Fundamentos y técnicas de análisis bioquímicos

Diagnóstico médico. Patologías. Metabolismo. Hormonas. Fases. Control. Métodos y mediciones. Analizadores

  • Enviado por: Bako
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FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICOS

UT 1. MÉTODOS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICOS (24/09/01)

  • INTRODUCCIÓN

    • LABORATORIO DE BIOQUÍMICA: se aplican métodos químicos y bioquímicos en el estudio de la enfermedad. Los estudios bioquímicos constituyen una tercera parte de todas las determinaciones del Laboratorio.

    • UTILIDADES: diagnóstico. Valoración del pronóstico y del tratamiento, investigación, ensayos clínicos de fármacos.

  • PROCESO ANALÍTICO

  • 2.1. FASE PREANALÍTICA

    • Correcta cumplimentación de la petición analítica: legible, datos mínimos imprescindibles (edad, sexo, raza, fecha de la solicitud) y datos complementarios (juicio clínico, semanas de embarazo, día del ciclo en caso de hormonas sexuales en mujeres, medicación, etc..

    • Preparación del paciente: (25/09/01)

      • Ayuno: se aconseja de forma generalizada. Se puede beber agua.

      • Alcohol: altera la concentración de lactato, ácido úrico, enzimas hepáticas...

      • Tabaco: contraindicado si se piden catecolaminas, cortisol, ácidos grasos...

      • Ejercicio físico: altera los niveles de enzimas musculares como la creatinfosfoquinasa (CPK).

      • Estrés: puede alterar los resultados de los análisis.

      • Dieta: algunos parámetros requieren restricciones o cambios en la dieta previos a la determinación. Ej. Aclaramiento de creatinina: no tomar exceso de carne.

      • Supresión de la medicación: para el aclaramiento de creatinina suprimir por ejemplo antiinflamatorios no esteroideos.

    • Obtención de la muestra:

      • Extracción de sangre: en posición sentado o tumbado.

      • Recogida de orina de 24 horas: algunos parámetros requieren condiciones de acidez por lo que habrá que añadir un ácido al recipiente de recogida (Ej. El 5-hidroxiindolacético, aldosterona en orina, etc).

      • Niveles de fármacos: hay que tener en cuenta la hora de la administración. Se suelen tomar las muestras 3-4 horas antes de la siguiente dosis. Hay casos particulares.

      • Ritmo cardíaco: hay que tenerlo en cuenta para algunas sustancias como ACTH, cortisol, etc.

    2.2. FASE ANALÍTICA

    • TÉCNICAS ANALÍTICAS: son los diferentes procedimientos de análisis basados en el comportamiento de la materia ante la Energía:

      • Espectrofotometría: autoanalizadores - Electroforesis

      • Cromatografía - Electroquímica

      • Química seca - Inmunoensayos

    (25/09/01)

    • MÉTODOS ANALÍTICOS: son aplicaciones de las técnicas, en casos determinados, con parámetros y protocolos concretos. Su nombre hace referencia a:

  • Alguna característica analítica: método del punto final, métodos cinéticos, métodos colorimétricos, métodos enzimáticos, métodos de curva de calibración, etc.

  • Alguno de los reactivos usados: método de la glucosa-oxidasa, método del verde bromocresol, etc.

  • A la persona que optimizó el método: método de Biuret, método de Jaffé, etc.

  • FASE POSTANALÍTICA

  • Es el conjunto de procesos que van desde la obtención de los resultados analíticos hasta que el clínico solicitante tiene el informe de resultados. Es una fase compleja pero decisiva para cumplir una calidad total.

    • Validación de resultados

            • Valoración técnica: es la aceptación de los resultados obtenidos por las distintas técnicas.

            • Valoración clínica: los resultados deben ser coherentes con la clínica.

          • Informe de resultados

          • Tiempo de respuesta: es el tiempo que transcurre hasta que se entregan los resultados al médico solicitante. Debe ser lo más corto posible, sin sacrificar la calidad.

          • Teoría de los valores de referencia: son intervalos de normalidad de los resultados, los límites superior e inferior no son rígidos (se pueden usar los valores anteriores del propio sujeto aunque normalmente no se tienen datos suficientes).

          • Variabilidad de los resultados analíticos:

            • Variaciones analíticas: toda determinación analítica está sometida a una variación que se denomina “error analítico”

            • Variaciones extraanalíticas: pueden ser fisiológicas, tanto interindividuales como intraindividuales.

  • CONTROL DE CALIDAD

  • Control de calidad interno:

  • Calidad en el Laboratorio: se basa en controlar los resultados que emite el Laboratorio. Es muy importante porque la calidad de los resultados analíticos puede afectar a la salud de las personas y puede traer importantes consecuencias económicas. Para controlar la calidad del Laboratorio se pone en marcha el “programa de control de calidad”.

  • Programa de Control de Calidad: (25/09/01)

    • Objetivos:

    1. Asegurar que los datos producidos por un determinado método analítico son científicamente válidos, defendibles ante terceras personas y tienen unas conocidas y aceptadas precisión y exactitud.

    2. Evaluar de forma real la capacidad funcional habitual de un Laboratorio con respecto a otros.

    3. Identificar problemas a medida que surgen.

    4. Resolver los problemas.

    • Requisitos:

    • Participación de todo el personal del Laboratorio.

    • Debe ser coordinado con la máxima eficacia por el responsable de la calidad.

    • Se debe informar periódicamente al personal del Laboratorio.

      • Fundamento: el control de calidad se basa en la manipulación de datos estadísticos que se obtienen de la repetición de los ensayos. Se realizan un conjunto de experimentos sistemáticos encaminados a asegurar la precisión y la exactitud de los análisis.

      • Concepto de Exactitud y Precisión:

      Exactitud: es el acercamiento de un resultado o de la media de un grupo de resultados al valor verdadero o a un valor aceptado como tal.

      Precisión: es el grado de concordancia entre medidas repetidas de una misma muestra, es decir, está relacionada con la dispersión que tiene varias determinaciones de una misma muestra.

      El valor numérico que define la precisión es la Desviación Estándar:

      Y también se define por otro valor, que es el Coeficiente de Variación:

      Para calcular la SD se deben determinar como mínimo 20 mediciones sucesivas del parámetro en cuestión.

      El 95% de los resultados deben encontrarse entre los siguientes valores:

      • X ± 2 SD

      • En la práctica X ± 3 SD

      (26/09/01)

      La SD expresa la amplitud de la variación de los resultados de tal manera que ésta se debe sólo a errores aleatorios y los valores se distribuyen como una curva normal o de Gauss:

      • Tipos de errores experimentales:

            • Errores Sistemáticos: son de causa ajena a lo que es el propio método en sí. Afectan tanto a la exactitud como a la precisión. Estos errores no deben existir, siempre que se de uno hay que buscar las causas y evitarlo.

            • Errores Aleatorios: rigen la precisión del método y dependen del propio método. No se pueden evitar.

            • Control de calidad interno basado en el empleo de muestras control.

            • C.1. SELECCIÓN DE LAS MUESTRAS DE CONTROL DE CALIDAD: se emplean preparados comerciales de referencia que son liofilizados.

              C.2. GRÁFICOS CONTROL: hay distintos tipos, el más extendido en el LDC es el “gráfico de Levey-Jennings”, en el cual los resultados de control son expresados en el eje de ordenadas con respecto al tiempo o a las determinaciones sucesivas en el eje de abcisas.

              Se introduce la muestra control una vez al día o una vez por turno de trabajo y se van anotando los resultados del análisis. Cuando tengamos como mínimo 20 determinaciones se hace la interpretación del gráfico.

              En la gráfica se apunta el valor medio esperado que es el valor que resulta de la media de todos los valores de las muestras de referencia analizadas. El valor medio esperado se utiliza para valorar la precisión del método.

              En el caso de la exactitud será el valor medio de referencia que tiene la muestra control cuando es suministrada por el Laboratorio de referencia.

              El valor medio se representa como una gruesa línea en el centro de la gráfica. Se señalan los límites de control aceptados, que se representan por una línea de puntos en el gráfico de control.

              (26/09/01)

              Modificaciones frecuentes en los gráficos de control:

              • Dispersión: cuando los errores aleatorios o la imprecisión aumentan

              • Tendencia: es la desviación sistemática de los valores observados cuando el método analítico sufre un problema en desarrollo progresivo.

              • Desviación: es una modificación abrupta o brusca con respecto al valor medio establecido.

              TÉCNICA MULTIRREGLA DE WESTGARD

                    • 1: 3 SD una observación supera la media ± el límite de 3SD

                    • 2: 2 SD dos observaciones consecutivas superan la misma media ± 2SD

                    • R:4 SD dos observaciones consecutivas se diferencian más de 4SD

                    • 4: 1 SD cuatro observaciones superan la media ± 1SD

                    • 10:MEDIA diez observaciones caen a un mismo lado de la media.

              Las reglas 1:3SD y R: 4SD generalmente sugieren un error aleatorio. Las reglas 2:2SD, 4:1SD y 10:MEDIA suele ser un error sistemático.

            • Control de calidad externo

            • Tiene como objetivo principal conocer la comparación de los resultados analíticos de diferentes Laboratorios. En la actualidad existen 2 tipos de programas:

            • Programas de vigilancia o pruebas de eficacia, en las que gran número de laboratorios analizan las mismas muestras varias veces al año.

            • Programas de control de calidad regional, en los que un grupo de laboratorios de una Región emplea los mismos lotes de muestras control para su programa de calidad interno. Se analizan durante un período de aproximadamente un año y, los resultados son enviados semanal o mensualmente al suministrador de programa. Éste compara el valor medio y la SD con los otros laboratorios.

            • (27/09/01)

              UT. 2 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS DE ANÁLISIS I

            • NATURALEZA DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

            • La Radiación Electromagnética es una forma de Energía radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se define:

            • Longitud de onda (): es la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, según el S.I. en nanómetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1m =10 A0 = 10-9 m.

            • Frecuencia (): es el número de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su fórmula es:  = c/, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

            • Fotones: la luz está formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotón depende de la frecuencia y de la longitud de onda, según la siguiente expresión: E = h x  = h x c/ (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energía Electromagnética se mide el Ergios. La relación entre la longitud de onda y la Energía es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energía y viceversa.

            • Espectro Electromagnético: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos  de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las más interesantes para nosotros son:

              • Región Ultravioleta:  = 10-380 nm

              • Región Visible:  = 380-780 nm

              • Región Infrarroja:  = 780-30.000 nm

              En la Región Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molécula puede ser dispersada o absorbida.

            • FENÓMENOS DE INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y MATERIA

            • FENÓMENO DE ABSORCIÓN

            • Cuando una partícula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partícula en estado excitado. La molécula absorbe la E de la onda y aumenta su energía, y ese aumento de energía es igual a la E de la Radiación Electromagnética absorbida (E = h.). La partícula en estado excitado tiende a volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor.

              (27/09/01)

              “Espectro de Absorción”. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene un determinado espectro de absorción. El espectro de absorción es un gráfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de la espectrofotometría de absorción.

              Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

            • FENÓMENO DE EMISIÓN

            • Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisión de energía radiante. En este caso, lo que se mide es la energía emitida y, en este fenómeno se basa la “fotometría de llama” o la “fluorescencia”.

            • LEYES DE ABSORCIÓN

            • Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta pérdida de intensidad, debido a la absorción por parte de la sustancia.

              Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

              T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100.

              Se puede perder intensidad por la interacción con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solución de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a esta medida inicial y se harán en la misma cubeta que se utilizó en la medida del blanco.

              La Transmitancia se usa poco, se emplea más la Absorbancia (A) porque la relación entre A y la concentración de una solución es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional.

              (28/09/01)

              La relación entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

              • Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0

              • Si el %T = 0 A = 2-log 0 = "

              En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

              3.1. LEY DE BEER

              “La absorbancia de una solución es directamente proporcional ala concentración y a la longitud del paso de la luz”.

              A =  . b. c

              Siendo:

              A: absorbancia. No tiene unidades.

              : el coeficiente de extinción molar, también llamado coeficiente de absorción. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm).

              b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

              c: es la concentración del absorbente. Se mide en mol/L.

              La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentración y esto lo podemos hacer de dos formas:

            • Por comparación con una solución conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estándar (S), podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas:

            • A través de una curva de calibración: la curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración.

            • Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre Absorbancia y Concentración.

              Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtiéndose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los límites de linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno. En esta situación, hay que diluir la muestra para que su concentración entre en los límites de la linealidad.

              • Empleo de los Factores de Calibración: Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F.

              (03/10/01)

              4. ESPECTROFOTÓMETRO

              Se distinguen dos tipos de aparatos:

              • Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de una determinada longitud de onda.

              • Espectrofotómetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromático cuya longitud de onda se varía a voluntad. Los monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difracción.

              Monocromador de Prisma

            • COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO

            • 1. Fuente de luz: proporciona energía radiante en forma de luz visible o no visible.

              • Tipos de lámparas:

              • Lámparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta próximo. Son fuentes de un espectro continuo de energía radiante entre 360-950 nm.

              • Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duración y emiten energía radiante de mayor intensidad.

              • Lámparas de Hidrógeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la región ultravioleta entre 220-360 nm.

              • Lámparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de líneas que se utilizan para calibración de longitudes de onda, se emplean solo para espectrofotómetros y cromatografía HPLC.

              • Precauciones:

                • Las subidas y bajadas bruscas de tensión producen sufrimiento de la lámpara y cambios en las lecturas de la Absorbancia.

                • La lámpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato.

              (03/10/01)

              2. Rendija de entrada: tiene como función reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda.

              3. Monocromadores. Pueden ser:

              • Prismas: son fragmentos con forma de cuña de un material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.

              • Redes de difracción: son un gran número de líneas paralelas situadas a distancias iguales entre sí y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metálica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un pequeño prisma.

              4. Rendija de salida: tiene como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la muestra, que provocaría desviaciones a la Ley de Beer. (04/10/01)

              5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición. Pueden ser de distintos tipos y tamaños (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posición. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plástico.

              6. Detector. Puede ser de dos tipos:

              • Fotocélulas o células fotovoltaicas:

              Es una lámina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de Óxido de Cobre. A ésto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y éste desprende electrones, que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un amperímetro que señala el paso de corriente.

              Características: son resistentes; económicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batería externa, ni vacío,...; la corriente producida es directamente proporcional a la Energía que llega y tienen “efecto fatiga”, es decir, que presentan una subida inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.

              • Fototubos multiplicadores:

              (04/10/01)

              Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un cátodo que emite electrones de forma proporcional a la Energía que incide sobre él. Tiene un ánodo que recoge los electrones y la corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos ánodos que van teniendo un voltaje superior al precedente. La señal se amplifica en cientos o miles de veces.

              Características: el tiempo de respuesta es muy rápido, no tienen “efecto fatiga” tan altos como la anterior y son muy sensibles.

              7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energía eléctrica que recoge el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una célula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de señal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y cálculos automáticos de concentraciones con relación a las curvas de calibración.

              (05/10/01)

              4.2 TIPOS DE APARATOS

              • ESPECTROFOTÓMETRO DE HAZ SIMPLE: es igual que la descripción dada para el espectrofotómetro en general. Consta de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinómetro: para determinar bilirrubina directa en capilar).

              • ESPECTROFOTÓMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos los componentes están duplicados, menos la lámpara y el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo por los distintos componentes separados en el espacio. Esto compensa las variaciones de intensidad de luz y de absorbancia.

              • ESPECTROFOTÓMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO: utilizan los mismos componentes que el espectrofotómetro de haz simple. Dos haces de luz pasan por los mismos componentes pero no al mismo tiempo. Emplean un “Chopper” consistente en un interruptor rotativo del haz luminoso colocado a continuación de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la porción de luz reflejada por el “chopper” a través de una cubeta de referencia y de ahí al detector común. El detector lee alternativamente el haz procedente de la muestra y el de la cubeta de referencia. Esto compensa la variación de energía radiante.

              (05/10/01)

              UT. 3 MEDIDAS FOTOMÉTRICAS II

              1. FLUORIMETRÍA

            • CONCEPTOS GENERALES

            • Luminiscencia

            • Fluorescencia

            • INSTRUMENTACIÓN FLUOROMÉTRICA

            • Fluorómetro

            • Espectrofluorómetro

            • CARACTERÍSTICAS DE LA FLUORIMETRÍA

            • APLICACIONES

            • 2. FOTOMETRÍA DE LLAMA

            • CONCEPTOS GENERALES

            • Generalidades

            • Fundamento

            • Interpretación

            • INSTRUMENTAL

            • 3. ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

              3.1 PRINCIPIOS

              3.2 INSTRUMENTAL

            • Lámpara de cátodo hueco

            • Quemador

            • Componentes fotométricos

            • 3.3 ABSORCIÓN ATÓMICA

              4. NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA

              4.1 PRINCIPIOS. LEY DE RAYLEIGH

              4.2 DETECCIÓN DE LA LUZ DISPERSADA

            • Turbidimetría

            • Nefelometría

            • (09/10/01)

              1. FLUORIMETRÍA (FLUOROMETRÍA)

            • CONCEPTOS GENERALES

            • LUMINISCENCIA: es un fenómeno resultante de la interacción de la luz con la materia que tiene como resultado la emisión de energía radiante. Dentro de la luminiscencia se incluyen la fluorescencia, fosforescencia y la quimioluminiscencia.

            • FLUORESCENCIA: se produce cuando una molécula absorbe luz de una determinada longitud de onda y emite luz de una longitud de onda superior y, por lo tanto, de menor energía. Es un fenómeno más lento que el de la absorción. Así, entre la absorción de energía y la liberación en forma de fluorescencia se produce un retraso de 10-8 - 10-4 segundos, mientras que en la absorción, el retraso es de 10-15 segundos. Si el tiempo transcurrido es inferior a 10-4 segundos se habla de fosforescencia.

            • La relación entre la concentración de la sustancia y la intensidad de emisión fluorescente se deduce a partir de la Ley de Beer según la siguiente expresión: I = Intensidad transmitida

              I / I0 = 10-bc I0 = Intensidad de la luz incidente

               = coeficiente de extinción molar

              b = longitud de paso de la luz

              c = concentración

              Se llama “rendimiento cuántico de la fluorescencia” a la relación entre los fotones emitidos y los absorbidos:  = I / I0

              Puede ir desde 0, para sustancias no fluorescentes; hasta 1 cuando la fluorescencia es óptima.

              Realizando operaciones matemáticas, se llega a la conclusión de que la intensidad de la radiación fluorescente es proporcional a la concentración de la sustancia.

              La fluorimetría combina la simplicidad de la fotometría con la alta sensibilidad y especificidad del fenómeno fluorescente.

              1.2 INTRUMENTACIÓN FLUOROMÉTRICA

              Se utilizan dos tipos de aparatos:

            • FLUORÓMETRO: emplea filtros de vidrio o filtros interferenciales para seleccionar la longitud de onda de excitación y de emisión.

            • ESPECTROFLUORÓMETRO: emplea prismas o redes de difracción para seleccionar las longitudes de onda.

            • Ambos aparatos tienen como componentes básicos:

                • Fuente de energía radiante: son dos lámparas de arco de Xenón o lámparas de Mercurio. Emiten energía radiante de intensidad elevada.

                • Rendijas de entrada y salida (= que en el espectrofotómetro)

                • Monocromadores: pueden ser filtros o prismas o redes de difracción. Hay dos monocromadores:

                  • Monocromadores de excitación o primario, que selecciona las longitudes de onda de excitación.

                  • Monocromadores de emisión o secundario, que selecciona la longitud de onda de emisión antes que la luz llegue al detector.

                    • Cubetas: son de sílice o cuarzo. No todas las de plástico valen porque pueden originar fluorescencia adicional.

                    • Detectores: son fototubos multiplicadores. Amplían la pequeña señal fluorescente pudiéndola cuantificar. Son muy sensibles. El monocromador secundario y el detector están situados en ángulo recto en relación al haz de luz incidente para impedir que la luz procedente de la lámpara llegue al detector. Los espectros de absorción y emisión varían de un compuesto a otro, por lo que al hacer una determinación, hay que seleccionar la longitud de onda de excitación más adecuada, que es la de máxima absorción; y hay que seleccionar la longitud de onda de emisión más adecuada, que es la del máximo de fluorescencia.

              1.3 CARACTERÍSTICAS DE LA FLUOROMETRÍA (10/10/01)

                      • Tiene una muy alta sensibilidad. Es de 100 a 1000 veces más sensible que las técnicas colorimétricas normales.

                      • Las medidas de fluorescencia se expresan en unidades de intensidad relativa, se emplea lo que se llama “Rendimiento de Fluorescencia Relativo”.

              La señal electrónica variará para la misma concentración de una sustancia de un instrumento a otro y, por lo tanto, no se podrán comparar.

              • Las medidas de fluorescencia se deben hacer siempre en soluciones diluidas. La absorción debe ser como máximo del 2% de la radiación incidente. Por encima de esta absorbancia no se ilumina por igual todas las partes de la solución y, por lo tanto, se emitirá distinta fluorescencia en las distintas capas de la solución.

              • Las cubetas no deben tener ralladuras porque aumentan la dispersión de la luz; ni se deben tocar con los dedos las caras ópticas de las cubetas, porque se produce fluorescencia contaminante.

              1.4 APLICACIONES (10/10/01)

                • FLUOROINMUNOANÁLISIS: son anticuerpos marcados con una sustancia fluorescente, específicos de la sustancia que se va a estudiar.

                • DETERMINACIÓN de vitaminas, fármacos, algunas enzimas, etc.

              2. FOTOMETRÍA DE LLAMA

              2.1 CONCEPTOS GENERALES

            • GENERALIDADES: La fotometría de llama se basa en el fenómeno de emisión de luz. Se utiliza para la determinación de Sodio, Litio y Potasio (Na, Li, k) en líquidos biológicos.

            • FUNDAMENTO: un átomo en estado fundamental sometido a la energía calorífica de una llama excita sus electrones pasando éstos a niveles superiores de energía. Como allí son inestables, vuelven a su estado inicial emitiendo el exceso de energía en forma de luz. La luz desprendida puede tener distintas longitudes de onda. Se debe seleccionar para un elemento aquella longitud de onda en la que emite con mayor intensidad y hay menos posibilidades de tener longitudes de onda cercanas que interfieran.

            • INTERPRETACIÓN: la intensidad luminosa es directamente proporcional al número de átomos que emiten energía, que a su vez es directamente proporcional a la concentración del ión de la muestra.

            • Los metales alcalinos (Li, Na, y K) son los más fáciles de excitar con una llama. Al ponerse en contacto con la llama, cada metal tiene un color característico que es: Litio-rojo; Na-amarillo y K-violeta. Y las longitudes de onda correspondientes a estos colores son las que se usan para determinar los iones correspondientes.

              2.2 INSTRUMENTAL

              Se usan aparatos iguales al espectrofotómetro pero sustituyendo la lámpara por una llama.

              • GASES: suele usarse gas natural, acetileno o propano con aire u oxígeno. La elección del gas depende de la temperatura que se desee. Normalmente se utiliza propano-aire para Na y K. El flujo de gas debe ser constante, para ello se necesitan reguladores.

              • ATOMIZADOR: tiene como función disgregar la solución problema en pequeñas gotas para que los átomos absorban la energía térmica de la llama y se exciten. Se debe aspirar previamente agua y soluciones estándar, además de un calentamiento previo para que la llama mantenga la temperatura constante. Se introducen comprobaciones con estándares de concentración conocida entre las determinaciones.

              3. ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

              Se utiliza para la determinación de Calcio, Magnesio, Cobre, Zinc, Plomo y otros metales

              3.1 PRINCIPIOS

              La técnica de basa en la absorción de la luz por parte de los átomos vaporizados en estado de reposo. El espectro de absorción de un átomo es muy estrecho (corto), recibe el nombre de “espectro de líneas” y va de 0,001 a 0,01 nm.

              Se basa en medir la cantidad de luz a la longitud de onda seleccionada que es absorbida cuando la luz pasa a través de una nube atómica.

              Los átomos de corresponden al metal que se va a medir y se cumple que a mayor concentración del metal, mayor absorción.

              3.2 INSTRUMENTAL

              Los espectrofotómetros de absorción atómica constan de:

              LÁMPARA DE CÁTODO HUECO: Es la fuente de luz. Está constituida por un cátodo hueco del metal que se va a medir, que emite el espectro de líneas característico de este metal.

              El ánodo y el cátodo se encuentran en un cilindro de vidrio sellado y relleno de un gas inerte (Ej. Ne, Ar). En el cilindro hay una ventana de vidrio o de cuarzo que permite la transmisión de la luz.

              CHOPPER

              QUEMADOR: tiene como función colocar al metal en estudio en un estado en el que se produzca la absorción de la luz. Para ello tienen lugar 2 procesos:

              • Nebulización de la muestra, es decir, transformar la solución en un fino aerosol antes de ser introducida en la llama.

              • Atomización: consiste en la evaporación del solvente dentro de la llama dando lugar a la formación de átomos. El combustible utilizado es el acetileno, usándose llamas aire-acetileno.

              RENDIJA DE ENTRADA; MONOCROMADOR; RENDIJA DE SALIDA; DETECTOR; MEDIDOR.

              4. NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA (15/10/01)

              4.1 PRINCIPIOS

              Cuando un haz de luz choca contra una partícula en suspensión sufre una serie de fenómenos:

              • DISPERSIÓN de la luz

              • REFLEXIÓN

              • ABSORCIÓN

              • TRANSMISIÓN

              La DISPERSIÓN de la luz depende de varios factores, que son:

                • Tamaño y peso molecular de las partículas

                • Longitud de onda de la luz incidente

                • Distancia del detector a la cubeta

                • Concentración de partículas

              Todos estos factores se relacionan mediante complejas fórmulas matemáticas, por la Ley de Rayleigh.

              4.2 DETECCIÓN DE LUZ DISPERSADA

              Se utilizan dos métodos para detectar la dispersión:

            • TURBIDIMETRÍA: Es la medida de la intensidad de un haz de luz incidente cuando éste pasa a través de una suspensión de partículas. La turbidimetría se mide a 0 grados del haz incidente, es decir, en su misma dirección. La disminución de la intensidad se puede medir como %T o como A en cualquier espectrofotómetro o autoanalizador.

            • NEFELOMETRÍA: Es la medida de la luz dispersada en ángulos distintos al de incidencia. Lo más frecuente es que sea entre los 15º-19º. La medida se realiza en aparatos diseñados con el sistema de detección situado a ángulos predeterminados.

            • 4.3 INSTRUMENTAL

              FUENTE DE LUZ: es una fuente de energía radiante. Puede ser cualquier tipo de lámpara (tungsteno, halógeno, etc), pero la mejor es el láser porque produce haces de luz estables de intensidad adecuada a la técnica y bien colimados, es decir, paralelos.

              COLIMADOR: es una lente o espejo, que tiene como misión hacer paralelos los haces de luz. Si la fuente es láser no será necesario.

              MONOCROMADOR: filtros, prismas, redes de difracción...No es necesario si la fuente es láser.

              CUBETA: = espectrofotometría.

              SISTEMA DE DETECCIÓN: si está colocado a 0º la técnica se denomina Turbidimetría, pero si el ángulo es distinto de 0º, la técnica se denomina Nefelometría.

              (16/10/01)

              UT. 4 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS DE ANÁLISIS III

              1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE METABOLITOS POR ANÁLISIS FOTOMÉTRICOS

              Se usan reacciones químicas de las sustancias que se valoran. Para ellos se utilizan los reactivos adecuados y se detectan los productos de estas reacciones por técnicas espectrofotométricas.

              La determinación de la concentración de un compuesto se puede medir de tres formas:

              • Midiendo la absorbancia del compuesto directamente si éste absorbe luz.

              • Haciéndolo reaccionar con reactivos adecuados, transformando la sustancia inicial en un producto que absorbe luz.

              • Haciendo que el compuesto forme parte de una reacción en la que otra sustancia experimente un cambio en sus propiedades de la absorción de la luz.

              2. MÉTODOS PARA MEDIR LA CONCENTRACIÓN DE UNA SUSTANCIA POR ESPECTROFOTOMETRÍA.

              2.1 MÉTODOS DE PUNTO FINAL (ó de equilibrio):

              Se incuba la muestra y el reactivo durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada para que se complete totalmente la reacción, de tal forma que la sustancia que buscamos debe consumirse totalmente. Si no fuera así y quedase parte de la sustancia sin consumir, al medir el producto, estaríamos midiendo menos cantidad de la que realmente hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo fijo de incubación.

              La concentración de un sustancia es igual a la absorbancia por un factor llamado “Factor de Calibración (K)”, que coincide con la pendiente de la recta de calibración:

              Y = a + bX

              a: punto donde la recta corta al eje Y (ordenada en el origen)

              b: pendiente de la recta

              Si a = 0, entonces Y = bX ------------------------------ C = K . A

              2.2 REACCIONES ACOPLADAS:

              Cuando se va a determinar una sustancia que se transforma en una reacción que no provoca cambios medibles por espectrofotometría, se utiliza otra reacción ligada a la anterior para medir el compuesto.

