secuencia, dado el apareamiento únicamente de purinas con pirimidinas, ya que de otro modo sería variable y haría la hélice inestable. Esto permite almacenar información siempre del mismo modo pero independientemente de la secuencia sin alterar la estructura. El eje pasa entre las bases de cada par, justo por las zonas de interacción de puentes de hidrógeno.

La doble hélice determina dos surcos de distinta anchura: el mayor y el menor. Esto se debe a las características antes citadas, principalmente por tres causas:

• La base no está centrada en la estructura del nucleótido.

• Las cadenas corren antiparalelas.

• Las bases tienen que aparear, con lo que se determina bastante la estructura.

Esto provoca que las dos hélices no discurran exactamente una frente a la otra, sino ligeramente desplazadas, de ahí los surcos de distinta anchura. Teniendo en cuenta la tautomería de las beses, los puentes de hidrógeno sólo pueden se los que describe el modelo, y como el diámetro es constante, la distancia entre C1' también es constante, exactamente de 10,85 Å.

Ya se ha mencionado que pueden aparecer en determinadas estructuras distintas de la del modelo de Watson y Crick puentes de hidrógeno diferentes entre tautómeros diferentes de cada base. Así se generan apareamientos inversos de Watson y Crick, o también de Hoogsten, en los que cambia tanto la configuración de los puentes de hidrógeno como los átomos implicados en su formación.

Consecuencias del modelo.

El modelo que describieron Watson y Crick es muy bueno porque aporta la idea del apareamiento de bases como algo básico en Biología molecular, permite e incluso sugiere un método de replicación, propone el antiparalelismo como uno de los elementos característicos de los ácidos nucleicos. Además, introduce el concepto de empaquetamiento de bases y excluye la posibilidad de la inclusión de moléculas de agua entre ellas. Los modelos anteriores partían de la idea de una escalera en la que las bases fueran los peldaños, pero esto deja 6,8 Å de distancia, que es suficiente para que entren moléculas de agua y la hagan inestable. El hecho de enrollar la escalera permite el acercamiento de los pares de bases hasta los 3,4 Å, que es justamente la distancia óptima de interacción mediante fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas, además de excluir físicamente el agua. Todo esto redunda en una mayor estabilidad del ADN.

Como consecuencia del modelo de ADN de Watson y Crick se permite la creación de teorías sobre la replicación y la mutación del ADN. El hecho de tener dos cadenas, cada una complementaria de la otra, provoca automáticamente la aparición de dos moldes, cada uno de los cuales puede dar lugar a una copia, cada una para cada célula hija. La duplicación de la información provoca automáticamente el aumento de la seguridad y la protección del material genético, además de porque la estructura es muy cerrada y las bases están protegidas en el centro frente a agresiones químicas del exterior.

Antes del modelo de Watson y Crick se desarrollaron tres posibles hipótesis de replicación del ADN: la conservativa, en que la doble cadena hace de molde de otra doble cadena igual; la semiconservativa (propuesta en el modelo), en la que cada hebra sirve de molde para fabricar la cadena complementaria, con lo que se obtienen dos dobles hélices; y la dispersiva, en la que la replicación se hace a trozos dispersos más o menos al azar que luego se unen y forman dos dobles hélices con secuencias de distintos orígenes. Meselson y Stahl elaboraron, sobre la base del modelo de Watson y Crick, experimentos de centrifugación diferencial de ADN en gradientes de CsCl según tuviera el isótopo 15N o el normal 14N. Los resultados de los ensayos sólo son coherentes con el modelo semiconservativo y, además, descartan cualquier otro propuesto hasta la fecha.

Las dos hebras de una molécula de ADN se pueden separar de diversas formas, ya sea por temperatura o por fuerza iónica, y esa cualidad se utiliza para su estudio. Esto significa que la estabilidad de la estructura helicoidal depende de unos factores tanto externos como internos, entre los que se encuentran:

• Puentes de hidrógeno internos entre las bases.

• Fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas entre los pares de bases.

• Puentes de hidrógeno externos entre el esqueleto y el agua.

• Estabilización catiónica de los fosfatos del esqueleto mediante iones divalentes metálicos cono Mg2+ y, en menor medida Ca2+, y también con policationes orgánicos como espermidina y putrescina.

Las bases exponen cada uno de sus lados a los surcos mayor y menor. De estos dos, sólo el mayor es representativo de la secuencia, y es el que utilizan las enzimas para leer el ADN, aparte de que el surco menor es ya de por sí muy pequeño para que quepa nada. Se podría considerar que las bases exponen su lado con información en el surco mayor, porque todas son distintas por ese lado. Esto es de extrema importancia para la detección de secuencias específicas por parte de los factores de transcripción y de todas las demás proteínas que interaccionan específicamente con ADN.

Otras estructuras en ADN.

El modelo de Watson y Crick representa la estructura de ADN más común en la célula, llamada ADN-B. Además de esta estructura, también se han encontrado otras variantes en determinados sitios del genoma. Estos cambios se producen en secuencias muy cortas y suelen tener implicaciones importantes en la regulación de la expresión génica porque representan cambios reconocibles en la superficie de la molécula de ADN. Los cambios estructurales responden a cambios en la conformación de los enlaces de los nucleótidos: conformación endo o exo, anti o syn, y todos los demás enlaces que implican al fosfato y los carbonos del esqueleto externo.

ADN-A.

Es una hélice dextrógira de 11 residuos por vuelta, cada uno de los cuales sube 2,55 Å, con lo que queda una hélice más ancha y corta que la del ADN-B de Watson y Crick (23 Å de diámetro frente a 20 y 28 Å de paso frente a 35,7). Esto origina una rotación menor de cada par de bases respecto al anterior, que pasa de 34,3 a 33 Å, con lo que se permite una mayor compresión de las bases que genera una inclinación mayor (20 Å frente a -6) y que todos los pares de bases se sitúen en la periferia interna de la hélice. Por esta característica el ADN-A tiene un hueco en su eje y los puentes de hidrógeno ya no están centrados en él.

Todos estos cambios que permiten un mayor apilamiento de las bases están originados por un único cambio en la conformación de la pentosa, que pasa de tener C2'-endo a C3'-endo, lo que obliga al esqueleto a, literalmente, contraerse porque se reduce la distancia entre átomos consecutivos de fósforo de 7 Å en el ADN-B a 5,9 Å en este ADN-A. Esto permite recorrer más residuos por vuelta, lo que deriva en todos los cambios que se han descrito.

La importancia del cambio de ADN-B a ADN-A cambia la conformación de la superficie de la molécula, es decir, la anchura y profundidad de los surcos. Esto tiene una especial importancia para la regulación de una expresión génica, dado que las regiones reguladoras con sitios de unión de factores de transcripción pueden sufrir estas transiciones estructurales.

Algo que el profesor no ha mencionado, pero que yo he notado y que viene en las fotocopias, es que el surco mayor pasa a ser el menor, y viceversa, con lo que el lado accesible de las bases ya no es el informativo, sino el que no se puede leer, y esto podría tener implicaciones como las descritas antes.

ADN-Z.

