Enzimología

Enzimas. Estructura enzimática. Naturaleza química. Sistema enzimático. Conenzima. Grupos prostéticos. Inhibidores

  • Enviado por: Luis González Mora
  • Idioma: castellano
  • País: España España
  • 26 páginas

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La enzimología

Indice

1. Introducción
2. Evolucion de la enzimologia
3. Las enzimas
4. Importancia biomedica de las enzimas
5. Caracteristicas de las enzimas
6. La estructura enzimática
7. Naturaleza química de las enzimas
8. Composición química de las enzimas
9. Nomenclatura y clasificacion de las enzimas
10.Partes del sistema enzimatico
11. Coenzima y grupos prostéticos
12. Activadores
13. Las enzimas son catalizadores estereoespecíficos
14. Especificidad enzimática
15. Preparación y purificación de las enzimas
16. Isoenzimas
17. Cinetica de las reacciones enzimaticas
18. Relaciones entre la enzima y el sustrato.
19. Accion de inhibidores.
20. Inhibicion por competencia
21. Inhibicion por no competencia
22. Antagonismo metaboloco (antimetabolitos)
23. Inhibicion alosterica
24. Enzimas: regulacion de actividades
25. Bibliografia

1. Introducción

Al igual que las disciplinas experimentales que han surgido como rama común que es la biología, tiene una historia propia construida a través de observaciones, experiencias, pruebas y teorías. Se inició con el estudio de los procesos de fermentación y de putrefacción y Antoine-Laurent Lavoiser (1743- 1794) fue el primero en plantear sobre bases cuantitativas el proceso de la fermentación alcohólica al observar una relación entre cantidad de azúcar presente y productos formados durante el proceso. Sostuvo que la fermentación podía ser considerada como una reacción química cualquiera. No obstante Pasteur demostró pronto que los procesos de putrefacción y fermentación eran provocados por la presencia de bacterias y levadura.

2. Evolucion de la enzimologia

Si bien algunos químicos consideraron esos procesos como metamorfosis de sustancias que provocaban excitaciones en otras que estaban cerca de ellas, esta cuestión fue, como ya se ha dicho, definitivamente resuelta por Buchner hacia finales del siglo XIX; exprimiendo masas celulares de Saccharomyces cerevisie obtuvo un liquido sin células, capaz de producir la mismas reacciones químicas que se obtenían utilizando la suspensión de células, es decir, la transformación del azúcar en alcohol y anhídrido carbónico. Por tanto, de la levadura se podía extraer una sustancia capaz de regular un proceso químico concreto.

Esto obligo a replantear las investigaciones contrarias a la teoría de que el proceso digestivo fuese debido a la trituración de la s sustancias digeridas hasta el punto de reducirlas a partículas lo suficientemente finas para poder ser asimiladas. En efecto, en el siglo XVIII R.A de Reaumur (1683- 1757) haciendo ingerir a un halcón una cápsula de hierro agujereada, que contenía alimento, observó que este quedó completamente disuelto por los jugos gástricos y que, por tanto, no era, molturado de modo mecánico por la robusta musculatura del robusto animal, pues la cápsula quedo intacta.

Mas adelante se constato que el almidón era degradado a monosacárido y disacárido por la acción del jugo salival (ptialina) y se describió la presencia de la pepsina en el jugo gástrico. Posteriormente, fueron aisladas sustancias de carácter fermentativo a partir de numerosas especies vegetales. Se observo que el extracto de algunas raíces tenían capacidad para modificar el color azul de determinadas sustancias y que el extracto de trigo era capaz de transformar el almidón en disacáridos y dextrina.

La vía para el estudio de esas sustancias estaba ya abierta. Jons Jacob Berzelius (1779 - 1848) interpreto su acción como si se tratase de unos catalizadores que favorecían determinada reacción química sin ser destruidos y sin aparecer en los productos finales. Richard Kuhne (1900-1967) fue el primero en dar a tales sustancias el nombre enzimas, tomado del griego, que significa literalmente "en la levadura".

3. Las enzimas

La Enzima Como Unidad Fundamental De Vida

Cada célula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que comporta continuos cambios en su estado bioquímico, en la base de la cual están las enzimas, que tienen el poder de catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos sintéticos y analíticos. Los propios genes son reguladores de la producción de las enzimas; por tanto, genes y enzimas pueden considerados como las unidades fundamentales de la vida.

Este concepto poco difundido casi hasta el siglo XX, se ha desarrollado y concretado cada vez mas, y constituye un componente esencial de diversas disciplinas: la microbiología, la fisiología, la bioquímica, la inmunología y la taxonomía, formando además parte del campo aplicado, en gran variedad de industrias. El rasgo particular de las enzimas es que pueden catalizar procesos químicos a baja temperatura, compatible con la propia vida, sin el empleo de sustancias lesivas para los tejidos. La vida es, en síntesis, una cadena de procesos enzimáticos, desde aquellos que tienen por sustratos los materiales mas simples, como el agua (H2O) y el anhídrido carbónico (CO2), presentes en los vegetales para la formación de hidratos de carbono, hasta los mas complicados que utilizan sustratos muy complejos.

La formación de los prótidos, los glúcidos y los lípidos es un ejemplo típico: Son a la vez degradados y reconstruidos por otras reacciones enzimáticas, produciendo energía a una velocidad adecuada para el organismo, sin el gasto energético que exigen los métodos químicos de laboratorio.

4. Importancia biomedica de las enzimas

Sin enzimas, no sería posible la vida que conocemos. Igual que la biocatálisis que regula la velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiológicos, las enzimas llevan a cabo funciones definitivos relacionadas con salud y la enfermedad. En tanto que, en la salud todos los procesos fisiológicos ocurren de una manera ordenada y se conserva la homeostasis, durante los estados patológicos, esta última puede ser perturbada de manera profunda. Por ejemplo, el daño tisular grave que caracteriza a la cirrosis hepática pueden deteriorar de manera notable la propiedad de las células para producir enzimas que catalizan procesos metabólicos claves como la síntesis de urea. La incapacidad celular para convertir el amoniaco tóxico a urea no tóxica es seguida por intoxicación con amoniaco y por ultimo coma hepático. Un conjunto de enfermedades genéticas raras, pero con frecuencia debilitantes y a menudo mortales, proporciona otros ejemplos dramáticos de las drásticas consecuencias fisiológicas que pueden seguir al deterioro de la actividad enzimática, inclusive de una sola enzima.

Después del daño tisular grave (por ejemplo, infarto del miocardio o pulmonar, trituración de un miembro) o siguiendo a multiplicación celular descontrolada (por ejemplo, carcionoma prostatico), las enzimas propias de tejidos específicos pasan a la sangre. Por lo tanto, la determinacion de estas enzimas intracelulares en el suero sanguineo proporciona a los medicos informacion valiosa para el diagnostico y el pronostico.

5. Caracteristicas de las enzimas

Desde el punto de vista químico, las enzimas están formadas de carbono (C), Hidrógeno (H), oxigeno (O), Nitrógeno (Ni), y Azufre (S) combinados, pero siempre con peso molecular bastante elevado y común propiedades catálicas especificas. Su importancia es tal que puede considerarse la vida como un "orden sistemático de enzimas funcionales". Cuando este orden y su sistema funcional son alterados de algún modo, cada organismo sufre mas o menos gravemente y el trastorno puede ser motivado tanto por la falta de acción como por un exceso de actividad de enzima.

Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiologicos, producidos por los organismos vivos. En consecuencia, las deficiencias en la funcion enzimatica causan patologias.

Las enzimas, en los sistemas biológicos constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenómenos vitales. La fijación de la energía solar y la síntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los vegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su vez, están dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines energéticos o estructurales; las funciones del metabolismo interno y de la vida de relación, como la locomoción, la excitabilidad, la irritabilidad, la división celular, la reproducción, etc. Están regidas por la actividad de innumerables enzimas responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sin liberaciones bruscas de energía a temperaturas fijas en un medio de pH, concentración salina, etc.; prácticamente constante.

A diferencia de un catalizador inorgánico que interviene en numerosas reacciones las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de reacción o solo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcadas que en general actúan exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa; por ejemplo, si solo atacan a los aminoácidos que tienen su carbono ð , asimétrico, con estructura L-, no muestran la menor actividad sobre formas idénticas de dichos aminoácidos, pero que sean del tipo D-.

En los sistemas biológicos se llevan a cabo diversas reacciones a partir de la misma sustancia; por ejemplo algunos microorganismos convierten la glucosa en alcohol y bióxido de carbono, al paso que otros gérmenes la convierten en ácido láctico o ácido pirúvico o acetaldehido. Esto quiere decir que la glucosa puede descomponerse en distintos productos y aunque todas las posibilidades son teóricas y prácticamente posibles la presencia de ciertas enzimas favorece uno de los caminos que llevan a la acumulación de determinados compuestos.

Las enzimas, por lo tanto, se consideran como catalizadores altamente específicos que:

  • Modifican la velocidad de los cambios promovidos por ellas.

  • Determinan que sustancias particulares, de preferencia a otras distintas son las que van a sufrir los cambios.

  • Impulsan dentro de los distintos cambios posibles que pueda seguir una sustancia, cual de ellos en especial, será el utilizado.

Las enzimas representan las sustancias encargadas de graduar la velocidad de una reacción determinada en el interior de las células; como en las diversas células se realizan infinidad de reacciones, ya que en una de ellas se encuentran varios miles de sustancias, se deduce, también, la presencia de varios miles de enzimas. Es posible, por lo tanto, que la mayor parte de esta estructura proteínica celular esté formada por enzimas, encargadas de las diversas funciones de síntesis, degradación, oxidación, etc. características de la actividad vital de los distintos organismos.