              Se llama “Reacción Auxiliar” a la que se utiliza para transformar la sustancia a determinar.

              Se llama “Reacción Indicadora” a la que se utiliza para la medida fotométrica o colorimétrica.

              Ambas reacciones se llevan a cabo en la misma mezcla de ensayo y se dice que están acopladas.

              Las REACCIONES COLORIMÉTRICAS pueden ser de dos tipos: Precedentes y Subsiguientes.

              (16/10/01)

              • R. Colorimétricas Precedentes (muy poco habituales): van antes que la reacción auxiliar. Se obtiene un producto que reacciona con la sustancia que vamos a determinar (A) dando un producto medible.

              U + Y ! X +Y (Reacción precedente)

              A + Y ! B + C (Reacción auxiliar)

              • R. Colorimétricas Subsiguientes: van después de la reacción auxiliar. Medimos un producto de la reacción auxiliar (D).

              A +B ! C + D (Reacción auxiliar)

              D + P ! Q + R (Reacción indicadora)

              2.3 MÉTODOS CINÉTICOS:

              En ellos se mide la velocidad de la reacción mediante la medida de la variación de la Absorbancia en el tiempo y esto se relaciona con la concentración. Es una medición continua, a diferencia de la del punto final, se mide en tiempos regulares. Se puede medir la cantidad de sustrato no transformado ó la cantidad de producto formado.

              Métodos cinéticos enzimáticos (Reacciones enzimáticas):

              El caso más sencillo es el de una reacción irreversible como Sustrato ! Producto

              Lo más frecuente es que se utilicen reacciones de primer orden que se caracterizan por presentar curvas de concentración frente al tiempo exponenciales. Se produce una variación de la Absorbancia en el intervalo de tiempo que es directamente proporcional a la concentración inicial de sustrato si se mantienen constantes los tiempos de medida.

              Métodos cinéticos enzimáticos (Reacciones enzimáticas):

              Las reacciones enzimáticas están basadas en la Ley de Acción de Masas o Equilibrio de las Reacciones, que sigue el siguiente esquema:

              Los enzimas (E) reaccionan ofreciendo su sitio activo al sustrato (S) con el cual se acoplan y forman un complejo (ES), donde el enzima actúa con gran rapidez hasta liberar el producto transformado (P). El enzima no se altera, quedando libre para volver a fijar otra molécula de sustrato. Si mantenemos constantes las condiciones de la reacción (pH; temperatura; cofactores y la concentración de la enzima) la velocidad aumentará a medida que aumente la concentración del sustrato, hasta que lleguemos a un punto en el cual se

              (16/10/01)

              alcanza la Velocidad Máxima (Vmax) y a partir del cual la velocidad es constante. Aunque sigamos aumentando la concentración del sustrato, como la enzima está saturada, la velocidad deja de aumentar.

              Ecuación de Michaelis-Menten: V = K . [S]

              V: velocidad de la reacción

              K ó KM: constante de Michaelis-Menten. Es la concentración de un sustrato en moles/L con la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. Es característica de cada enzima con su sustrato y nos da información de la afinidad que tiene el enzima por su sustrato.

              Cinética de primer orden: se habla de cinética de primer orden cuando las concentraciones de sustrato son bajas y, por lo tanto, la velocidad es una función lineal de la cantidad de sustrato.

              Cinética de orden cero: se habla de cinética de orden cero cuando la concentración de sustrato es muy alta y, por lo tanto, la velocidad es independiente de la concentración de sustrato.

              Para una KM alta, la mitad de la Vmax se alcanzará con una concentración de sustrato alta, y la velocidad de la reacción es lenta.

              Para una KM baja, la velocidad de la reacción es rápida porque con una concentración baja se llega rápido a la velocidad máxima.

              Por lo tanto, las determinaciones cinéticas de las concentraciones de sustancias requieren enzimas con constantes de Michaelis altas para que la velocidad de la reacción sea lenta, se tarde más en llegar a la velocidad máxima y podamos medir mayor cantidad de sustrato.

              (18/10/01)

              UT. 5 MEDICIÓN DEL PH EN LÍQUIDOS BIOLÓGICOS. TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS.

              1. BASES DE ELECTROQUÍMICA

            • CONCEPTO DE ELECTROQUÍMICA: son un conjunto de métodos analíticos cuantitativos, basados en las propiedades eléctricas de la disolución de un analito cuando forma parte de una célula eléctrica..

            • FUNDAMENTO:

            • SEMICÉLULA DEL ÁNODO: un metal sumergido en una disolución produce una diferencia de potencial por la tendencia de los átomos del metal a pasar a la disolución en forma de iones, liberando electrones en el proceso. La reacción que se produce es la siguiente: (M0 es el átomo metálico neutro y M+ es el ión positivo)

            • M0 ____! M+ + e-

              La lámina de metal introducida en la disolución recibe el nombre de electrodo.

              El sistema completo (electrodo + disolución) recibe el nombre de semicélula.

              La reacción que se produce recibe el nombre de oxidación, ya que el átomo neutro pasa al estado positivo y se pierden electrones.

            • SEMICÉLULA DEL CÁTODO: con algunos metales ocurre el proceso contrario, es decir, los iones metálicos de la disolución toman electrones y pasan a átomos neutros que se depositan en el electrodo. Ésta es una reacción de reducción del ión metálico y, el electrodo, recibe el nombre de cátodo.

            • ECUACIÓN DE NERNST

            • La relación entre el potencial generado en la semicélula y la concentración de la disolución implicada viene dada por la Ec. de Nernst.

              E: Potencial de la semicélula

              E0: Potencial de la semicélula en condiciones estándar, que está calculado experimentalmente para las distintas semicélulas.

              R: Constante general de los gases

              T: temperatura absoluta (K)

              n: nº de electrones que se intercambian en el proceso

              F: Constante de Faraday

              (18/10/01)

              2. LA CÉLULA ELECTROQUÍMICA

              La célula electroquímica se constituye por la unión de dos semicélulas de forma que los potenciales generados en cada una de ellas se combinan formando una célula electroquímica con una diferencia de potencial que se manifiesta por un flujo de corriente eléctrica medible con un voltímetro.

              El ejemplo más típico es la célula de Zn/Cu. El Zn va a formar parte de la semicélula del ánodo y el Cu la del cátodo. Las dos semicélulas están unidad por un puente salino formado por Cl- y K+, que es el que establece la conexión eléctrica. El circuito se completa con un potenciómetro.

              El ánodo(Zn) tiene un exceso de electrones, mientras que el cátodo (Cu) tiene un déficit de electrones, por lo tanto, el exceso de electrones va desde el ánodo hasta el cátodo, y esto constituye la corriente eléctrica.

              3. ELECTRODOS DE REFERENCIA

              Para medir el potencial E de una disolución necesitamos un “electrodo indicador” y un “electrodo de referencia”.

              Electrodo de Referencia: debe mantener el voltaje constante, en condiciones controladas durante un tiempo significativo. De esta forma, se transforman las diferencias de potencial relativas, según el par Redox que se utilice, a tablas de potenciales absolutos al enfrentarse los pares Redox con un par de referencia al que se le asigna un valor cero de potencial.

              Los electrodos de referencia más usados son:

              • Electrodo Estándar de Hidrógeno: consiste en un electrodo de Platino sumergido en una disolución de iones Hidrógeno. Tiene pH = 0, Tª = 25ºC. Se elige el par Redox del Hidrógeno: 2H+ + 2e- ! H2

              A este se le asigna de forma arbritaria el valor 0, de tal forma, que conectando cualquier semicélula a ésta y midiendo el E desarrollado se obtiene el E relativo de la segunda semicélula.

              El electrodo de Hidrógeno no se utiliza habitualmente en los sistemas de medida porque es de muy difícil mantenimiento.

              • Electrodo de Calomelanos ( Hg2Cl2 = calomel): está compuesto por Mercurio metálico en equilibrio con una disolución saturada de Cloruro Mercurioso y una concentración conocida de Cloruro Potásico. La reacción de oxid-red es la siguiente: Hg2Cl2 + 2e- ! 2Hg0 + 2Cl

              • Electrodo de Plata-Cloruro de plata: está constituido por un asa de Ag recubierta de AgCl: AgCl + e- ! Ag0 + Cl-

              Electrodo indicador: responde proporcionalmente a la concentración de la sustancia de interés. Lo que se mide realmente es la variación de potencial con respecto al electrodo de referencia. (19/10/01)

              4. TIPOS DE SISTEMAS ELECTROQUÍMICOS

              4.1 MÉTODOS EN LA INTERFASE DEL ELECTRODO CON LA FINA CAPA DE DISOLUCIÓN ADYACENTE:

            • Estáticos o potenciométricos: son los que miden el potencial existente entre dos electrodos en solución sin que haya paso de la corriente eléctrica.

              • Potenciometría analítica: Mide la actividad de los iones de la disolución que está relacionada con la concentración por un “Factor de Actividad”, según la siguiente fórmula: ai = Ci . fi

              • ai: actividad de los iones de una solución.

                Ci: concentración de los iones medidos.

                Fi: Factor de Actividad.

              • Dinámicos o amperométricos: se basan en la medida de la cantidad de corriente eléctrica que fluye cuando se aplica un voltaje constante al electrodo de medida.

                • Columbimetría: es una técnica que mide la carga total necesaria para la oxidación o reducción total de una especie. Se usa fundamentalmente para la determinación de Cloro en líquidos biológicos, utilizando el “clorímetro de Cotlove”.

                • Amperometría.

                4.2 MÉTODOS EN EL SENO DE LA DISOLUCIÓN

                A. Conductimetría.

                    • MEDIDAS DEL PH

                pH-metro: es el aparato que mide el pH y que consta de dos electrodos, el de 2Referencia” y el “Selectivo”.

                • Electrodo de Referencia: es un electrodo de calomelanos.

                • Electrodo Selectivo: es un electrodo que está lleno de una solución de pH constante. La conexión a un medidos de voltaje se realiza por medio de un hilo de Ag cubierto de AgCl e inmerso en una solución de HCl 0,1M.

                Los pasos a seguir en la medida del pH son los siguientes:

                  • Lavar el electrodo con agua destilada.

                  • Colocar un tampón de calibración de pH cercano al pH que se quiere medir.

                  • Ajustar el valor del pH.

                  • Colocar otro tampón de pH conocido. Suelen ser tampones fosfato (pH = 6,8) y ajustamos el pH de nuevo.

                  • Colocar la solución cuyo pH se quiere medir.

                    • MEDIDA DE LA PRESIÓN PARCIAL DE CO2:

                Se utiliza el electrodo de “Severing-Havs”, que es una modificación de la medida del pH cuyos electrodos están separados de la muestra por una membrana que deja pasar el CO2 selectivamente.

              • MEDIDA DE LA PRESIÓN PARCIAL DE O2:

              • Se utiliza el electrodo de “Clark”: las moléculas de O2 disueltas en una solución acuosa determina la corriente eléctrica, que es la que mide el electrodo y, que es proporcional, a la presión parcial de O2.

              • ELECTRODOS SELECTIVOS

              • Concepto: son sistemas electroquímicos que tienen mecanismo de selección asociado al electrodo, que lo hace solo sensible a variaciones de potencial debidas a la concentración de un determinado ión.

                La selectividad ideal se consigue con electrodos de polímeros orgánicos porosos.

                Tipos:

                • Electrodo de vidrio para medir hidrogeniones (H+)

                • Electrodo de vidrio para medir Sodio

                • Electrodo de Polivinilcloruro/Valinomicina: se usa para la determinación de Potasio

                • Electrodo de Sulfuro de Plata/Cloruro de Plata: para medir Cloro

                • Electrodo recubierto de un enzima (Ej. Ureasa, para medir Urea-Amonio)

              • ANALIZADORES DE PH Y GASES (22/10/01)

              • 9.1 CONCEPTO: Miden automáticamente el pH, la presión parcial de CO2 y la de O2. Estas medidas las hacen directamente y, el resto de medidas se calculan por microprocesadores incorporados a los autoanalizadores. Tenemos como parámetros asociados, por ejemplo el bicarbonato plasmático (CO3H-); CO2 total; exceso de base; etc. Las medidas se realizan con electrodos selectivos.

                9.2 COMPONENTES

                • Sistema de aspiración: la muestra (sangre arterial) es aspirada por una bomba peristáltica que coge normalmente de 50-250 L.

                • Cámara de medida: donde se localizan los electrodos. Está a temperatura constante.

                • Electrodos: de pH, CO2 y O2.

                • Tampones de calibración: se calibran con 2 puntos, uno a pH = 7,382 y otro a pH = 6,838, estableciéndose entre ambos una recta.

                • Gases con sistema de humidificación: para la calibración de la presión parcial de CO2 y O2.

                • Contenedor de desechos

                • Microprocesador: encargado de dirigir la operación

                • Impresora

                9.3 ERRORES MÁS FRECUENTES (22/10/01)

              • Procesamiento inadecuado de la muestra:

                • La entrada de aire en la muestra, bien en el recipiente de extracción ó en la cámara de medida (aire ambiental: la presión parcial de O2 = 160 mmHg y la de CO2 = 0 mmHg).

                • Demora en la realización del análisis. Esto determina el consumo de O2 por parte de las células sanguíneas y consiguiente formación de CO2.

                • 2. Alteraciones en los electrodos:

                  • Se pueden contaminar con las proteínas de la muestra. Para evitarlo, se debe pasar una solución desproteinizante con frecuencia.

                  • El envejecimiento de la membrana del electrodo de CO2, que se hace entonces permeable a los hidrogeniones. Se debe cambiar periódicamente la membrana.

                  • Alteración del electrolito de relleno.

                  3. Contaminación de los tampones: Se debe vigilarlos, comprobándolos periódicamente y cambiarlos.

                  UT. 6 MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE MOLÉCULAS

                  1. INTRODUCCIÓN

                  Uno de los objetivos principales de los Laboratorios es la separación de mezclas de sustancias en sus componentes, ya sea con fines cualitativos o cuantitativos.

                  2. CENTRIFUGACIÓN

                  2.1 CONCEPTO: Es un método que utiliza la fuerza centrífuga para separar elementos de densidades distintas o de pesos moleculares distintos.

                  2.2 FUNDAMENTO: La FCR (Fuerza Centrífuga Relativa) es la fuerza requerida para que se produzca la separación. Las unidades de esta fuerza se expresan como el número de veces mayor que la fuerza de la gravedad y se calcula mediante la fórmula:

                  FCR = 1,118 . 105 . r . n2

                  r: distancia horizontal del radio en centímetros desde el centro de rotación hasta el fondo del tubo durante la centrifugación.

                  n: Velocidad de rotación del motor (r.p.m)

                  Es fundamental observar el principio de equilibrio. Para ello se colocarán tubos y cubetas de igual forma, peso y tamaño en posiciones opuestas en la cabeza de la centrífuga, buscando una disposición geométricamente simétrica, utilizando tubos de agua si fuera necesario.

                  2.3 DESCRIPCIÓN DE LA CENTRÍFUGA

                  • ROTOR O CABEZAL: Es el lugar donde se colocan las muestras. Hay dos tipos

                    • Cabezal oscilante u horizontal: los contenedores oscilan libremente entre las ramas del rotor. Las muestras, dentro de los contenedores, oscilan hasta ponerse en posición horizontal, en ángulo recto con el eje de rotación y adoptan la posición vertical o de reposo cuando la centrífuga está parada.

                    • Cabezal angular o de ángulo fijo: los tubos de muestra están en posición fija formando un ángulo de entre 25-40º con el eje de rotación. Solamente forman un ángulo de 90º en una centrífuga especial para el estudio del hematocrito.

                  (24/10/01)

                  • EJE: Es el vástago que soporta el rotor y que actúa como eje de rotación.

                  • MOTOR: Acciona el vástago y el rotor.

                  • ACCESORIOS: El rotor está incluido en una “cámara” que generalmente lleva tapadera con una cerradura de seguridad que impide abrirla hasta que haya terminado la centrifugación. Otros accesorios son el temporizador, control de velocidad (r.p.m), refrigerador para disminuir la temperatura de la cámara, freno,...

                  2.4 UTILIDADES

                    • Separación de suero o plasma.

                    • Concentración de células: en líquidos biológicos se concentran las células para facilitar su estudio microscópico (Ej. Sedimento de orina).

                    • Separación de sustancias: Ej. Para el estudio del HDL colesterol, se precipitan previamente las lipoproteínas LDL y VLDL.

                    • Aclaración de líquidos orgánicos: separando las fases líquidas de distinta densidad.

                    • Separar quilomicrones del suero o fraccionar las distintas lipoproteínas: para esto se necesitan ultracentrífugas (alcanzan grandes velocidades).

                  2.5 CONTROL Y MANTENIMIENTO

                  Se deben tener en cuenta las siguientes precauciones:

                  • Utilizar tubos resistentes a la FCR

                  • No debe sobresalir el tubo del portatubos

                  • Equilibrar correctamente la centrífuga.

                  • Tapar los recipientes para evitar la evaporación por el aumento de la temperatura.

                  • No forzar el paro de la centrífuga.

                  • Chequeo de la velocidad de centrifugación cada 3 meses con un tacómetro externo.

                  • Limpieza periódica de la cámara y los contenedores.

                  3. ELECTROFORESIS

                  3.1 PRINCIPIOS

                  • Concepto: es el movimiento de partículas cargadas por aplicación de un campo eléctrico externo.

                  • Movimiento de una partícula cargada en el seno de un campo eléctrico: cuando una partícula cargada se coloca dentro de un campo eléctrico se moverá hacia el polo positivo (ánodo) si está cargada negativamente (anión), ó hacia el polo negativo (cátodo) si la partícula está cargada positivamente (catión).

                  La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la partícula cargada es proporcional a la carga de la partícula (Q) y al voltaje del campo eléctrico aplicado (V):

                  F = Q . V

                  Sin embargo, existe otra fuerza opuesta al movimiento de la partícula que es proporcional al tamaño y forma de la misma, y a la viscosidad del tampón (v):

                  Fr = f . v

                  Siendo “f” el coeficiente de fricción, que es una característica de cada partícula. Estas dos fuerzas (F y Fr) se equilibran cuando la partícula comienza a migrar y hacen que alcance una velocidad constante. La velocidad de migración por unidad de campo eléctrico se llama “movilidad electroforética ()” y tiene como unidades cm2 / V . seg (centímetro cuadrado/Voltios por segundo)

                  • Factores que afectan a la migración de las partículas:

                    • La carga neta de la partícula: La carga neta de las partículas en solución está determinada por el pH del tampón en que se encuentran, que es lo que decide el grado de ionización de las mismas. El grado de ionización es el balance entre las cargas positivas y negativas de una partícula en solución.

                  Las proteínas son anfóteras (tienen cargas positivas y negativas) y éstas dependen del pH del medio. Existe un pH para el cual, el número de cargas positivas es igual al número de cargas negativas, dando como resultado una carga neta cero. Este pH recibe el nombre de “Punto Isoeléctrico”. La mayoría de las proteínas tienen un punto isoeléctrico ácido, que oscila entre 4,6 para la Albúmina y 6,2 para algunas globulinas. A un pH superior al del punto isoeléctrico la partícula posee más cargas positivas que negativas comportándose como un catión. Si el pH es inferior al punto isoeléctrico tendría más cargas positivas que negativas, comportándose como un anión.

                  • La fuerza iónica del tampón: A mayor concentración del tampón, éste transportará más corriente y, por tanto, las partículas transportarán menos corriente y migrarán más despacio. La concentración del tampón debe ser la suficiente para que éste cumpla sus funciones, que son dos: mantener un pH constante y transportar la corriente.

                  • Tamaño y forma de las partículas: La importancia es relativa, es más importante cuando se emplean soportes de electroforesis que permiten el paso selectivo de las moléculas según su tamaño reteniendo las más grandes y dejando pasar las más pequeñas. (26/10/01)

                  • Potencial del campo eléctrico: Cuanto más alto sea el potencial mayor es el movimiento de la partícula. Esto viene determinado por:

                  V = R . I

                  Siendo V = voltaje; R = Resistencia del medio; I = Intensidad de corriente. Al aumentar el V aumentamos también la temperatura y esto determina la desnaturalización de las proteínas y la evaporación del tampón o buffer. Por lo tanto, los voltajes de trabajo están limitados y sólo se utilizarán voltajes altos si el aparato tiene sistema de refrigeración.

                  3.2 REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS

                  • Preparación de la muestra: Las principales muestras son suero, plasma, sangre total, orina, líquido cefalorraquídeo,...

                  Suero y plasma no suelen necesitar preparación. Para la electroforesis de hemoglobina hay que utilizar un hemolizado de hematíes. Para la de proteínas urinarias se utiliza una orina que se debe preparar mediante concentración, etc.

                  • Selección del soporte: La electroforesis se lleva a cabo sobre soportes tomando el nombre de “electroforesis de zona ó zonal”. Los principales soportes utilizados son de dos tipos:

                    • No restrictivos:

                      • Papel

                      • Acetato de celulosa: se utiliza en forma de tiras que están formadas por fibras de este compuesto y que engloban aire entre ellas. Cuando se van a usar se sumergen en el tampón de tal forma que éste ocupa los huecos. El tampón es el encargado de transportar la corriente eléctrica a través de la tira. Ventajas: es de fácil manejo, de fácil lectura, son de rápida ejecución y son económicos.

                      • Gel de agarosa: se utiliza a una concentración de entre 0,5-1 gramos por 100 cm3 de tampón. Su aspecto es claro y transparente y se puede medir por fotodensitometría.

                        • Restrictivos: El soporte ejerce algún tipo de impedimento al desplazamiento de las partículas de la muestra. Este desplazamiento depende del tamaño del poro del gel y, por lo tanto, del tamaño de las partículas. Hay dos tipos fundamentales:

                          • Gel de almidón: Tiene como ventaja que aumenta el número de fracciones separadas. Tiene muchos inconvenientes: preparación extratemporánea del gel, preparación complicada para obtener una capa de espesor y porosidad uniformes, prácticamente imposible medir por densitometría,...

                          • Gel de poliacrilamida: Es el soporte ideal si se quieren conseguir más y mejores separaciones electroforéticas. Se usa solo en laboratorios de investigación.

                            • Aplicación de la muestra: Se puede aplicar según tres técnicas:

                              • Aplicación sobre la superficie del soporte dejando que la muestra penetre (Ej. Suero en electroforesis con acetato de celulosa)

                              • Practicar orificios o ranuras en los geles (Ej. En inmunoelectroforesis se trabaja con geles que tienen las concavidades excavadas o preparadas)

                              • Incluir la muestra en el proceso de polimerización del gel.

                                • Proceso electroforético: Se requiere una instrumentación:

                                  • Fuente de alimentación: se usa para aportar la energía eléctrica al proceso.

                                  • Cubeta: consiste en una cámara que contiene los electrodos de carga opuesta. Los electrodos están situados en dos receptáculos separados entre sí que se conectan por un puente salino cuya función es permitir el paso de la corriente. La cubeta se encuentra tapada para minimizar la evaporación. En algunos casos lleva un sistema de refrigeración.

                  • Revelado: Tiene por objeto la localización de las distintas fracciones de la muestra. Esto se consigue mediante la tinción de la tira. Previamente a este paso se debe parar el proceso de difusión que se consigue con distintos métodos. El colorante empleado dependerá del compuesto que queramos localizar (Ej. Para proteínas, el negro amido). Una vez sumergida la tira en el colorante se debe eliminar el exceso mediante lavados con una solución aclarante.

                  • Lectura y evaluación: Se puede leer de dos formas:

                  • Elución: Cada zona se recorta y se eluye en un disolvente adecuado al colorante. Se obtiene así una disolución coloreada que se mide en el espectrofotómetro.

                  • Densitometría: Consiste en la lectura directa de la tira mediante un fotodensitómetro. En este aparto se elige la longitud de onda adecuada, se hace pasar un haz de luz a través de la tira y, dependiendo de la densidad de color de cada fracción se absorberá más o menos luz. Un detector recibe el haz de luz y dependiendo de la intensidad de la luz recibida se determina la concentración. El aparato es capaz de elaborar una gráfica de registro del recorrido de la luz. En esta gráfica, cada banda aparece como un pico cuya altura depende de la densidad de color que a su vez depende de la concentración de la sustancia.

                  • 3.3 TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS

                    Electroforesis en acetato de celulosa: es una de las técnicas más utilizadas en la rutina diaria por diversos motivos: se trata de un soporte económico, es de fácil manejo, fácil aplicación de la muestra, supone una rápida separación, es de fácil lectura por densitometría y tiene una buena resolución.

                    La tira más empleada es el “cellogel” que es acetato de celulosa gelatinizado y que tiene como ventaja que se puede transparentar previamente a la lectura en el densitómetro.

                    Electroforesis en gel de agarosa: es de muy amplia difusión en el LDC. Puede venir preparado o bien fabricarlo en el laboratorio. La muestra se sitúa en posillos excavados en el gel.

                    Electroforesis en gel de almidón

                    Electroforesis en gel de poliacrilamida: es un gel restrictivo. Dependerá de la carga y el tamaño de las partículas. Cuando transcurre el proceso electroforético, las partículas comienzan a migrar de acuerdo con su carga eléctrica, pero son frenadas en su avance según su tamaño. Con esto se consigue una separación más completa y un mayor número de bandas.

                    Los geles de pueden emplear en placas o en tubos y pueden ser de dos tipos:

                    • Continuos: el tamaño del poro varía de forma gradual.

                    • Discontinuos: el tamaño del poro varía en zonas bien diferenciadas.

                    Isoelectroenfoque: se basa en la separación de sustancias conforme a su punto isoeléctrico, por lo tanto, sirven para separar sustancias anfóteras como las proteínas.

                    Sobre un medio soporte se establece un gradiente de pH mediante una mezcla de anfolitos. El gradiente de pH aumenta desde el ánodo (+) al cátodo (-).

                    Cuando una proteína se introduce en este gradiente migrará de acuerdo con su carga neta. Si su carga neta inicial es positiva migrará hacia el cátodo. A medida que avanza hacia el cátodo va recorriendo una zona en la que el pH cambia y, por lo tanto, también cambiarán sus cargas, perdiendo cargas positivas y ganando cargas negativas. Llegará un momento en el que las cargas positivas y negativas se igualen, resultando su carga neta 0 (punto isoeléctrico). En este punto permanecerá estática. De esta manera se alcanzará una posición de equilibrio formando una banda definida.

                    El voltaje empleado para crear el gradiente de pH con los anfolitos tiene que ser muy elevado. Se emplean voltajes de hasta 2000 V lo que determina la formación de calor en gran cantidad (será necesario un sistema de enfriamiento de la cubeta).

                    Ventaja principal: tiene gran poder de resolución. Permite separar sustancias cuyos puntos isoeléctricos se diferencian en 0,02 unidades de pH.

                    3.4 APLICACIONES CLÍNICAS (05/11/01)

                    La Electroforesis en acetato de celulosa es la más utilizada habitualmente en el LDC y se usa fundamentalmente para la separación de las proteínas séricas y separación de aminoácidos.

                    La Electroforesis en gel de agarosa se utiliza para la separación de las lipoproteínas, para la separación de isoenzimas y en la inmunoelectroforesis.

                    La Electroforesis en gel de poliacrilamida se usa para la separación de isoenzimas de la fosfatasa alcalina, para determinar pesos moleculares de proteínas y para investigación.

                    El Isoelectroenfoque se utiliza para el estudio de las inmunoglobulinas y para estudiar algunos isoenzmas.

                    3.5 ASPECTOS PRÁCTICOS

                    • Problemas con el tampón: El tampón se contamina muy fácilmente y, para evitarlo, se debe guardar refrigerado. Si el volumen de tampón utilizado es pequeño se deberá desechar, mientras que si es grande se deberá guardar en una botella a 4ºC.

                    • Fuente de alimentación y cubetas:

                      • La cubeta debe estar en posición horizontal con los dos receptáculos de tampón nivelados y llenos por igual.

                      • Los dos extremos del puente salino deben estar bien impregnados en tampón.

                      • Las cubetas se deben mantener limpias y siempre tapadas.

                        • Aplicación de la muestra: Los aplicadores deben estar perfectamente limpios antes de cada uso y hay que respetar la cantidad de muestra de la técnica indicada.

                        • Voltaje y calentamiento: Si se incrementa el voltaje se incrementa la movilidad de las partículas pero se genera un calentamiento. Este calentamiento puede traer como efecto no deseado la aparición de “bandas arqueadas” debido a la desecación de los bordes de la tira que hace que en ellos la movilidad sea más lenta.

                        • Tinción y lectura: La tira debe tener un fondo transparente y uniforme, para poderla leer por fotodensitometría.

                    4. CROMATOGRAFÍA

                    4.1 PRINCIPIOS GENERALES

                    Es un método de análisis en el cual, una fase móvil (gas o líquido), que contiene la muestra provoca la separación de sus componentes mediante la distribución diferencial entre esta fase y una fase estacionaria (sólida o líquida). De esta forma, un compuesto que tenga más afinidad que otro por la fase estacionaria se retrasará en su avance a través de ésta, mientras que el que tiene poca afinidad la atravesará antes.