Es una hélice más estilizada que las dos anteriores, pero la principal característica del ADN-Z es que la doble hélice es levógira. Evidentemente esto implica dos cosas: la estructura sufre un cambio radical, y la hélice sólo se puede conseguir dándole la vuelta a las bases, para mantener los puentes de hidrógeno descritos por Watson y Crick. Esta estructura de ADN sólo se puede dar en regiones cuya secuencia es PuPyn, y se ha estudiado in vitro mediante oligonucleótidos GCn. En este tipo de secuencia las guaninas (purina) se unen al azúcar en conformación syn, en lugar del anti normal en ADN-A y B, y cambian de C2' endo en ADN-B a C3' endo en ADN-Z. Las citosinas podrían hacer lo mismo, pero como la conformación syn está estéricamente impedida en las pirimidinas, por el oxígeno en 2', en este caso es todo el nucleósido (la citosina y la desoxirribosa) el que se da la vuelta, gracias a la flexibilidad de los enlaces que flanquean cada átomo de oxígeno (O5' y O3') [corregir esto en la anterior entrega]. Como consecuencia del giro del nucleósido entero, el esqueleto de azúcar-fosfato aparece retorcido en el ADN-Z, de modo que las distancias entre átomos de fósforo ya no son constantes y es mayor entre los que flanquean una G (7 Å) que entre los que flanquean una C (5,9 Å), produciendo una línea quebrada. Todas estas características hacen que en el ADN-Z la unidad estructural básica sea el dinucleótido GC, en lugar de los nucleótidos individuales.

Las zonas de ADN-Z se intercalan como pares PuPy en regiones puntuales de ADN-B. Este cambio provoca una distorsión enorme, además de generar un punto de inestabilidad, ya que en la interfase estructural las bases no están apiladas correctamente unas encima de las otras y se pierde la interacción, y se permiten más giros o curvamientos bruscos que en otros tipos de estructura de ADN.

Localización de cada tipo de estructura en la célula.

El ADN-B es el tipo mayoritario de ADN, y se encuentra normalmente en condiciones fisiológicas de humedad y salinidad. El ADN-A se forma al bajar la humedad en el laboratorio hasta el 75%, pero también se ha comprobado su existencia in vivo en algunas esporas (que están muy deshidratadas) y en determinadas secuencias cortas polidC·polidG, y en todos los segmentos de doble cadena de ARN (en ARNt y ARNr) y en los híbridos de ADN·ARN debido al hidroxilo en C2'. En este caso se dice que el ARN tiene estructura ARN-A o ARN-11, porque caben once residuos por vuelta como en el ADN-A. Hay muchas más estructuras de ADN:

• ADN-C: Reduciendo más la hidratación.

• ADN-D: 8,5 pb/vuelta. Se presenta en regiones polidA·polidT.

• ADN-T: En el genoma de algunos tipos de fagos.

El ADN-Z aparece en plásmidos para relajar tensiones debidas a superenrollamiento negativo, y en eucariotas aparecen secuencias que potencialmente adquieren esta estructura en regiones esenciales para el metabolismo de ácidos nucleicos y la expresión génica, porque se asocia a regiones de comienzo de la transcripción (caja GACA o secuencia -35).

Variaciones en la estructura.

La estructura global del ADN, independientemente de cuál se trate, es en realidad un promedio de pequeñas variaciones sobre el total, cada una de ellas generadas por cada par de bases. Es decir, la secuencia determina las variaciones puntuales en la estructura global, pero no cambia esta última. Esta característica de conservar una estructura superior y promediada a base de acumular, o a pesar de que existan pequeñas variaciones incorporadas o producidas por cada parte de ella, se llama metaestabilidad. El ADN es un inmenso repertorio de estructuras distintas y cambiantes, incluidas cada una de ellas por cada par de bases distinto, pero que sumadas todas las variaciones resulta la estructura promedio que antes se ha descrito, por esto se dice que el ADN es metaestable.

Sin embargo, dado que el ADN no es una molécula rígida, la estructura se puede distorsionar muy fácilmente por, entre otras cosas, los agentes intercalantes. Éstos son moléculas pequeñas, apolares y generalmente aromáticas o planas, de tal modo que pueden introducirse entre dos pares de bases consecutivos y forzar una distorsión en la hélice. Estos compuestos se utilizan en el laboratorio para detectar ácidos nucleicos, aprovechando que la mayoría de estas sustancias también son fluorescentes cuando se exponen a luz ultravioleta (bromuro de etidio, naranja de acridina). Estas sustancias son capaces de introducirse entre las bases porque la estructura del ADN no es inmutable, sino que existen determinados momentos en los que la vibración propia de toda molécula provoca un estiramiento puntual de la hélice y, consecuentemente, la separación de los pares de bases adyacentes. Ese momento es el que permite al agente intercalante introducirse entre los dos pares de bases, donde se quedará porque establece interacciones hidrofóbicas con ellas.