6. La estructura enzimática

Por su estructura y composición química puede afirmarse que el origen de las enzimas esta vinculando al origen de las sustancias proteicas. Al hablar del origen de la vida se ha citado el éxito de los experimentos realizados en el laboratorio para la producción de aminoácidos; estos aminoácidos son los que precisamente constituyen la base del edificio proteico. También en el laboratorio se ha intentado la síntesis de proteínas a partir de aminoácidos.

La sede de las enzimas es el citoplasma. Los cloroplastos vegetales contienen una amplia gama enzimas encargadas de la función clorofílica, proceso que a través de reacciones químicas complejas y encadenadas transforman compuestos inorgánicos, como el agua, y el anhídrido carbónico, en sustancias complejas adecuadas para ser entre otras cosas el alimento fundamental de los animales.

En las mitocondrias existe un sistema de transporte de electrones que determinan importantes fenómenos de oxidorreducción, durante los cuales se forman notables cantidades de ATP, que es un compuesto altamente energético del que depende la mayor parte de metabolismo, y coma, por tanto el trabajo de las células; en las mitocondrias se produce el metabolismo enzimático de los ácidos grasos, los cuales son en parte elaborados también en el citoplasma.

En los ribosomas tiene lugar concretamente todas la s síntesis de las sustancias proteicas, mientras que en los lisosomas se producen enzimas hidrolíticos cuya misión escindir, con la intervención del agua, moléculas grandes en otras menores, que pueden a su vez ser utilizadas por las células; en cambio, las enzimas glucolíticos están difundidos en el citoplasma.

La localización de las sedes de las distintas operaciones enzimáticas antes mencionadas ha sido posible a través del sistema de ruptura de las células y de la separación de los distintos componentes mediante centrifugación diferencial del homogeneizado de estas la ruptura celular y la subdivisión de los componentes subcelulares se realizan actualmente utilizando los tejidos, por ejemplo con saltos bruscos desde temperaturas inferiores a 0ð C hasta temperaturas mas elevadas con cambios de presión osmótica o mediante ultrasonidos.

7. Naturaleza química de las enzimas

Existen numerosas razones para afirmar que las enzimas son proteinas. La

más importantes son las siguientes:

  • El análisis de las enzimas obtenidas en forma más pura, criatalizada, demuestra que son proteínas.

  • Las enzimas son inactivadas a altas temperaturas y, en geeral, la cinética de la desnaturalización térmica de las enzimas da resultados muy parecidos a los de la desnaturalización térmica de las proteínas; por ejemplo el Q10 de la mayoría de las reacciones químicas es de 2 a 3, y, en el casod e las enzimas, a temperaturas elevadas, alrededor de 60 a 70 ð C, la actividad neta aumeta varios cientos, como sucede con la velocidad de la desnaturalización térmica de las proteínas.

  • Las enzimas son activadas en unas zona muy restringida de pH, y presenta un punto óptimo de ph donde su actividad es mayor. Las proteínas en su punto isoeléctrico, muestran propiedades parecidas desde el punto de vista de viscosidad, solubilidad, difución, etc., que resulta del todo similares a las propiedades de este tipo que muestran las enzimas.

  • Todos los agentes que desnaturalizan a las proteínas también destruyen o inactivan a las enzimas, ya sea el calor, los ácidos fuertes, o los metales pesados que puedesn combinarse con ellas.

  • Los problemas de solubilidad y de precipitación son comunes a las proteínas y las enzimas; en general, son solubles en agua o soluciones salinas, insolubles en alcohol, precipitan con determinadas concentraciones de sales neutras, etc.

  • 8. Composición química de las enzimas

    Los conocimientos sobre la composición química de las enzimas constituyeron materia de numerosas controversias hasta 1926, cuando J.B Sumner (1887-1955) consiguió cristalizar la ureasa, enzima que transforma la urea en anhídrido carbonico y amoniaco, y demostrar que era una sustancia proteica.

    A, partir de entonces fueron aisladas otras enzimas en forma pura, cristalina, y el análisis demostraba siempre la presencia de una proteina, simple o conjugada. Cuando los analisi químicos demuestran que la enzima es una proteína conjugada, pueden distinguirse en el dos partes bien diferenciadas:

    • El grupo prosteico (Coenzima)

    • La proteina (Apoenzima)

    En algunas enzimas oxidantes fue observada la presencia de la promoporteinas, en las cuales el grupo prospético esta representado por un compuesto que contiene Fe y otro elemento, el cual desmpeña un papel importante en la combinación de la proteina con el sustrato; otras veces este grupo prostético es derivada de vitaminas (como la vitamina B); 4en muchos casos resulta facil de separar de la molécula proteica. No obstante una vez separadas, las dos unidades no muestran actividad enzimático; por tanto el grupo proteico (coenzima) y el grupo proteico (apoenzima) han de estar íntimamente ligados entre si para ser operativos. Por consiguiente, de las enzimas pueden distinguirse los formados por:

    • Solo proteínas, que difieren entre si por la secuencia con que los aminoácidos están combinados, como la ureasa y las enzimas digestivas (la pepsina y la tripsina)

    • Los conjugados, separados en dos entidades químicas bien definidas: la coenzima y la apoenzima.

    Después del descubrimiento de Sumner, el numero de la enzimas y el estudio de sus actividades químicas proporcionaron un notable impulso en la enzimología, y la gran cantidad de las enzimas que rápidamente se acumulaban determinaron la necesidad de utilizar una clasificación o nomenclatura para evitar errores y facilitar la comprensión de futuros investigadores.

    9. Nomenclatura y clasificacion de las enzimas

    Cien años atrás solo se conocian enzimas, muchas de estas, catalizaban la hidrólisis de enlaces covalentes. Algunas enzimas, de manera especial las que fueron descubiertas en un principio, recibieron nombres ligados mas bien a su sitio de procedencia anatómica que no siguen ninguna regla ni sistema; tal es el caso de la ptialina de la saliva, que ataca al almidón de la pepsina del estómago y de la tripsina del páncreas, que atacan proteínas; de la renina, que cuagula la leche; de la papaina, enzima proteolítica que se encuentra en la papaya y de las catepsinas, también proteasas, que se encuentran en las células. Las enzimas relacionadas con la cuagulación de la sangre, como son la trombina, la plasmina, el plasminógeno, etc. reciben también nombres sistematizados.

    Al descrubir nuevas enzimas y proceder a su caracterización estricta se aplicaron reglas de nomenclatura basadas en el nombre del sustrato atacado, o en el tipo general de sustrato, o en la reacción catalizada y se ha añadido convencionalmente, la terminación -asa. Por ejemplo: las lipasas (hidrolizan lipidos o grasas), las amilasas (hidrolizan almidon), las proteasas (hidrolizan proteinas), las esterasas (basado en la unión general de tipo éster presentes en muchas sustancias), colesterol estrerasa (si la esterasa es específica de los esteres de colesterol) y acetilcolina esterasa (si la estersa de la acetilcolina). Otros ejemplos: Las fosfatasas son enzimas que atacan las uniones éster, pero en este caso, toman su nombre del grupo vecino a la unión que van a atacar, de manera que se denominan fosfatasas (cuando quitan una molécula de monofosfato), pirofosfatasas (cuando quitan el ácido fosfórico como esteres dobles (pirofosfatos), o triples, etc.) De la misma manera, las carbohidrasas se denominan así genericamente, pero pueden comprender enzimas con nombres proveniente del sustrato particular sobre el que actuan como la amilasa que ataca al almidón y la celulasa que actúa sobre la celulosa y, en otras ocaciones, se denominan de acuerdo con la unión atacada, como la ð -glucosidasa que actúa sobre las uniones ð -glucosídicas. Los ejemplos se pueden extender a todos los terrenos de la actividad enzimática, como en las enzimas proteolíticas, las fosforilasas, las nucleasas, etc.

    Esta manera de llamarlas, se demostro que era inadecuada porque al descubrirse varias enzimas, notaron que varias enzimas catalizaban reacciones diferentes del mismo sustrato, por ejemplo, oxidacion o reduccion de la funcion alcohol de un azucar.

    Aunque el sufijo -asa continua en uso; actualmente, al nombrar a las enzimas, se enfatiza el tipo de reaccion catalizada. Por ejemplo: las hidrogenasas catalizan la eliminacion de hidrogeno y las transferasas, reacciones de transferencia de grupo. Con el descubrimiento de mas y mas enzimas, surgieron ambiguedades y con frecuencia no estaba claro cual era la enzima que un investigador deseaba estudiar. Para remediar esta deficiencia, la Comisión para el estudio de las enzimas, que constituye con respecto a los sistemas anteriores un punto de vista más uniforme, preciso y descriptivo; esta formada por la Union Internacional de Bioquimica (IUB) adopto, en 1964, un sistema complejo pero inequivoco de la nomenglatura enzimatica basado en el mecanismo de reaccion.

    El sistema se basa en la reacción química catalizada que es la propiedad específica que caracteriza a cada enzima las cuales se agrupan en clases, porque catalizan procesos semejantes, y en subclases que especifican con mayor exactitud la reacción particular considerada. En general, las enzimas reciben un nombre de acuerdo con el sustrato o los sustratos que participan en la reacción seguido por el tipo de reacción catalizada y, por fin, la terminación -asa. A menudo los nombres así obtenidos resultan largos y complejos, por lo que es muy dificil que en la práctica se pueda excluir el uso de los nombres triviales, consagrados por la costumbre. Sin embargo, con fines de sistematización, se reconoce la necesidad de aceptar el nuevo sistema.