                    4.2 CLASIFICACIÓN

                    • Según las características físicas de las fases móvil y estacionaria

                      • Móvil: Líquida ó Gaseosa

                      • Estacionaria: Sólida ó Líquida

                    • Según el mecanismo físico que lleva a la separación de los solutos:

                    • Adsorción

                    • Partición

                    • Intercambio iónico

                    • Afinidad

                    • Exclusión molecular

                    • Según la forma física de los sistemas:

                    • En columna

                    • En soportes planos

                    CROMATOGRAFÍA

                    LÍQUIDA GASEOSA

                    SÓLIDA LÍQUIDA SÓLIDA LÍQUIDA

                    (L / S) (L / L) (G / S) (G / L)

                    Mecanismos Mecanismo Mecanismo Mecanismo

                    • Exclusión Molecular Partición Adsorción Partición

                    • Adsorción

                    • Intercambio iónico

                    La cromatografía de gases se lleva a cabo siempre en columna.

                    La cromatografía líquida se puede llevar a cabo en soporte plano o en columna.

                    4.3 FORMAS DE CROMATOGRAFÍA

                    Cromatografía en papel:

                    • Características Físicas de las fases: L / L

                    • Mecanismo: Partición, que es un proceso por el cual un soluto se distribuye entre dos fases inmiscibles.

                    • Soporte: plano. Consiste en una hoja de papel de celulosa

                    • Fase estacionaria: constituida por la hoja de papel recubierta de una capa de agua.

                    • Fase móvil: Es líquida y está formada por solventes cuya polaridad se elige según la naturaleza de los componentes a separar.

                    Como la fase estacionaria es agua, las partículas de mayor polaridad se retendrán más en la fase estacionaria y las de menor polaridad se moverán más.

                    • Técnica general:

                    • Aplicación de la muestra: se hace sobre el papel, en un extremo, y se espera a que se seque.

                    • Se introduce el soporte en la cámara, que es una cubeta que contiene el solvente, en posición vertical, de manera que el solvente podrá atravesarlo por capilaridad en sentido ascendente o descendente, arrastrando a su paso los componentes de la muestra.

                    • Separación de los componentes de la mezcla en función de su reparto entre las dos fases. Cuando el solvente ha alcanzado el frente del papel se quita el papel de la cámara y se deja secar.

                    • Detección: Las sustancias separadas se detectan por distintos procedimientos físicos o químicos según la naturaleza de las sustancias. Se obtiene un cromatograma que es una serie de bandas separadas o zonas detectadas ya sea visualmente o indirectamente.

                    • Se puede hacer una determinación bidimensional girando el papel 90º y ejecutando una segunda cromatografía.

                    • Cromatografía en capa fina (08/11/01)

                          • Características físicas de las fases: L / S

                          • Mecanismo: Adsorción, que es un proceso por el cual una sustancia se adhiere a otra a causa de las fuerzas de atracción de los átomos de las superficies de ambas.

                          • Soporte: Plano. Consiste en una capa muy fina de partículas situadas sobre una superficie de vidrio. Este soporte constituye la fase estacionaria.

                          • Fase Móvil: Es líquida y está formada por solventes de polaridad adecuada.

                      Cromatografía en Columna

                      LÍQUIDA GASEOSA

                      LÍQDA / LÍQDA LÍQDA / SÓLIDA GAS / LÍQDA GAS / SÓLIDA

                      Partición Adsorción Partición Adsorción

                      Las columnas están formadas por un tubo de longitud y ancho variables que llevan en su interior un soporte sólido o bien puede ir asociado a un líquido, que serían la fase estacionaria.

                      La fase móvil es un solvente en la cromatografía líquida o un gas en la cromatografía gaseosa. La muestra se introduce en la fase móvil.

                      Una vez separadas las sustancias, éstas salen por elución, que es la separación de cuerpos adsorbidos, por lavados progresivos. Se efectúan lecturas sobre el eluido obteniéndose un registro en el cual, los distintos componentes se detectan en forma de picos de distinta altura y anchura.

                      En la actualidad se emplean 2 tipos fundamentales de cromatografía:

                      • HPLC: Es la cromatografía líquida de alta resolución. Realiza separaciones en tiempos cortos.

                      Esquema. Cromatografía liquida en columna.

                      • Cromatografía de gases: La fase móvil es un gas que proviene de un tanque a presión. En el gas se inyecta la muestra y, la mezcla pasa por la columna, que se encuentra incluida en un sistema calefactor, que tiene como misión volatilizar la muestra.

                      4.4 FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

                        • Coeficiente de Distribución (Kd): Es la relación entre la concentración de soluto en la fase estacionaria y la concentración de soluto en la fase móvil.

                      El valor de la Kd muestra la afinidad del soluto por las distintas fases. Cuanto mayor sea Kd mayor es la proporción de soluto retenido en la fase estacionaria.

                        • Relación al frente del solvente (Rf): En la cromatografía en placas (papel o capa fina) Rf es la relación entre la distancia desde el punto de aplicación de la muestra a la mancha (dm) y la distancia desde el punto de aplicación al frente del solvente (ds).

                        • Volumen de retención (Vr): Es el volumen de elusión en el cual sale un compuesto de interés. (Vm es el volumen de la fase móvil para eluir un compuesto sin afinidad por la fase estacionaria. Por lo tanto, a mayor Kd de un soluto, mayor será su Vr)

                        • Tiempo de Retención (tr): El tiempo de retención para un soluto dado será el tiempo en el que éste sale eluido. Está relacionado con el volumen de retención según la siguiente fórmula:

                      F = flujo de la elusión, es decir, la velocidad en mL/min de la elusión.

                        • Selectividad (): Es la relación entre los coeficientes de distribución de dos solutos (A, B) en estudio. Para estudiar dos sustancias nos interesa que  sea lo mayor posible, habitualmente mayor de 1.

                        • Resolución (R): Es la capacidad para separar sustancias lo mejor posible. En los cromatogramas se mide:

                        • Las distancias a las que aparecen los picos desde un punto de referencia, que suele ser la respuesta del detector (d1 , d2 , ...)

                        • El ancho de la base de cada pico. Se miden en las misma unidades de las distancias (a1 , a2 ,...)

                        • Las distancias pueden ser medidas como tiempos de aparición de la sustancia (tiempo al que aparece el máximo del pico), como volúmenes de retención ó como distancias en medidas de longitud.

                          Se requiere un valor de R " 1,25 para considerar que una separación cromatográfica es buena. Si R " 0,4, la forma del pico no mostrará claramente la presencia de dos componentes.

                                • Cálculos: A partir de los datos del cromatograma, podemos calcular Kd, según la siguiente fórmula:

                          4.5 MECANISMOS DE SEPARACIÓN (09/11/01)

                                  • Cromatografía de intercambio iónico:

                          Características físicas de las fases: L / S

                          Mecanismo: el fundamento de la separación de las sustancias está en las diferencias entre el signo y la magnitud de sus cargas eléctricas.

                          Fase estacionaria: Es una resina de intercambio iónico, es decir, que tiene grupos cargados. Puede ser resina de intercambio aniónico si la carga de la resina es positiva y, por lo tanto, separa aniones (carga-), ó puede ser de intercambio catiónico si la carga de la resina es negativa y separará cationes (carga+).

                          Intercambio aniónico (M-R+) + F- ___! M- + (R+F-)

                          Intercambio catiónico (M+R-) + F+ ___! M+ + (R-F+)

                          Siendo: R = resina

                          M = iones de la muestra

                          F = iones del flujo de la fase móvil

                          Fase móvil: es un líquido.

                          Cuando se produce el paso de la fase móvil a través de la fase estacionaria los iones de la muestra compiten con los iones de la fase móvil por los sitios de unión en la resina (fase estacionaria). De manera que, aquellos que tienen mayor fuerza de unión, son más retenidos y saldrán más tarde de la columna.

                          La fuerza de unión con la fase estacionaria se puede modificar cambiando el pH. Por esta circunstancia, cuando se quiere terminar el proceso se puede cambiar el pH y eluir la muestra que fue más retenida.

                                  • Cromatografía de exclusión molecular:

                          Características físicas de las fases: L / S. Se utiliza para averiguar pesos moleculares, para separar inmunoglobulinas, etc.

                          Mecanismo: El fundamento de la separación se basa en el tamaño molecular. La separación se lleva a cabo por exclusión molecular: la solución con las sustancias que queremos separar se introduce en la columna de tal forma que las sustancias de tamaño mayor que el poro pasan sin ser retenidas, y las sustancias con un tamaño menor que el poro quedan retenidas en el gel eluyéndose más tarde.

                          Fase estacionaria: Es un gel que tiene poros que son de un tamaño determinado. Los geles utilizados son muy variados. El más conocido es el SEPHADEX.

                          UT.7 ANALIZADORES AUTOMÁTICOS PARA QUÍMICA CLÍNICA

                          ANTECEDENTES HISTÓRICOS

                          La Química Clínica hospitalaria inició un cambio hacia principios de los años 60 por dos motivos fundamentales:

                            • La mecanización de las determinaciones

                            • La producción industrial de los reactivos

                          El primer autoanalizador se utilizó en los años 50 y era un autoanalizador de flujo continuo para la determinación de Glucosa y Nitrógeno Ureico.

                        • CONCEPTO DE AUTOMATIZACIÓN

                        • AUTOMATIZACIÓN

                          Se aplica a aquellos procesos donde el instrumento lleva a cabo una serie de test con un mínimo de intervención de los técnicos. En el LDC los aparatos son regulados por los operarios, por lo tanto, se debería hablar se mecanización y no de automatización.

                          ANALIZADOR AUTOMÁTICO

                          Es un aparato que mecaniza las diferentes etapas del análisis de la muestra.

                          VENTAJAS DEL AUTOANALIZADOR

                              • Elimina el factor humano en etapas repetitivas y delicadas del análisis

                              • Aumenta la precisión y la exactitud de los resultados.

                              • Son de coste alto pero se compensa con el ahorro de personal y reactivos.

                              • ETAPAS DEL ANÁLISIS DE UNA MUESTRA

                                    • Identificación de la muestra

                                    • Preparación de la muestra

                                    • Sistemas de carga de la muestra

                                    • Sistemas de dispensación de la muestra

                                    • Reactivos y sistema de dispensación de los reactivos

                                    • Sistema de mezcla de reactivos y muestra

                                    • Sistema de incubación

                                    • Cubetas de reacción

                                    • Sistema de detección

                                    • Proceso de datos

                                    • 3.1 IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA: Hay dos sistemas:

                                              • Directo: La muestra se une a unos identificadores que permiten asociarla con el paciente en cualquier momento. Los identificadores más comunes son los códigos de barras, que permiten el marcado electrónico de la muestra. Las etiquetas con el código de barras se adhieren al tubo de extracción y también a los recipientes donde se coloca la muestra para el análisis.

                                      El problema de la identificación es el de la separación del suero en alícuotas, lo que requiere volver a marcar los tubos (más errores). Esto se puede solucionar utilizando el llamado “tubo primario”, que consiste en realizar el proceso analítico a la muestra en el mismo tubo de la extracción.

                                              • Indirecto: La muestra se relaciona con la posición que ocupa en una secuencia analítica según indicará una lista de trabajo previamente realizada.

                                      3.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

                                      La muestra más frecuentemente utilizada es el suero, pero también se usan plasma, sangre total, líquido cefalorraquídeo, orina y otros líquidos biológicos (Ej. Sinovial).

                                      Todas ellas, menos la sangre total, deben ser manipuladas previamente mediante diluciones, centrifugación, etc. Es importante en la obtención del suero que la coagulación sea completa y la centrifugación la adecuada para que no quede fibrina, que obstruye los sistemas de toma de muestra.

                                      3.3 SISTEMAS DE CARGA DE LA MUESTRA

                                      Se suelen utilizar copas de plástico desechable, cuya forma y tamaño depende del tipo del analizador.

                                      Se deben fabricar en material inerte, que no absorba ni desprenda ninguna sustancia. Se debe evitar la luz directa sobre las cubetas de carga porque pueden afectar a productos fotosensibles (Ej. Bilirrubina).

                                      Se pueden colocar en gradillas, en bandejas circulantes o en cadenas transportadoras.

                                      Actualmente es muy frecuente que se utilice el tubo primario en lugar de las copas de plástico.

                                      Existen dos tipos de carga de muestra:

                                      • Se cargan las muestras en un dispositivo que se cambia cuando se han tomado todas las muestras.

                                      • Se cambian continuamente los contenedores de las muestras, a medida que se van tomando.

                                      3.4 SISTEMAS DE SISPENSACIÓN DE MUESTRA

                                        • De Flujo Continuo: La muestra, impulsada por una bomba peristáltica, es aspirada por una aguja hacia una corriente continua de reactivo. La proporción resultante entre muestra y reactivo viene dada por la velocidad de flujo. La cantidad de muestra depende del diámetro interno del tubo.

                                        • Analizadores Discretos: La muestra es aspirada a través de una aguja llamada “jeringa de desplazamiento líquido positivo” y es colocada en una cubeta de reacción, junto con el reactivo. Las jeringas pueden ser de un volumen fijo o variable, dependiendo del autoanalizador. Si realizan poca variedad de pruebas se podrán usar de volumen fijo, pero si tienen múltiples determinaciones distintas, han de ser de volumen variable.

                                      3.5 SISTEMAS DE DISPENSACIÓN DE REACTIVOS

                                      Tipos de Reactivos:

                                      • Reactivos líquidos de reserva: Son los más empleados. Son reactivos en estado líquido que se adquieren de esta forma o en forma de polvos que se reconstituyen con agua o con buffers (tampones). Se manejan en contenedores de vidrio o plástico. El volumen del contenedor depende de la estabilidad del reactivo y de la capacidad de trabajo del autoanalizador.

                                      • Reactivos de unidad: Se utilizan para una sola determinación. Se utilizan más en autoanalizadores nuevos y son mucho más caros.

                                      Dispensación: Cada prueba utiliza 1 ó 2 reactivos, aunque algunas permiten el uso de 3 ó más. Se pueden dispensar de forma continua ó discreta., igual que la muestra.

                                      3.6 SISTEMAS DE MEZCLA DE REACTIVOS Y MUESTRA

                                      Analizadores de flujo continuo: Los reactivos y las muestras se mezclan por intersecciones en “Y” de los tubos transportadores. Una vez en el mismo tubo se mezclan por acción del flujo.

                                      Analizadores discretos: La mezcla tiene lugar en las cubetas de reacción. El mezclado se puede hacer por distintos mecanismos:

                                      • Por movimientos rotatorios de los contenedores

                                      • Por inyección de aire a presión

                                      • Mediante agitadores magnéticos

                                      • Agitadores de barra, etc.

                                      Analizadores centrífugos: La mezcla se lleva a cabo por acción de la fuerza centrífuga del rotor.

                                      Analizadores de química seca: La mezcla se produce por la difusión de la muestra a través de los reactivos.

                                      3.7 SISTEMAS DE INCUBACIÓN

                                      La incubación pretende que la reacción tenga lugar en un determinado tiempo y a una determinada temperatura.

                                      Flujo continuo: Los tubos en los que transcurre la reacción están inmersos en unos bloques de termostatización cuya temperatura se regula por la longitud del tubo y la velocidad del flujo.

                                      Discretos: La temperatura se puede alcanzar por baños de agua ó aire caliente a temperatura controlada. En estos baños se encuentran introducidas las cubetas de reacción.

                                      Centrífugos: Los rotores con las cubetas se reacción se encuentran inmersos en baños de aire caliente.

                                      Química seca: Las tiras de reacción se encuentran en contacto con superficies metálicas calientes.

                                      3.8 CUBETAS DE REACCIÓN Y LECTURA

                                      Flujo continuo: La reacción se produce en los tubos y la lectura se produce en las cubetas de lectura o de flujo. Por estas cubetas van pasando las soluciones para ser leídas.

                                      Discretos: Las cubetas de reacción pueden ser desechables o reutilizables. La lectura se realiza en las mismas cubetas de reacción.

                                      3.9 SISTEMAS DE DETECCIÓN

                                      El sistema de detección más frecuente es la espectrofotometría de absorción. También se pueden usar medidas nefelométricas y turbidimétricas, medidas de fluorescencia, electroquímica, química seca (reflexión ó electroquímica), etc.

                                      3.10 PROCESAMIENTO DE DATOS

                                      El detector crea una señal analógica que se transforma después en digital. Transforma los datos digitales en resultados que luego se imprimen.

                                      4. TIPOS DE AUTOANALIZADORES

                                      Hay que definir una serie de conceptos para después conocer los distintos tipos de autoanalizadores que hay:

                                      REPERTORIO DE PRUEBAS: Son las pruebas que puede llevar a cabo un autoanalizador. Hay que distinguir entre:

                                      • Número de pruebas totales que el autoanalizador puede realizar.

                                      • Número de pruebas que puede realizar de forma inmediata, es decir, pruebas programadas en una serie ó tanda de análisis sin necesidad de cambiar reactivos ni otras condiciones del aparato.

                                      TIEMPO DE RETARDO: Es el tiempo mínimo requerido para obtener un resultado después del procesamiento inicial de la muestra. Depende de la determinación solicitada y del número de determinaciones.

                                      CAPACIDAD: Es el número de determinaciones que se pueden procesar en 1 hora. Dependerá del tiempo de retardo.

                                      Tipos de Autoanalizadores

                                      • Analizadores Selectivos: También se llaman analizadores de acceso al azar. Pueden seleccionar para cada paciente las pruebas que se deseen del repertorio total sin tener que ejecutar en una muestra todas las determinaciones.

                                      • Analizadores Discretos: Cada muestra es transportada en contenedores individuales. Los reactivos se adicionan discontinuamente por medio de dispensadores y utilizan para dispensar las muestras “jeringas de desplazamiento líquido positivo”. Hay tres tipos:

                                        • Analizadores monoclonales por lotes: Realizan una única determinación de forma simultánea sobre varias muestras.

                                        • Analizadores monoclonales selectivos: Realiza varias pruebas distintas, seleccionables sobre cada muestra, pero solo tienen un sistema de muestra y un solo canal de lectura espectrofotométrica.

                                        • Analizadores multicanales: Realizan varias determinaciones simultáneas en una misma muestra.

                                      • Analizadores de Flujo Continuo: Son instrumentos que bombean continuamente reactivos a través de tuberías para formar una corriente de flujo, bombeando después la muestra a esta corriente. Para ello se utilizan bombas peristálticas.

                                      UT. 8 INMUNOENSAYOS. MÉTODOS ISOTÓPICOS

                                    • CONCEPTO

                                    • Los inmunoensayos son técnicas inmunológicas de cuantificación de Ag ó Ac. Emplean marcadores de los Ag o de los Ac, y los más utilizados son:

                                        • Isótopos radiactivos ! Radio Inmuno Análisis! RIA

                                        • Enzimas ! Enzimo Inmuno Análisis ! EIA

                                        • Compuestos fluorescentes ! Fluoro Inmuno Análisis! FIA

                                        • Compuestos luminiscentes ! Lumino Inmuno Análisis ! LIA

                                        • TIPOS DE INMUNOENSAYOS

                                        • 2.1 HOMOGÉNEOS

                                          Concepto: El compuesto marcado se comporta de forma diferente según esté libre o ligado al Ag o al Ac, por lo tanto, no es necesaria la separación física de las sustancias reaccionantes en dos fracciones, la libre y la ligada.

                                          Aplicación: Se usan para cuantificar Ag y son de tipo competitivo.

                                          Ag: antígeno que queremos medir

                                          Ag*: antígeno igual que el anterior, pero marcado

                                          Ac: anticuerpo que se une específicamente a estos antígenos

                                          Incubamos Ag y Ag* con una cantidad insuficiente de Ac para unirse a todas las moléculas de antígeno que tenemos. Los antígenos competirán entre sí por unirse a este Ac, por lo tanto, a mayor cantidad de Ag mayor será la cantidad de Ag* que quedará sin unirse al Ac.

                                          Principales inmunoensayos homogéneos:

                                          E.I.A: Enzimo inmuno ensayo. El EIA más importante es:

                                          • EMIT (Enzyme Mediated Immunoassay Technique)

                                          F.I.A: Fluoro inmuno ensayo. Tipos:

                                          • F.P.I.A (Fluorescent Polarization Immunoassay)

                                          • S.L.F.I.A (Substrate Label Fluorescent Immunoassay)

                                          • F.E.T.I (Fluorescent Excitation Transfer Immunoassay)

                                          2.2 HETEROGÉNEOS

                                          Concepto: El compuesto marcado se comporta de forma análoga esté libre o esté ligado, por lo tanto requiere una separación previa de las fracciones libre y ligada.

                                          Métodos de separación de las fracciones ligada y libre:

                                          • Adsorción: Se utilizan materiales insolubles como, por ejemplo, el carbón activo, resinas de intercambio iónico, silicatomagnésico, etc, a los que se une el compuesto que se desea determinar cuando se encuentra en estado libre. Se centrífuga, quedando en el sobrenadante la fracción líquida y en el sedimento la fracción libre.

                                          Se usa frecuentemente en el RIA. Tiene una desventaja, que es que es fundamental el tiempo de contacto entre el adsorbente y la muestra.

                                          • Precipitación: Se utilizan compuestos que precipitan las proteínas, como por ejemplo, el Etanol, Sulfato Amónico, Ácido Perclórico,... Después de centrifugar, en el sobrenadante queda la fracción libre, y en el sedimento la fracción ligada.

                                          • Doble Ac: Se usa un segundo Ac que precipita el Ag unido (fracción ligada), por lo tanto lo encontraremos en el sedimento y en el sobrenadante encontraremos la fracción libre.

                                          • Soporte Sólido: Unen uno de los componentes de la reacción inmunológica a un soporte sólido, que puede ser un tubo o una bola y, posteriormente, se separan las fracciones libre y ligada por lavado.

                                          Principales inmunoensayos heterogéneos:

                                            • Isotópicos:

                                              • RIA (Radioinmunoassay)

                                              • IRMA (Inmunoradiometric Assay)

                                            • Enzimáticos:

                                          • ELISA (Enzyme linked inmunoabsorbent Assay)

                                          • MEIA (Microparticle enzyme inmunoassay)

                                            • Fluorogénicos:

                                              • DELFIA (Dissociation enhaced by lanthanum fruoroinmunoassay)

                                            • Luminiscentes:

                                          • SPALT (Solid phase antigen luminescent technique)

                                          • ICMA (Inmunochemil inmunometric Assay)

                                          Tipos de inmunoensayos heterogéneos:

                                        • COMPETITIVOS: Son análogos a los homogéneos competitivos. Se emplean para moléculas de tamaño pequeño, que solo poseen un lugar antigénico o epítopo.

                                        • Ej. ELISA competitivo mediante conjugados Enzima-Ac:

                                          El Ag marcado y sin marcar compiten por el Ac.

                                          Actividad enzimática de fracción ligada es directamente proporcional a la concentración de Ag libre.

                                        • INMUNOMÉTRICOS DE TIPO SÁNDWICH: Se emplean para moléculas grandes que poseen más de un determinante antigénico. Utilizan también soportes sólidos.

                                        • 1º El Ac en fase sólida reacciona con el Ag

                                          2º Lavado

                                          3º Exceso de Ac marcado con E

                                          4º La actividad enzimática en la fase sólida es directamente proporcional a la concentración de Ag.

                                          Esta técnica se puede utilizar para determinar Ac, uniendo el Ag a la superficie sólida. El segundo Ac es específico para el Ac de la muestra.

                                          3. MÉTODOS DE AJUSTE DE CURVAS EN LOS INMUNOENSAYOS

                                          Las curvas de calibración de los inmunoensayos no son lineales y, por lo tanto, su representación gráfica es complicada y sometida a errores. Se realiza ajuste de curvas mediante complicados programas de ordenador.

                                          4. RADIOINMUNOANÁLISIS

                                          Concepto: Es un inmunoensayo que utiliza isótopos radiactivos para marcar los Antígenos ó los Anticuerpos.

                                          Tipos:

                                          • RIA: es un inmunoensayo heterogéneo, competitivo.

                                          • IRMA: es un ensayo inmunométrico de tipo sándwich, heterogéneo.

                                          Isótopos radiactivos más utilizados:

                                          • Carbono 14: para péptidos pequeños, fármacos y esteroides.

                                          • I125: para moléculas grandes.

                                          • Tritio (H3): para moléculas pequeñas.

                                          5. ENZIMOINMUNOENSAYOS

                                          Concepto: Utilizan enzimas como marcadores de Ag ó Ac. Pueden ser homogéneos o heterogéneos y constan de dos etapas, una primera inmunológica (durante la cual tiene lugar la reacción Ag-Ac) y una segunda etapa en la que se determina fotométricamente la actividad de la enzima marcada.

                                          Enzimas que se utilizan como marcadores: Peroxidasas, Fosfatasa alcalina, Glucosa oxidasa, Glucosa 6-fosfato Deshidrogenasa, -Galactosidasa.

                                          Inmunoensayos homogéneos:

                                          El EMIT es el más utilizado. Se usa fundamentalmente para la determinación de fármacos, sobre todo antiepilépticos, drogas, cardiotónicos y antineoplásicos.

                                          El fundamento es el siguiente: La sustancia que se desea determinar se marca con una enzima. La sustancia marcada de une con un Ac específico y esto determina que se inactive la actividad enzimática debido a que ocupa el lugar que debería ocupar el sustrato. Se mezclan la sustancia marcada y la muestra y ésta última compite con el Ac, de tal forma que a mayor cantidad de Ag en la muestra, más se unirá al Ac y éste dejará libre la enzima., manifestándose otra vez la actividad enzimática.

                                          Por lo tanto, hay una relación directa entre la concentración de Ag de la muestra y la actividad enzimática. Empleando soluciones de concentración conocida (patrones o satándares) de la sustancia que se quiere medir se puede elaborar una curva de calibración.

                                          Hay una excepción al mecanismo de inhibición, que es la Determinación de la Tiroxina, T4 (hormona tiroidea). Para ello se utiliza un enzima que es la Malato Deshidrogenasa (MDH). Este enzima se une a la Tiroxina y el conjugado Sustancia-Enzima es inactivo. Al unirse con el Ac específico anti Tiroxina se Activa. Por lo tanto, a mayor actividad de la enzima significa que tenemos más Ac fijado y menos concentración de T4 en la muestra que competiría con el Ac. Es decir, que la concentración de T4 de la muestra es inversamente proporcional a la actividad enzimática.

                                          Enzimoinmunoensayos heterogéneos:

                                          El más importante es el ELISA. Este sistema utiliza soportes sólidos para la separación de las fracciones ligadas y libres de la enzima. Los soportes más utilizados son: placas de microtitulación, bolas de poliestiremo y tubos.

                                          ELISA puede ser Competitivo y de tipo Sándwich. Se pueden usar Ac policlonales ó monoclonales.

                                          6. FLUOROINMUNOENSAYO (FIA)

                                          Utiliza compuestos fluorescentes como marcadores de los Ag ó de los Ac. Pueden ser homogéneos ó heterogéneos. Los marcadores más usados son el Isotiocianato de Fluoresceína y la Rodamina.

                                          Tipos de Fluoroinmunoensayos homogéneos

                                          FPIA: Se utiliza para sustancias de bajo peso molecular. Se basa en la cantidad de luz fluorescente que se detecta cuando la sustancia unida al marcador se ilumina con luz polarizada. Es de tipo competitivo.

                                          SLFIA: También es de tipo competitivo. Se une a la sustancia que se quiere medir un sustrato fluorogénico de un enzima, que cuando se hidroliza da lugar a un compuesto fluorescente.

                                          FETI: Es de tipo competitivo. La sustancia marcada y la no marcada de la muestra compiten por un Ag que lleva unido un extintor de la fluorescencia (quecher, q). Cuando se unen a la sustancia y el Ac, la fluorescencia del compuesto marcado se extingue. La competencia de la sustancia libre de la muestra inhibe la unión y bloquea la extinción. A mayor fluorescencia medida, mayor concentración de la sustancia estudiada.

                                          Tipos de Fluoroinmunoensayos heterogéneos

                                          Suelen usar fases sólidas a las que se unen los Ag ó los Ac para separar las fracciones ligada y libre.

                                          DELFIA: Usa un Ac marcado con un quelato de un lantánido (Europio) que es fluorescente. Puede ser competitivo ó de tipo sándwich.

                                          7. LUMINOINMUNOENSAYOS

                                          Utilizan compuestos luminiscentes como marcadores de los Ag ó los Ac. Los componentes más utilizados son la Lucigenina, Luminol, Isoluminol, derivados de la Acridina, Pirogalol,...Pueden ser homogéneos ó heterogéneos, y éstos últimos a su vez pueden ser competitivos ó de sándwich. Tipos: SPALT (Competitivo) ICMA (Competitivo)

                                          8. ANALIZADORES AUTOMÁTICOS PARA INMUNOENSAYOS

                                          Para inmunoensayos homogéneos: Se utilizan los autoanalizadores normales que se adaptan a este tipo de inmunoensayos fácilmente porque no hay que separar la fracción ligada de la libre.