ADN triple.

Se pueden producir asociaciones de tres cadenas de ADN si tienen secuencias poliPu o poliPy. Se puede considerar como una doble hélice poliPu·poliPy a la que se enrolla otra de cualquiera de los dos tipos anteriores sobre su surco mayor, con orientación distinta según tenga sólo Pu o sólo Py. Esta asociación ocurre en determinados sitios dependiendo de la secuencia, y generalmente forma parte de alguna estructura terciaria sobre una sola hélice doble en la que una hebra vuelve a enrollarse sobre sí misma. En esta triple hélice se observan apareamientos entre bases que no son los de Watson y Crick, sino que aparecen mezclados con otros raros, como los e Hoogsten, pero la estructura es bastante menos estable que un hélice doble convencional.

Estabilidad del ADN.

La estabilidad de una doble hélice de ADN depende de muchos factores, tanto internos como externos, de los que todos se producen a la vez y cooperativamente:

• Grado de polaridad del solvente. El ADN es más estable cuanto más polar sea el medio.

• Tipo y concentración de iones. La estabilidad aumenta cuanto mayor sea la concentración de cationes divalentes en el medio.

• pH. Cuanto menor es el grado de pH, más estable es la doble hélice, porque al aumentar la basicidad pueden llegar a desprotonarse las bases e impedir la formación de puentes de hidrógeno.

• El porcentaje de pares G·C frente a A·T. La unión de G con C se realiza a través de tres puentes de hidrógeno, mientras que la unión A·T sólo tiene dos. Cuanto mayor sea la proporción de G + C, mayor será la estabilidad. Este apareamiento se produce espontáneamente entre bases sueltas.

• Apilamiento de bases. Este fenómeno es también espontáneo en una solución de bases sueltas.

Siempre se tiende a pensar que el ADN se mantiene en su configuración de doble hélice gracias a los puentes de hidrógeno, pero en la mayoría de los casos no es así, sino que lo que mantiene unida la estructura son las interacciones hidrofóbicas y las fuerzas de Van der Waals que se dan entre pares de bases contiguos. La importancia de los puentes de hidrógeno es, más bien, la especificidad que otorgan a la molécula y a todos los procesos en los que se ve implicado algún tipo de ácido nucleico, siendo su contribución a la estabilidad de la doble hélice algo secundario aunque nada desdeñable.

Desnaturalización y renaturalización del ADN.

Desnaturalización.

La desnaturalización de una molécula de ADN de doble cadena implica la separación de las dos hebras. Esto se consigue aumentando el pH hasta niveles en los que todas las bases se encuentren desprotonadas y, por tanto, no se establezcan puentes de hidrógeno, o también elevando la temperatura para separar las hebras mediante el aumento de la vibración térmica. Cualquiera de los métodos anteriores, aunque se utiliza más el segundo, permite obtener dos moléculas de ADN de cadena sencilla sin conformación alguna en la que no hay puentes de hidrógeno ni apilamiento de bases, partiendo de una doble hélice.

La separación en dos hebras lleva aparejados una serie de cambios en las variables macroscópicas de una disolución de ADN:

• Se pierde la viscosidad característica de las disoluciones de ADN de doble cadena. Esto se debe a la pérdida de la conformación helicoidal, relativamente rígida y que forma hilos largos, y la sustitución por una estructura sin conformación definida, capaz de formar ovillos que presentan mucha menos fricción intermolecular y, por tanto, menos viscosidad.