    Aunque su claridad y carencia de ambigüedad recomiendan al sistema de nomenglatura IUB para trabajos de investigacion, nombres mas ambiguos, pero basante mas cortos persisten en libros de texto y en el laboratorio clinico. Por esta razon, a continuacion solo se presenta principios generales del sistema IUB:

  • Las reacciones y las enzimas que las catalizan se dividen en 6 clases principales, cada una con 4 a 13 subclases.

  • El nombre de la enzima tiene 2 partes: la primera es el nombre del o los sustratos; la segunda, con terminacion -asa, indica el tipo de reaccion catalizada.

  • Informacion adicional, si es necesario aclarar la reaccion, puede seguir el parentesis. Por ejemplo: la enzima que cataliza L-malato + NAD= = piruvato + CO2 NADH + H= , se denomina como 1.1.1.37 L-malato:NAD+ oxidorreductasa (descarboxilante).

  • Cada enzima tiene un numero clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reaccion según la clase (primer digito), subclase (segundo digito) y subclase (tercer digito). El cuarto digito es para la enzima especifica. Asi, E.C. 2.7.1.1 denota la clase 2 (una transferasa), subclase 7 (transferencia de fosfato), sub-clase 1 (una funcion alcohol como aceptor de fosfato). El ultimo digito denota a la enzima hexocinasa o ATP: D-hexosa-6-fosforotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo de carbono 6 de la glucosa.

  • Al final de sus y trabajos, clasifico las enzimas en seis grupos principales, correspondientes por sus términos a las raciones que cada enzima ejerce sobre el sustrato. Estos grupos se subdividen en otro, según el tipo de sustrato y los átomos concretos que son sensibles a sus acciones. Estos seis grupos son los siguientes:

  • Oxidoreductasas

  • Transferasas

  • Hidrolasas

  • Isomerasa

  • Liasas

  •  

    1.Oxido-reductasas: Son las enzimas relacionadas con las oxidaciones y las reducciones biológicas que intervienen de modo fundamental en los procesos de respiración y fermentación. Las oxidoreductasas son importantes a nivel de algunas cadenas metabólicas, como la escisión enzimática de la glucosa, fabricando también el ATP, verdadero almacén de energía. Extrayendo dos átomos de hidrógeno, catalizan las oxidaciones de muchas moléculas orgánicas presentes en el protoplasma; los átomos de hidrógeno tomados del sustrato son cedidos a algún captor.

    En esta clase se encuentran las siguientes subclases principales: Deshidrogenasas y oxidasas. Son más de un centenar de enzimas en cuyos sistemas actúan como donadores, alcoholes, oxácidos aldehidos, cetonas, aminoácidos, DPNH2, TPNH2, y muchos otros compuestos y, como receptores, las propias coenzimas DPN y TPN, citocromos, O2, etc.

    2.Las Transferasas: Estas enzimas catalizan la transferencia de una parte de la molécula (dadora) a otra (aceptora). Su clasificación se basa en la naturaleza química del sustrato atacado y en la del aceptor. También este grupo de enzimas actúan sobre los sustratos mas diversos, transfiriendo grupos metilo, aldehído, glucosilo, amina, sulfató, sulfúrico, etc.

    3.Las Hidrolasas: Esta clase de enzimas actúan normalmente sobre las grandes moléculas del protoplasma, como son la de glicógeno, las grasas y las proteínas. La acción catalítica se expresa en la escisión de los enlaces entre átomos de carbono y nitrógeno (C-Ni) o carbono oxigeno (C-O); Simultáneamente se obtiene la hidrólisis (reacción de un compuesto con el agua)de una molécula de agua. El hidrógeno y el oxidrilo resultantes de la hidrólisis se unen respectivamente a las dos moléculas obtenidas por la ruptura de los mencionados enlaces. La clasificación de estas enzimas se realiza en función del tipo de enlace químico sobre el que actúan.

    A este grupo pertenecen proteínas muy conocidas: la pepsina, presente en el jugo gástrico, y la tripsina y la quimiotripsina, segregada por el páncreas. Desempeñan un papel esencial en los procesos digestivos, puesto que hidrolizan enlaces pépticos, estéricos y glucosídicos.

    4.Las isomerasas:Transforman ciertas sustancias en otras isómeras, es decir, de idéntica formula empírica pero con distinto desarrollo. Son las enzimas que catalizan diversos tipos de isomerización, sea óptica, geométrica, funcional, de posición, etc. Se dividen en varias subclases.

    Las racemasas y las epimerasas actúan en la racemización de los aminoácidos y en la epimerización de los azúcares. Las primeras son en realidad pares de enzimas específicas para los dos isómeros y que producen un solo producto común. Las isomerasas cis - trans modifican la configuración geométrica a nivel de un doble ligadura. Las óxido - reductasas intramoleculares cetalizan la interconversión de aldosas y cetosas, oxidando un grupo CHOH y reduciendo al mismo tiempo al C = O vecino, como en el caso de la triosa fosfato isomerasa, presente en el proceso de la glucólisis ; en otros casos cambian de lugar dobles ligaduras, como en la (tabla) isopentenil fosfato isomerasa, indispensable en el cambio biosinético del escualeno y el colesterol. Por fin las transferasas intramoleculares (o mutasas) pueden facilitar el traspaso de grupos acilo, o fosforilo de una parte a otra de la molécula, como la lisolecitina acil mutasa que transforma la 2 - lisolecitina en 3 - lisolecitina, etc. Algunas isomerasa actúan realizando inversiones muy complejas, como transformar compuestos aldehídos en compuestos cetona, o viceversa. Estas ultimas desarrollan una oxidorreducción dentro de la propia molécula (oxido rreductasa intramoleculares)sobre la que actúan, quitando hidrógeno, a algunos grupos y reduciendo otros; actúan ampliamente sobre los aminoácidos, los hidroxácidos, hidratos de carbono y sus derivados.

    5.Las Liasas: Estas enzimas escinden (raramente construyen) enlaces entre átomos de carbono, o bien entre carbono y oxigeno, carbono y nitrógeno, y carbono y azufre. Los grupos separados de las moléculas que de sustrato son casi el agua, el anhídrido carbónico, y el amoniaco. Algunas liasa actúan sobre compuestos orgánicos fosforados muy tóxicos, escindiéndolos; otros separan el carbono de numerosos sustratos.

    6.Las Ligasas: Es un grupo de enzimas que permite la unión de dos moléculas, lo cual sucede simultáneamente a la degradación del ATP, que, en rigor, libera la energía necesaria para llevar a cabo la unión de las primeras. Se trata de un grupo de enzimas muy importantes y recién conocidas, pues antes se pensaba que este efecto se llevaba a cabo por la acción conjunta de dos enzimas, una fosfocinasa, para fosforilar a una sustancia A (A + ATP A - ! + ADP) y una transferasa que pasaría y uniría esa sustancia A, con otra, B (A -! + B A - B + Pi ). A este grupo pertenecen enzimas de gran relevancia reciente, como las aminoácido -ARNt ligasas conocidas habitualmente con el nombre de sintetasas de aminoácidos -ARNt o enzimas activadoras de aminoácidos que representan el primer paso en el proceso biosintético de las proteínas, y que forman uniones C-O; las ácido-tiol ligasas, un ejemplo típico de las cuales es la acetil coenzima. A sintetasa, que forma acetil coenzima. A partir de ácido acético y coenzima A ; las ligasas ácido - amoniaco (glutamina sintetasa), y las ligasas ácido-aminoácido o sintetasas de péptidos, algunos de cuyos ejemplos más conocidos son la glutación sintetasa, la carnosina sintetasa, etc.

    La acción de estas enzimas se manifiesta con la formación de enlaces entre átomos de carbono y oxigeno de diversas moléculas, o bien entre carbono y azufre, carbono y nitrógeno y carbono y carbono. Las ligasas utilizan siempre, para el proceso de reacción, la energía proporcionada por el ATP o compuestos homólogos que son degradados, Por consiguiente las enzimas de esta clase son los únicos que intervienen en reacción no espontánea desde un punto de vista termodinámico; Actúan sobre los sustratos más diversos y revisten particular importancia en el metabolismo de los ácidos nucleicos.

    Estas reacciones enzimáticas se desarrollan en dos tiempos: en el primero se forma un complejo intermedio con potencia energética muy alta-, en el segundo utilizan la energía obtenida para realizar la reacción de síntesis.

    Grupo

    Accion

    ejemplos

    1. Oxidoreductasas

    Catalizan reacciones de oxidorreducción. Tras la acción catálica quedan modificados en su grado de oxidación por lo que debe ser transformados antes de volver a actuar de nuevo.

    Dehidrogenasas

    Aminooxidasa

    Deaminasas

    Catalasas

     

     

    2. Transferasas

    Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas moléculas)a otras sustancias receptoras. Suelen actuar en procesos de interconversiones de azucares, de aminoácidos, etc

    Transaldolasas

    Transcetolasas

    Transaminasas

    3. Hidrolasas

    Verifican reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de monómeros a partir de polímeros. Suele ser de tipo digestivo, por lo que normalmente actúan en primer lugar

    Glucosidasas

    Lipasas

    Peptidasas

    Esterasas

    Fosfatasas

    4. Isomerasas

    Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus isómeros de función o de posición. Suelen actuar en procesos de interconversion

    Isomerasas de azúcar

    Epimerasas

    Mutasas

    5. Liasas

    Realizan la degradación o síntesis (entonces se llaman sintetasas) de los enlaces denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de alto valor energético.