                                          Para inmunoensayos heterogéneos: Existen autoanalizadores específicos:

                                          • Analizador automático para enzimoinmunoensayo ES-600 (Boehringer Mannheim)

                                          • Para imunoensayo de partición radial, el STRATUS (Borxter)

                                          • Utiliza la técnica MEIA, el IMX (Abbot)

                                          9. USO DE LOS Ac MONOCLONALES EN LOS INMUNOENSAYOS

                                          Concepto de Ac Monoclonal: Son Ac uniformes y homogéneos que se producen de manera continua a partir del mismo clon celular y se dirigen hacia un solo epítopo o determinante antigénico.

                                          Ventajas:

                                          • Exclusión de Ac con características no deseadas

                                          • Reconocimiento de un único determinante antigénico

                                          • Tiene menor interferencia de fondo

                                          • Tienen mayor facilidad de estandarización porque se pueden producir en grandes cantidades sin que cambien sus propiedades

                                          Desventajas:

                                          • La afinidad del Ac monoclonal suele ser baja

                                          • Es imposible diferenciar entre un grupo de moléculas que lleven el mismo determinante antigénico

                                          _________________________________________________________________________

                                          TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

                                          INMUNOELECTROFORESIS

                                          • Es un método cuantitativo.

                                          • Aplicación: Se utiliza para la identificación de paraproteínas, es decir, incrementos monoclonales de una inmunoglobulina.

                                          • Técnica: Se realiza en dos fases:

                                            • La primera es la separación de los Ag por electroforesis

                                            • La segunda consiste en la caracterización inmunológica de cada una de las proteínas separadas. Se difunden un antisuero general ó específico para la proteína que se identifica. Se produce la reacción Ag-Ac que se visualiza por la precipitación de los complejos inmunes. Los arcos de precipitación se pueden ver directamente ó teñirse con colorantes de proteínas.

                                          Ej.: Inmunoelectroforesis de suero general y suero humano

                                          • Muestras: Suero, orina y Líquido Cefalorraquídeo. El suero se aplica directamente, pero como la orina y el LCR tienen una concentración de proteínas baja hay que concentrarlos antes de su aplicación.

                                          • Patologías más frecuentes: Gammapatías monoclonales como el mieloma múltiple, la macroglobulemia de Waldestrom, etc.

                                          INMUNOELECTROFORESIS EN CONTRACORRIENTE Ó ELECTROINMUNODIFUSIÓN

                                          Los Ag migran en un gel de agarosa hacia el polo positivo y, los Ac se desplazan hacia el negativo. Los complejos Ag-Ac precipitan en el punto de equivalencia, formando líneas en forma de cohetes llamados “Rockets” y cuyas alturas son proporcionales a la concentración de Ag. Es un método muy rápido.

                                          REACCIONES DE PRECIPITACIÓN

                                          La reacción entre Ag y Ac forma complejos que se agregan entre sí y precipitan. La cantidad de precipitado depende de las proporciones de Ag y Ac. Se puede representar la “Curva de Precipitación” característica:

                                          INMUNONEFELOMETRÍA E INMUNOTURBIDIMETRÍA

                                          Se cuantifican Ag ó Ac al medir la dispersión de la luz que producen los pequeños agregados que enturbian la solución.

                                          Aplicaciones

                                          Determinación cuantitativa de Proteínas Específicas:

                                          • Inmunoglobulinas como IgG, IgM, IgA,...

                                          • 1-antitripsina

                                          • 2-macroglobulina

                                          • Ceruloplasmina

                                          • Prealbúmina

                                          • Transferrina, etc.

                                          INMUNODIFUSIÓN SIMPLE

                                          Se incorpora el Ac a un gel de Agar en un tubo. Se incuba con el Ag a temperatura ambiente durante un tiempo que permita la difusión. Se producen zonas de precipitación en el punto de equivalencia Ag-Ac.

                                          La distancia de la línea de precipitación desde el punto de aplicación del Ag es directamente proporcional a la concentración de Ag.

                                          Se construye una curva de calibración con patrones (Estándares) de concentración conocida y se obtendrá la cantidad de Ag presente en una muestra problema.

                                          INMUNODIFUSIÓN DOBLE ó de OUCHTERLONY

                                          Es un método cualitativo. Se usa para detectar proteínas específicas no habituales en el medio que se ensaya.

                                          Se colocan el Ag y el Ac en 2 pequeños pocillos hechos sobre un soporte. Ambos difunden de forma radial en el gel, uno hacia el otro, de tal forma que cuando se ponen en contacto aparece un arco de precipitación en el punto de equivalencia de Ag-Ac.

                                          Se pueden obtener 3 PATRONES:

                                          • PATRÓN DE IDENTIDAD: Ponemos en un pocillo el Ac y en otros dos pocillos el Ag1 y el Ag2. Si el Ag 1 y 2 son iguales, se unen las líneas de precipitación, apareciendo un solo arco de precipitación:

                                          • PATRÓN DE SEMIIDENTIDAD: Los Ag 1 y 2 están relacionados pero no son idénticos. Las líneas de precipitación se funden en un punto de corte:

                                          • PATRÓN DE DISPARIDAD: Los Ag 1 y 2 son diferentes y las líneas de precipitación se entrecruzan:

                                          INMUNODIFUSIÓN RADIAL

                                          El Ag está incluido en el Agar. Se practican unos pocillos donde se coloca la muestra. Se mide la distancia del arco de precipitación. Se usa fundamentalmente para Inmunoglobulinas y otras proteínas del suero.

                                          UT 9. DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL METABOLISMO BÁSICO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

                                          1. FISIOPATOLOGÍA (29/11/01)

                                        • CONCEPTO Y FUNCIONES

                                        • Los Hidratos de Carbono son compuestos orgánicos formados fundamentalmente por C, H, y O, entrando estos dos últimos elementos en la misma proporción que en el agua 2:1. Son Polihidroxialdehidos ó polihidroxicetonas:

                                          Su fórmula empírica es (CH2O)n. Son los compuestos más frecuentes en la naturaleza.

                                          Funciones:

                                          • Obtención de E: es la forma más rápida que tiene el organismo para obtener E.

                                          • Reserva energética en forma de glucógeno.

                                          • Estructural: sobre todo en las plantas (Ej. Celulosa)

                                          • CLASIFICACIÓN

                                          • Monosacáridos

                                            Constituidos por una sola molécula de polihidroxialdehído ó cetona. La fórmula empírica es (CH2O)3

                                          • Aldosas: Cuando tienen un grupo aldehído en la cadena

                                          • n = 3 ! Gliceraldehído

                                            n = 4 !Tetrosas (Eritrosa, Terrosa)

                                            n = 5 ! Pentosas (Ribosa, Arabinosa, Xilosa)

                                            n = 6 ! Hexsosas (Glucosa, Galactosa)

                                            n = 7 ! Heptosas

                                            n = 8 ! Octosas

                                          • Cetosas: Tienen un grupo ceto en la cadena

                                          • n = 3 ! Cetotriosas (Dihidroxiacetona)

                                            n = 4 ! Cetotetrosas (eritrolosa)

                                            n = 5! Cetopentosas (Ribulosa)

                                            n = 6! Cetohexosas (Fructosa)

                                            Estructura Química de los Monosacáridos

                                            • Formas L y D: están determinadas por la posición que ocupa, en el C5, el grupo -OH. Así, las formas D son aquellas que tienen el -OH en la derecha, mientras que las formas L son las que lo tienen a la izquierda (D-Glucosa es el azúcar más frecuente y más importante en el organismo humano).

                                            • Formas Epímeras: son azúcares que difieren en la posición que tiene un grupo -OH ó varios de algunos de sus átomos de carbono.

                                            • Hemiacetal: en solución, los azúcares están en forma cíclica ó de hemiacetal, que resulta de la reacción de los grupos aldehídos o cetónicos con el grupo -OH de una misma molécula. En disolución hay equilibrio entre ambas formas (cíclicas y no cíclicas). Los grupos situados a la izquierda de la molécula se sitúan hacia arriba del anillo y los de la derecha, en la parte inferior.

                                            • Formas  y : Las formas cíclicas pueden existir de dos maneras. Las alfa tienen el grupo -OH del C1 hacia abajo, mientras que las beta lo tienen hacia arriba. Ambas formas desvían la luz polarizada de diferente forma y en solución coexisten las dos.

                                            Disacáridos

                                            Están formados por dos monosacáridos iguales o distintos entre sí. Los monosacáridos se unen por un enlace glucosídico, que se forma entre un grupo carbonilo de un monosacárido y un grupo -OH del otro. Los más importantes son:

                                            Sacarosa: D-Glucosa + D-Glucosa (azúcar común)

                                            Lactosa: D-Galactosa + D-Glucosa

                                            Maltosa: D-Glucosa + D-Glucosa

                                            Oligosacáridos

                                            Formados por la unión de 3 a 10 monosacáridos.

                                            Polisacáridos

                                            Formados por la unión de más de 10 monosacáridos. Pueden ser:

                                            Homopolisacáridos: Están constituidos por un único tipo de monosacárido. El más importante es el glucógeno, que es la forma de almacenamiento de la Glucosa en el hígado.

                                            Heteropolisacáridos: Tienen 2 ó más tipos de monosacáridos. Pueden estar formados por aminoazúcares denominándose entonces “mucopolisacáridos” (heparina, ácido hialurónico, ácido condroitín sulfato). La alteración del metabolismo de estos mucopolisacáridos da lugar a enfermedades hereditarias de grave pronóstico pero poco frecuentes.

                                          • METABOLISMO

                                          • Ingreso en el organismo: Son ingeridos con la dieta diaria, sobre todo en forma de polisacáridos (Almidón) y en forma de disacáridos (Sacarosa y Lactosa) y, en menor proporción, en forma de monosacáridos (Glucosa, Galactosa y Manosa).

                                            Digestión: Actúan los enzimas digestivos para transformar los Hidratos de Carbono en monosacáridos. La digestión comienza en la boca, donde actúa la Amilasa Salivar, que comienza a transformar el Almidón en Dextrina y disacáridos. En el intestino actúa la amilasa pancreática, que transforma el Almidón en Dextrina y disacáridos. También en el intestino delgado actúan las disacaridasas que transforman los disacáridos en monosacáridos, fundamentalmente Glucosa.

                                            Absorción/ Transporte/ Metabolismo: La Glucosa se absorbe en el intestino, pasando a la sangre y siendo transportada al hígado y al músculo donde se almacena en forma de glucógeno mediante una serie de reacciones que reciben el nombre de “Glucogénesis” en la que se consume Energía, por lo tanto, forma parte del anabolismo donde de sustancias más pequeñas se crean sustancias más grandes con consumo de E.

                                            También la Glucosa puede ser transportada a las células que necesitan E en ese momento. La Glucosa entra e el interior de las células y tiene lugar una serie de reacciones denominadas “Glucólisis” que se puede llevar a cabo de forma aerobia ó anaerobia. Con estas reacciones la Glucosa se transforma en E (forma parte del Catabolismo).

                                            Si el organismo necesita Glucosa, recurre al Glucógeno que, mediante un conjunto de reacciones que reciben el nombre de “Glucogenolisis” se transforma en Glucosa (Catabolismo)

                                            Si la necesitad de Glucosa es muy grande, bien porque no se pueda utilizar la Glucosa sanguínea, o bien porque no haya reservas, la propia célula es capaz de sintetizar Glucosa a partir de fuentes alternativas como, por ejemplo, los aminoácidos, el lactato, los ácidos grasos, los cuerpos cetónicos, glicerol,... mediante un proceso llamado “Neoglucogénesis” (Anabolismo). La Neoglucogénesis tiene lugar en las células hepáticas, adiposas y musculares

                                            Regulación Hormonal del metabolismo de los Hidratos de Carbono: Los niveles de Glucosa se mantienen dentro de unos márgenes estrechos y constantes y se encuentran regulados fundamentalmente por dos hormonas que son la “Insulina” y el “Glucagón”, ambas secretadas por el páncreas endocrino. Éste está formado por pequeños y numerosos islotes de células llamadas “Islotes de Langerhans”, que tienen dos tipos de células:  (Producen glucagón) y  (Producen insulina). Estas últimas son mucho más abundantes.

                                            INSULINA

                                            Es una hormona proteica que sale a la sangre donde circula poco tiempo y es metabolizada en el hígado. Se sintetiza a partir de una molécula, que es la “proinsulina” que se escinde (divide) para dar lugar a la insulina y al péptido C. Influye tanto en el metabolismo de Hidratos de Carbono, como en el de los lípidos o el de las proteínas:

                                          • Influencia sobre los Hidratos de Carbono: La insulina es la única hormona hipoglucemiante, es decir, que promueve la captación, el almacenamiento y el uso de la Glucosa para la mayoría de las células del organismo, disminuyendo su concentración en la sangre. Es especialmente importante su efecto en el hígado, favoreciendo la entrada masiva de Glucosa para obtener E, pero no necesita insulina para la entrada de la Glucosa en las Células.

                                          • Influencia sobre los lípidos: Ahorra grasa para obtener E, por lo tanto, disminuye la lipólisis y aumenta la síntesis de ácidos grasos.

                                          • Influencia sobre las proteínas: Favorece la entrada de aminoácidos en la célula, por lo que aumenta la síntesis de proteínas.

                                          • GLUCAGÓN

                                            Es una hormona proteica que produce hiperglucemia, es decir, un aumento de glucosa en sangre. Este aumento se produce por dos motivos fundamentales:

                                            • Favorece la glucogenolisis en el hígado

                                            • Favorece la formación de glucosa a partir de los aminoácidos

                                            La regulación de la secreción de insulina y glucagón viene determinada fundamentalmente por la Glucemia, es decir, por la cantidad de glucosa en sangre.

                                            En ayunas, con una glucemia normal, la secreción de insulina es basal mínima. Como la insulina es hipoglucemiante se establece un mecanismo de retroalimentación negativo (inhibición de la insulina)

                                            INSULINA ______! ! Glucemia

                                            _____________

                                            (-) Feed Back

                                            Con el glucagón ocurre lo contrario. Si hay hipoglucemia, el páncreas libera la producción de glucagón.

                                            Control de la Glucemia. La glucemia normal en ayunas es de aproximadamente 80-90 mg/100 mL. Se eleva después de las comidas hasta aproximadamente 140 mg/100mL, volviendo a la normalidad a las 2 horas.

                                            Además de la Insulina y el Glucagón, también el Hígado regula la glucemia: aumenta la glucogenolisis cuando la glucosa es baja y absorbe glucosa para formar glucógeno cuando la glucemia aumenta.

                                            También el Sistema Nervioso interviene en la regulación de la glucosa: la hipoglucemia determina un estímulo del Sistema Nervioso Simpático (SNS) que se manifiesta con un aumento de la Adrenalina y que determina un estímulo de la glucogenolisis hepática.

                                            1.4 ALTERACIONES DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

                                            HIPERGLUCEMIA: DIABETES MELLITUS

                                            Concepto: Es una enfermedad plurietiológica de base genética que se caracteriza por la mala utilización de los Hidratos de Carbono, que determina un aumento de la Glucemia.

                                            Fisiopatología:

                                            • Aumento de la glucemia en ayunas por encima de los 140 mg/dL (7,8 mmol/L)

                                            • Aumento exagerado de la glucosa a cualquier hora del día por encima de los 200 mg/dL (11,1 mmol/L).

                                            • Aparición de glucosa en orina (glucosuria) cuando la glucemia es superior a los 180 mg/dL (10 mmol/L), que es el umbral de filtración para la glucosa. El aumento de la glucosa en orina determina un aumento de la osmolaridad de la orina y, por lo tanto, un aumento de la secreción de agua en la orina, produciéndose una poliuria.

                                            • El aumento de la glucemia aumenta la osmolaridad sanguínea y, por lo tanto, un aumento del agua intravascular por dos mecanismos que determinan una hemodilución de los elementos formes de la sangre y que son:

                                          • Por un aumento de la sed (Polidipsia), que obliga a beber agua en grandes cantidades.

                                          • Que exista un trasvase de agua desde el interior de la célula al exterior.

                                            • La glucosa está muy aumentada en sangre pero es incapaz de ingresar en la célula y producir E por la falta de Insulina. Por ello, la sensación de hambre no se aplaca y el enfermo come mucho (Polifagia), a pesar de lo cual disminuye su peso corporal ya que se utilizan las reservas activándose la neoglucogénesis con gran formación de cuerpos cetónicos que pueden dar lugar a una acidosis metabólica.

                                            • Con el tiempo y con hiperglucemias prolongadas se producen trastornos vasculares que afectan a los vasos pequeños (Retina, Riñón...) y a capilares de la circulación general, pudiendo acabar el enfermo con ceguera, insuficiencia renal o gangrena de las zonas periféricas.

                                            Tipos de Diabetes Mellitus

                                            • Diabetes Mellitus Insulino dependiente (DMID) ó Diabetes Juvenil ó Diabetes Tipo I.

                                            • Diabetes Mellitus NO Insulino dependiente (IMNID) ó Diabetes del adulto ó Tipo II: el déficit de insulina no es absoluto pero no hay insulina suficiente para mantener los niveles de glucosa dentro de los valores normales. Estos enfermos se tratan con dieta y con antidiabéticos orales.

                                            • Diabetes Mellitus Secundaria: puede aparecer un aumento de la glucemia, secundaria a muchas patologías, como por ejemplo, por enfermedades del páncreas o la ingestión de fármacos como los corticoides o los anticonceptivos orales.

                                            HIPERGLUCEMIA: DISMINUCIÓN DE LA TOLERANCIA A LA GLUCOSA

                                            La Glucemia es menor de 126 mg/dL (valor normal). Cuando a estos pacientes se les administra por vía oral una cantidad de glucosa, a las 2 horas los valores de la glucemia son valores intermedios entre los fisiológicos y los de la diabetes.

                                            No existe clínica, suelen ser obesos y, muchas veces, disminuyendo el peso se corrige el problema. Estas personas tienen mayor tendencia a padecer Diabetes Mellitus en el futuro.

                                            HIPERGLUCEMIA: DIABETES DEL EMBARAZO

                                            Se diagnostica durante el embarazo, normalizándose los niveles de glucosa al terminar el mismo. Esta diabetes siempre es insulino dependiente.

                                            HIPOGLUCEMIA

                                            Los niveles de glucosa están por debajo de 40-45 mg/dL. Puede ser:

                                            • En ayunas: a su vez puede ser debida a 2 motivos principales:

                                            • Ayuno prolongado

                                            • Insulinoma: Tumor del páncreas (hiperplasia ! aumento del número de células) que da lugar a un aumento de la insulina.

                                              • Hipoglucemia reactiva por comer o tomar medicamentos: la más importante es la producida en los enfermos diabéticos tras la administración de insulina o hipoglucemiantes orales.

                                            Manifestaciones clínicas de la Hipoglucemia

                                                • Manifestaciones Precoces: aparecen secundarias a la liberación de Catecolaminas (Adrenalina y Noradrenalina) que se produce para aumentar la glucogenolisis y, por tanto, la glucosa en sangre. Estas manifestaciones son más intensas cuanto más rápidamente se instaura la hipoglucemia. Son las siguientes: Taquicardia; sudoración intensa; temblores; Sensación de ansiedad; sensación de hambre; hipertensión;...

                                                • Manifestaciones Tardías: son debidas a las alteraciones del sistema nervioso central y son las únicas que aparecen cuando la hipoglucemia se instaura lentamente. Son: Mareos; cefalea; alteraciones de la percepción visual; confusión; convulsiones; y coma.

                                            2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS PARA VALORAR EL FUNCIONAMIENTO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

                                            2.1 DETERMINACIÓN DE LA GLUCEMIA BASAL

                                          • Métodos basados en el poder reductor de los H.C:

                                            • Reducción del cobre (método de Benedict)

                                            • O - Toluidina (no se usa)

                                            • Métodos enzimáticos

                                              • Método de la Hexoquinasa: es el método de referencia porque es el que proporciona el máximo de especificidad. Se basa en las siguientes reacciones:

                                              GLUCOSA + ATP ______! GLU-6-P + ADP

                                              Hexoquinasa

                                              GLUC-6-P + NADP _____! 6 Fosfogluconolactona + NADPH + H+

                                              • Método de la Glucosa-Oxidasa: se basa en la oxidación de la glucosa por la enzima “Glucosa Oxidasa”. Dentro de este método existen otros, siendo el más utilizado el método “Trinder”.

                                              2.2 HEMOGLOBINA GLICOSILADA

                                              La Hb Glicosilada es una fracción de la Hb A unida de forma irreversible a la glucosa por enlaces covalentes. Su aparición es proporcional a los niveles de glucosa en sangre y se mantiene hasta que son destruidos los hematíes.

                                              No es útil para el diagnóstico de la diabetes porque es muy específica pero no muy sensible, por lo tanto, la obtención de Hb glicosilada normal no excluye la diabetes. Se utiliza para hacer el seguimiento de los enfermos diabéticos porque permite conocer los niveles de glucemia de los 2 meses anteriores a la determinación. Se emplea la fracción de Hb A1c y los niveles de referencia están alrededor de 4,5-5,7 %. Los métodos para su determinación son: HPLC; Cromatografía de intercambio iónico; Cromatografía de afinidad; e Inmunoturbidimetría (la más usada)

                                              2.3 FRUCTOSAMINA

                                              Las proteínas del plasma se glican (se unen a glucosa) por un mecanismo enzimático de forma similar a la Hb glicosilada, por ello, la determinación de la fructosamina se usa para el seguimiento de los diabéticos.

                                              La vida media de las proteínas plasmáticas es de 17-30 días, por lo tanto, nos da información de la tasa de glucemia de 2 ó 3 semanas anteriores a la determinación. Se determina por espectrofotometría.

                                              2.4 OTRAS DETERMINACIONES

                                              Insulina: Se determina mediante ELISA y RIA

                                              Péptido C: se utiliza para saber si una hiperinsulinemia es de origen exógeno o endógeno ya que los preparados comerciales de insulina no llevan péptido C. Para su determinación se usa el RIA.

                                              Microalbuminuria: es la excreción de proteínas por la orina en cantidad inferior a los 20 mg/dL. Por debajo de esta cantidad no se detectan las proteínas en orina con las tiras reactivas. Sirve para el control precoz de los diabéticos, para detectar las lesiones renales por microangiopatía. Se determina mediante métodos inmunoquímicos, por nefelometría o turbidimetría, y nos permite detectar niveles de entre 2 a 20 mg/dL.

                                              Anticuerpos y Receptores: se pueden determinar Ac anti-insulina, Receptores de insulina y Ac contra las células productoras de insulina. Se pueden determinar por enzimoinmunoensayo y por inmunofluorescencia indirecta.

                                              2.5 PRUEBAS FUNCIONALES

                                              Se llaman Test de Tolerancia a la Glucosa Oral (TTGO) o también Prueba de Sobrecarga de Glucosa. Consiste en los siguientes pasos:

                                              • Durante los días inmediatamente anteriores a la prueba, generalmente 3 días, el paciente debe ingerir una dieta rica en carbohidratos.

                                              • No es conveniente realizar esta prueba a personas que se encuentran hospitalizadas por una enfermedad grave por dos motivos: la inmovilización y la dieta.

                                              • Al paciente se le da una sobrecarga oral de 75 g de Glucosa (puede ser entre 50-100 g de Glucosa en adulto). A los niños se les da 1,75 g por kilogramo de peso siempre hasta un máximo de 75 g.

                                              • Al paciente se le hace una extracción de sangre en condiciones basales y se le determina la glucemia basal. Debe haber estado en ayunas al menos 12 horas.

                                              • Se le ofrece una solución de Glucosa que debe beberse despacio (durante unos 5 minutos). Si se presentan nauseas, mareos, sudoración o cualquier signo de hiperactividad del sistema nervioso vegetativo debe extraerse una muestra de sangre inmediatamente y suspender la prueba.

                                              • A la hora y a las dos horas de iniciar la ingestión se extrae sangre venosa. Hay que tener en cuenta que la Glucosa es mal tolerada por algunos pacientes. Si vomitan lo anotaremos porque puede modificar la prueba.

                                              • La tolerancia a la Glucosa disminuye con la edad, por eso la prueba es de difícil interpretación en personas mayores.

                                              • Evaluación: según la OMS se diagnostica Diabetes cuando:

                                                • La Glucosa Plasmática en ayunas es superior a 140 mg/dL

                                                • El valor a las 2 horas debe ser superior o igual a 200 mg/dL

                                                • El valor de Glucosa entre 0-2 horas debe ser superior a 200 mg/dL

                                                  • Las pruebas de sobrecarga se realizan para establecer el diagnóstico en los siguientes casos:

                                                    • Personas con glucosuria que tienen glucemia basal normal y no tienen síntomas clínicos de diabetes.

                                                    • Personas que tienen síntomas de diabetes, glucemias basales normales y no tienen glucosuria.

                                                    • Personas que tengan antecedentes familiares de Diabetes Mellitus.

                                                    • Mujeres que han tenido hijos con peso excesivo (Ej. 4,5 Kg.)

                                                    • Embarazadas.

                                              UT 10. ESTUDIO BIOQUÍMICO DE LA ORINA

                                              1. ANÁLISIS DE ORINA: OBJETIVOS

                                              • Obtener información del estado general de los riñones y sus posibles alteraciones.

                                              • Detectar la existencia de una alteración a nivel de las vías urinarias.

                                              • Detectar alteraciones funcionales de otros órganos teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan por vía urinaria. Ej.: Urea; Creatinina; Ácido Úrico...

                                              • Detectar alteraciones metabólicas y del equilibrio ácido-base e hidroelectrolítico.

                                              Resumiendo, buscamos en primer lugar sustancias que no están normalmente en orina (Ej. Glucosa, proteínas,...) y, en segundo lugar alteración en la concentración por exceso o defecto de sustancias que habitualmente están en la orina (Ej. Urea, ácido úrico,...).

                                              PATOLOGÍA DEL APARATO URINARIO

                                            • ENFERMEDADES RENALES

                                            • Glomerulonefritis (GNF)

                                              • CONCEPTO: es una inflamación del ganglio renal.

                                              • ETIOLOGÍA (causas):

                                                • Primaria: tiene un origen inmunológico (Ej. Estreptococo  hemolítico como Ag)

                                                • Secundaria: aparece como consecuencia de otra patología (Ej. Lupus Eritematoso Sistémico LES

                                              • FISIOPATOLOGÍA:

                                                • Orina: Oliguria (disminución del filtrado glomerular)

                                                Albuminuria

                                                Hematuria Aumento de la permeabilidad de la membrana

                                                Leucocituria

                                                • Extrarrenal: Hipertensión Arterial HTA

                                                Edemas: aparición de líquido en el tejido intersticial

                                                Azotemia: retención de productos nitrogenados en sangre

                                                Acidosis Metabólica

                                              • Síndrome Nefrótico

                                                • CONCEPTO: es un síndrome cuya clínica se caracteriza por Proteinúria; Hipo y Disproteinemia (baja concentración y distinta proporción de proteínas en sangre); Edemas e Hiperlipidemia.

                                                • ETIOLOGÍA: Glomerulonefritis; LES, etc.

                                                • FISIOPATOLOGÍA:

                                                • Orina: Proteinúria muy elevada y selectiva y Cilindruria (aparición de cilindros en orina)

                                                • Extrarrenal: Hipoproteinemia; hiperlipemia; Edemas.

                                                • Insuficiencia Renal (IRA)

                                                    • AGUDA

                                                      • CONCEPTO: es una lesión aguda de las células tubulares

                                                      • ETIOLOGÍA: Disminución del riego sanguíneo (IRA Prerrenal)

                                                  Glomerulonefritis y otras enfermedades renales (IRA Renal)

                                                  Obstrucción de las vías urinarias (IRA Postrrenal)

                                                  • FISIOPATOLOGÍA:

                                                  1ª Fase: Oliguria (9-11 días) ! orina escasa, isostenuria; Albuminuria; Hematuria; Piuria; cilindruria.

                                                  2ª Fase: Poliúrica (2 ó 3 semanas) ! Orina abundante e Hipostenuria (densidad baja) que se produce porque los túbulos renales se hacen insensibles a la hormona antidiurética ADH.

                                                    • CRÓNICA

                                                  • CONCEPTO: es la incapacidad para cumplir las funciones renales alcanzada lentamente por progresiva inutilización de las nefronas.

                                                  • ETIOLOGÍA: Enfermedades glomerulares; enfermedades intersticiales; enfermedades vasculares; tumores; etc.

                                                  • FISIOPATOLOGÍA: al principio hay compensación por las nefronas sanas. Progresivamente se produce oliguria con hipostenuria y finalmente se produce la descompensación total dando lugar al cuadro llamado “UREMIA” que se caracteriza por Oliguria; Isostenuria; Azotemia; Acidosis, etc.

                                                • ENFERMEDADES DE LAS VÍAS URINARIAS

                                                • Litiasis Urinaria ó Cólico Nefrítico: es un cuadro doloroso por la formación de cálculos en las vías urinarias.