• Se produce un aumento de la absorción a 280 nm. Este es el llamado efecto hipercrómico, que se produce porque la pérdida de las interacciones hidrofóbicas y las fuerzas de Van der Waals entre las bases libera a los electrones que estaban anteriormente implicados, con lo que ahora contribuyen a la absorción de radiación. Este aumento puede llegar a ser de un 40% entre las formas de cadena doble y sencilla, pero la forma del espectro no cambia.

El efecto hipercrómico se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN que se tiene en forma de doble hebra o de cadena sencilla. Al representar la temperatura frente a la absorción a 280 nm se observa una curva sigmoidea, con lo que se deduce que las fuerzas que estabilizan la estructura helicoidal son cooperativas, es decir, cuesta mucho romper las primeras interacciones estabilizantes, pero una vez conseguido el resto se rompe muy fácilmente. Hay un umbral mínimo de energía a partir del cual el proceso de desnaturalización es muy rápido.

La temperatura a la cual se ha conseguido separar el 50% de las hebras se llama temperatura de fusión TM (de melting: fusión en inglés), y da un valor representativo de la estabilidad de una secuencia determinada de ADN. Se ha comprobado que este valor depende de todos los factores que dan estabilidad al ADN, pero sobre todo depende de la cantidad de pares G·C que haya, es decir, de la cantidad de puentes de hidrógeno que se establezcan. Esto pone de relevancia que estos enlaces también contribuyen de manera importante a la estabilidad de la doble hélice o, más bien, que todos los procesos o características que estabilizan la estructura actúan conjunta y cooperativamente. Se ha caracterizado una relación lineal entre el porcentaje de G + C y la TM, de modo que ésta aumenta 0,4 ºC cada 1% más de G + C. En el hombre y los mamíferos el porcentaje medio de G + C es de un 40%, con lo que la temperatura de fusión ronda los 87 ºC, pero hay zonas del genoma, concretamente los promotores, en los que la proporción de G + C sube hasta un 60%, con lo que son zonas del ADN especialmente estables en las que la TM tiene un valor de hasta 95 ºC.

También se ha encontrado una relación directa de la temperatura de fusión con la concentración de cationes en el medio, que era otro de los factores estabilizantes a los que se aludía antes. Concretamente los cationes monovalentes estabilizan la estructura inespecíficamente (Na+, Li+, K+), y los divalentes son más específicos y efectivos y son los que se utilizan en experimentos donde es necesaria una regulación fina de la estabilidad del ADN (Mg2+, Ca2+ aunque menos utilizado). Algunos de estos procesos incluyen la amplificación en PCR, donde la concentración de sal es uno de los parámetros a optimizar, ya que esta técnica se basa en la regulación de la estabilidad de las moléculas de ADN para un apareamiento selectivo de una que interesa (el cebador). Tan previsible es la TM que hay fórmulas para hallarla, entre las cuales ésta es un ejemplo:

TM = 0,411(% de G + C) + 16,6[Na+] + 81,5

Renaturalización.

La renaturalización de moléculas de ADN es el proceso contrario al de la desnaturalización, es decir, se parte de dos hebras sencillas para volver a formar una doble hélice. Éste es también un proceso cooperativo en el que hace falta un primer apareamiento estable que haga de semilla para después seguir a lo largo de las hebras a modo de cremallera. La formación de esas primeras interacciones se llama nucleación, y necesita una mínima cantidad de tiempo para que se den los contactos necesarios entre las bases complementarias. Sin embargo, a diferencia de la desnaturalización, para la correcta renaturalización del ADN hace falta que se baje la temperatura lentamente y no muy por debajo de la TM (10 ó 15 ºC menos) para mantener el equilibrio desnaturalización-renaturalización (que las moléculas puedan moverse y encontrarse, pero que las uniones no correctas no sean tan estables ni permanentes) y evitar que apareen secuencias ligeramente homólogas donde no deben. Si se bajara la temperatura bruscamente se formaría un gel de moléculas de hebra sencilla parcialmente apareadas en segmentos cortos con homología secuencial, incluso dentro de una misma hebra. Esta característica se utiliza para guardar muestras de ADN que se quieran conservar como hebras sencillas.