    Aldolasas

    Decarboxilasas

     

    6. Ligasas

    Realizan la degradación o síntesis de los enlaces fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas en energía como los nucleosidos del ATP

    Carboxilasas

    Peptidosintetasas

    10.Partes del sistema enzimatico

    Los sistemas enzimáticos en general, están formados por la enzima propiamente dicha (apoenzima), el sustrato o los sustratos un grupo proteico ( o coenzimas) y sustancias activadoras. La estructura formada por la apoenzima y la coenzima se denomina boloenzima; con cierta frecuencia se reconocen sistemas enzimaticos que no tienen grupo prostético o activadores reconocidos.

    Apoenzima: concepto del centro activo

    La apoenzima es la enzima propiamente dicha, de naturaleza proteica formada por cadenas de polipéptidos, con peso moléculas elevado, no dializable y termolábil.

    Las estudiadas analíticamente hasta ahora, han sido, por razones técnicas de peso molecular bajo, 12 a 24 000, tienen una sola cadena polipeptídica (ribonucleasa, papaina, tripsina, pepcina, etc.) excepto uno o dos casos (ð - quimotripsina y aldolasa) que tienen dos.

    El análisis de los aminoácidos que componen a diversas enzimas demuestran que tienen una estructura similar a la de cualquier proteína; existen, de hecho unos cuantos casos en los que se ha determinado su secuencia completa, es decir, el orden en el que están dispuestos todos ellos en la cadena. El análisis de la estructura secundaria de la proteína, osea el modo como la cadena peptídoica se dispone a lo largo de su eje mayor y el de la estructura terciaria, osea la forma en que la cadena se pliega y se acomoda para formar una estructura tridimensional se conocen muy mal para todas las enzimas. Solo en el caso de la lisozima (enzima presente en las lágrimas donde funciona como un antiséptico suave y que tiene la capacidad de atacar a los polisacáridos que forman la pared de diversas bactérias) se ha determinado la estructura tridimensional de una enzima; para este fin se aplican las técnicas de cristalografía de rayos x, con una solución de dos Å, lo que demostró que la lisosima es una proteína con su cadena de 129 aminoácidos ampliamente plegada y en la que se reconoce una hendidura representante del centro activo donde se acomodan muy bien los inhibidores - ciertos compuestos del tipo de carbohidratos - que nulifican su actividad enzimática. Se ha demostrado, en este caso, que es cierta regla general de que el modo como se ordenan y disponen los aminoácidos de termoina el arreglo espacial que permite a las otras partes del sistema enzimático - sustratos, cofactores, iones, etc. - adaptarse, en el espacio, en forma adecuada, para que se lleve a cabo la acción catalítica. Por lo tanto, las estructuras indispensables que permiten la combinación con el sustrato y que confieren propiedades enzimáticas a la molécula se denomina "centro activo". Se acepta que el centro activo no es una parte muy grande de la enzima completa y, en ciertos sistemas estudiados por medio de bloqueos químicos no parece constituir una zona de más de 20 Å de diámetro. Es muy posible que el centro activo esté formado por la contribución de grupos funcionales de aminoácidos situados en distintas cadenas o en diferentes repliegues de una cadena, asiendo aparecer a dichos grupos muy distantes entre ellos si se considera el orden que guardan a lo largo de la cadena polipeptídica.

    Un caso muy ilustrativo sobre lo que significa la estructura del centro activo desde el punto de vista de la composición de los aminoácidos es el de la triptofano pirrolasa, enzima ampliamente estudiada en bacterias desde el punto de vista de la bioquímica genética. En ella, la modificación de algunos aminoácidos produce perdida e la actividad enzimática, que se recupera si vuelve a incluirse los aminoácidos en el orden original; sin embargo, se pueden reemplazar dos de ellos por otros completamente distintos, y la enzima vuelve a ser totalmente activa. Es posible que con estos nuevos aminoácidos se consigan también las condiciones de distribución espacial de grupos funcionales y estructuras necesarias para la actividad enzimática.

    El concepto de arreglo tridimensional adecuado de los aminoácidos que forman la cadena polipeptídica de la enzima para lograr la actividad funcional correcta permite entender numerosos denómenos: la necesidad de que la molécula proteica íntegra esté preservada en su forma; el hecho de que la desnaturalización de la enzima al permitir la separación de los pliegues, conduce a la perdida de la actividad enzimática; que al calentar una enzima con su sustrato (por ejemplo, la invertasa con sacaroza, la transaminasa con ácido ð -cetoglutárico), se impide una desnaturalización que sin ellos se produciría, pues es posible que el propio sustrato contribuya a sostener y reforzar la aproximación de los pliegues de la cadena, etc.

    También se entiende por que al atacar la ribonucleasa con pepsina y romper una sola unión peptídica que separa un tetrapéptido del extremo con grupo carboxilo libre se pierde la actividad, mientras que si solo se quita los tres últimos disminuye su acción sugiriendo así la importancia del residuo de ácido aspártico para sostener el centro activo en condiciones de eficiencia, o lo que es más probable, para formar parte del propio centro activo. Si se parte la ribonucleasa entre los aminoácidos 20 y 21, y se separan los dos fragmentos, ninguno es activo, pero basta mezclarlos para que se unan en tal forma que se restablece la actividad, aunque un poco menor que la originalmente observada.

    El estudio detallado de la estructura del centro activo se hace por medio de inhibidores o de reactivos que se combinan de modo específico, con algunos de los aminoácidos del centro activo tales como el diisopropilfluorofosfato (DFP), que se combina con el OH del aminoácido serina, en diversas esterasas, peptidasas, etc. , e inactiva el centro activo del que forman parte dicho aminoácido; este inhibidor, aún a concentraciones de 10-10 M, inhibe a la acetilcolinesterasa; mucho de los derivados del DFP se utilizan como gases de guerra o como insecticidas (parathion), y su utilidad se debe, en rigor a su capacidad para destruir funcionalmente ciertas enzimas.

    La unión del DFP al aminoácido cedina es muy estrecha y a permitido el análisis de los aminoácidos vecinos a él, haciendo un estudio de su ordenamiento en el centro activo. La secuencia de los centros activos de diversas enzimas hidrolíticas sensibles al DFP, se demuestran que la mayoría tienen cerina y a demás un aminoácido dicarboxílico (aspártico o glutámico) y en el otro un aminoácido neutro (alanina o glicina). También se ha demostrado que la histidina, cuando menos para el caso de la quimotripsina, forma parte del centro activo aún cuando el análisis de la secuencia no demuestra que exista cerca de la cerina ninguna histidina; se trata, por lo tanto, de otro ejemplo de una aminoácido, alejado e otro, y en distinto pliegue de la cadena, que integra el centro activo.

    Teniendo en cuenta estos hechos, se deduce, por lo tanto, que la actividad de la enzima depende en parte de la disposición o arreglos de los aminoácidos y grupos prostéticos en determinada región de la proteína. Los aminoácidos que componen a las proteínas pueden tener moderadas actividades catalíticas, aunque de ninguna manera comparable en su magnitud, cuando se les considera en forma aislada, a las que muestran la gran molécula proteica. De hecho para muchos sistemas enzimáticos se han ideado modelos análogos, osea sustancias químicas sencillas que suelen reproducir los efectos ocasionados por la enzima, tal es el caso de los análogos, a base de piridoxsal que representan la parte activa de enzimas descarboxilantes y transaminantes. Esto no significa que necesariamente, en el estado natural, la enzima funcione como lo hace el análogo pues muchos sistemas pudieran tener otro mecanismo de operación; la hidrólisis del almidón lo mismo se logra con la adición del ácido que con la enzima específica amilasa, aún cuando en el primer caso se atacan indiscriminadamente numerosas uniones glucosídicas, y con la enzima, en cambio solo se desprenden, uno tras otro fragmentos de dos unidades de glucosa de los extremos de las ramificaciones.

    • Conformación de la enzima y propiedades del centro activo. La propiedad catalítica de las enzimas parece depender de la facilidad con la que ayudan a que se pongan en contacto las sustancias reaccionantes para dar el producto o los productos de la reacción. Esto implica que el sistema enzimático tenga una conformación especial osea, una disposición adecuada de os grupos funcionales - aminoácidos de la apoenzima y grupos prostéticos, cuando existen estos - y de las moléculas mismas de los sustratos que se unirán a aquellos y permitirán que se lleve a cabo la reacción química. Este acercamiento de las sustancias reaccionantes de los grupos prostéticos y los grupos funcionales fue las razón del modelo de Ehrlich, conocido clásicamente como de la "llave y la cerradura". Así la enzima sería un molde tridimensional en negativo, de la estructura también tridimensional, en positivo de los reaccionantes que se adaptarían perfectamente a ala disposición de la enzima. Sin embargo ha sido necesario reconsiderar esta situación y sugerir - de acuerdo con Koshland - la teoría de un "acomodo inducido".

    Así las enzimas pueden sufrir un cambio en su estructura desde el momento en que entran en contacto con los reaccionantes, sustratos y cofactores, y es posible que todos ellos modifiquen el arreglo tridimensional de la enzima; la enzima los recibe en un orden determinado y cada uno de ellos al unirse a la enzima modifica su estructura. La nueva analogía es la del "guante y la mano"; aquel no representa una estructura de negativo tridimensional mientras no se halla la mano en el, ya que antes pueden tener diversas formas y disposiciones, una vez que ha entrado la mano - que a su vez también puede adoptar distintas posiciones - se ponen en contacto todas las partes correspondientes, es decir, en el caso de la enzima, las partes reactivas del sistema enzimático, con las partes reaccionantes, osea los sustratos. Se ha preservado con esta nueva idea, el aspecto de la armonía estructural entre el sustrato y la enzima pero se introduce el nuevo concepto de que es necesario provocar un cambio en la estructura proteica que favorezca la colocación adecuada de todos los elementos que interviene en la reacción enzimática. Los cambios de la estructura protéica se denominan "conformacionales". El cambio en la disposición tridimensional puede hacerse a distancia y en muchas ocasiones la unión del sustrato a una parte de la enzima modifica otras zonas de ella y aún su estructura completa, debido a plegamientos que acercan o alejan diversos grupos colocados a lo largo del péptido que forma la enzima. Esta alteración múltiple y de tipo flexible, permite entender mejor el proceso de entrada ordenada de los sustratos, y los cofactores y la reacción en la que se participan. También permiten comprender porque un sustrato entra a una enzima y es atacado y uno que no lo es aún muy parecido a él, puede quedar excluido del centro activo.