                                                • Infecciones de las Vías Urinarias:

                                                  • Cistitis: inflamación de la vejiga urinaria, casi siempre por infecciones y cuya clínica consiste en Polaquiuria (aumento del número de micciones); Disuria (dolor al orinar) y Tenesmo Vesical (aumento de ganas de orinar).

                                                  • Uretritis.

                                                  • Tumores.

                                                  • 2. ETAPAS DEL ANÁLISIS DE ORINA

                                                    A. CARACTERÍSTICAS GENERALES Y MEDIDAS

                                                    A.1 COLOR

                                                    • Orina normal: amarillo-ámbar. Varía en función de la concentración de la orina

                                                    • Alteraciones:

                                                      • Orina incolora o amarillo muy claro: aparece en:

                                                    *La Diabetes insípida: disminución o falta de la Vasopresina o Antidiurética ADH.

                                                    * Poliuria: eliminación de mayor cantidad de orina.

                                                    • Orina marrón o pardo oscura: Signo de Hepatitis o Cirrosis Hepática.

                                                    • Orina amarilla-amarilla: o verdoso-amarillento: Signo de Ictericia (Bilirrubina aumentada que se elimina por la orina)

                                                    • Orina amarillo oscuro: Signo de fiebre aguda (eliminación de cuerpos cetónicos).

                                                    • Orina lechosa, blanca: Signo de infecciones urinarias como la cistitis (presencia de leucocitos)

                                                    • Orina rojiza: Significa siempre la presencia de sangre. Puede ser rojo turbio cuando es Hematuria (hematíes en orina) o rojo claro cuando se trata de Hemoglobinuria (no hay hematíes sino hemoglobina).

                                                    • Orina naranja: Se debe a la toma de algún tipo de antibióticos.

                                                    • Orina negra: Se deben a la existencia de melanina o ácido Homogentísico.

                                                    A.2 TURBIDEZ

                                                    La orina recién emitida es clara y transparente. Luego, con el tiempo se opacifica por la precipitación de sales.

                                                    La orina de los pacientes con infección piógena (infecciones bacterianas) de las vías urinarias es frecuentemente turbia recién emitida.

                                                    Hay que diferenciar la turbidez por piuria (pus en orina = leucocitos) de la producida por la precipitación de sales. Esto se hace de varias formas:

                                                    • Si hay uratos (sales de ácido úrico) al calentar la orina a 60ºC desaparece la turbidez.

                                                    • Si acidificamos la orina y no desaparece la turbidez significa piuria.

                                                    • Se mide el pH de la orina. Si es básico, la turbidez es debida más frecuentemente a Fosfatos y Carbonatos.

                                                    La aparición de espuma resistente al agitar, significa presencia de proteínas.

                                                    A.3 DENSIDAD ó PESO ESPECÍFICO

                                                    La densidad indica la relación entre los sólidos disueltos y el volumen total de la muestra.

                                                    La densidad normal está comprendida entre 1010 - 1030 (1,010 - 1,030)

                                                    Si la orina es la primera de la mañana: 1020 -1025

                                                    La densidad se puede medir con un urodensitómetro, por refractometría o mediante tiras reactivas. Este último método es el más utilizado.

                                                    Los Valores Anormales de peso específico o densidad son:

                                                    • Densidad baja 1001 - 1003: Puede ser debida a una Diabetes insípida ó a una alteración de la función renal que a su vez se puede deber a una glomerulonefritis GNF ó inflamación del riñón; a una pielonefritis ó inflamación de la pelvis renal; al uso de diuréticos; etc.

                                                    • Densidad alta > 1030: se debe a que el paciente padece patologías que conllevan una pérdida de agua (diarreas, vómitos persistentes...) ó patologías que aumenten la cantidad de solutos pero que mantengan el volumen de líquido constante.

                                                    • Densidad fija: una orina con una densidad fija baja (aproximadamente 1010) se conoce con el nombre de “Isostenuria” e indica un daño renal grave.

                                                    A.4 PH URINARIO

                                                    Los valores normales de pH urinario están comprendidos entre 4,5 - 8,2, aunque el valor más frecuente es el de 6. El pH urinario es más bajo después del ayuno nocturno y es más alto después de las comidas.

                                                    Los valores anormales son:

                                                    • Acidez urinaria:

                                                      • Dietas ricas en carne

                                                      • Fiebre

                                                      • Diabetes Mellitus

                                                      • Acidosis metabólica

                                                    • Alcalinidad:

                                                    • Dietas ricas en vegetales y cítricos

                                                    • Úlceras gástricas

                                                    • Tratamiento con antiácidos

                                                    • Bacterias productoras de Ureasa (Ej. Proteus)

                                                    • Cistitis (inflamación de la vejiga)

                                                    El pH urinario es importante en el caso de cálculos urinarios (litiasis) ya que su formación depende parcialmente del pH urinario. Así, los cálculos de Fosfato y Carbonato Cálcico se desarrollan en orinas alcalinas.

                                                    Los cálculos de ácido úrico y de cistina aparecen en orinas ácidas.

                                                    El método de medida del pH más utilizado son las Tiras Reactivas, que utilizan como indicadores el Rojo de Metilo y el Azul de Bromotimol, y permiten diferenciar pH entre 5 y 9, obteniéndose una gama de naranjas, verdes y azules.

                                                    A.5 VOLUMEN

                                                    En adultos, la Diuresis normal oscila entre los 700 -2000 cc/24h, aunque el volumen más frecuente es de 1500 cc/24h.

                                                    En niños hasta de 6 años, lo normal es un volumen de entre 300 -600 mL/24h, y de 6 - 12 años entre 500 -1100 mL/24h.

                                                    A la diuresis normal influye fisiológicamente la ingesta de líquidos y de sustancias diuréticas (Ej. El alcohol, café, fármacos diuréticos, etc).

                                                    Las alteraciones en el volumen son:

                                                    • Oliguria: disminución del volumen urinario. 50-300 mL/24h

                                                    • Poliuria: aumento del volumen urinario superior a 2000 mL/24h

                                                    • Anuria: falta de formación de orina o eliminación inferior a 100 mL/24h

                                                    B. DETERMINACIONES QUÍMICAS

                                                    B.1 PARÁMETROS MÁS HABITUALES DETECTADOS EN EL EXAMEN BIOQUÍMICO DE LA ORINA

                                                    • Proteínas

                                                    • Glucosa

                                                    • Cuerpos Cetónicos

                                                    • Hemoglobina

                                                    • Pigmentos Biliares

                                                    • Urobilinógeno

                                                    • Nitritos

                                                    En condiciones normales los métodos de análisis de orina no detectan estas sustancias debido a que su concentración es menor que la sensibilidad de dichos métodos, por ello se habla de “Detección de Anormales”.

                                                    El estudio se hace de forma cualitativa o semicuantitativa mediante la utilización de la química seca, es decir, tiras reactivas de diferentes tipos. Si se precisan valores más exactos se hará la determinación cuantitativa mediante los métodos habituales (Espectrofotómetro, autoanalizador, etc)

                                                    B.2 IMPORTANCIA CLÍNICA DEL ESTUDIO DE ANORMALES EN ORINA

                                                    • PROTEINAS: En condiciones normales están en muy pequeña cantidad. Aproximadamente entre 130 - 150 mg/día (Orina de 24 horas). En el recién nacido (3 primeros días de vida) los valores normales están comprendidos entre 2 - 8 mg/100 mL de orina.

                                                    Las proteínas con peso molecular inferior a 50.000 - 60.000 D se filtran pero se reabsorben en el Túbulo Contorneado Distal TCD.

                                                    Las proteínas que habitualmente se eliminan por orina son:

                                                      • Albúmina: constituye 1/3 del total de proteínas que se eliminan. Tiene un peso molecular de 69.000 D. Es la llamada Albúmina Fisiológica.

                                                      • Globulinas

                                                      • Proteína de Tamm-Horsfall: es una mucoproteína de estructura viscosa que no se encuentra en el suero, que se forma en el TCD y constituye la matriz de los cilindros.

                                                    La Proteinúria es la eliminación de proteínas en orina en cantidades superiores a lo normal. Tipos:

                                                  • En función de la cantidad de proteínas:

                                                    • Proteinúria Intensa (> 4 g /día) : tiene lugar en el Síndrome Nefrótico; en las glomerulonefritis;... en general, cuando hay un daño renal grave.

                                                    • Proteinúria Moderada (0,5 - 4 g /día): se produce en las enfermedades renales menos graves.

                                                    • Proteinúria Leve (< 0,5 g /día): aparece en enfermedades leves como los riñones poliquísticos o lesiones renales incipientes o tempranas; Mieloma Múltiple (también se puede incluir en enfermedad moderada).

                                                    • En función de la zona renal afectada:

                                                      • Proteinúria de patrón glomerular: el glomérulo pierde su selectividad en la filtración apareciendo en orina proteínas de mayor peso molecular (Ej. Albúmina). A mayor tamaño de las proteínas mayor lesión glomerular.

                                                      • Proteinúria de patrón tubular: no se reabsorben las proteínas de bajo peso molecular que son las que aparecen en la orina (Ej. Microglobulinas).

                                                      • En función de la duración:

                                                        • Intermitente o Transitoria: aparece en pacientes sin causa renal

                                                        • Persistente.

                                                        • GLUCOSA: La orina normal carece casi por completo de glucosa. La glucosa se filtra continuamente por el glomérulo pero se reabsorbe casi totalmente en el TCD.

                                                        La máxima concentración de glucosa en sangre que los túbulos son capaces de reabsorber se denomina “umbral renal” y es de 160 mg /dL.

                                                        La Glucosuria es el aumento de la concentración de Glucosa en orina por encima de los valores normales. Las causas de glucosuria son la Diabetes Mellitus, que aumenta la glucemia; y la Tubulopatía, que mantiene una glucemia normal.

                                                        • CUERPOS CETÓNICOS: Se llaman cuerpos cetónicos al Ácido Acetil Acético ó Diacético; Ácido -hidroxibutírico y a la Acetona.

                                                        En personas sanas, los cuerpos cetónicos se sintetizan en el hígado y en condiciones normales se metabolizan por completo, de tal forma que en orina aparecen en cantidades indetectables.

                                                        La Cetonuria es la aparición de cuerpos cetónicos detectables en orina. Las causas de que aparezca son fiebre alta, vómitos, diabetes mellitus,...

                                                        • HEMOGLOBINA: No aparece en orinas normales.

                                                        La hemoglobinuria es la presencia de hemoglobina en orina. Si la hemoglobina aumenta se ve a simple vista y las causas de que aparezca son las enfermedades renales de vías altas (riñón, pelvis renal), anemia hemolítica, reacciones transfusionales...

                                                        • PIGMENTOS BILIARES: Son la Bilirrubina y la Biliverdina. Se forman en el hígado, en el bazo y en la médula ósea por degradación fisiológica de los hematíes. El aumento de bilirrubina en orina aparece en disfunciones hepáticas.

                                                        • UROBILINÓGENO: Es el resultado de la transformación de la bilirrubina en el intestino. Da color a las heces y a la orina y aumenta en enfermedades hepáticas.

                                                        • NITRITOS: Su aparición en orina indica crecimiento bacteriano de gérmenes capaces de reducir los nitratos a nitritos (Ej. Enterobacterias). Un resultado negativo no significa que no haya m.o ya que pueden ser no reductores de nitratos (Ej. Estreptococcus) y, además, puede que no haya nitratos en la dieta.

                                                        C. EXAMEN MICROSCÓPICO DEL SEDIMENTO

                                                        C.1. CONCEPTO: el sedimento urinario comprende la investigación e interpretación de estructuras de distinto origen y composición como células, cristales, cilindros, etc, utilizando el estudio microscópico. La muestra se prepara por centrifugación de la orina.

                                                        C.2. CÉLULAS: se buscan con el objetivo de 40x. Tenemos que hacer recuento de glóbulos rojos y blancos y se informa como número de células por campo después de haber observado 4 o 5 campos. Las células epiteliales y los m.o se suelen informar como ocasionales, escasos, frecuentes o muy numerosos.

                                                        C.2.1 Hematíes: Tienen formas circulares, ocasionalmente bicóncavos, sin núcleo, refractan un poco la luz, tienen menor tamaño que los leucocitos y células epiteliales. A veces se confunden con levaduras (hongos), pero éstas tienen forma ovoide y suelen presentar brotes.

                                                        En orinas de baja densidad los hematíes se hinchan, incluso se lisan, dando lugar a lo que se llama “células fantasma” o “corpúsculos fantasma”. En orinas de alta densidad pueden aparecer formas dentadas. Es normal la aparición de 2 o 3 hematíes por campo. El aumento de hematíes en orina se llama hematuria y puede aparecer en distintas patologías como cálculos renales, glomerulonefritis, infecciones, TBC, etc.

                                                        C.2.2 Leucocitos: son más grandes que los hematíes pero más pequeños que las células epiteliales. Contienen uno o más núcleos. Los leucocitos polimorfonucleares tienen citoplasma punteado y bordes irregulares. Su aumento en orina se llama Leucocituria o Piuria y los valores normales son:

                                                        • Hombres >3 leuc. /campo

                                                        • Mujeres y niños " 5 leuc. /campo

                                                        Las patologías en las que hay piuria son, por ejemplo, inflamaciones por infecciones urinarias (cistitis, uretritis...), tumores o en litiasis.

                                                        C.2.3 Células Epiteliales: son varias veces más grandes que los glóbulos rojos o blancos. Tienen distintas formas según su origen, pero su identificación no es fácil porque presentan muchas alteraciones morfológicas. Se distinguen 3 tipos:

                                                        • Células epiteliales escamosas o pavimentosas: proceden de la porción distal del tracto urinario, es decir, de la uretra y del tracto genital en las mujeres. Son las más grandes, de forma irregular, planas, con un gran citoplasma y un núcleo simple, pequeño y centrado. En general son muy poco significativas excepto que sean muy abundantes.

                                                        • Células epiteliales de transición: son de 2 a 4 veces más grandes que los leucocitos. Tienen forma ovalada o piriforme (forma de pera). Tienen normalmente un núcleo grande (pueden tener dos). Revisten el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la uretra. Si aparecen en grandes cantidades hay que hacer un estudio citológico más completo para descartar un calcinoma.

                                                        • Células tubulares: son un tercio mayores que los leucocitos. Tienen un núcleo grande y redondeado. Son de forma rectangular o cúbica. No se detectan apenas en un sedimento normal. Su aumento indica daño tubular por distintas causas como, por ejemplo, pielonefritis, necrosis tubular aguda, rechazo del riñón trasplantado, intoxicación por salicilatos,...

                                                        C.2.4 Espermatozoides: aparecen tanto en hombres como en mujeres y carece de significado patológico.

                                                        C.3. MICROORGANISMOS

                                                        C.3.1 Bacterias: la orina es un líquido estéril, pero se puede contaminar con facilidad. Así, una orina alcalina con muchas bacterias y pocos glóbulos blancos es característica de muestras contaminadas. Si aparece bacteriuria hay que hacer un estudio microbiológico.

                                                        C.3.2 Levaduras: tienen una forma ovoidea con células en estado de gemación. Tiene pared con doble refracción y se parecen bastante a los hematíes. El hongo más frecuente en la orina es la “Cándida albicans”. La presencia de hongos indica contaminación y pocas veces infección (Ej. Vaginitis por Cándida albicans)

                                                        C.3.3 Parásitos: casi siempre indican contaminación genital o fecal. La más frecuente es la “Tricomonas vaginalis”, sobre todo en sedimentos de mujeres. El parásito es periforme, un poco mayor que los leucocitos y tiene una gran movilidad por la presencia de flagelos. Solo se deben informar si tienen movilidad, que es la característica diagnóstica.

                                                        Otros parásitos son los oxiuros, huevos de parásitos, etc

                                                        C.4. CILINDROS

                                                        Son conglomerados alargados de material proteico constituidos por la proteína de “Tamm Horsfall”. Se forman en los túbulos renales (TCD, TCP, TC). Pueden ser de distintos tamaños dependiendo se su origen, siendo más estrechos los que proceden del túbulo contorneado distal y proximal y más anchos los que proceden del túbulo colector. El sedimento urinario normal no tiene cilindros o escasos cilindros hialinos. Un número alto de cilindros en el sedimento indica enfermedad renal. Los cilindros, frecuentemente, se acompañan de proteinúria. Para la formación de los cilindros se requiere un pH de orina bajo, alta densidad o concentraciones de solutos altas y estancamiento de la orina que se produce casi siempre por una disminución de la filtración glomerular.

                                                        C.4.1 Cilindros Hialinos: no tienen significación clínica excepto que se vean en gran cantidad. Son poco refringentes, por lo tanto, se ven mejor con poca luz. Son pálidos, transparentes y con matriz clara. Tienen extremos redondeados. Aumentan en la deshidratación y en el ejercicio físico.

                                                        C.4.2 Cilindros Granulosos: predomina la estructura granular sobre la hialina. Se puede observar entre ellos glóbulos rojos, blancos o grasa. Pueden ser más anchos en un extremo que en otro. Su presencia indica nefropatía. Hay dos tipos:

                                                        • Granulosos gruesos

                                                        • Granulosos finos: se pueden confundir con los hialinos pero los granulosos son más refringentes.

                                                        C.4.3 Cilindros de Células Epiteliales: siempre indican patología. La matriz del cilindro engloba una serie de células epiteliales que se han desprendido de la luz tubular. Aparecen en lesiones tubulares producidas por tóxicos o por virus (Ej. Virus de la Hepatitis).

                                                        C.4.4 Cilindros Hemáticos o Eritrocitarios: aparecen en sedimentos con hematuria (hematuria renal). Son diagnósticos de enfermedad glomerular. Pueden ser incoloros o de color castaño. Si los hematíes se su interior están intactos se habla de “Cilindros Eritrocitarios”, si los hematíes se su interior se han degradado se transforma en un cilindro granuloso de color rojizo y se llaman “Cilindros Hemoglobínicos o Hemáticos”.

                                                        C.4.5 Cilindros Leucocitarios: aparecen en infección renal y otros procesos inflamatorios no infecciosos.

                                                        C.4.6 Cilindros Céreos: son altamente refringentes, duros, de aspecto rígido y brillantes. Los extremos pueden ser romos (redondeados) o cortados. Son grandes y sin gránulos. Son signo de lesión renal.

                                                        C.4.7 Cilindros Grasos: son cilindros granulosos o celulares en los que aparecen inclusiones de grasa. Son amarillos, de alta refringencia. Son signo de enfermedad renal.

                                                        C.5. CRISTALES

                                                        La presencia de cristales en orina se llama “cristaluria”.

                                                        Son habituales en la orina pero solo ocasionalmente tiene significado clínico. Se forman por precipitación de sales cuando la orina se mantiene en la vejiga o en el recipiente de recogida.

                                                        El pH de la orina es el factor más determinante en la formación de los cristales, así:

                                                        • A un pH ácido se forman URATOS y cristales de ÁCIDO ÚRICO

                                                        • A un pH alcalino se forman los FOSFATOS TRIPLES, AMORFOS y CARBONATO CÁLCICO.

                                                        • A un pH variable se forman los OXALATOS CÁLCICOS, CISTINA, COLESTEROL, TIOSINA, LEUCINA, etc.

                                                        C.5.1 Cristales poco significativos

                                                        A. Cristales de Fosfato Triple (o de Fosfato Amónico Magnésico): aparecen en orinas neutras y alcalinas. Son incoloros, tienen de 3 a 6 caras con forma de ataud o sobre de carta. Pueden aparecer en orinas normales o en orinas de pacientes con infecciones del aparato urinario (Ej. Cistitis).

                                                        B. Cristales de Fosfato Cálcico: suelen aparecer en orinas alcalinas o neutras. Tienen forma de prismas largos y afilados. En ocasiones se unen unos con otros formando rosetas o estrellas. Suelen aparecer en orinas normales. Pueden dar lugar a cálculos.

                                                        C. Cristales de Oxalato Cálcico: aparecen en orinas ácidas y neutras. Son incoloros. Tienen forma de sobre cuadrado y al enfocarlos se observa una equis sobresaliendo del cristal. Aparecen en dietas ricas en oxalatos (Ej. Tomates, naranjas,...). No indican patología pero de forma patológica puede aparecer en hepatopatías y en litiasis renal.

                                                        D. Cristales de Carbonato Cálcico: aparecen en orinas alcalinas o neutras. Son poco frecuentes. Se ven como un material amorfo o granular con forma de pequeños lazos o esferas incoloras. No tienen interés clínico.

                                                        E. Cristales de Ácido Úrico: aparecen en orinas ácidas. Tienen un color amarillo-naranja, con forma de diamante o roseta. A veces aparecen con 6 caras, como las de cistina. Su presencia no indica patología necesariamente. Frecuentemente aparecen en un 16% de enfermos de gota.

                                                        F. Uratos Amorfos: aparecen en orinas ácidas. Se ven como un precipitado amorfo de color naranja o amarillento y carecen se significación clínica.

                                                        G. Uratos de Sodio: aparecen como agujas solas o en racimos, sin ningún significado clínico.

                                                        C.5.2 Cristales significativos

                                                        A. Cristales de Leucina y Tirosina: son productos finales del metabolismo proteico. Suelen aparecer juntos y aparecen en orinas ácidas en enfermedad hepática grave.

                                                        Los cristales de Tirosina aparecen como un manojo de agujas muy finas. Los cristales de Leucina son gránulos esféricos con estrías radiales y concéntricas de aspecto graso y muy refringente.

                                                        B. Cristales de Cistina: son los únicos que tienen significación clínica por sí mismos ya que aparecen cuando se produce la eliminación urinaria en exceso de dicho aminoácido (Cistinuria). La cistinuria es un error metabólico congénito poco frecuente. Tienen formas hexagonales regulares, transparentes. Cuando aparecen, es imprescindible confirmar la presencia de cistina en orina.

                                                        C. Cristales de Colesterol: son placas planas, transparentes, con formas irregulares. Aparecen en nefritis e infecciones graves del tracto urinario y también en quiluria, que es la presencia de linfa en orina por obstrucción a nivel torácico y abdominal del drenaje linfático.

                                                        D. Formas Cristalinas: solo son significativas cuando hay sospechas de toxicidad.

                                                        UT. 11 DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL METABOLISMO CLÁSICO DE LOS LÍPIDOS

                                                        1. FISIOPATOLOGÍA DE LOS LÍPIDOS

                                                      • DESCRIPCIÓN: son moléculas insolubles en agua y solubles en los disolventes orgánicos como el éter, cloroformo, etc.

                                                      • FUNCIONES

                                                        • Función energética: tienen mayor valor calórico que el resto de los principios inmediatos.

                                                        • Función de Almacenamiento: almacenan energía.

                                                        • Función Estructural: forman parte de las membranas celulares y de las lipoproteínas.

                                                        • Son Agentes Emulsificantes

                                                        • Son compuestos funcionales (Ej. Hormonas, vitaminas, prostaglandinas,...)

                                                        • CLASIFICACIÓN

                                                        • Triglicéridos:

                                                          • Valores normales en sangre: < 160 mg/ dL

                                                          • Son compuestos formados por esterificación del glicerol con 3 ácidos grasos.

                                                          • Pueden ser exógenos (provienen de la dieta) o endógenos (sintetizados en el hígado a partir de ácidos grasos o a partir de los hidratos de carbono). La mayor parte de los lípidos entran en la dieta en forma de TG que, en el tubo digestivo, son transformados por la “Lipasa Pancreática” a glicerol y ácidos grados.

                                                          • Su principal función es almacenar energía, por eso son movilizados rápidamente en situaciones de ayuno, de ejercicio, de frío, etc.

                                                          • Colesterol:

                                                            • Valores normales de colesterol total: < 200 mg /dL

                                                            • Pueden ser exógenos o endógenos, en este caso es sintetizado por el hígado.

                                                            • Principales funciones: componente estructural fundamental de las membranas celulares; es precursor de las hormonas sexuales y de las hormonas de la corteza suprarrenal; y participa en la síntesis de los ácidos biliares.

                                                            • Circula por la sangre unido a lipoproteínas

                                                          • Ácidos Grasos Libres:

                                                            • Valores normales en sangre: 10 - 20 mg /dL

                                                            • Son los únicos lípidos que circulan por el plasma sin estar unidos a lipoproteínas

                                                            • Su principal función es servir de fuente inmediata de energía. En el ayuno prolongado, los ácidos grasos se transforman en las mitocondrias de las células, en un proceso llamado “ oxidación” en acetil CoA que a su vez se transforma en cuerpos cetónicos dando lugar a un aumento de estos (acidosis).

                                                            • LIPOPROTEINAS

                                                            • Son macromoléculas que están formadas en su estructura por lípidos apolares (TG y ésteres de colesterol) y, a su vez, están formados por lípidos polares en su superficie (colesterol, fosfolípidos) y proteínas. La parte proteica de las lipoproteínas se llaman “Apoproteínas” y se designan con las letras de la A a la F.

                                                              Tipos de Lipoproteínas

                                                              • Quilomicrones: son partículas grandes que no presentan movilidad electroforética. Aparecen en el plasma tras la ingestión de grasa y son sintetizados en el intestino a partir de TG, Fosfolípidos y de Colesterol. La vida media es inferior a 30 minutos. Su función es transportar los TG exógenos a los tejidos donde son hidrolizados por las lipoproteinlipasas a ácidos grasos y glicerol. Los ácidos grasos son utilizados o almacenados en forma de TG.

                                                              • VLDL (Very Low Density Lipoprotein): Son las proteínas de muy baja densidad. Se sintetizan en el hígado y en el intestino a partir de los lípidos endógenos y exógenos. Migran en la zona pre- de la electroforesis. Su función principal es la de transportar los TG endógenos. Los TG son degradados por la lipoproteinlipasa y se transforman en unos residuos ricos en colesterol que pueden ser retirados de la circulación o son transformados en otra lipoproteína que es la LDL.

                                                              • LDL (Low Density Lipoprotein): son proteínas de alta densidad. Se originan de la degradación de las VLDL en el torrente circulatorio. Su función es transportar el 80% del colesterol circulante hacia las células para la síntesis de las membranas celulares y de las hormonas. Tienen migración electroforética .

                                                              • HDL (High Density Lipoprotein): son proteínas de alta densidad. Captan el colesterol libre de las células de los tejidos periféricos por acción de una enzima, la “LCAT Lecitín Colesterol Acil Transferasa” lo transforma en ésteres de colesterol. Este colesterol es una molécula hidrofóbica que se sitúa en el interior de la lipoproteína y así es transportado al hígado donde es degradado transformándose en sales biliares y el eliminado.

                                                              • Lipoproteína A: tiene la apoproteína B-100, está en muy baja concentración en el plasma, se sintetiza en el hígado, está regulada por genética y tiene interés debido al carácter aterogénico que tiene.

                                                              • METABOLISMO DE LOS LÍPIDOS

                                                              • Los quilomicrones están en el torrente sanguíneo. La grasa exógena proveniente de la dieta es transportada por el torrente circulatorio en forma de quilomicrones desde el intestino donde ha sido absorbida.

                                                                Los TG endógenos, sintetizados en el hígado son transportados en forma de VLDL. Nada más entrar en la circulación son transformados por un enzima que está presente en la luz de los capilares, que es la “Lipoprotein Lipasa, LPL” que es activada por la APO C.II que se encuentra habitualmente en las partículas ricas en TG. La LPL va rompiendo los TG en ácidos grasos y glicerol. Por acción de la LPL, las VLDL se transforman en una partícula de densidad intermedia que es la LDL.

                                                                El quilomicrón, por acción de la LPL se transforma en “quilomicrón vaciado o remanente”, que se une a la superficie de los hepatocitos, se introduce en su interior y se degrada.

                                                                Las HDL que provienen del hígado captan el colesterol libre de los tejidos y, por acción de la “Lecitin Colesterol Acil Transferasa, LCAT” esterifican el colesterol. Parte de los ésteres de colesterol son incluidos en las HDL y son transportados al hígado donde son eliminados. Otra parte de los ésteres de colesterol son transportados a las IDL que pasan a convertirse en LDL. Se degradan en el hígado del 30-50% de las LDL circulantes, el resto son ligadas o unidas por un receptor celular específico que se encuentra en casi todos los tejidos extrahepáticos y que reconocen a la APO B. El complejo Receptor-Proteína entra en la célula y es degradado por los lisosomas.

                                                              • PATOLOGÍA DE LOS LÍPIDOS: DISLIPOPROTEINEMIAS

                                                              • Concepto: Las dislipoproteinemias son alteraciones de las fracciones lipídicas circulantes. La importancia clínica de las mismas está relacionada con una patología que es la “Arteroesclerosis” (formación de placas de ateroma en las arterias).

                                                                Tipos:

                                                                • Primarias: en este caso se deben a mutaciones en los genes que codifican la síntesis de lipoproteínas.

                                                                • Secundarias: acompañan a tras enfermedades como por ejemplo la diabetes mellitus, síndrome nefrótico, alcoholismo, mala dieta, etc. Estos se corrigen mejor al tratar la enfermedad primaria.

                                                                2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS

                                                                2.1 ANÁLISIS DE COLESTEROL TOTAL

                                                                El análisis de colesterol se complica por la existencia de dos formas moleculares que son el Colesterol Libre (1/3 del total) y el Colesterol Esterificado.