Hibridación de ADN.

Las técnicas de hibridación de ADN se basan en la detección de secuencias específicas, ya sea sobre tejido (hibridación in situ; para ver la localización celular del ácido nucleico que se busque) o sobre ácidos nucleicos purificados (sobre ADN técnica de Southern; sobre ARN técnica de Northern), mediante el empleo de sondas. Éstas son fragmentos cortos de ácido nucleico sintetizado en el laboratorio, cuya secuencia es la complementaria de aquélla que se busca y están marcados de algún modo para poder luego detectarlos con facilidad. Existen varios tipos de sondas:

• ADNss: Se utiliza para detectar ARNm. Generalmente sólo puede tener una marca radiactiva en un extremo.

• ADNds: Primero se desnaturaliza y se enfría rápidamente para obtener ADNss, que es el que se usa. Sin embargo, este método provoca la competencia entre las mismas moléculas de la sonda, con lo que se pierde efectividad. La ventaja es que suelen ser más largos que los ADNss y, al ser de cadena doble, se puede introducir más radiactividad y a la postre el resultado puede ser más sensible.

• ADNc (ds): Son copias complementarias a un ARNm, utilizados como las sondas anteriores.

• ARNc (ss): A veces es la técnica más sensible. Para esto se parte del ADNc de la proteína que se quiere estudiar, al que se le añade un promotor y un sitio de corte al final. Sobre esto se añade la polimerasa correspondiente a ese promotor y una colección de nucleótidos, que pueden estar todos marcados. El ARN que se forma es el ARNc, con secuencia complementaria a la del ARNm. Si no se conoce la orientación del ARNm, entonces se colocan dos promotores y dos sitios de restricción a sendos lados del ADNc, y se obtiene una colección de ARNc, cada uno complementario de una hebra, y la mitad de ellos complementarios del ARNm. Como se incorpora una gran cantidad de marca, después se trata con una ARNasa que elimina los restos de ARNss para resaltar el contraste, y ésta es la gran ventaja frente a las sondas de ADN.

Los experimentos de hibridación se basan en la complementariedad de bases, pero también puede haber secuencias cortas o incluso componentes celulares que hibriden o se asocien inespecíficamente a la sonda. Para minimizar este problema se juega con las condiciones de hibridación (renaturalización: Tª, concentraciones) y de lavado (desnaturalización), sobre todo con estas últimas. Se puede hibridar a temperaturas más altas, para que la unión sea más específica, pero sobre todo se procede a un lavado riguroso después de hibridar a unas condiciones poco severas, aumentando la temperatura y bajando la concentración de iones para que sólo queden apareadas las sondas con sus secuencias complementarias.

Estructura terciaria.

Estructuras en horquilla.

Aparece frecuentemente en ácidos nucleicos de cadena sencilla que tengan regiones complementarias en su propia secuencia. La estructura básica es una doble hélice en cuyo extremo hay un bucle de unas cuantas bases desapareadas. Normalmente también hay bucles internos dentro de la hélice en los que no hay complementariedad de bases, e incluso nucleótidos que no encajan entre dos pares de bases y bien salen hacia fuera o bien se intercalan entre ellos, pero de todos modos se encuentra en una situación energéticamente desfavorable. Esta estructura es muy importante para determinadas proteínas, porque determina la función (como ocurría con la forma de las proteínas), sobre todo de ARNt, ARNr y los ARNsn (fragmentos U).

Hay programas de ordenador capaces de determinar la estructura de una molécula de ácido nucleico teniendo en cuenta el balance energético entre la estabilización por cada base apareada y la desestabilización por cada base no desapareada, según esté en un bucle interno, terminal, o sin pareja en una doble hélice. Mediante estas técnicas se puede inferir la estructura más estable.

Esta estructura se encuentra también en algunos virus de ADN, en los que ayuda a su propia replicación.

Repeticiones invertidas.