    Se ejemplifican estas ideas en A se encuentra la enzima en una forma desplegada con ciertos grupos reactivos (+) y (-), colocados en una zona de la superficie de la enzima. La entrada de un cofactor F1, modifica una parte del sistema (B); se introduce en el sistema un nuevo arreglo a base de la reactividad de tipo electrónico entre la zona (+) y una parte del cofactor F1, recién introducido; por fin la entrada de un nuevo reaccionate F2 modifica la parte terminal de la enzima de manera que permite la entrada del otro reaccionante (sustrato) que se acomoda en un lugar preparado previamente por los reaccionantes F1 y F2, y permite de esta manera echar a andar la reacción catalítica. Los cambios conformacionales, se pueden demostrar con diversos métodos algunos de tipo físico, como son las modificaciones en la rotación óptica o en el patrón de sedimentación en el campo gravitacional de la ultracentrífuga, o químicos como el aumento o la disminución de la actividad enzimática bajo la influencia de cambios térmicos o la adición de agentes desnaturalizantes. Basten unos cuantos ejemplos: la transaminasa ð -cetoglutárica se pude calentar a 65ð C. en presencia de su sustrato sin que se afecte, al paso que la enzima sola es rápidamente degradada, cambia de configuración y se precipita; la miosina, proteína muscular contráctil, en presencia de ATP hace más notable su forma de espiral y permite el reconocimiento de aminoácidos previamente ocultos en sus pliegues; la D-amino oxidasa, al unirse a su cofactor, el FAD, pasa de la forma espiral en ð -hélice, a una disposición irregular distribuida al azar.

    11. Coenzima y grupos prostéticos

    Aparte del sustrato, cuya transformación será condicionada por la enzima, existe otra parte del sistema enzimático, de peso moléculas bajo y por lo tanto dializable, termostable y en general, no protéica, adherida de mas o menos laxa a la apoenzima y a la cual se le llama grupo prostético, si está muy intimanente ligada a la apoenzima - como es el caso del núcleo porfirínico de numerosas oxidasas o la estructura flavínica de la deshidrogenasa succínica - o coenzima cuando la unión es débil y se separan fácilmente, como por ejemplo el DPN y el TPN que asisten a las funciones de varias deshidrogenasas. Es muy grande la importancia del grupo prostético o de la coenzima desde el punto de vista funcional pues suelen ceder y recibir alternadamente parte de los productos de la reacción. Por ejemplo en las reacciones de oxido - reducción los hidrógenos desprendidos de un sustrato deben ser captados por una sustancia con lo que se expulsa al sustrato oxidado y es posible recibir una nueva molécula del sustrato con hidrógenos. Tal sustancia es una coenzima, como el DPN, el TPN, el FAD, etc., que, a su vez, suele cederlos a una tercera sustancia o, cuando las reacciones son reversibles los pasan al sustrato oxidado para reducirlo. Algunos autores denominan cosustratos a estos agrupamientos coenzimáticos para hacer énfasis en su carácter reversible, no catalítico y equimolecular con respecto al sustrato. Una proporción de las vitaminas forman parte de moléculas mas complejas que funcionan como coenzimas en diversas reacciones.

    • Muchas enzimas requieren una coenzima

    Muchas enzimas que catalizan la transferencia de grupos y otras reacciones requieren, además de su sustrato, una segunda molécula orgánica conocida como coenzima sin la cual son inactivas. Para distinguirlas de iones metálicos activadores y de las enzimas mismas, las coenzimas se definen como compuestos orgánicos termoestable, de peso molecular bajo, requeridas para la actividad de las enzimas. La mayor parte de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerza no covalentes. Las que forman enlace covalentes con las enzimas se denominan también grupos prostéticos.

    Entre las reacciones que requieren coenzimas están las oxidorreducciones, las reacciones de transferencia de grupo e isomerización y las reacciones que forman enlaces covalentes (claves 1,2,5 y 6;IUB). Las reacciones líticas que comprenden reacciones hidrolíticas catalizadas por enzimas digestivas no requieren de coenzimas.

    • Las coenzimas pueden considerarse como segundo sustrato

    La coenzima puede considerarse como un segundo sustrato o cosustrato por dos razones. En primer lugar, los cambios químicos en la coenzima compensa exactamente a los que realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones o oxidorreducción (deshidrogenasa), una molécula de sustrato es oxidasa y una molécula de coenzima es reducida.

    Una segunda razón para dar igual énfasis a las reacciones de la coenzima es que, en realidad, este aspecto de la reacción es el que puede ser de significado fisiológico fundamental. Por ejemplo, la importancia de la capacidad del músculo que trabaja en condiciones anaerobias para convertir el piruvato en lactato no residen en el piruvato ni en el lactato.

    La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima reducida NADH a NAD+. Sin NAD+ la glucólisis no puede continuar y la síntesis anaerobias de ATP (y por tanto, el trabajo) tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reducción del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la síntesis de ATP. Otras reacciones pueden servir igualmente bien. Por ejemplo, en las bacterias o levaduras que crecen en medio anaerobio, algunos metabolitos derivados del piruvato son utilizados como oxidante para el NADH y son reducidos en el proceso.

    • Las coenzimas funcionan como reactivos en la transferencia de grupos

    Las reacciones bioquímicas de transferencia de grupo del tipo.

    D - G + A = A - G + D

    En la cual un grupo funcional, G es transferido de una molécula denadora, D-G, a una molécula aceptora, A, por lo general comprende la participación de una coenzima como último aceptor (por ejemplo, reacciones de dehidrogenación) o como portador intermediario del grupo (por ejemplo, reacciones de transaminación). El esquema siguiente muestra el último concepto.

    D-H CoE A-G

    D CoE-G A

    Aunque estos sugiere la formación de un complejo sencillo CoE-G, durante el curso de la reacción global, pueden intervenir varios complejos intermediarios CoE-G en una reacción particular (por ejemplo, transaminación).

    Cuando el grupo transferido es el hidrógeno, es costumbre representar sólo la "mitad izquierda de la reacción":

    D-H CoE

    D CoE-H

    Que esto representa en realidad sólo un caso especial de la transferencia general de grupos puede apreciarse mejor en términos de las reacciones que ocurren en las células intactas. Se pueden representar de las siguientes manera:

    D-H CoE A-H

    D CoE-H A

    • Las coenzimas pueden clasificarse de acuerdo al grupo cuya transferencia facilitan

    Basándose en este concepto podría clasificarse a las coenzimas como sigue:

    Para la transferencia de grupos distintos del hidrógeno:

    • Fosfatos de azúcares

    • CoASH

    • Pirofosfato de tiamina.

    • Fosfato de piridoxal

    • Coenzimas del folato

    • Biotina

    • Coenzimas de cobamida (B12)

    • Ácido lipoico

    • Para la transferencia del hidrógeno:

    • NAD+, DADP+

    • FMN, FAD.

    • Ácido lipoico

    • Coenzima Q.

    -Muchas coenzimas derivan de vitamina B y del monofosfato de adenosina

    Las vitaminas B forman parte de la estructura de numerosas coenzimas. Las vitaminas B; nicotinamida, tiamina, riboflavina y ácido pantoténico son constituyentes esenciales de las coenzimas para las oxidaciones y las reducciones biológicas y las coenzimas ácido fólico y cobamida funcionan en el metabolismo de compuestos de un solo carbono. Numerosas coenzimas contienen adenina, ribosa y fosfato y se derivan del monofosfato de adenosina AMP. Los ejemplos incluyen NAD+ y NADP+

    12. Activadores

    Las enzimas son catalizadores orgánicos que disminuyen la barrera denominada energía de activación; y por tanto facilitan el que se inicie una reacción. Este proceso implica el trabajo necesario para poner a dos moléculas en un contacto lo suficientemente estrecho como para que reaccionen; además, el trabajo debe realizarce sobre la unión química - una con covalencia en sentido estricto - para que pueda romperse y formar otros compuestos. Las enzimas, como muchos catalizadores, son partículas de gran superficie y muestran que tienen capacidad para atraer y captar diversas moléculas. Cualquier factor que permita por una parte atraer al sustrato a su centro activo se pude considerar como un activador, además algo que permita la rápida salida de los productos también pude considerarse como un activador. Asi se reconocen diversas posibilidades:

    • Activación iónica. Numerosos metales monodivalentes son necesarios para la actividad enzimática de diversos sistemas. Destacan entre ellos los siguientes: K+, Mn++, Mg++, Ca++, Fe+++, Cu+, Cu++, etc. A menudo el metal, a estas condiciones, es el centro que permite la unión conjunta del sustrato, de la coenzima y de la misma apoenzima con la que forma quelatos (de chelos, garra; complejos moleculares sostenidos por un metal) al unirse con grupos cargados electricamente. Muy amenudo se demuestra que es posible sustituir los metales divalentes entre ellos, sin grandes modificaciones de la velocidad de la reacción.

