Espectrofotometría de absorción

Bioquímica. Azul de metileno. Cianmetahemoglobina. Concentración disoluciones

  • Enviado por: Noelia
  • Idioma: castellano
  • País: España España
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ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN DEL

AZUL DE METILENO Y DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA

  • FUNDAMENTO

Cuando se pretende determinar, espectrofotométricamente la concentración de un soluto de una disolución, es imprescindible conocer las longitudes de onda a las que se produce la máxima absorción. Lo ideal es hacer incidir sobre la solución un haz de luz con la longitud de onda que se produce la máxima absorción; para descubrir la capacidad de absorción de una sustancia a distintas longitudes de onda, se hace un barrido de longitudes de onda.

Cada sustancia tiene su espectro característico, por lo que podemos indentificarla en una solución cuya composición desconocemos, y esto se suele emplear en la determinación de tóxicos en líquidos biológicos.

Existen dos formas de llevar a cabo los espectros de absorción:

  • Manualmente: se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz simple, se coloca en la cubeta la solución y vamos midiendo las absorbancias a distintas longitudes de onda.

  • Automáticamente: se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz doble, en el que se sitúa la cubeta con el blanco en una de sus celdas y en la otra la solución problema, se programa el aparato para q haga incidir distintas longitudes de onda y este hace el barrido.

  • AZUL DE METILENO

  • Preparación de la mesa de trabajo:

      • Papel de filtro

      • Vaso de precipitado

      • Matraz

      • Pipeta de 5 ml

      • Pipeta pasteur

      • Tubo de ensayo

      • Cubetas

      • Espectrofotómetro

      • Servilletas

      • Preparar la solución, 25 ml de una disolución de 0.1% de concentración de azul de metileno, a partir de una de 1%; para lo cual se pipetea 2.5 ml de azul de metileno y se le añade agua destilada hasta los 25 ml.

      • Dispensar en un tubo de ensayo 5 ml.

      • En una cubeta del espectrofotómetro vertemos la solución de azul de

      • metileno.

      • Vamos a medir distintas longitudes de onda: 340, 405, 500, 546, 578 y

      • 630.

      • Preparamos el espectrofotómetro, vamos a realizar esta práctica de forma manual.

          • Lo enchufamos y conectamos

          • Código 100 + enter

          • Utilidad 1 + enter

          • Código (nº que le vayamos a poner a nuestra técnica : X) + enter

          • Identificación (print) 0 (relativo a la absorbancia) + enter

          • Modo (print) 0 (relativo a la absorbancia) + enter

          • WL1 (1ª longitud de onda) + enter

          • WL2 no me hace falta + enter

          • Temperatura 37º + enter

          • Retardo de lectura 1 seg + enter

          • Terminado esto saldrán impresas todas las condiciones descritas y la técnica ya está programada.

      • Ejecución de la técnica

        • Stop + código (X) + enter

        • Nos pedirá que metamos un blanco, q será en este caso agua destilada + read.

        • A continuación nos pedirá q metamos la muestra + read.

        • Stop + código (X) + enter

        • Identificación 0 + enter...... igual q antes hacemos todos los pasos otra vez, lo único q cambia es que la longitud de onda va variando.

      • A continuación vamos a realizar la misma técnica pero de una forma

      • automática.

      • Ya tenemos conectado el espectrofotómetro

      • Colocamos dos blancos en sus cubetas, que van a seguir siendo agua destilada y le damos a “Medida autocero”.

      • Sacamos una de las cubetas de blanco, la de abajo, y en su lugar colocamos la muestra.

      • Le hemos metido los parámetros de longitudes de onda a la que queremos que nos mida las absorbancias. (700 - 200 nm)

      • El espectrofotómetro comienza a leer las absorbancias y hace la gráfica.