                                                                El método más utilizado es el enzimático, en el que se hidrolizan inicialmente los ésteres de colesterol y se mide el colesterol libre total. Es un análisis muy específico.

                                                                El colesterol se va a determinar mediante un método enzimático colorimétrico por espectrofotometría con autoanalizador.

                                                                2.2 ANÁLISIS DE TRIGLICÉRIDOS

                                                                Se analizan por métodos colorimétricos tanto químicos como enzimáticos mediante un autoanalizador. Todos los métodos empleados implican 2 procesos:

                                                              • Hidrólisis de los triglicéridos para formar glicerol y ácidos grasos.

                                                              • Medida del glicerol liberado.

                                                              • ANÁLISIS DE HDL COLESTEROL

                                                              • El método que más se usa consiste en eliminar las lipoproteínas que contienen APO B y que son: los quilomicornes, VLDL, LDL y Lipo A mediante precipitación y medir posteriormente el colesterol en el sobrenadante.

                                                                Se utiliza como precipitante el Fosfotungstato / Mg++ y se hace una medida enzimática del HDL colesterol.

                                                              • CÁLCULO DE LDL COLESTEROL

                                                              • Sus niveles se miden por ultracentrifugación pero también se puede calcular con gran aproximación mediante la fórmula de “Friedewald”, que es la siguiente:

                                                                LDL colesterol = Colesterol Total - (TG / 5 + HDL colesterol)

                                                                El error que se comete en esta fórmula es inferior al 5-10%, excepto cuando el contenido de TG es superior a 400 mg /dL, en cuyo caso no puede aplicarse la fórmula.

                                                              • ANÁLISIS DE APO Y LIPOPROTEÍNAS

                                                                • Ultracentrifugación: al someter un suero a ultracentrifugación, las distintas fracciones lipoproteicas se sitúan a distintas alturas según las densidades.

                                                                • Métodos electroforéticos: separan las lipoproteínas según su velocidad de migración en el campo eléctrico. Los Quilomicrones, si están presentes, permanecen en el origen. Las demás lipoproteínas se mueven hacia el polo positivo ya que a un pH de 8,6 tienen carga neta negativa:

                                                                  • Las HDL se sitúan en la zona de las -globulinas

                                                                  • Las LDL en la zona de las -globulinas

                                                                  • Las VLDL se mueven con las globulinas 2 localizándose en la zona pre-

                                                                • Métodos inmunológicos: se puede utilizar el RIA, el EIA, Inmunodifusión radial, la Inmunonefelometría, etc.

                                                              • DETERMINACIÓN DE EXISTENCIA O NO DE QM EN AYUNAS

                                                                • Condiciones de la muestra:

                                                                  • El paciente debe estar en ayunas 12 horas antes de la extracción. Puede tomar agua y medicamentos pero hay algunos fármacos como los anticonceptivos orales y la heparina que pueden influir en las concentraciones de las lipoproteínas.

                                                                  • El consumo de alcohol debe restringirse o eliminarse 2 días antes

                                                                  • La muestra puede ser suero o plasma. Es importante que el anticoagulante elegido sea EDTA

                                                                  • La centrifugación de la sangre debe hacerse lo más pronto posible, siempre antes de 3 horas.

                                                                • Valoración de los resultados: El estudio de las Hiperlipidemias es importante por varios motivos:

                                                                • Existen casos hereditarios en los que es necesario el control desde la infancia, siendo sumamente importante el consejo genético.

                                                                • Su relación son las enfermedades vasculares (cardiopatía isquémica, accidentes cerebro-vasculares) está ampliamente demostrada. La peligrosidad aumenta cuando se asocian tabaquismo, hipertensión arterial, diabetes y los anticonceptivos orales.

                                                                • Actualmente se consideran valores de colesterol a tener en cuenta los siguientes:

                                                                        • Colesterol Total 200 -250 mg /dL ! se aconseja dieta y vida saludable

                                                                        • Colesterol Total 250 -300 mg /dL ! se requiere confirmación y además otros datos analíticos como la HDL colesterol, apoproteínas, etc, y se le da tratamiento farmacológico si las cifras no bajan con dieta.

                                                                        • Colesterol Total > 300 mg /dL confirmado ! hay que determinar si el paciente presenta una hipercolesteronemia endógena o primaria.

                                                                  UT 12. DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL METABOLISMO BÁSICO DE LAS PROTEÍNAS

                                                                  FISIOLOGÍA DE LAS PROTEÍNAS

                                                                • COMPOSICIÓN: están constituidas por la unión de aminoácidos. Los aa poseen un grupo amino -NH2 y un grupo carboxilo -COOH.

                                                                • Los aa integrantes de las proteínas son 20, que se diferencian entre sí por el grupo -R. Son anfóteros, es decir, que se pueden comportar como ácidos o como bases dependiendo del medio en el que estén. En disolución acuosa existe equilibrio entre el ión dipolar y la forma aniónica y catiónica del aa:

                                                                  La posición de equilibrio depende del pH de la disolución, llamándose punto isoeléctrico al pH en el que tiene una carga neta 0, es decir, no es ni ácido ni base sino que es neutro. El punto isoeléctrico es característico de cada aa.

                                                                  En general, en soluciones ácidas, los aa están presentes como cationes y en soluciones básicas están en forma de aniones.

                                                                  Las proteínas están formadas por la unión del grupo carboxilo de un aa al grupo amino de otro aa formando un enlace peptídico. La unión de aa da lugar a la formación de péptidos que reciben en nombre de polipéptidos cuando al menos se unen 100 aa. Se habla de proteínas cuando se unen más de 100 aa entre sí.

                                                                • ESTRUCTURA

                                                                  • Estructura primaria: es la secuencia de zz

                                                                  • Estructura secundaria: plegamiento de zz en el espacio sobre sí mismos dando lugar a una estructura tridimensional. Hay 3 tipos: -hélice, lámina plegada  y triple hélice.

                                                                  • Estructura terciaria: las anteriores estructuras se pliegan a su vez sobre sí mismas.

                                                                  • Estructura cuaternaria es la unión de distintas cadenas polipeptídicas que forman parte de una proteína (Ej. Hemoglobina)

                                                                • CLASIFICACIÓN

                                                                  • Según su forma:

                                                                  • Fibrilares o Fibrosas: tienen las cadenas polipeptídicas dispuestas paralelamente entre sí (Ej. Colágeno, -queratinas,...)

                                                                  • Globulares: formadas por una o más -hélices enrolladas formando una esfera (Ej. La mayoría de las enzimas, hormonas y anticuerpos)

                                                                • Según su composición:

                                                                • Simples: compuestas solo por aminoácidos (Ej. Albúmina)

                                                                • Conjugados: tienen en su composición además de zz un componente no proteico que se llama “grupo prostético”. Estas proteínas se subdividen de acuerdo con la naturaleza del grupo prostético en Lipoproteínas; Glucoproteínas; Nucleoproteínas y Fosfoproteínas.

                                                              • Según su función biológica:

                                                              • Enzimas: son proteínas que actúan como catalizadores biológicos (Ej. Coagulasa, transaminasa...)

                                                              • Hormonas: son proteínas que actúan como mensajeros (Ej. FSH,...)

                                                              • Estructurales: mantienen unidas las estructuras del organismo (Ej. Colágeno, queratina,...)

                                                              • Transportadoras: transportan moléculas o iones en el interior del organismo (Ej. Hemoglobina)

                                                              • Protectoras: encargadas de la defensa del organismo (Ej. Gammaglobulinas)

                                                              • Contráctiles: intervienen en la contracción y relajación muscular (Ej. Actina, miosina,...)

                                                              • Tóxicas (Ej. Venenos de serpiente)

                                                              • DIGESTIÓN, ABSORCIÓN Y METABOLISMO

                                                              • Estómago PROTEÍNAS _____! POLIPÉPTIDOS

                                                                pepsina

                                                                Duodeno PROTEÍNAS ____! POLIPÉPTIDOS ____! aa

                                                                Tripsina Pancreática Aminopeptinas

                                                                Se da en el Duodeno, en forma de aminoácidos.

                                                                Los aminoácidos son utilizados para sintetizar proteínas si son necesarias

                                                                Si las proteínas no son necesarias:

                                                              • PROTEÍNAS SÉRICAS

                                                              • La Concentración de proteínas séricas es de aproximadamente 7 g/ 100 mL

                                                                Se Clasifican mediante técnicas como la electroforesis en grupos o fracciones, fundamentalmente 5 fracciones:

                                                                • Albúmina

                                                                •  - globulinas

                                                                •  - globulinas

                                                                •  - globulinas

                                                                • Fibrinógeno

                                                                Sus Funciones son: nutrición celular, soporte, transporte, coagulación sanguínea, intervienen en el sistema tampón, etc.

                                                                Alteraciones en la Concentración:

                                                                • Elevación de las proteínas séricas: puede ser una elevación relativa cuando hay una disminución del agua corporal, o puede ser una elevación absoluta en enfermedades crónicas como la cirrosis hepática.

                                                                • Disminución de las proteínas plasmáticas: puede ser una disminución relativa cuando hay un exceso de agua, o pueden ser disminuciones absolutas, que se producen en proteinurias importantes, enteropatías, pérdidas de proteínas por la piel en quemaduras graves, etc. Además, hay una disminución de proteínas plasmáticas por falta de síntesis de proteínas y esto ocurre en un déficit grave dietético y en enfermedades hepáticas graves. Cuando los niveles de proteínas plasmáticas son inferiores a 4 g/ 100 mL aparecen los edemas.

                                                                El Método de referencia para la determinación de proteínas totales es el método de “Biuret” (método espectrofotométrico muy específico que permite la automatización)

                                                              • ALBÚMINA

                                                              • Constituye más de la mitad del total de las proteínas plasmáticas, por eso los cambios en la concentración de Albúmina son muy significativos. Se determina por espectrofotometría utilizando gran variedad de colorantes.

                                                                Los valores normales de Albúmina son aproximadamente 3,5 - 5,2 g /dL ó 100mL

                                                              • PROTEÍNAS URINARIAS TOTALES: los métodos de determinación son:

                                                                • Procedimientos turbidimétricos: son los más utilizados

                                                                • Métodos químicos (Ej. Biuret): es muy poco utilizado porque es poco sensible. Actualmente se usa una técnica modificada del Biuret que concentra previamente las proteínas por precipitación y posterior centrifugación.

                                                                • Métodos de fijación de colorantes

                                                                La concentración de proteínas urinarias normal es de aprox. 100 - 200 mL /dL

                                                              • PROTEÍNAS TOTALES EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO

                                                              • Los valores normales son de entre 15 - 45 mg /dL (muy baja)

                                                                La mayor parte de las proteínas son de bajo peso molecular, principalmente la Albúmina que constituye del 55 al 75% de todas las proteínas del LCR.

                                                                La determinación de proteínas en LCR se utiliza sobre todo para conocer el estado de la barrera hematoencefálica, ya que estados patológicos suelen aumentar su permeabilidad.

                                                                Los métodos para su determinación son: métodos turbidimétricos (+ usados) y demás métodos utilizados en el análisis normal de la orina.

                                                              • FRACCIONES PROTEICAS

                                                                  • Albúmina: constituye el 55% de las proteínas plasmáticas. Su principal función es la de mantener la presión osmótica del plasma. Además se encarga de la fijación y el transporte de sustancias (Ej. Bilirrubina, ácidos grasos, etc).

                                                                  •  - globulinas: constituyen aproximadamente el 14% de las proteínas plasmáticas. Tienden a aumentar cuando hay un daño en los tejidos. 2 tipos:

                                                                1 - globulinas: constituyen entre el 1-4%. Están constituidas por 1 - antitripsina, transcobalamina y 1 - lipoproteínas.

                                                                2 - globulinas: constituyen entre el 6-10%. Son la haptoglobina (fijadora de la hemoglobina), la celuloplasmina (trasportadora de Cu), la 2 - macroglobulina (inhibidora de proteasas) y las 2 - lipoproteínas.

                                                                  •  - globulinas: constituyen aproximadamente el 13% de las proteínas totales. Las alteraciones son poco frecuentes. Forman parte de ellas la Transferrina, la Hemopexina, el Complemento y las  - lipoproteínas.

                                                                  •  - globulinas: constituyen el 11%. Son inmunoglobulinas, es decir, anticuerpos, por lo que aumentan en conjunto en procesos inflamatorios crónicos y en algunas enfermedades autoinmunes. En ocasiones aumenta solo un tipo de inmunoglobulina y esto recibe el nombre de “Paraproteinemia”. Pueden disminuir en el síndrome nefrótico, en enfermedades carenciales, en deficiencias inmunitarias, en inmunodeficiencas, en la edad avanzada,...

                                                                INTERPRETACIÓN DE UN PROTEINOGRAMA

                                                                El resultado del proteinograma no es suficiente para obtener un diagnóstico definitivo. Excepto la Albúmina, las demás fracciones proteicas corresponden a grupos de proteínas, pudiendo haber variación porcentual de sus componentes, por tanto, para corroborar los resultados del proteinograma hay que hacer análisis inmunológicos más específicos como la inmunoelectroforesis y la inmunodifusión radial.

                                                                Los principales patrones electroforéticos patológicos son:

                                                                Patrón Normal

                                                                Cirrosis Hepática: hay un notable aumento de las  - globulinas con solapamiento  -. Además disminuye la Albúmina y la 2 globulina.

                                                                Síndrome Nefrótico: se produce una pérdida selectiva de proteínas. Hay una disminución de la Albúmina y de las  - globulinas y un aumento de las  - globulinas, sobre todo de la 2.

                                                                Gammapatía Monoclonal (Ej. Mieloma múltiple): Es la presencia de una inmunoglobulina en cantidades elevadas debido a la proliferación de un clon celular que produce dicha inmunoglobulina. Presenta generalmente un pico grande en las  - globulinas.

                                                                UT. 13 ENZIMOLOGÍA DIAGNÓSTICA

                                                                1. FISIOPATOLOGÍA

                                                                DEFINICIÓN: la enzimología es la aplicación del conocimiento de las enzimas en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la enfermedad. Las enzimas son las responsables de la mayor parte de las reacciones químicas que tienen lugar en el organismo, encontrándose presentes en todos los tejidos.

                                                                ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS: son macromoléculas de origen proteico y peso molecular alto. tienen estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. la estructura espacial de los enzimas presenta unas regiones denominadas “sitios activos” que son los lugares donde se unen las moléculas de sustrato para que la enzima pueda realizar su función de catalizador. La actividad catalítica de la enzima depende de las estructuras primaria, secundaria..., por lo tanto es muy sensible a los cambios de temperatura, pH y concentración de sales del medio.

                                                                FUNCIÓN: Son Catalizadores Biológicos. Tienen como misión aumentar la velocidad de las reacciones químicas sin ser destruidas en el proceso. El material con el que reacciona la enzima se llama sustrato que, después de reaccionar con ella, se transforma en producto: E + S ___! ES ___! P + E

                                                                Las propiedades de las enzimas son:

                                                                • Son eficaces en pequeñas cantidades

                                                                • No se alteran en la reacción

                                                                • Son muy específicos

                                                                • Solo afectan a la velocidad con la que se alcanza el equilibrio de la reacción.

                                                                Los enzimas pueden actuar en solitario o a través de un complejo llamado “Holoenzima” que está formado por el enzima propiamente dicho (“Apoenzima”) y por un “cofactor”. Los cofactores pueden ser metales (Zinc, Cloro, Magnesio, etc) en cuyo caso se llaman “activadores enzimáticos”, o pueden ser moléculas orgánicas, llamándose entonces “coenzimas”.

                                                                ISOENZIMAS: son enzimas diferentes pero que catalizan la misma reacción química.

                                                                SIGNIFICADO DE LAS ENZIMAS PLASMÁTICAS: en el suero de individuos sanos se detectan actividades enzimáticas fisiológicas que tienen distintos orígenes:

                                                                • Enzimas plasmaespecíficas: que desarrollan su propia función en el plasma (Ej. Enzimas de la coagulación como la protrombina; enzimas que intervienen en el aclaramiento de las lipoproteínas como la LCAT,...)

                                                                • Actividades enzimáticas fisiológicas que mantienen niveles constantes y bajos. Tienen su origen en la constante renovación celular de los tejidos, en la actividad muscular y en el paso de enzimas de órganos secretores al torrente circulatorio. Cuando existe alguna lesión en la membrana celular, el contenido citoplasmático de la célula y con él los enzimas intracelulares, son vertidos al exterior. Cuando los enzimas llegan al torrente circulatorio existen sistemas encargados de captarlos, metabolizarlos y eliminarlos, por lo tanto, las enzimas permanecen en sangre un tiempo determinado.

                                                                TERMINOLOGÍA. CLASIFICACIÓN: se siguen las directrices de la comisión internacional de enzimas de bioquímica, según la cual todas las enzimas se denominan con las iniciales EC y cuatro números separados por puntos.

                                                                El primer número define la clase

                                                                El segundo número indica la subclase

                                                                El tercer número indica la sub-subclase

                                                                El cuarto número es su número de serie específico.

                                                                (Ej. EC 1.1.1.27 es la Lactato Deshidrogenasa. El primer 1 nos dice que pertenece a la clase de las oxidorreductasas; el siguiente 1 nos dice que es de la subclase oxidasa; el tercer 1 que la sub-subclase es la de las citocromooxidasas y, por último, el 27 nos dice que ocupa el lugar 27 de las citocromooxidasas)

                                                                Existen 6 clases posibles de enzimas:

                                                                CLASE I: Oxidorreductasas

                                                                CLASE II: Transferasas

                                                                CLASE III: Hidrolasas

                                                                CLASE IV: Liasas

                                                                CLASE V: Isomerasas

                                                                CLASE IV: Ligasas

                                                                ESTUDIO DE LAS ENZIMAS MÁS FRECUENTEMENTE DETERMINADAS EN EL LABORATORIO

                                                                Fosfatasas: pertenecen a la Clase III y subclase Esterasas. Se incluyen principalmente:

                                                              • Fosfatasa Alcalina (EC 3.1.3.1): es una enzima intracelular que se encuentra prácticamente en todos los tejidos (si hay lesión del tejido aumenta en el plasma). Es un marcador muy sensible de la enfermedad obstructiva hepática, pero no es específica porque también aumenta en enfermedades óseas y en situaciones fisiológicas como el embarazo y en el crecimiento. Tiene un pH óptimo de 9.

                                                              • Fosfatasa Ácida (EC 3.1.3.2): está en numerosos tejidos, pero el más rico en fosfatasa ácida es la próstata. Tiene varias isoenzimas pero sólo son útiles la “isoenzima 2 o prostática” que se determina por electroforesis, y las “isoenzimas 1 y 5” del bazo humano en la enfermedad de Gaucher. La isoenzima que más frecuentemente se estudia en el laboratorio es la 2, que se utiliza como marcador tumoral en los calcinomas metaestáticos de próstata. En condiciones no patológicas la tasa de fosfatasa ácida prostática es igual en hombres y en mujeres.

                                                              • Cretina Quinasa CK (EC 2.7.3.2): es una transferasa que cataliza la formación de ATP requerido por los sistemas contráctiles o de transporte. Es una enzima citoplasmática y mitocondrial ampliamente distribuida por los tejidos, pero en forma decreciente, sobre todo se localiza en músculo esquelético, músculo cardíaco, placenta, cerebro y otros tejidos.

                                                                Está formada por dos subunidades, la M y la B. Estas a su vez se combinan formando tres isoenzimas que son: CK-MM; CK-BB; CK-MB. Se pueden identificar por distintos métodos , fundamentalmente por electroforesis, cromatografía de intercambio iónico, inhibición, aglutinación y RIA.

                                                                La CK-MM predomina en el músculo esquelético, en el miocardio también predomina la CK-MM pero hay entre un 13-22% de CK-MB. En el cerebro hay un 100% de CK-BB.

                                                                Aminotransferasas o Transaminasas

                                                                AST (EC 2.6.1.1): Aspartato Aminotrasferasa (GOT glutámico oxalacética). Existen dos formas de AST, la mitocondrial que es la más abundante y la citoplasmática que se encuentra en menor cantidad y es soluble. La AST se localiza en el corazón, en el hígado, músculo esquelético y riñón. Su aumento en el suero indica daño tisular pero no de órgano específico.

                                                                ALT (EC 2.6.1.2): Alanina Aminotransferasa (GPT Transaminasa Glutámico Pirúvica). Se distribuye principalmente en el hígado y, en menor proporción en miocardio y otros tejidos. No es específica de enfermedad hepática.

                                                                GGT (EC 2.3.2.2): Gamma Glutamil Transferasa. Se distribuye por riñón, páncreas, hígado y próstata. Se utiliza en el estudio de enfermedades de origen alcohólico debido a que es una enzima microsómica y el alcohol es capaz de provocar un aumento de este enzima.

                                                                Lactato Deshidrogenasa LDH (EC 1.1.1.27): está ampliamente distribuida por todos los tejidos pero es más abundantes en corazón, músculo esquelético, riñón e hígado. Está constituida por cuatro subunidades, que pueden ser de dos tipos: subunidad H, específica del corazón y subunidad M del músculo. Estas subunidades se combinan de 5 formas diferentes dando lugar a 5 isoenzimas: LDH 1(4H), LDH 2 (3H/1M), LDH 3 (2H/2M), LDH 4 (3h/1H) y LDH 5 (4M).

                                                                La LDH existente en el miocardio contiene más isoenzimas LDH 1 y LDH 2, y en el hígado y músculo esquelético mayor proporción de LDH 4 y LDH 5.

                                                                 - Amilasa (EC 3.2.1.1): transforma los hidratos de carbono en componentes más sencillos. En condiciones normales se produce en las glándulas salivares y en el páncreas exocrino. Tiene un bajo peso molecular por lo que se filtra fácilmente por los glomérulos renales, aumentando en orina cuando está aumentada en suero. Tiene dos isoenzimas:

                                                                • Amilasa P: producida en el páncreas

                                                                • Amilasa S: producida en las glándulas salivares

                                                                Las isoenzimas se pueden separar por electroforesis y se usa sobre todo para el estudio de pancreatitis.

                                                                2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS

                                                                Las determinaciones enzimáticas se basan en demostrar in vitro la actividad catalítica que un enzima tiene in vivo, por lo tanto, la cantidad de enzima que tenemos en el sistema en estudio no es lo que se mide sino que se mide su funcionalidad. La actividad de un enzima se mide mediante determinación de la cantidad de sustrato transformado por unidad de tiempo en condiciones precisas de temperatura, pH, etc.

                                                                Las unidades en las que se miden las enzimas son Katal / L. 1Katal = 1 mol de sustrato catalizado por segundo. Estas unidades aún no se utilizan en todos los laboratorios siendo expresada la actividad enzimática en UI/ L. Las UI/ L se definen como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1mol de sustrato o coenzima por minuto en las condiciones de la prueba. 1UI = 16,7 nK (nanokatales).

                                                                3. ASPECTOS PRÁCTICOS

                                                                3.1 CONDICIONES DE LA MUESTRA

                                                                • No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces porque se puede desnaturalizar irreversiblemente la proteína constituyente de la enzima.

                                                                • No poner los sueros en tubos lavados con detergentes porque pueden alterar la estructura de las proteínas.

                                                                • Separar lo antes posible el coágulo del suero porque hay ciertas enzimas como la LDH y la Fosfatasa Ácida que se encuentran en los trombocitos y se liberan al medio si hay destrucción de las mismas.

                                                                • No trabajar con muestras hemolizadas porque en estas aumentan los componentes intraeritrocitarios como el LDH y AST.

                                                                • Evitar el éstasis venoso prolongado durante la extracción porque esta produce hipoxia y aumento de permeabilidad en las células sanguíneas.

                                                                • Evitar en envejecimiento de las muestras, sobre todo para la CK y para la Fosfatasa Ácida, que son muy lábiles.

                                                                3.2 CONDICIONES DE LOS REACTIVOS Y DEL INSTRUMENTAL

                                                                • Revisar siempre la fecha de caducidad de los reactivos, sobre todo la solución de sustrato.

                                                                • Cuando se recibe un pedido de reactivos hay que comprobar que se reciben en las condiciones adecuadas.

                                                                • Revisar las condiciones de almacenamiento de los reactivos, sobre todo la temperatura de las neveras.

                                                                • Cuando se reconstituye el reactivo, anotar la fecha y seguir las instrucciones del fabricante respecto al almacenamiento y fecha de caducidad.

                                                                • El aparato para medir la actividad enzimática, bien sea manual o automático debe cumplir 2 requisitos: debe ser un espectrofotómetro fiable que mida de forma correcta a la longitud de onda del ensayo. Además tiene que tener un buen sistema de regulación de temperatura, de tal forma que permita mantener la temperatura de trabajo en un margen de ± 0,1 ºC.

                                                                • Si trabajamos de forma manual debemos trabajar con pipetas adecuadas, bien calibradas y de pequeño volumen.

                                                                4. VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS

                                                                INFARTO DE MIOCARDIO

                                                                Es una muerte de parte de las células del músculo cardíaco que se produce secundaria a una isquemia (falta de riego sanguíneo). Se determinan:

                                                                • CK y su coenzima CK-MB: se elevan de forma precoz, concretamente a las 6 horas del infarto. El pico de CK se da a las 36 horas y se normaliza al tercer día.

                                                                • AST (GOT): se eleva más tarde y se mantiene elevada durante más tiempo. El pico máximo ocurre alrededor de las 48 horas y se normaliza hacia el 5º día.

                                                                • LDH: se eleva después que las anteriores, siendo su elevación más sostenida. Presenta el pico máximo alrededor del 3º día y se mantiene elevada más allá del 6º día.

                                                                En las primeras horas del infarto es muy interesante ver los niveles de CK totales y, sobre todo, el aumento del isoenzima CK-MB. Se recomienda realizar un control enzimático cada 6 horas. Una vez establecido el diagnóstico se realizan análisis cada 12-24 horas para poder observar los picos de la AST y de la LDH, y ver la normalización de las mismas que es un signo de buen pronóstico.

                                                                PANCREATITIS AGUDA

                                                                Es la autolisis del parénquima del páncreas exocrino. Esto determina la liberación a la circulación de 2 enzimas: la Lipasa Pancreática y la -Amilasa. Las dos se filtran por el glomérulo renal pero la Lipasa se reabsorbe en el túbulo y la -Amilasa sí aparece en orina. Para diagnosticar la pancreatitis aguda se determinan Lipasa y -Amilasa en sangre y -Amilasa en orina. Estas enzimas aparecen elevadas en el plasma a las 6-8 horas y alcanzan su máxima concentración entre las 20-30 horas, normalizándose entre el 2º-8º día. En la orina, la -Amilasa aparece elevada a las 5-8 horas después de hacerlo en el plasma y se normaliza varios días después de normalizarse en el plasma.

                                                                HÍGADO Y ENZIMAS SÉRICAS

                                                                • Hepatitis víricas agudas: están aumentadas la ALT (GPT), AST (GOT) y GGT. La que aumenta en mayor cantidad es la ALT. No existe apenas relación entre la gravedad del daño hepático y la elevación de las encimas. Las transaminasas se normalizan en un plazo de 3-5 semanas. Si la hepatitis cronifica no se normalizan. Si la hepatitis es fulminante las transaminasas descienden de forma brusca debido a la necrosis masiva del hígado que hace que no quede tejido hepático para liberar enzimas.

                                                                • Colestasis: es una obstrucción a nivel biliar que determina un estancamiento o éstasis de la bilis en el interior del hígado. Se elevan sobre todo la GGT y la Fosfatasa Alcalina.

                                                                • Etilismo crónico: se determina GGT en plasma.

                                                                • Cirrosis hepática: hay una elevación moderada de las transaminasas, siendo mayor el aumento de la AST que de la ALT. Si la cirrosis es de origen etílico estará también aumentada la GGT y si es de origen biliar estarán aumentadas las Fosfatasas Alcalinas.

                                                                NEOPLASIAS

                                                                • Cáncer de Próstata: aumenta la Fosfatasa Ácida total pero no es un marcador precoz de la enfermedad porque aumenta cuando ya hay metástasis

                                                                • Metástasis hepáticas: aumenta la Fosfatasa Alcalina y la GGT

                                                                • Metástasis óseas: si las metástasis son condensaciones aumenta la Fosfatasa Alcalina. Si son de tipo lítico aumentan las Fosfatasas Ácidas totales.

                                                                UT. 14 ESTUDIO DE LA FUNCIÓN ENDOCRINA

                                                                1. FISIOLOGÍA

                                                              • CONCEPTO: El sistema endocrino es un conjunto de órganos glandulares que no utilizan conductos para liberar sus secreciones sino que las vierten directamente a la sangre, que las conduce a otros lugares del organismo para ejercer su acción. Las células donde ejercen esta acción se llaman “células diana” y en ellas se sitúan los receptores donde actúa la hormona para transmitir su mensaje.