    Los metales como el hierro, el cobre y el molibdeno, actúan a menudo como transportadores de electrones y no se les puede considerar activadores en el sentido estricto pues forman parte integral del grupo prostético. Algunos aniones también son necesarios para la actividad de ciertas enzimas; bien conocido es el caso del Cl-, el que puede sustituirse, a un cuando con baja de la velocidad, por Br-, para la amilasa salival; o el propio radical fosfato que se requiere en reacciones de fosforilación.

    • Activación por el grupo prostético. En determinadas reacciones estos son indispensables para el trabajo de la enzima y constituyen, en rigor, la parte funcional activa del sistema.

    • Activación de la apoenzima. Consisite en la obtención de una correcta estructura del centro activo de la proteina con actividad enzimática, ya referido anteriormente.

     

    • Integridad de los grupos funcionales del centro activo. Destaca la relacionada con los grupos sulfhidrilo, -SH. Cualquier alteración química que los destruya, bloquee u oxide a disulfuro, -S-S-, puede inactivar a las enzimas. Esto puede suceder incluso en las suaves condiciones del trabajo celular por exposición a agentes oxidantes o al oxigeno mismo, aunque puede lograrse por el efecto de sustancias que los ataquen y que combinen con ellos como la yodacetamida. En otras ocaciones la destrucción de los grupos -SH, aun la distancia del centro activo modifica de tal manera la estructura tridimencional de la enzima que el centro activo se deforma al grado de que no puede llevar a efecto su acción sobre las sustancias reaccionantes. Existen otros grupos funcionales cuyo bloqueo acaba por completo con la actividad enzimatica; en tal caso estaría la acción de inhibidores o venenos enzimáticos.

    • Medida de la actividad enzimática. Aparte del problema de medir las pequeñísimas cantidades de enzimas presentes en los tejidos; muy pocas de ellas poseen características químicas o espectroscópicas particulares que permita medirlas directamente. En general, las enzimas se cuantean siguiendo la actividad de la reacción que catalizan y se aceptan, en principio que dicha actividad es proporcional a la cantidad de enzima presente. Como la actividad de un enzimas sólo rara vez se puede expresar en relación a su peso absoluto o a la molaridad de la enzima, lo habitual es expresarla en "unidades" fijadas de modo convencional con relación a la proteina presente en la preparación.

    La actividad enzimática se mide por la desaparición del sustrato o la aparición de alguno de los productos de la reacción, siguiendo dichos cambios en el tiempo. Sin embargo, las condiciones del sistema no son uniformes a lo largo del tiempo: el grado de saturación de la enzima con el sustrato cambia constantemente, los productos que aparecen suelen inhibir a la enzima o se presentan modificaciones del pH que afectan a la reacción, etc. Para evitar estos problemas se hace la medida de la velocidad inicial, tomando en cuenta solo el comienzo, en forma de línea recta de la gráfica, lo que sucede en general cuando se ha consumido no más de una cuarta parte del sustrato.

    La actividad puede espresarce, una vez determinada la reacción, en relación con el tiempo empleado por la enzima para producir un cambio determinado; mientras mayor sea el tiempo, la actividad de la enzima es menor. Por lo tanto, la recíproca del tiempo (la inversa del tiempo osea el valor que resulta de dividir la unidad sobre el tiempo, 1/T) es una medida de la actividad enzimática.

    13. Las enzimas son catalizadores estereoespecíficos

    Casi todos los sustratos forman por lo menos tres enlaces con las enzimas. Esta adherencia en tres puntos pueden conferir asimetría a una molécula por otro lado simétrica. La figura * muestra una molécula de sustrato, representada como un átomo de carbono que tiene tres grupos diferentes, próximos a adherirse en tres puntos a un sitio de la enzima. Si el sitio puede ser alcanzado sólo desde un lado y únicamente los átomos complementarios y los silios pueden interactuar (ambos suposiciones válidas para las enzimas reales), la molécula se unirá sólo en una forma. La reacción misma puede estar confinada a los átomos unidos en los sitios 1 y 2 aún, cuando los átomos 1 y3 sean idénticos. Girando mentalmente la molécula de sustrato en el espacio, nótese que puede adherirse en tres puntos a un costado del sitio planar con una sola orientación. En consecuencia, los átomos 1 y 3 aunque sean idénticos viene a ser distintos cuando el sustrato está adherido a la enzima. Por tanto, un cambio químico puede afectar el átomo uno (pero no al átomo tres) o viceversa. Esto puede explicar el porqué la reducción, catalizada enzimáticamente de la molécula del piruvato ópticamente inactiva, forma L- y no D,L-lactato.

    14. Especificidad enzimática

    Los distintos grupos de enzimas muestran variaciones considerables en su grado de especificidad. Algunas de ellas muestran requerimientos estrictos tanto para el sustrato (o los sustratos si se trata de reacciones bimoleculares) como para el tipo de unión química sobre el que van a actuar; pequeños cambios en cualquiera de ellos bastán para inactivar la reacción; tal es el caso de la mayoría de las enzimas. En otras ocaciones, la deshidrogenasa alcohólica, que funciona con DPN como coenzima, es absolutamente específica para el DPN, pero pude actuar sobre diversos alcoholes aparte del etílico que es su sustrato característico. Asi mismo, las enterasas, las fosfatasas y ciertas peptidasas a menudo solo son específicas para el tipo de unión atacada - éster, peptídica, etc. - y no requieren estructuras definidas en el sustrato, a ambos lados de la unión. Hay ejemplo de especificidad doble: la xantina oxidasa, altamente específica para la xantina a la que convierte en ácido úrico, y por otro lado muy activa, pero en forma inespecífica, al mostrar gran capacidad para mostrar la activación de gran variedad de aldehidos.

    El requisito de estereoespecificidad para los sustratos es muy importante. Las enzimas que habitualmente atacan a los azúcares naturales con configuración D-, no lo hacen sobre sus isómeros artificiales L-; las enzimas tan activas en la naturaleza sobre los aminoácidos comunes tipo L- so inactivas para los aminoácidos artificiales (o muy raros en los organismos vivos) de tipo D-. Esto es tan absoluto que cuando existen mezclas racémicas de isómeros D- y L-, un método conveniente de separarlas, es el de dejar que actue sobre ellas una enzima que degradará exclusivamente a uno de los dos isómeros dejando al otro intacto.

    Cuando el sustrato es simétrico y el producto es asimétrico, la enzima provoca, específicamente, la formación de uno solo de los productos asimétricos, aquel para el que la enzima es activa; tal es el caso de la deshidrogenasa láctica que, al actuar sobre el ácido pirúvico (simétrico) produce exclusivamente ácido D-láctico y no ácido L-láctico, y el de la deshidrogenasa glutámica que al atacar el ácido ð -cetoglutárico produce solo ácido L-glutámico:

    CH3 CH3

    | |

     

    C = O HCOH

    | |

    COOH COOH

    Ácido pirúvico Ácido D-láctico

    Existen otras formas de isomerismo geométrico aparte del isomerismo D-, L-, suceptibles de ser reconocidas por enzimas. Tal es la situación de los isómeros cis - trans en que solo uno de los tipos del par es atacado. La fumarasa introduce una molécula de agua en el ácido fumárico trans, pero el isómero cis, o sea el ácido maleico, no es atacado.

    H - C - COOH H - C - COOH

    HOOC - C - H H - C - COOH

    Ácido fumárico (trans) Ácido maléico (cis)

    Las enzimas también pueden distinguir moléculas que desde el puntod e vista estructural, como compuestos químicos, son identicas. Por ejemplo, la glicerol cinasa, por medio de ATP, convierte al glicerol en L-grlicerol - 3- fosfato, osea produce su fosforilación, pero exclusivamente en la posición 3, hecho que se ha demostrado con glicerol marcado con C radiactio, C14, en las dos posiciones posibles 1 y 3.

    Los mismo sucede con el ácido cítrico que al ser oxidado y descarboxilado hasta producir ácido ð -cetoglutárico adquiere un grupo -C=O, en uno de los lados de la molécula, quimicamente simétrica. Esta capacidad de la enzima para reconocer el sustrato obedece a que debe tener por lo menos tres grupos químicos orientados en el espaciod e tal modo que el sustrato, aunque en apariencia simétrico, solo puede adaptarse por completo a la enzima en una sola posición. De todo esto se desprende por el sustrato a los sustratos necesitan tener un patrón peculiar de grupos químicos, específicos para cada enzima particular, de modo que se adapte perfectamente a su centro activo; mientras mayor y más complejo sea este requerimiento mayor será la especificidad de la enzima.

    15. Preparación y purificación de las enzimas

    Aun cuando se sabe que las propiedades de las enzimas in situ puden ser muy diferentes a las de las enzimas puras estudiadas en el laboratorio, está plenamente justificada la necesidad de tener preparaciones puras para hacer el estudio químico completo de su actividad. En la actualidad se han cristalizado o purificado de manera adecuada cerca de unas 200 enzimas (del posible total de unas 5000 ) y quizas en los próximos años aumente de modo considerable este número.

    Para extraer las enzimas de las células que las contienen, a menudo es necesario dividir finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los tratamientos más enérgicos comprenden la molienda del tejido con arena el empleo de vibraciones ultrasónicas, los procesos alternados de congelamiento y descongelamiento, la autolísis , el desecado con calor o el emmpleo de solventes como la caetona, el éter y el tolueno. El desecado con acetona y la producción de los llamados polvos acetónicos constituyen un excelente ejemplo de rotura de la menbrana celualr y la obtención de un material rico en enzimas y de fácil concervación. Cuando las enziams están asociadas a lípidos, como sucede con als enzimas mitocondriales, es ventajoso el tratamiento con sustancias de tipo detergente o con butanol que disgregan la estructura lipoprotéica y permiten la salida de las enzimas.