En los ácidos nucleicos pueden aparecer secuencias de unos 10 a 15 nt (aunque pueden ser más largas) que tienen una repetición complementaria y en sentido contrario al que están definidas y que, además, pueden estar separadas o no por nucleótidos no simétricos.

En el caso de ADNds, las repeticiones invertidas están próximas entre sí y, además, también existen en la hebra complementaria, con lo que se forma una estructura doblemente simétrica (o también con un eje de simetría) llamada palíndromo. En este caso la formación de bucles en cada hebra por el método descrito antes implica la separación previa del ADN en sus dos hebras partiendo del eje de simetría y la posterior nucleación y reapareamiento sobre la propia hebra. Al final se obtiene un doble bucle que por su forma recuerda una cruz y, por tanto, se llama cruciforme. La energía necesaria para separar la doble hélice en sus dos hebras se recupera luego en la formación del cruciforme.

En el caso del ARNss, cuando se copia el palíndromo de ADN en ARNm, se permite el establecimiento de apareamientos intracatenarios, lo que generaría algo parecido a una horquilla, pero a menor escala y en un rango mucho menor de nucleótidos. Este mecanismo es el que se utiliza en la regulación de la expresión génica en bacterias mediante atenuación, que consiste en la formación de un bucle de unos 15 pb en distintos sitios de la molécula de ARNm según las disponibilidades de elementos para la síntesis de las proteínas del operón correspondiente (recordar el operón Trp).

La importancia de los cruciformes en el ADNds es la capacidad de intercambio con otras estructuras como superenrollamientos negativos, lo que es muy importante en la topología y regulación metabólica del ADN.

Topología.

Se llama topología del ADN a la forma tridimensional que adquiere esta molécula en el espacio. Los elementos anteriores considerados como estructuras terciarias son, realmente, una extensión tridimensional de la estructura secundaria. Hay que decir a este respecto que el límite entre estructura secundaria y terciaria, e incluso otras estructuras de orden superior e inferior está muy difuso en los ácidos nucleicos, no como en las proteínas que los límites son claros. De todos modos, la verdadera estructura terciaria “tridimensional” es lo que se conoce como topología de ADN. Para estudiarla hace falta tener en cuenta una serie de conceptos, y recurrir insistentemente a ellos:

• La doble hélice de ADN es una estructura flexible y que se puede doblar, a veces muy bruscamente.

• Los cambios en la topología son esenciales para la función y regulación del metabolismo del ADN.

• El número de bases por vuelta es flexible y ajustable según las circunstancias y las necesidades de distintos procesos o secuencias concretas del ADN.

• La flexibilidad de una determinada región en la doble hélice provoca un cambio opuesto y complementario en las zonas adyacentes. Es decir, que si la hélice se relaja en un punto determinado, las regiones que flanquean la zona relajada sufren una sobretensión equivalente.

• El curvamiento del ADN responde a condiciones fisiológicas y también puede ser provocado por unión a distintas estructuras, generalmente proteicas y relacionadas con la transcripción o la replicación.

• El ADN se tiene que separar en sus dos hebras para poder realizar los procesos citados anteriormente. Paralelamente, los organismos cuyo material genético es ADNss deben adquirir estructura de doble hélice para replicarse.

• Por tanto, la estructura del ADN es extremadamente dinámica.

Curvamiento del ADN.

El curvamiento de las dobles hélices puede deberse a la propia secuencia de pares de bases, a la aparición de interacciones con proteínas, o a ambas cosas a la vez. Si nos limitamos a una doble hélice sin más elementos externos o internos que distorsionen la estructura, existe una longitud mínima, llamada de persistencia, en la que el ADN no se puede doblar y es de unas 200 pb. Sin embargo, existe un microorganismo patógeno cuyo ADN mitocondrial (ADNmit) tiene zonas de 200 pb capaces, no sólo de curvarse, sino de formar círculos, observación corroborada por los datos de movilidad electroforética, en los que se aprecia una menor distancia recorrida que para un fragmento lineal del mismo peso molecular. Esto indica un fuerte curvamiento que hace que la molécula de enganche más a menudo en el gel de electroforesis.