                                                              • ÓRGANOS Y TEJIDOS SECRETORES DE HORMONAS:

                                                              • Eje Hipotálamo-Hipofisario: el hipotálamo y la hipófisis constituyen un sistema porque están unidos por nervios y vasos sanguíneos. La HIPÓFISIS se divide en dos lóbulos:

                                                              • Lóbulo anterior o adenohipófisis: en el se producen las siguientes hormonas:

                                                              • MSH: Hormona Melanocito Estimulante. Promueve la pigmentación.

                                                                ACTH: Hormona Corticotropa. Tiene como función la de estimular la secreción de glucocorticoides (Cortisol) actuando sobre la corteza suprarrenal. El aumento de cortisol determina un Feed-Back negativo sobre el hipotálamo, disminuyendo la secreción de CRH y, por lo tanto, disminuyendo la secreción de ACTH.

                                                                TSH: Hormona Tirotropa. Aumenta la producción de hormonas tiroideas T3 y T4 actuando sobre la glándula tiroidea. El aumento de la T3 y T4 ejerce un Feed-Back negativo sobre el hipotálamo disminuyendo la producción de TRH y, por tanto, de TSH.

                                                                FSH: Hormona Folículo estimulante. En hombres actúa sobre los tubos seminíferos estimulando la producción de espermatozoides. En las mujeres madura el folículo, estimula la producción de estrógenos y estimula la proliferación del endometrio.

                                                                LH: Hormona Leutinizante. Junto con la anterior forma parte de las Hormonas gonadotropas. En los hombres actúa sobre las células de Leydig estimulando la producción de testosterona. En mujeres determinan la ovulación en la mitad del ciclo, estimula en la segunda mitad del ciclo el mantenimiento del cuerpo lúteo y además estimula la producción de estrógenos y progesterona.

                                                                GH: Hormona del crecimiento.

                                                                PROLACTINA: Hormona estimuladora de la secreción láctica.

                                                                Regulación de las hormonas adenohipofisarias: la secreción de estas hormonas es controlada por los factores liberadores e inhibidores producidos en el hipotálamo:

                                                                SNC

                                                                CRH TRH GnRH GRH GIF PIF MIF

                                                                ACTH TSH FSH y LH GH PROLACTINA MSH

                                                              • Lóbulo posterior o neurohipófisis: las hormonas son secretadas en el Hipotálamo y se transportan posteriormente por las fibras nerviosas a la neurohipófisis. Son dos las hormonas neurohipofisarias:

                                                              • ADH o VASOPRESINA (Hormona Antidiurética): promueve la reabsorción de agua en los túbulos distal y colector del riñón.

                                                                OXITOCINA: su acción es la contracción del útero.

                                                                B. Tiroides: la glándula tiroidea está situada en la cara interior del cuello y está integrada por dos lóbulos laterales unidos por un istmo. Se comprende de folículos que es la unidad funcional del tiroides. Cada folículo está formado por una sola capa de células que rodea a una cavidad llena de una solución de proteína llamada “tiroglobulina, TG”.

                                                                El folículo capta el yodo inorgánico y los transforma en yodo molecular, uniéndose éste al aminoácido tirosina (Tyr) de la tiroglobulina, formándose así la “Diyodotironina, DIT”.

                                                                La unión de dos moléculas de DIT da lugar a la T4 o Tiroxina

                                                                La unión de una molécula de DIT con una molécula de MIT (monoyodotironina) da lugar a la T3 o Triyodotironina.

                                                                La glándula tiroides sintetiza sobre todo T4 y una pequeña cantidad de T3. Para que las hormonas salgan del tiroides deben ser transportadas por una proteína producida en el hígado llamada “TBG”. En la célula, la T4 se transforma en T3 que es la forma activa.

                                                                Funciones de las hormonas tiroideas:

                                                                • Estimulan el crecimiento y la diferenciación

                                                                • Aumenta el metabolismo basal

                                                                • Estimular el trofismo de la piel

                                                                • Estimular las funciones de los aparatos y sistemas del organismo

                                                                Regulación de la secreción de las hormonas tiroideas:

                                                                    • Si disminuye la T3 y T4 por disminución de su producción en el tiroides, la TRH y la TSH estarán altas (Hipotiroidismo primario)

                                                                    • Si disminuye la T3 y T4 por alteración hipofisaria, la TSH estará baja y la TRH alta (Hipotiroidismo secundario).

                                                                    • Si aumenta la T3 y T4 por patología tiroidea, la TRH y la TSH estarán inhibidas (Hipertiroidismo)

                                                                C. GH: Su secreción es pulsátil, es decir, que se libera en porciones a lo largo del día con un máximo aporte en la primera fase del sueño. Ejerce su acción fisiológica mediante unos factores de crecimiento llamados “Somatomedinas” siendo el más importante la Somatomedina C. Se producen en todos los tejidos, pero sobre todo en el hígado.

                                                                Regulación: el hipotálamo segrega el factor liberador de la GH (GR.) que actúa sobre el lóbulo anterior de la hipófisis para que se sintetice y libere GH. Las somatomedinas ejercen un Feed-Back negativo sobre la hipófisis y el hipotálamo

                                                                Acciones:

                                                                • Acción Directa: es una acción antiinsulina. Provoca un aumento de la Glucemia y un aumento de la Lipemia.

                                                                • Acción Indirecta: la ejerce a través de las somatomedinas y estimula el crecimiento esquelético, la síntesis de proteínas y la diferenciación celular.

                                                                Factores reguladores del crecimiento

                                                                  • Genéticos

                                                                  • Hormonales: GH, T3 y T4; hormonas sexuales; insulina; glucocorticoides

                                                                  • Nutricionales

                                                                  • Factores emocionales

                                                                D. Páncreas: los islotes de Langerhans tienen 3 tipos de células. Las  que producen el glucagón, las  que producen la insulina, y las  que producen la somatostatina.

                                                                E. Glándulas Suprarrenales

                                                                Son dos glándulas situadas en los polos superiores de ambos riñones. Se dividen en dos zonas, que son la Corteza y la Médula Suprarrenal:

                                                                CORTEZA: secreta hormonas esteroideas y se divide a su vez en tres zonas:

                                                                • Zona Glomerular: se producen los mineracorticoides de los cuales el más importante es la Aldosterona. Esta aumenta la volemia y la retención de Na. Favorece la eliminación de potasio.

                                                                • Zona Fasciculada: produce los glucocorticoides de los cuales el más importante es el Cortisol. La secreción de cortisol está regulada por la ACTH y ambas hormonas tienen unos niveles variables a lo largo del día, tienen un ritmo circadiano. Alcanza el nivel máximo por la mañana hacia las 8 horas y la de ACTH cuatro horas antes. El mínimo lo alcanzan a las 00 horas.

                                                                Funciones del Cortisol: regula los niveles de glucosa en período de ayuno mediante un proceso de neoglucogénesis a partir de las proteínas; interviene en la distribución de la grasa; disminuye los eosinófilos y linfocitos; tiene efecto antiinflamatorio, etc.

                                                                • Zona Reticular: produce andrógenos (tanto en hombres como en mujeres)

                                                                MÉDULA SUPRARRENAL: segrega las catecolaminas que son la Adrenalina (A) y la Noradrenalina (NA). Se sintetizan según la siguiente cadena:

                                                                TIROSINA __! DOPA __! DOPAMINA __! NA ! A

                                                                La degradación de catecolaminas da lugar al ácido vanilmandélico que se elimina por la orina.

                                                                La Noradrenalina interviene en la contracción de las arterias, mientras que la Adrenalina aumenta la frecuencia cardiaca, aumenta el volumen del latido y dilata los bronquios.

                                                                F. Hormonas Sexuales

                                                                Andrógenos: son esteroides que se pueden sintetizar en las glándulas suprarrenales, en los ovarios y, sobre todo, en los testículos. El principal andrógeno es la “Testosterona”, que no circula libre en la sangre sino unida a una proteína que es la SBG (“Sex Binding Globuline”). El hígado destruye estas hormonas, cuya principal función es regular los caracteres sexuales masculinos y la formación de espermatozoides.

                                                                Hormonas Sexuales Femeninas. Ciclo ovárico:

                                                                1ª Fase: el primer día del ciclo es el primer día de la menstruación. La FSH y la LH estimulan la maduración del folículo y éste empieza a producir ESTRÓGENOS.

                                                                Hacia el décimo día el nivel de estrógenos es alto y se produce la liberación de FSH y, sobre todo de LH que determinarán hacia el día 14 el “pico de ovulación”, que es un aumento de la concentración de LH que determina la máxima maduración del folículo que hace que se rompa y se libere el óvulo.

                                                                2ª Fase: Disminuye la FSH y la LH. Comienza a sintetizarse la PROGESTERONA en grandes cantidades en el cuerpo lúteo o cuerpo amarillo.

                                                                Si no hay embrazo, hacia el día 28 disminuyen los estrógenos y la progesterona, produciéndose la descamación del endometrio.

                                                                Si hay embarazo, el cuerpo lúteo se mantiene, manteniéndose altos los niveles de progesterona, inhibiéndose la síntesis de LH y de FSH.

                                                                G. Endicronología de la gestación

                                                                Gonadotropina coriónica o coriógena HCG: está producida por el “Sincitiotrofoblasto”, una membrana externa del embrión. Esta hormona nos permite hacer el diagnóstico del embarazo. Es necesaria para el mantenimiento del embarazo, sobre todo en el primer trimestre. Alcanza su máximo nivel hacia el tercer mes de gestación, descendiendo luego lentamente hasta el quinto mes a partir del cual se mantiene en forma de meseta hasta el final del embarazo.

                                                                Lactógeno placentario: se sintetiza en la placenta y tiene como función preparar la mama para su función después del parto.

                                                                2. PATOLOGÍA DEL SISTEMA ENDOCRINO

                                                              • HIPÓFISIS ANTERIOR

                                                                • Hiperfunción

                                                                  • Autóctona: se produce por una lesión a nivel de la glándula hipofisiaria. Puede ser:

                                                                    • Por un aumento de la FSH y LH: Hipergonadismo

                                                                    • Por un aumento de la ACTH: Síndrome de Cushing

                                                                    • Por un aumento de la TSH: Hipertoriodismo (rara)

                                                                    • Por un aumento de la GH: en los niños, antes del cierre epifisario (epífisis: cartílago del crecimiento) se produce el gigantismo hipofisiario en el que hay un aumento de la talla armónico (equilibrado). Además se produce hiperglucemia secundaria al efecto de la GH. En el adulto, se da una patología llamada acromegalia, que es un crecimiento excesivo de piel, huesos y vísceras.

                                                                    • Por un exceso de Prolactina: se produce galactorrea (salida de leche) y amenorrea (no menstruación).

                                                                      • Reguladora: se producen aumentos de las hormonas hipofisiarias, que son secundarios a la disminución de las hormonas de las glándulas hipofiso-dependientes (Ej. Disminución de Cortisol ! Aumento de ACTH)

                                                                        • Hipofunción

                                                                          • Autóctona: podemos tener:

                                                                            • Descenso de la GH: Enanismo hipofisiario. Es una disminución de la talla de forma armónica. Tiene tendencia a la hipoglucemia.

                                                                            • Descenso de la FSH y LH: Hipogonadismo que tiene su origen en la hipófisis

                                                                            • Descenso Panhipopituitarismo: disminución global de todas las hormonas hipofisiarias. También se llama Síndrome de Simmons-Sheeham.

                                                                          • Reguladora: se producen aumentos de la ACTH y del Cortisol.

                                                                          • B. HIPÓFISIS POSTERIOR

                                                                            • Diabetes insípida que se produce por una disminución de la ADH

                                                                            • Síndrome de Schwantz-Bartter que se produce por un aumento de la secreción de la ADH. Se suele producir por un tumor pulmonar que secreta un polipéptido semejante a la ADH. También se puede producir por tumores hipofisiarios secretores de ADH y su principal consecuencia clínica es la hiperhidratación.

                                                                            C. TIROIDES

                                                                            • Bociogénesis: bocio simple, que es un aumento del tamaño de la glándula tiroides y es secundario a la elevación de TSH por la disminución de T3 y T4.

                                                                            • Hipertiroidismo: es el aumento de las hormonas tiroideas, T3 y T4, que puede ser primario o secundario:

                                                                            • Primario: la TSH estará disminuida y la T3 y T4 aumentadas.

                                                                            • Secundario: la TSH estará aumentada y la T3 y T4 aumentadas.

                                                                            • Hipotiroidismo:

                                                                              • Primario: las hormonas tiroideas están disminuidas y la TSH aumentada (aumento de la glándula)

                                                                              • Secundario: la T3 y T4 están disminuidas. La TSH también está disminuida.

                                                                            • Cretinismo: faltan T3 y T4 durante la vida fetal

                                                                            D. GLÁNDULAS SUPRARRENALES

                                                                            • Hipofunción Corticosuprarrenal: hay una disminución de la función de la corteza suprarrenal. Puede ser:

                                                                              • Primaria: se produce una afectación de la corteza suprarrenal, por lo tanto, estaría disminuido es Cortisol y la Aldosterona, y aumentada la ACTH. También se producirá un aumente de la pigmentación de la piel (hiperpigmentación). Si la hipofunción es crónica se llama “Enfermedad de Adisson”.

                                                                              • Secundaria: el problema está en la hipófisis. Habrá una disminución de la ACTH, se mantendrán los niveles de Aldosterona y disminuirá el Cortisol. No hay hiperpigmentación, la pigmentación es normal. Si la aldosterona está normal es que no hay hormona para estimular la secreción en la hipófisis.

                                                                            • Hiperfunción Corticosuprarrenal: hay un aumento de la función de la corteza suprarrenal.

                                                                            • Síndrome de Cushing: hay un aumento de Cortisol. Puede ser primario o secundario:

                                                                              • Primario: la patología está en la glándula suprarrenal. Casi siempre se debe a tumores funcionales en la corteza suprarrenal. Disminuye la ACTH.

                                                                              • Secundario: puede ser debido a dos motivos:

                                                                            1. Alteraciones de la hipófisis. Aumento de ACTH.

                                                                            2. Tumores pulmonares que producen un polipéptido semejante a la ACTH.

                                                                            • Síndrome Adrenogenital: es el aumento de los andrógenos. Puede ser:

                                                                            1. De forma congénita. Cuando falta algún enzima necesario para la síntesis de corticoides esto hace que aumente la ACTH que lleva a una hiperplasia de la corteza suprarrenal y a un aumento secundario de los andrógenos

                                                                            2. De forma adquirida: se produce por un tumor funcionante de la zona reticulada de la corteza.

                                                                            • Hiperaldosteronismo: es un aumento de las aldosteronas. Puede ser:

                                                                            1. Primario: debido a un tumor en la zona glomerular.

                                                                            2. Secundario: debido a estímulos externos (Ej. Disminución de bolemias que estimula la secreción de aldosterona para segregar agua) .

                                                                            • Hiperfunción de la Médula Suprarrenal: se produce por un tumor de la médula suprarrenal llamado feocromocitoma que produce un aumento de las catecolaminas.

                                                                            E. PATOLOGÍA DE LAS GÓNADAS

                                                                            • Hipogonadismo: primario y secundario (igual que en casos anteriores)

                                                                            • Hipergonadismo: primario y secundario.

                                                                            3. MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE LAS HORMONAS

                                                                              • Radioinmunoanálisis (RIA)

                                                                              • Enzimoinmunoanálisis

                                                                              • Fluoroenzimoinmunoanálisis

                                                                              • Quimioluminiscencia

                                                                            ESTUDIO DE LA GH

                                                                            Se realizan fundamentalmente dos test farmacológicos de estimulación:

                                                                            1. Test de Clonidina: se administra clonidina, que es un antagonista 2-adrenérgico que estimula la secreción de GH a través de la secreción de GHRH. El procedimiento es el siguiente:

                                                                            • Toma de muestra basal y administración del fármaco

                                                                            • Extracciones a los 30-60-90-120 y 150 minutos de la administración del fármaco.

                                                                            • Cuantificación de la GH e interpretación:

                                                                            Se considera deficiencia total de GH si ninguno de los picos es superior a 5 ng/ mL

                                                                            Se considera deficiencia parcial si se obtienen valores entre 5-10 ng/ mL.

                                                                            El test de la Clonidina tiene como efectos secundarios la hipotensión y la somnolencia. Se debe monitorizar la frecuencia cardiaca y la presión arterial.

                                                                            2. Test de ejercicio. Propanolol: se administra propanolol, que es un -bloqueante que inhibe a la somastotatina y se le manda hacer ejercicio físico. Procedimiento:

                                                                            • Toma de muestra basal

                                                                            • Se le da el fármaco y se le tumba en decúbito supino 2 horas

                                                                            • A los 120 minutos se hace otra extracción y se le manda realizar ejercicio físico intenso durante 20-30 minutos. Debe estar cansado pero no extenuado.

                                                                            • Extracción tras el ejercicio (150 minutos). Administrar soluciones azucaradas al finalizar. Los resultados se interpretan igual que en el otro test.

                                                                            Está contraindicado en pacientes con asma. Los efectos secundarios de esta prueba son hipotensión, bradicardia e hipoglucemia.

                                                                            ESTUDIO DE LA NEUROHIPÓFISIS

                                                                            Se hacen determinaciones basales hidrosalinas, como son la osmolaridad en sangre y orina, iones en sangre y orina, creatinina en sangre y orina y equilibrio ácido-base.

                                                                            Se hacen determinaciones basales hormonales

                                                                            Test de estimulación de la ADH

                                                                            ESTUDIO DE LA FUNCIÓN TIROIDEA

                                                                            Determinaciones basales:

                                                                            • Determinación de hormonas libres T3, T4, TSH, etc

                                                                            • Determinación de proteínas fijadoras como la TBG

                                                                            • Determinación de Ac anti-tiroideos

                                                                            Test dinámicos o funcionales:

                                                                            TRH ! se administra por vía intravenosa una dosis adecuada de TRH sintético. Se hace una toma basal y extracciones a los 20-60 y 90 minutos de la toma y se cuantifica la TSH.

                                                                            Interpretación: se alcanza un valor máximo a los 20 minutos, debiendo producirse incrementos de 2 a 30 mUI /mL.

                                                                            ESTUDIO DE LA FUNCIÓN GLUCOCORTICOIDE Y MINERACORTICOIDE

                                                                            Ritmo de cortisol ACTH: sirve para estudiar la función glucocorticoide así como la mineracorticoide. No requiere estímulo. Se extraen muestras a las 8 de la mañana y a las 20h de la tarde del mismo día y se determina Cortisol y ACTH.

                                                                            Interpretación: se alcanza el máximo de cortisol a las 8 de la mañana y un mínimo por la noche.

                                                                            Test de frenación corta (NUGGENT): se les da dextrametasona y se hacen extracciones a las 8 de la mañana del día que se toma la dosis y otra extracción a las 8 de la mañana del día siguiente. Se analiza el Cortisol y la ACTH.

                                                                            Interpretación: el nivel de ACTH debe ser inferior a 10 pg/ mL en el día siguiente a la toma.

                                                                            Test de frenación larga/ débil y larga / fuerte

                                                                            UT. 15 EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO Y ÁCIDO-BASE

                                                                            1. EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO

                                                                          • INTRODUCIÓN

                                                                          • El agua es el componente más abundante del cuerpo humano. Comprende el 60-70% del peso corporal total, pero varía dependiendo del sexo, edad, grasa corporal, etc.

                                                                          • DISTRIBUCIÓN DEL AGUA

                                                                          • El agua total se distribuye en dos compartimentos:

                                                                            Compartimento Intracelular: es el compartimento más grande. Supone aproximadamente el 40% del peso corporal total. Tiene neutralidad eléctrica, es decir, tiene disueltas sustancias con carga negativa en igual cantidad que sustancias con carga positiva.

                                                                            Compartimiento Extracelular: constituye aproximadamente el 20% del peso corporal total. Está formado a su vez por 3 compartimentos, que son:

                                                                            • Plasma: es la fracción de la sangre libre de células. Supone el 5% del peso corporal total. Tiene un alto contenido en proteínas y forma lo que se llama el “espacio intravascular”.

                                                                            • Líquido Intersticial: está localizado entre la membrana de las células y las paredes de los vasos. Supone aproximadamente el 14-15% del peso corporal total y se encarga de transportar las sustancias entre las células y el plasma sanguíneo. Es pobre en proteínas.

                                                                            • Líquido Trascelular: constituye el 1% del peso corporal total, pero en situaciones patológicas puede aumentar mucho. Está formado por LCR, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido seminal, líquido intraocular y secreciones digestivas.

                                                                            • INTERCAMBIO DE AGUA EXTRACELULAR

                                                                            • El intercambio de líquidos entre el plasma y líquido intersticial se produce a través de las paredes de los vasos capilares y tiene lugar de la siguiente forma:

                                                                              Presión Hidrostática Capilar: es la presión que determina la salida de líquido de los capilares. Es mayor en el extremo arteriolar que en el venoso.

                                                                              Permeabilidad Capilar: el endotelio capilar actúa como una membrana semipermeable.

                                                                              Presión Osmótica: es debida a las proteínas plasmáticas y favorece la retención de líquido dentro del capilar.

                                                                              Drenaje Linfático: es esencial cuando hay trastornos del equilibrio hídrico.

                                                                            • EQUILIBRIO DE AGUA E IONES EN LOS DISTINTOS COMPARTIMENTOS CORPORALES

                                                                            • Homeostasis: es el mantenimiento de la composición del medio interno (sangre).

                                                                              Electrolitos: son los iones libres en los líquidos corporales. Son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis porque influye en tres aspectos fundamentalmente: pH, estado de hidratación y osmolalidad.

                                                                              Características del equilibrio hidroelectrolítico: los iones y el agua del organismo están en constante intercambio con el exterior, pero se mantienen en equilibrio, lo que es fundamental para la vida. Existe igualdad entre el total de aniones y de cationes en los compartimentos corporales, de tal forma que, si aumenta un anión, aumentará también un catión, manteniéndose la neutralidad eléctrica. Los principales electrolitos disueltos en el organismo son: Na+, K+, Mg+, Ca++, Cl-, HCO3-, HPO4-, y se distribuyen de la siguiente forma:

                                                                              Intracelularmente: Mg+, HPO4-, K+

                                                                              Extracelularmente: Na+, Ca++, HCO3-, Cl-

                                                                              Osmolalidad: es el número de partículas de soluto por unidad de volumen de una disolución expresada en miliosmoles de soluto por litro de solución (mosm / L). La osmolalidad del suero sanguíneo es de 290 ± 10 mosm / L, pero puede variar con el grado de hidratación y la cantidad de partículas disueltas. Los electrolitos HCO3-, K+ y Na+ constituyen más del 92% de osmolalidad. El 8% restante la aportan otros electrolitos del líquido extracelular, proteínas séricas, glucosa y urea.

                                                                              La importancia de la osmolalidad en los líquidos corporales es que regula la distribución del agua en los distintos compartimentos. En general el agua difunde de una zona de menor osmolalidad a otra de mayor osmolalidad.

                                                                              La osmolalidad aumenta el punto de ebullición y disminuye el punto de congelación, en esto es en lo que se basa la medida de la misma. Para ello se utiliza un osmómetro que mide el descenso del punto de congelación de una solución.

                                                                              Interés clínico de la osmolalidad:

                                                                            • Osmolalidad Plasmática: los estados hiperosmolares se producen cuando la osmolalidad es superior a 325 mosm/ Kg de H2O. Cuando la cifra alcanza los 350 mosm/ L la situación es de extrema gravedad y el paciente suele estar en coma hiperosmolar.

                                                                            • Las patologías que cursan con hiperosmolaridad son:

                                                                                • Diabetes mellitus descompensada

                                                                                • Insuficiencia renal

                                                                                • Nutrición parenteral

                                                                                • Deshidratación hipertónica, etc.

                                                                                • Osmolalidad Urinaria: es una medida más exacta que la determinación de la densidad para controlar la concentración urinaria. Los valores normales de osmolalidad urinaria son 100-900 mosm/ L. Después de una restricción de líquidos de más de 12 horas, la osmolalidad urinaria debe ascender como mínimo a 800 mosm/ L. Sin embargo, en la insuficiencia renal no se superan los 400 mosm/ L (Hipoosmolalidad).

                                                                                • Las principales patologías que cursan con Hiperosmolalidad urinaria son:

                                                                                  • Todas aquellas que determinen una pérdida de agua

                                                                                  • Lesiones cerebrales (afectación de la LDH), etc.

                                                                                  Para evaluar la función renal y, por lo tanto, diferenciar las causas renales de la poliuria de las causas extrarrenales, se utiliza la siguiente fórmula:

                                                                                  OSMOLALIDAD URINARIA / OSMOLALIDAD PLASMÁTICA = 1 a 3

                                                                                • MANTENIMIENTO DEL EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO

                                                                                  • El agua representa el 60% del peso corporal total

                                                                                  • El suero tiene un 93% de agua

                                                                                  • Hay igualdad de aniones y cationes en los líquidos corporales:

                                                                                  Na+ 142 meq /L Cl- 103 meq /L

                                                                                  K+ 4 HCO3- 27

                                                                                  Ca2+ 5 HPO42- 2

                                                                                  Mg2+ 2 SO42- 1

                                                                                  Ác. Orgánicos 5

                                                                                  Proteínas 16

                                                                                  ____________ __________

                                                                                  154 meq /L 154 meq /L

                                                                                  • Balance de líquidos: al tubo digestivo llegan aproximadamente 9 L de agua cuya procedencia es la siguiente:

                                                                                  • Ingesta 1,5 L

                                                                                  • Saliva 1,5 L

                                                                                  • Jugo gástrico 3 L

                                                                                  • Bilis 0,5 L

                                                                                  • Jugo pancreático 1-2 L

                                                                                  • Jugo intestinal: Indeterminado

                                                                                  Estos líquidos se absorben en el intestino delgado y en el colon, eliminándose por las heces aproximadamente 100 cc.

                                                                                  • Necesidades de electrolitos en la dieta: los electrolitos deben ingerirse en pequeñas cantidades. El calcio y el potasio se eliminan continuamente por lo que deben consumirse regularmente. El exceso de consumo normalmente es compensado por una mayor eliminación urinaria.

                                                                                  • Absorción de los electrolitos: los electrolitos se absorben mediante un mecanismo de transporte activo, con gasto energético. También se absorben por difusión pasiva y facilitada.

                                                                                  • Regulación del equilibrio hidroelectrolítico: el principal regulador es el riñón. Existen sustancias excretadas o ingeridas que están en equilibrio de tal forma que se excreta la misma cantidad que se ingiere. Así, el riñón, el labora la orina en la cantidad que se necesita y con una concentración variable de tal forma que:

                                                                                    • Si el organismo necesita retener agua, entran en funcionamiento los mecanismos de reabsorción renal y se produce un aumento de la osmolalidad renal.

                                                                                    • Si hay un exceso de agua, aumenta el flujo urinario, aumenta la cantidad de agua en orina y disminuye la osmolalidad urinaria.

                                                                                  La absorción y la secreción de agua y electrolitos son procesos mediados por hormonas de la siguiente forma:

                                                                                  • Un aumento de la osmolalidad en suero estimula la secreción de ADH. Ésta actúa sobre los túbulos renales aumentando la reabsorción de agua y provocando un aumento de la concentración de la orina.

                                                                                  • Si disminuye la osmolalidad del suero, se inhibe la secreción de ADH, lo que da lugar a una disminución de la reabsorción de agua y la orina se diluye.

                                                                                  Además del riñón, el aparato respiratorio también interviene en la regulación del equilibrio hidroelectrolítico variando la velocidad de la respiración.

                                                                                • EVALUACIÓN DEL EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO EN EL ORGANISMO

                                                                                • El equilibrio hidroelectrolítico se evalúa estudiando la capacidad del riñón como regulador y esto se hace determinando el peso específico de la orina, la osmolalidad y los electrolitos en orina. De esta forma valoramos el estado de hidratación de una persona, la funcionalidad de la ADH y la gravedad de un estado de coma.

                                                                                • ESTUDIO DE LOS ELECTROLITOS ORGÁNICOS MÁS IMPORTANTES

                                                                                • SODIO: es el principal catión del líquido extracelular. Su concentración sérica normal es de 136-145 mmol /L, y en orina es de 30-280 mmol / día. Su metabolismo se regula de la siguiente forma:

                                                                                  Existen receptores en las aurículas y en las arterias centrales que reciben cambios de presión o de flujo sanguíneo de tal forma que, cuando disminuye el volumen sanguíneo porque lo hace la cantidad de sodio, se reduce el riego sanguíneo renal y se activa el sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona. Al disminuir el riego renal, disminuye la filtración glomerular y, por lo tanto, disminuye también el sodio filtrado. Esto determina un aumento de la reabsorción tubular de sodio por acción de la aldosterona.

                                                                                  Si se ingiere o retiene sodio en exceso, se produce una hipernatremia transitoria ya que la sed hace que aumente la ingesta de agua. El líquido ingerido estimularía la secreción de ADH de tal modo que el resultado final va a ser una aumento de volumen extracelular y no una hipernatremia.