    La purificación de las enzimas con método de precipitación fraccionada recurre a diversos procedimientos, el cambio de pH quita las nucleoproteínas y el material grueso, con lo que se facilitan los pasos siguientes. Con el empleo del calor a veces se logra la desnaturalización de material protéico inactivo; por ejemplo, en la purificación de la transaminasa se añade el sustrato de la enzima - ácido ð - cetoglutárico - al homogenado y se calienta hasta 65ð C, con lo que muchas enzimas se desnaturalizan y precipitan, lo que no sucede con la transaminasa así protegida.

    En otros casos se emplean solventes orgánicos como el etanol, muy utilizado para separar diversas proteínas del suelo sanguíneo y la caetona; o las sales, como el sulfato de amonio, que es muy soluble en agua, por lo que se puede manejar a elevadas concentraciones, y en general no ataca la estructura de las enzimas. la absorción fraccional tiene gran utilidad para absorver gran material indeseable o para absorber la enzima y luego desprenderla del material absorbente en una forma más pura; muy usado con este fin en el gel de aluminio C.

    En los últimos años se han logrado adelantos notables en materia de fraccionamiento protéico con el empleo de técnicas coromatográficas en columnas que se basan en fenómenos de absorción, de intercambio iónoco o de una verdadera "filtración molecular". Se agraga a una columna con el material activo la solución de la enzima que queda fijada a dicho material; se lava la columna con soluciones de sales, cada vez más concentradas o con distinto pH, etc. , y se recogen los lavados en fracciones de volúmenes determinadas; en alguna porción sale la enzima en estudio, en forma más pura. Los materiales más usados para este fin son ciertas formas de fosfato de calcio - hidroxiapatita -, resians de intercambio iónico, como las Amberlitas o las Dowex (aunque tienen el inconveniente de desnaturalizar a las proteínas y de tener poca superficie útil) y diversos derivados de la celulosa, tales como la dietilaminoetil celulosa (DEAE - celulosa) y la carboximetil celulosa (CM - celulosa). Ejemplos de los filtros moleculares lo constituye el material que está compuestod e un polisacárido que forma una rejilla tridimensional, el Sephadex, que puede retener proteínas con peso molecular aproximado de 25 000 hasta 200 000 según el tipo que se emplee.

    El paso final de la purificación es el de la cristalización de la enzima que debe repetirse varias veces pues los primeros cristales suelen estar contaminados con otras enzimas. A pesar de esto, la obtención de cristales no demustra que la enzima esté 100% pura, es solo obtención de una actividad específica de un valor constante ante las recristalizaciones repetidas la que ofrece la seguridad de su pureza.

    El estudio de la pureza de una enzima comprende la aplicación de las técnicas empleadas para el estudio de la pureza de las porteínas, el análisis por ultracentrífuga, el análisis el electroforético, etc. Sin embargo, aún es podsible, si se somete la enzima a fraccionamientos más sensitivos, como losd e la electroforésis en gel de agar, de almidón, o de acrilamida demostrar que la enzima en cuestión puede estar formada por varias proteínas, algunas de las cuales tienen la misma actividad enzimática, pero que por tener propiedades físicas o estructurales diferentes se deben considerar como isoenzimas, y otras que son proteinas que se han procesado a lo largod e todas las etapas de purificación.

    En general las enziams se consideran especies químicas homogéneas y puras cuando llenan requisitos como los siguientes: su actividad no debe aumentar después de que se la recristaliza repetidas veces; su solubilidad no aumenta al elevar la cantidad de cristales de la proteína problema que se pone en solución; tanto en el análisis realizado con la ultracentrífuga como en los diversos métodos electroforéticos se encuentra un patrón de mobilidad único y persistente.

    16. Isoenzimas

    Al hacer el estudio electroforético del suero humano normal y hacer un revelado de la actividad de la deshidrogenasa láctica se encontró distribuida en cinco bandas diferentes; se llegó así al concepto que es posible que en un tipo de tejido existan diversas y múltiples formas moleculares de una enzima, a las que se denominan isoenzimas. Son por lo tanto proteínas con actividad catalítica que favorece la misma reacción pero que pueden distinguirse por alguna característica física, estructural, inmunológica, etc. En el ejemplo antereior sus diferencias se rejistraron en la velocidad de migración electroforética. En otras ocaciones la diferencia eside en las propiedades cinéticas; por ejemplo, existen dos deshidrogenásas málicas que catalizan la misma reacción; sin embargo, actuan de modo distinto cuando se les pone en contacto con los análogos artificiales del DPN y, además, una es de origen mitocondrial, la otra se encuentra en el sobrenadante celular.

    Sin embargo, este concepto tiene sus limitaciones; el caso de la deshidrogenasa láctica es muy ilustrativo. Esta enzima se diferencia en 5 isienzimas denominadas I, II, III, IV y V que parecen ser características de distintos tejidos; en el corazón dominan el I y la II, el higado tiene un predominio de la V, etc. al tratar la enzima -que pesa 135 000 - con úrea o guanidina, su molécula se fragmenta en cuatro porciones, cada una de las cuales tiene un peso molecular de unos 35 000. Las cinco isoenzimas comunes de la hidrogenasa láctica parecen sermezclas de dos tipos básicos A y B, o H (de "heart", corazón) y de m (músculo) de la siguiente manera:

    HHHH Tipo I, miocárdico, H

    HHHM Tipo II

    HHMM Tipo III

    HMMM Tipo IV

    MMMM Tipo V, muscular, M

    Se ha confirmado inmunológicamente su presencia; los anticuerpos preparados contra ambas moléculas originales H o M nomuestran reacción cruzada entre si, pero si reaccionan con los híbridos formados de H y de M. Del mismo modo, muestran diferencias considerables en su composición de aminoácidos.

    No solo las características fisicoquímicas son diferentes; quizá aun más importante sea el aspecto funcional. La actividad de las deshidrogenasas lácticas ante sus sustratos normales, lactato, piruvato, y ante los análogos del DPN indican el papel de la enzima en la regulación de las relaciones DPN/DPNH2, que a su vez, regulan funciones celulares importantes. Es muy notable la diferencia en la inhibición producida por un exceso de piruvato sugerente de que, en rigor, la enzima tipo M o V funciona más bien como una reductasa del piruvato. Esta forma (M o V) es muy útil en los músculos voluntarios que presentan demandas bruscas de energía proporcionadas por la glucólisis, o en tejidos con poco oxígeno (anaerobiosis). Por el contrario la tipo H (I) funcionan preferentemente en músculos que deben realizar un ejercicio sostenido y en los que las necesidades energéticas se satisfacen por medio de un metabolismo aeróbico intenso; este tipo, por lo tanto, está capacitado, funcionalmente, para lograr una mayor exidación del lactato a ácido pirúvuco.

    La distribución de la enzima con respecto a la aerobiosis (o anaerobiosos) del tejido se ha comprobado en varios casos: la de tipo H (I) es más abundante en la corteza renal (cerca de 100%) que en la médula (50%) en las papilas (10%), en razón directa con el grado deaerobiosis de esas zonas renales. Lo mismo sucede con músculos de un mismo animal; si tienen que trabajar constantemente muestran grandes proporciones de la forma H (I), como el dorsal ancho de las gallinas que casi en el 100% muestran dicha forma; el pectoral, en cambio tiene menos del uno por ciento de ella, en cambio, en los pectorales de las aves migratorias que deben sostener por horas y aun días, esfuerzoz extraordinarios, aparece nuevamente la forma H (I) de preferencia a la M (V).

    Es obio que cuando son muy marcadas las diferencias de pesos moleculares, composición de aminoácidos, características cineticas y otras propiedades físicas, es dificil hablar de isoenzimas; más conveniente es considerarlas entonces como enzimas distintas que simplemente catalizan la misma reacción reservando el término de isoenzima para aquellas situaciones como la de la deshidrogenasa láctica que representan agregados híbridos de composición relativamente parecida.

    17. Cinetica de las reacciones enzimaticas

    Aunque las leyes generales de la catálisis debieran ser válidas para las enzimas, el hecho de que éstas sean sustancias complejas, de alto peso molecular, de tamaño coloidal y de composición difícil de precisar, impide la aplicación de dichas leyes de una manera estricta; por ejemplo, su tamaño coloidal puede causar fenómenos de adsorción o diversas reacciones debidas a sus numerosas cargas eléctricas. No obstante, los factores que afectan la velocidad de la reacción enzimática son los ya señalados a propósito de las reacciones químicas en general, como la temperatura y las concentraciones de las sustancias reaccionantes que, en este caso particular, son la enzima el sustrato. Además intervienen el PH medio donde se realiza la reacción, la presencia de los productos de la reacción, y otros factores secundarios como las radiaciones y los efectos óxido - reductores.

    18. Relaciones entre la enzima y el sustrato.

    Es universalmente aceptado, que la enzima, como todo catalizador, participa de una manera activa en la reacción. Existen pruebas experimentales de esta situación cuando menos para algunos.

    Un ejemplo bien conocido es el de la peroxidasa que, en presencia de peróxido de hidrógeno, H2O2, y un acceptor de hidrógeno adecuado, produce la reducción del H2O2, . La peroxidasa en ausencia de H2O2 muestras unas bandas de absorción características en el espectro visible; cuando se combina con el H2O2 , pero sin que exista el acceptor de los hidrógenos, aparece una nueva distribución de las bandas. Si se permite el paso de los hidrógenos a un acceptor, automáticamente desaparecen las bandas nuevas y reaparecen las originales de peroxidasa.