La hipótesis para explicar este curvamiento anómalo es la existencia de una secuencia P que específicamente hace que el ADN se curve. Para determinar la posición de la secuencia se obtuvo un dímero del ADNmit uniendo dos moléculas cabeza con cola, y tratando luego con distintas enzimas de restricción para obtener una colección de moléculas circularmente permutadas. Cada una de estas moléculas tiene el mismo peso molecular, que es igual al de la molécula de origen, pero su secuencia está desplazada ligeramente entre cada tipo de molécula modificada. Esto permitió predecir los resultados del ensayo en base a la hipótesis formulada. La mayor o menor movilidad electroforética de cada especie deberá indicar la mayor o menor proximidad de la secuencia P al extremo, ya que si se aleja del centro de la molécula el efecto de curvatura del ADN será menor y, por tanto, la movilidad mayor.

El ensayo permitió determinar una secuencia característica alrededor del nt 140, en la que se repetían grupos de 5 ó 6 A cada 10 nt, es decir, cada vuelta. Los segmentos de poli-A tienen un ángulo de rodada característico que, junto a todos los demás, forman lo que se llama un sitio de curvamiento (bending locus), y su situación estratégica cada 10 nt hace que estén todos en el mismo lado de la hélice, con lo que el efecto de curvatura se suma; se dice que están en fase. Si, por el contrario, la fase es cada 16 nt (vuelta y media), entonces se disponen las secuencias alternativamente a cada lado de la hélice, con lo que se consigue una molécula en zigzag. Experimentalmente se demostró que grupos de 3 ó 4 A espaciados 10 nt hacen que el ADN se curve, y no cualquier otro espaciamiento distinto.

Aparte de secuencias con curvatura, también hay secuencias susceptibles de ser curvadas en determinados momentos, sobre todo cuando se produce la unión con proteínas. Puede darse cualquier combinación, desde ADN curvo que sirve para unir proteínas hasta proteínas que obligan al ADN a curvarse, pasando por todos los estados intermedios. Un ejemplo es la unión de la proteína CAP (catabolyte activator protein: proteína activadora de catabolito) a la región operadora del operón lactosa. Esta región está curvada, y la unión es específica para esta proteína. La demostración de la curvatura del ADN se realizó mediante un experimento de características similares las del de arriba.

La curvatura del ADN también se encuentra en el sitio de origen de la replicación. Se ha estudiado en detalle el virus SV40, en el que existe una secuencia de poli-A que aporta una gran flexibilidad a la zona. Cuando el virus entra en la célula se produce una proteína llamada antígeno T que, dimerizado, se une específicamente a la zona del origen de la transcripción para permitir la apertura de la hélice y que comience la replicación del virus. En otros orígenes de replicación también se encuentran grupos de poli-A en fase que aportan la flexibilidad necesaria para poder abrir la hélice.

Una manera de provocar curvaturas en el ADN es mediante la introducción de fotodímeros de T debido a la excitación con luz ultravioleta. La dimerización impide el giro de una base respecto a la otra, por lo que se provoca un curvamiento en la hélice. El sistema de reparación específico de esta distorsión no reconoce el dímero de T hasta que no encuentra previamente la distorsión de la doble hélice.

En eucariontes el inicio de la transcripción depende siempre de la unión de factores proteicos específicos. Siempre hace falta la unión de un primer factor a la zona del promotor, exactamente a la caja TATA. Este factor (TBP: TATA binding protein; proteína de unión a TATA) provoca un curvamiento muy brusco, casi se diría que es una doblez, en la doble hélice. Esta distorsión tan enorme es la que realmente permite la unión posterior de otros factores de transcripción y, finalmente, la ARN polimerasa. Sin la curvatura inducida por TBP no sería posible la transcripción.