                                                                                  Alteraciones en el metabolismo del sodio:

                                                                                  Hiponatremias: no se deben a una falta de sodio en la dieta sino a pérdidas de sodio que pueden ser extrarrenales (Ej. A través del tubo digestivo en caso de peritonitis, o a través de la piel por sudoración excesiva) o pueden ser renales (Ej. Insuficiencia renal; mal uso de diuréticos, etc). Si la pérdida de sodio es extrarrenal su concentración está por debajo de 10 mmol /L en orina. Si la pérdida tiene su origen a nivel del riñón, su concentración está por encima de los 20 mmol / L en orina.

                                                                                  Hipernatremia: se debe a un déficit del agua corporal. La principal causa de pérdida de agua es la diabetes insípida pero no determina grandes hipernatremias ya que la sed compensa la pérdida de agua.

                                                                                  POTASIO: es el principal catión intracelular. La concentración normal de potasio está entre 3,5 - 5 mmol /L.

                                                                                  Funciones:

                                                                                  • Interviene en el mantenimiento del equilibrio ácido-base

                                                                                  • Interviene en la conducción nerviosa

                                                                                  • Interviene en la contracción muscular

                                                                                  • Regula el gasto cardíaco controlando el volumen y la frecuencia cardiaca

                                                                                  • Regula la presión osmótica.

                                                                                  Regulación del metabolismo del K+

                                                                                  • El K se filtra libremente en el riñón

                                                                                  • Se reabsorbe en el TCP

                                                                                  • Se secreta en el TCD: del 80 al 90% del K de las células se excreta por el riñón, el resto lo hacen por las heces y el sudor.

                                                                                  • No hay umbral renal para el potasio, de tal forma que en estados carenciales de K podemos seguir eliminando potasio.

                                                                                  • Se necesita una ingesta diaria y regular de potasio (tomates y plátanos)

                                                                                  Alteraciones del metabolismo del K+

                                                                                  Hipokaliemia: niveles de potasio < 3,5 meq / L

                                                                                  Causas: a) Digestivas: por falta de ingesta, vómitos, diarreas, etc

                                                                                  b) De origen renal: utilización de fármacos diuréticos, enfermedades tubulares renales, exceso de mineralcorticoides suprarrenal, etc.

                                                                                  Consecuencias: cuando K+ < 2,5 meq / L aparecen problemas cardiacos (arritmias, alteraciones en la contracción cardiaca, etc)

                                                                                  Hiperkaliemia: niveles de K+ > 5 meq / L

                                                                                  Causas: a) Disminución de la excreción renal (insuficiencia renal, diuréticos ahorradores de potasio, insuficiencia suprarrenal aguda que disminuye al aldosterona,...)

                                                                                  b) Aumento del aporte:

                                                                                  Destrucción celular (aplastamientos, quemaduras, hemólisis masiva, intervenciones quirúrgicas...)

                                                                                  Perfusión K+

                                                                                  Acidosis metabólica: el potasio es extraído de las células

                                                                                  c) Uso de fármacos: como la penicilina potásica.

                                                                                  Consecuencias: cuando los niveles de K+ > 6,5 meq / L aparecen problemas cardiacos.

                                                                                  Pseudohiperkaliemia: se produce cuando se hace una extracción sanguínea con torniquete durante un tiempo prolongado. También cuando se hace una extracción con apertura y cierre del puño repetidas veces.

                                                                                  CLORO: Es el principal anión extracelular. [ Cl- ] = 98 -106 mmol / L ó meq / L

                                                                                  Alteraciones metabólicas del Cl-

                                                                                  Hipocloremia: valores inferiores a 98 meq / L. Estos descensos se deben a una pérdida excesiva de Cloro que puede ser debida a pérdidas gastrointestinales en forma de HCl, enfermedades renales que cursan con pérdida de Na, etc.

                                                                                  Hipercloremia: se da en la acidosis metabólica, por pérdida excesiva de bicarbonato.

                                                                                  Es importante la determinación de Cloro para el diagnóstico de algunas patologías, siendo de gran importancia en el “Test de sudor”, en el que se estimula la piel por calor y piloecarpina, se toma el sudor y se analiza el cloro o cloruro sódico. Esta prueba es fundamental para el diagnóstico de la Fibrosis Quística (patología de las glándulas exocrinas).

                                                                                  CALCIO (Ca2+): los valores normales de Calcio Total = 8,5 - 10,5 mg / dL. De todo el calcio plasmático, solo la fracción iónica puede ser utilizada por el organismo en procesos vitales, es decir, es la fracción fisiológicamente activa.

                                                                                  Los valores normales de Calcio Iónico = 4,48 - 4,92 mg / dL (2,4 meq / L).

                                                                                  Localización:

                                                                                  • El 98% del calcio se localiza en el esqueleto

                                                                                  • El restante 2% se localiza en el plasma, del cual:

                                                                                    • Un 46% es calcio iónico

                                                                                    • Un 40% es calcio unido a la Albúmina

                                                                                    • Un 14% forma sales de calcio

                                                                                  Influencia del pH sobre el calcio: la acidosis favorece la disociación de calcio, por lo tanto favorece la creación de calcio iónico. La alcalosis disminuye el calcio iónico.

                                                                                  Metabolismo del calcio iónico:

                                                                                  • El calcio se absorbe en el intestino (eliminación por vía renal)

                                                                                  • Para la regulación metabólica intervienen 3 hormonas, que son:

                                                                                    • PTH (Paratohormona): provoca un aumento de los niveles de Calcio en sangre y esto lo consigue porque provoca un aumento de la reabsorción renal ósea del calcio y favorece la reabsorción en el intestino.

                                                                                    • CALCITOINA: se produce en la glándula tiroides. Tiene el efecto contrario a la paratohormona, es decir, que disminuye los niveles de calcio en la sangre.

                                                                                    • CALCIPRIOL: es la vitamina D3 activa. En algunos alimentos hay precursores de la vitamina D3 que, con los rayos ultravioletas sobre la piel, sintetizan la vitamina completándose la síntesis en el hígado y riñón, formándose la hormona. Provoca un aumento del Ca2+ en sangre.

                                                                                  Funciones del calcio:

                                                                                      • Es un componente esencial del esqueleto

                                                                                      • Es imprescindible en la coagulación sanguínea

                                                                                      • Interviene en la excitabilidad neuromuscular y la transmisión nerviosa.

                                                                                  Patología:

                                                                                  Hipercalcemia: se produce cuando el calcio total en sangre es superior a 10,5 mg /dL, siendo grave cuando pasa de los 13,5 mg / dL.

                                                                                  Causas: insuficiencia renal crónica, alteraciones hormonales, inmovilizaciones prolongadas, tumores, aumento del aporte,...

                                                                                  Hipocalcemia: disminución del calcio total en sangre por debajo de 8,5 mg / dL.

                                                                                  Causas: disminución del aporte de calcio, síndromes de mala absorción intestinal, etc.

                                                                                  FÓSFORO: Valores normales en niños = 4 - 6,5 mg /dL, y en adultos = 3 -5 mg / dL.

                                                                                  Localización:

                                                                                  • Intracelular: el tanto por ciento más alto es de fosfato orgánico, que está formando parte de las macromoléculas como los fosfolípidos y las fosfoproteínas. Un tanto por ciento más bajo está en forma de fosfato inorgánico formando parte de la molécula de ATP.

                                                                                  • Extracelular: un 85% está formando parte de la matriz ósea del esqueleto y un 15% está en el plasma.

                                                                                  Alteraciones Metabólicas:

                                                                                  Hierfosfatemia: es grave cuando el fósforo está por encima de los 9 mg / dL. El aumento del fósforo va unido a la disminución del calcio y tiene como consecuencias arritmias cardiacas y contracciones musculares.

                                                                                  Hipofosfatemia: se considera grave con valores de fósforo inferiores a 1 mg / dL. La consecuencia de la hipofosfatemia es la alteración en la contracción de los músculos esqueléticos, que determina una insuficiencia respiratoria.

                                                                                  MAGNESIO (Mg2+): los valores normales son 1,5 - 2,5 meq / L.

                                                                                  Funciones:

                                                                                  • Activación de enzimas

                                                                                  • Interviene en la conservación de la estructura del ADN, ARN y de los ribosomas

                                                                                  Distribución:

                                                                                  • 50% en los huesos

                                                                                  • 45% intracelular

                                                                                  • 5% extracelular

                                                                                  Alteraciones Metabólicas:

                                                                                  Hipomagnesemia: es más importante clínicamente que la hipermagnesemia. Se da en las siguientes circunstancias:

                                                                                  • Situaciones de mala absorción intestinal

                                                                                  • Diarrea abundante

                                                                                  • Alcoholismo, etc.

                                                                                  Hipermagnesemia: son muy raras porque el riñón excreta el exceso de magnesio. Se da en la insuficiencia renal crónica.

                                                                                  COBRE (Cu2+): los valores normales son 70 -140 g / dL en las mujeres y 80 - 155 g / dL en los hombres.

                                                                                  Funciones:

                                                                                  • Síntesis de hemoglobina

                                                                                  • Construcción de enzimas y proteínas

                                                                                  Metabolismo: el 80% del cobre va unido a las proteínas plasmáticas, concretamente a las 2 - globulinas y dentro de ellas a la ceruloplasmina.

                                                                                  Alteraciones:

                                                                                  • Enfermedad del Wilson: se produce por depósito del cobre en el hígado. Tiene el cobre plasmático bajo.

                                                                                  • Aumentado en plasma en la enfermedad de Hodgkin.

                                                                                  2. EQUILIBRIO ÁCIDO - BASE

                                                                                  2.1 INTRODUCCIÓN

                                                                                  Los valores normales del pH del líquido extracelular (plasma) son de 7,25 - 7,45, lo que equivale a una concentración de hidrogeniones (H+) de 35 - 45 mmol / L.

                                                                                  El pH del líquido intracelular no se puede determinar con precisión, pero se le atribuye un pH de 6,9.

                                                                                  Es imprescindible para el buen funcionamiento del organismo que se mantengan los niveles de pH y esto se controla por tres sistemas, que son:

                                                                                  • Los tampones ácido - base de la sangre

                                                                                  • Riñones

                                                                                  • Pulmones

                                                                                  2.2 SISTEMAS AMORTIGUADORES DEL PH CORPORAL

                                                                                  Son soluciones que disminuyen al máximo las variaciones de pH cuando se añade un ácido o una base.

                                                                                  Tampón Bicarbonato/ Ácido Carbónico ( HCO3- / H2CO3 ): es el más importante

                                                                                  H2O + CO2 ! H2CO3 ! H+ + HCO3-

                                                                                  pH = pKa + log [ HCO3- ] / log [ H2CO3 ]

                                                                                  Si añadimos un ácido fuerte, los H+ reaccionarán con el bicarbonato para formar ácido carbónico. El ácido carbónico es un ácido débil, que provocará sólo un ligero aumento de la concentración de hidrogeniones ( HCO3- + H+ ! H2CO3 ).

                                                                                  Si añadimos una base, los OH- reaccionarán con los hidrogeniones del ácido carbónico para formar bicarbonato y agua, de tal forma que el pH apenas se modificará.

                                                                                  El H2CO3 se elimina muy fácilmente a través de la respiración en forma de CO2. El HCO3- se puede eliminar o se puede preservar si se necesita, por el riñón.

                                                                                  Tampón de Hemoglobina: es el segundo en importancia. Es intraeritrocitario. Se basa en los cambios que se producen entre las variaciones de Hb oxigenada y la Hb desoxigenada.

                                                                                  Tampón de las proteínas plasmáticas: Se basa en la característica de ser anfóteras.

                                                                                  Tampón fosfato el menos importante.

                                                                                  2.3 DETERMINACIÓN ANALÍTICA DEL PH DE LA SANGRE Y ORINA

                                                                                  Los valores normales de pH son:

                                                                                  • pH en sangre total = 7,38 - 7,44

                                                                                  • pH de sangre arterial = 7,36 - 7,41 (promedio = 7,4)

                                                                                  • pH de sangre venosa = 7,37 - 7,45

                                                                                  Aspectos prácticos:

                                                                                    • El pH de la sangre recién extraída permanece invariable durante 3 horas si se guarda la sangre a 4ºC en un baño de agua de hielo. Si no el pH disminuye progresivamente después de la extracción. Por lo tanto, lo mejor es medir el pH dentro de los 30 minutos posteriores a la extracción.

                                                                                    • Para fines clínicos, el pH de la sangre venosa tiene el mismo significado de la sangre arterial.

                                                                                    • El pH de la orina varía entre 4,6 y 8, y nunca se pueden medir orinas congeladas.

                                                                                  2.4 EQUILIBRIOS ÁCIDO - BASE

                                                                                • Acidosis: es un trastorno que tiende a retener ácidos o a extraer bases de los líquidos corporales.

                                                                                • a.1 Acidosis Metabólica: se produce cuando hay una carencia primaria de bicarbonato.

                                                                                  • Datos de laboratorio:

                                                                                    • HCO3- !

                                                                                    • pH !

                                                                                    • Acidez !

                                                                                    • H2CO3 !

                                                                                    • NH3 urinario !

                                                                                  • Compensación de acidosis metabólica: se hace mediante la hiperventilación, aumento de la eliminación renal de ácido y una retención de base. Actúa como compensador el tampón HCO3- / H2CO3

                                                                                  • Causas: Insuficiencia renal crónica, envenenamiento por salicilatos, diarreas abundantes, acidosis láctica.

                                                                                  a.2 Acidosis Respiratoria: se produce por un exceso primario de H2CO3 , que se produce cuando el pulmón disminuye la eliminación de CO2.

                                                                                  • Datos de laboratorio:

                                                                                    • HCO3- !

                                                                                    • pH !

                                                                                    • Acidez urinaria !

                                                                                    • H2CO3 !

                                                                                    • NH3 urinario !

                                                                                    • pCO2 !

                                                                                  • Causas: Epoc (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), fibrosis pulmonar, enfermedad cardiaca, respiración de aire con alto contenido en CO2 ,...

                                                                                  • Compensación: interviene el tampón de hemoglobina y el de las proteínas plasmáticas. Se produce una hiperventilación y el riñón aumenta la reabsorción de bicarbonato.

                                                                                  • Alcalosis: es un trastorno que tiende a extraer ácido o a agregar base al medio interno.

                                                                                  • b.1 Alcalosis Metabólica: es un exceso primario de bicarbonato.

                                                                                    • Datos de laboratorio:

                                                                                      • HCO3- ! - pH urinario !

                                                                                      • pH ! - pCO2 !

                                                                                      • H2CO3 !

                                                                                    • Causas: vómitos, tratamiento con diuréticos, síndrome de Cushing, hiperaldosteronismo primario, ...

                                                                                    • Compensación: Actúa el tampón HCO3- / H2CO3, hay una hiperventilación pulmonar y el riñón disminuye la reabsorción de bicarbonato.

                                                                                    b.2 Alcalosis Respiratoria: se produce por un aumento de la eliminación de CO2 por parte del pulmón. Esto determina una carencia primaria de H2CO3.

                                                                                    • Causas: se da en todos los procesos que cursan con un aumento de la frecuencia o de la profundidad de la respiración, por ejemplo, en situaciones de fiebre alta mantenida, anoxia o hipoxia, histeria, etc.

                                                                                    • Datos de laboratorio:

                                                                                      • HCO3- !

                                                                                      • pH !

                                                                                      • pH urinario !

                                                                                      • H2CO3 !

                                                                                      • pCO2 !

                                                                                    Cuando el cuadro es grave también se produce un aumento de cuerpos cetónicos y fosfatos disminuidos.

                                                                                        • Compensación: el riñón disminuye la reabsorción de bicarbonato.

                                                                                    3. GASES EN SANGRE. Aspectos prácticos en la determinación de gases en sangre

                                                                                    La determinación de gases en sangre se denomina GASOMETRÍA. Para determinar gases en sangre hay que realizar una punción arterial. El paciente debe estar sentado y en reposo al menos durante 10 minutos antes de la punción. Debe abstenerse de fumar y de tomar broncodilatadores y vasodilatadores, así como oxigenoterapia antes de la extracción, siempre que las condiciones lo permitan. Se recomienda realizar la punción en la arteria radial a la altura del túnel carpiano. La muestra se prepara con un anticoagulante (heparina sódica) y debe permanecer siempre herméticamente cerrada.

                                                                                    UT 16. ESTUDIO DEL PERFIL DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA

                                                                                    1. ANATOMO-FISIOLOGÍA DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA

                                                                                  • ANATOMÍA

                                                                                    • Anatomía Macroscópica:

                                                                                      • El hígado es una glándula impar, asimétrica, la más grande del cuerpo, cuyo peso es de 1500 g., lo que supone el 2,5% del peso corporal.

                                                                                      • Se localiza en el hipocondrio derecho, debajo del diafragma.

                                                                                      • Está recubierto por una membrana fibrosa que se llama “Cápsula de Gusson”.

                                                                                      • Es un órgano muy vascularizado, recibe sangre de la arteria hepática y de la vena porta, recibiendo de 1400-1600 mL de sangre que supone el 25% de todo el gasto cardíaco. La sangre sale del hígado por las venas suprahepáticas derecha e izquierda que desembocan en la vena cava inferior.

                                                                                    • Anatomía Microscópica (Histología): la unidad funcional hepática es el “Lobulillo Hepático”. Estos están separados entre sí por tejido conectivo y cada uno mide de 1 a 2 mm de diámetro. Tienen forma hexagonal. En el centro del lobulillo se encuentra la vena centrolobulillar. En la periferia se encuentran unos espacios triangulares llamados “Espacios Porta”. Cada espacio porta tiene una rama de la vena porta, una rama de la arteria hepática y un conductillo biliar.

                                                                                    Los hepatocitos o células hepáticas se agrupan formando cordones que se disponen radialmente desde el centro del lobulillo hasta la periferia. Entre estas láminas o cordones se encuentran los “Sinusoides Vasculares” por los que circula la sangre procedente de las ramas de la arteria hepática y de la vena porta. La sangre circula por ellos dirigiéndose a la vena centrolobulillar. En las paredes de estos sinusoides están las “Células de Kupffer”, que son células del Sistema Retículo Endotelial. Cada hepatocito, en su superficie de contacto con otro hepatocito, presenta una hendidura que con otra hendidura de la otra célula forma un conducto llamado “Capilar Biliar” y que recoge la bilis segregada por los hepatocitos conduciéndola a los conductillos biliares de los espacios porta. Los conductillos biliares se van uniendo unos con otros dando lugar al final a dos “Conductos Biliares” (derecho e izquierdo) que salen del hígado. Los dos se unen y forman el “Conducto Hepático” que se une al “Conducto Cístico” (viene de la vesícula biliar) y ambos forman el “Conducto Colédoco”, que desemboca en la ampolla de Vater localizada en la segunda porción del duodeno.

                                                                                  • FISIOLOGÍA

                                                                                    • Formación de la Bilis: la bilis está constituida por agua, bilirrubina, sales biliares, colesterol, fosfolípidos y electrolitos. La bilis interviene en la digestión y absorción de las grasas en el intestino delgado.

                                                                                    La Bilirrubina es un pigmento que procede de la destrucción de los eritrocitos viejos en el SER. La hemoglobina de los hematíes se cataboliza y se obtiene la bilirrubina que recibe el nombre de “Bilirrubina Indirecta o no conjugada”, que pasa a la sangre donde circula unida a la albúmina siendo transportada hasta el hígado. En el hígado se conjuga con el ácido glucurónico y se obtiene la “Bilirrubina Directa o conjugada” que es soluble en agua. Ésta llega al intestino por la bilis y por acción de la flora bacteriana se transforma en urobilinógeno que es eliminado.

                                                                                    • Función Metabólica: el hígado interviene en el metabolismo de los lípidos, proteínas y glúcidos.

                                                                                    • Función desintoxicadora: Intervienen en el catabolismo y la eliminación de sustancias tóxicas para el organismo (Ej. Sustancias aminadas, alcohol, etc)

                                                                                    • Almacenamiento de vitaminas y metales como el hierro y el cobre.

                                                                                    • Inactivación de hormonas que luego serán eliminadas

                                                                                    • Función de Sistema Retículo Endotelial a través de las células de Kupffer.

                                                                                    2. PATOLOGÍA HEPÁTICA

                                                                                    2.1 DEFINICIÓN DE HEPATOPATÍA: las hepatopatías engloban los diferentes trastornos hepáticos. Son de difícil clasificación porque a menudo se desconoce su causa y su evolución.

                                                                                    2.2 CLASIFICACIÓN

                                                                                  • Enfermedades Parenquimatosas: son de localización intrahepática.

                                                                                    • Hepatitis: las más frecuentes son virales pero pueden ser también tóxicas. Pueden ser agudas o crónicas.

                                                                                    • Cirrosis Hepática: es una enfermedad degenerativa del hígado, crónica y que lleva a unas lesiones anatomopatológicas del hígado muy graves. Puede tener múltiples causas:

                                                                                    • Origen alcohólico

                                                                                    • Origen en un trastorno de las vías biliares

                                                                                    • Hemocromatosis (acumulación de hierro)

                                                                                    • Enfermedad de Wilson

                                                                                      • Infiltrados: pueden ser de grasa, de glucógeno o de tipo amiloide. Otros infiltrados son las leucemias y los linfomas.

                                                                                      • Lesiones que ocupan lugar: Hepatoma (tumor maligno), Metástasis hepáticas, Abscesos, Quistes.

                                                                                      • Trastornos funcionales con ictericia: Síndrome de Gilbert, Colestasis del embarazo.

                                                                                      • Enfermedades Hepatobiliares: son el resultado de alteraciones en las vías biliares. Las dos más frecuentes son:

                                                                                        • Obstrucción extrahepática de las vías biliares (litiasis biliar, tumor pancreático,...)

                                                                                        • Colangitis: inflamación de los conductos biliares.

                                                                                      • Enfermedades vasculares: son de origen circulatorio.

                                                                                        • Congestión pasiva crónica. El hígado lo sufre siempre que haya insuficiencia cardiaca derecha.

                                                                                        • Trombosis de las venas suprahepáticas o de la vena porta.

                                                                                        3. MEDIDA DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA

                                                                                        3.1 PRUEBAS BIOQUÍMICAS INDICADORAS DE LA FUNCIÓN EXCRETORA HEPÁTICA

                                                                                        Una de las principales funciones del hígado es la eliminación del organismo de sustancias exógenas y endógenas que son nocivas para la fisiología humana.

                                                                                      • Determinación de Bilirrubina y Urobilinógeno: los niveles séricos normales de Bilirrubina son inferiores a 1 mg / dL. A partir de 2,5 mg /dL se habla de hiperbilirrubinemia, en este caso se produce ictericia.

                                                                                        • Ictericia: es la coloración amarillenta de la piel y mucosas. Tipos:

                                                                                          • Ictericia NO conjugada: se produce por un aumento de la Bilirrubina Indirecta o no conjugada. Puede ser:

                                                                                            • Prehepática: Hemólisis

                                                                                            • Hepática: se produce por un transporte defectuoso de bilirrubina de la sangre al hepatocito.

                                                                                          • Ictericia conjugada: se produce por un aumento de la Bilirrubina Directa o conjugada. Puede ser:

                                                                                            • Hepática: se produce por lesión del hepatocito (Ej. Cirrosis, hepatitis, etc)

                                                                                            • Colestásica: se produce por transporte defectuoso de bilirrubina en el canalículo biliar (Ej. Cirrosis biliar primaria)

                                                                                            • Posthepática: se produce por obstrucción mecánica de las vías biliares (Ej. Litiasis biliar, carcinoma de páncreas, etc)

                                                                                              • Diagnóstico diferencial de las ictericias:

                                                                                              • Determinación de bilirrubina total y bilirrubina directa en suero.

                                                                                              • Bilirrubina en orina (“Urobilina”): la bilirrubina indirecta está unida a la albúmina, por lo tanto, no se filtra por el glomérulo, es decir, que si está aumentada en sangre no estará aumentada en orina. La bilirrubina directa es soluble en agua y, por lo tanto, si está aumentada en sangre aumenta en orina.

                                                                                              • Determinación de Urobilinógeno en orina y heces: se hace aplicando el “reactivo de Erlich” y se cuantifica por la intensidad de color.

                                                                                              • Medida de excreción de colorantes: se basa en la capacidad que tiene el hígado para extraer colorantes de la sangre. Se usan colorantes como el Rosa de Bengala, la Bromo Sulfoftaleina o el Verde de Indocianina.

                                                                                              • 3.2 PRUEBAS BIOQUÍMICAS INDICADORAS DE LA CAPACIDAD DE SÍNTESIS HEPÁTICA Y METABÓLICA

                                                                                                Se basan en la medida de compuestos que son sintetizados habitualmente por el hígado.

                                                                                              • Medida de la Albúmina y globulinas: la Albúmina es la proteína más importante cuantitativamente, sintetizada por el hígado, por lo tanto, su descenso en sangre es un excelente indicador de la gravedad de una hepatopatía.

                                                                                              • Las gamma globulinas se sintetizan en las células plasmáticas y aumentan en las hepatopatías para compensar la disminución de la destrucción de Ag por el hígado.

                                                                                              • Determinación de factores de la coagulación: los factores de la coagulación sintetizados por el hígado son el I o Fibrinógeno, el II o Protrombina, el V, el VII, el IX y el X. Estos factores existen en exceso y sólo en caso de hepatopatías muy graves disminuyen.

                                                                                              • Las pruebas indicadas para su control son: El Tiempo de Protrombina (TP) y el Tiempo de Tromboplastina Parcial (TTP).

                                                                                              • Medida de amoníaco en sangre: el amoníaco en sangre se encuentra en forma de ión amonio. El hígado elimina la mayor parte del amoníaco de la sangre en forma de urea. En las hepatopatías el amoníaco no se elimina, aumenta en sangre y esto determina una importante alteración neurológica porque el amoníaco es neurotóxico. La medida de amoníaco en sangre es muy útil para la identificación de la encelopatía hepática y el coma hepático.

                                                                                              • Se producen aumento del amoníaco precoz en el “Síndrome de Reye”, que aparece en niños de corta edad.

                                                                                                4. MARCADORES SÉRICOS DE LA ENFERMEDAD HEPÁTICA

                                                                                                Son pruebas bioquímicas útiles para estudiar la enfermedad hepática, pero no sirven para medir la función del hígado.

                                                                                                • Enzimas: Transaminasas (AST, ALT, GGT), LDH, Fosfatasa Alcalina, 5'-Nucleotidasa. Esta última se utiliza para determinar la existencia de enfermedad hepatobiliar. Su principal utilidad es confirmar el origen hepático de un aumento de la Fosfatasa Alcalina en niños, embarazadas y pacientes con osteopatías.

                                                                                                • Marcadores serológicos de Hepatitis Virales:

                                                                                                  • Hepatitis A: está producida por el virus de la Hepatitis A. Se caracteriza porque tiene transmisión fecal-oral y porque no cronifica.

                                                                                                Serología: se utilizan para su diagnóstico y se dispone de una vacuna efectiva para personas especialmente expuestas.

                                                                                                    • IgM-anti VHA: está aumentada desde su aparición hasta los seis meses.

                                                                                                    • IgG-anti VHA: aumenta a las 6 semanas del inicio y se mantiene aumentada hasta el final de la enfermedad.

                                                                                                  • Hepatitis B: se transmite por el virus de la Hepatitis B y tiene tres vías de contagio, la parenteral, sexual y materna-fetal.

                                                                                                El virus de la Hepatitis B completo recibe el nombre de “partícula Dane” y se descompone en:

                                                                                                • Genoma viral

                                                                                                • Cápsula: es la parte exterior de la estructura y se llama “Ag de superficie” o HBs Ag

                                                                                                • Núcleocápside o Core: está formada por ADN y proteínas y se llaman HBc Ag.

                                                                                                Cronifica en un 15-20% de los caos y en un 1% es fulminante.

                                                                                                Serología:

                                                                                                • HBs Ag o Ag Australia: indica infección actual del virus de la Hepatitis B. Su negatividad no permite descartar la enfermedad.

                                                                                                • HBs Ac: son los únicos marcadores en personas vacunadas y en hijos de madres con anti-HBs.

                                                                                                • HBc Ac: tiene una concentración alta en fases muy tempranas de la infección. Se mantiene en concentraciones muy bajas muchos años en personas ya curadas. Las IgM anti HBc indican infección aguda (es el mejor indicador). Si son negativas permiten descartar la enfermedad.

                                                                                                • HBe Ag: indica replicación activa del virus y, por lo tanto, posibilidad de contagio de la enfermedad.

                                                                                                • HBe Ac: indica junto con la desaparición simultánea del Ag HBe buen pronóstico.

                                                                                                  • Hepatitis C: se transmiten por vía parenteral

                                                                                                Serología: se determinan Ac anti-VHC que no sirven para la fase aguda pudiendo tardar meses en aparecer.

                                                                                                  • Hepatitis D: se transmite por vía parenteral a personas que padecen o han padecido Hepatitis B.

                                                                                                  • Hepatitis E: se transmite por vía fecal-oral en epidemias causadas por fuentes de agua contaminadas.

                                                                                                HEPATITIS VIRAL AGUDA A HEPATITIS B AGUDA



                                                                                                105

                                                                                                84