    Se acepta corrientemente una hipótesis propuesta por Michaelis para explicar la actividad enzimática, sobre la base de la información de un compuesto de la enzima con el sustrato (complejo enzima - sustrato), previamente al ataque del sustrato por la enzima y a la liberación de los productos de la reacción. El desarrollo matemático que permitió a Michaelis formular su hipótesis, estuvo acorde con los datos experimentales obtenidos una vez vencidos los enormes obstáculos de orden técnico para llevar a cabo la confirmación de la teoría en el laboratorio.

    Si se hace el estudio de la actividad de una enzima en relación con la concentración de sustrato. En ella se registran, en las abscisas, la cantidad creciente de sustrato y, en las ordenadas, la cantidad de uno de los productos de la reacción liberada de un tiempo dado, que expresa, en rigor, la actividad de la enzima. La curva obtenida es la de una hipérbola rectangular, la cual tiene algunas propiedades interesantes; por ejemplo, la velocidad límite o velocidad máxima, es el valor que trata de alcanzar la curva a medida que se aumenta el sustrato y que, en la figura, está señalada con la línea V. Existe un punto, fijado arbitrariamente, en el que la mitad de la velocidad límite corresponde a una concentración específica del sustrato; esta concentración de sustrato se representa habitualmente como KM, y se denomina constante de Michaelis, valor característico para un par - enzima - sustrato y que, por lo tanto, es la concentración de sustrato con la cual se alcanza la mitad de la velocidad límite o velocidad máxima de la reacción. Los resultados obtenidos experimentalmente concuerdan con los derivados de modo matemático, sobre la hipótesis de formación de un complejo enzima - sustrato.

    La constante de Michaelis, KM, indica en términos generales, las relaciones de afinidad entre el sustrato y la enzima; un KM, implica la necesidad de una alta concentración de sustrato que, al combinarse con una enzima, produzca la mitad de la velocidad máxima, o sea, que la afinidad por la enzima y sustrato es pobre; por el contrario, si la concentración de sustrato que se requiere para alcanzar la mitad de la velocidad es muy pequeña (KM pequeña), quiere decir que el sustrato tiene una gran afinidad por la enzima.

    En ocasiones, la misma enzima puede ser más afín a un sustrato que a otro; por ejemplo, la sacarasa es 16 veces más activa para atacar a la sacarosa que a la rafinosa. Se conocen con exactitud los valores de KM para muchos sustratos y enzimas, con los siguientes: la pepsina, actuando sobre albúmina, de huevo: KM de 4.5. por ciento; la tripsina sobre la caseína :KM de 2 por ciento; la amilasa sobre el almidón en presencia de Cl - : KM de 0.4 por ciento ; la sacarasa de levadura, sobre la sacarosa : KM 0.016 a 0.04 M, etc.

    La explicación de la curva hiperbólica que implica la formación del complejo enzima - sustrato parece depender de la existencia física, en la enzima, de determinados sitios donde se absorbe el sustrato para ser activado. Al principio de la curva se puede aumentar la concentración del sustrato y la enzima es capaz de activarlo con toda eficiencia; pero como una vez activado el sustrato se separa en forma de los productos, y la velocidad con la que éstos se separan no es igual a la velocidad con la que captado el sustrato, y en vista de la cantidad creciente del sustrato, la línea obtenida no es una recta, sino la curva señalada. Cuando la cantidad de sustrato ha sobrepasado la capacidad física de la enzima para recibirlo y poder transformarlo, la curva alcanza una meseta, lo que significa que la reacción prosigue a la misma velocidad, independientemente de la cantidad de sustrato adicionada. De acuerdo con los términos ligados a la velocidad de reacción, expresados en la página 36, se encuentra que, al principio del experimento, la reacción depende exclusivamente de la concentración del sustrato y se trata de una reacción de primer orden; al final de ella, cuando hay un exceso de sustrato, la reacción es independiente de la cantidad de sustrato y, por lo tanto, es de orden cero.

    Otra característica en relación con la finalidad de la enzima por el sustrato es la comprendida en el llamado número de recambio, el cual representa los moles de sustrato atacados por un mol de enzima en una unidad de tiempo determinada, generalmente un minuto. Este número de recambio, en algunas ocasiones, es muy elevado, como sucede con la catalasa que a 0º C., tiene un número de recambio de 2.5 millones; es decir, un mol de enzima es capaz, en un minuto, de desdoblar dos y medio millones de moles de H2O2 ; el citrocomo c, a 38º C, tiene un número de recambio de 1.4 X 103 ; la carboxialasa a 30º C., da un número de recambio de 1 X 103 , etc.

    Mecanismo Ping Pong

    En la transaminación, la reacción avanza a través de los fenómenos alternos de adición de sustrato y liberación de producto .

     Iones sustrato

    Estos facilitan la fijación del sustrato y la catálisis por creación de varias de complejo de puente constituidos por un enzima, metal y sustrato en la que os iones metálicos pueden actuar como catalizadores ácidos generales o facilitar la aproximación de los reactantes.

    19. Accion de inhibidores.

    Si a un sistema enzimático se añaden sustancias que impidan la realización de la actividad propia de la enzima, se dice que el sistema ha sido inhibido, y la sustancia usada con estos fines se denomina inhibidor.

    Muchos inhibidores son agentes que desnaturalizan a las enzimas, ya que éstas son moléculas proteínicas, susceptibles a una diversidad de agentes, especialmente químicos, como aniones complejos o metales pesados, Zn ++, Pb ++, Ag ++, etc. A menudo estos agentes que impiden la actividad enzimática actúan sobre casi todas las enzimas, lo que demuestra que su acción no es específica, sino que afectan a tosa molécula proteínica . Tal es el caso de los inhibidores de sufhidrilos, -SH, los cuales forman parte de una gran variedad de enzimas. Otras sustancias bloquean específicamente determinadas reacciones enzimáticas y su especificidad es tal, que sólo cierto sustrato y cierta enzima son los susceptibles.

    De acuerdo con esto, es posible clasificar los fenómenos de inhibición enzimática en diversos grupos : inhibición por competencia e inhibición por no competencia y ésta, a su vez, en la debida a agentes desnaturalizantes y a agentes inespecíficos.

    20. Inhibicion por competencia

    En este caso el inhibidor no permite la formación del complejo enzima - sustrato normal, ya que se forma un complejo enzima - inhibidor ; una vez que el inhibidor ocupa el lugar activo de la enzima, el complejo enzima - inhibidor, no se separa, en vista de que la enzima no tiene acción sobre el inhibidor y, por lo tanto, queda bloqueada la parte activa de la enzima. El sustrato no puede entrar al lugar activo, que está ocupado por el inhibidor y, de esta manera, se impide la acción enzimática.

    El ejemplo clásico de inhibición competitiva es el de la enzima deshidrogenasa succínica que, en presencia de ácido succínico en ácido fumárico, reduciendo, simultáneamente, al acceptor de H. Diversas sustancias parecidas al ácido succínico, como el ácido malónico, el oxálico y el glutárico, se pueden combinar con la enzima e impiden su acción sobre el ácido succínico.

    Al añadir el inhibidor, la actividad enzimática disminuye sin embargo, si se añaden cantidades mayores del sustrato natural de la enzima (en el ejemplo anterior, de ácido succínico) nuevamente empieza a aparecer actividad enzimática, y cuando las cantidades de ácido succínico añadido sobrepasan considerablemente a las presentes del inhibidor, la actividad enzimática se restablece por completo. Esta situación representa, aparentemente, un fenómeno de competencia entre el sustrato natural y el inhibidor para ocupar el sitio activo de la enzima; la cantidad presente de una sustancia o de otra , en un momento dado, en el sitio de la reacción , determina si se dirige en un sentido o de otro; si hay más inhibidor, la enzima queda bloqueada por éste, y no se lleva a cabo la reacción enzimática ; si aún en presencia de importantes cantidades de inhibidor existen mayores cantidades del sustrato natural, éste domina al inhibidor y llega a desplazarlo introduciéndose en los sitios activos de la enzima para permitir que se reanude la actividad catalítica.

    21. Inhibicion por no competencia

    Cuando las sustancias inhibidoras actúan independientemente de la calidad del sustrato natural presente, se trata de inhibición por no competencia. En este caso, el inhibidor bloquea loas sitios activos de la enzima de modo irreversible ; en ocasiones se trata de la desnaturalización de la enzima, como cuando se añaden aniones o cationes que precipitan las proteínas. En otros casos la combinación irreversible se hace con sustancias que actúan de manera específica sobre ciertos grupos activos de la enzima, o sobre la conformación o estructura completa de ella ; sin embargo, en estas circunstancias, se ven afectadas por igual todos o cuando menos varios tipos de enzimas.

    Existen algunos inhibidores no competitivos que muestran cierta especificidad, como los agentes bloqueadores del radical sulfhidrilo, -SH, presente en las cadenas laterales del aminoácido cisteína, común a todas las moléculas proteínicas y, por lo tanto, a las enzimas. Entre los inhibidores de sulfhidrilos más conocidos se encuentran el ferricianuro, el yodacetato, el famoso gas usado con fines bélicos, la lewisita, y otras sustancias de tipo arsenical que deben sus efectos letales a su combinación con los grupos sulfhidrilo de proteínas y enzimas de gran importancia fisiológica.

    Hay enzimas que contienen iones metálicos indispensables para su actividad y que son susceptibles a la acción inespecífica de agentes que afectan dichos iones; tal es el caso de las enzimas con hierro que son intoxicadas por medio del cianuro o el H2S. De la misma manera, la adición de oxalato a un sistema puede precipitar el calcio o el magnesio, e impedir la actividad de enzimas que los requieren.

    22. Antagonismo metaboloco (antimetabolitos)

    Las enzimas pueden ser inhibidas por diversos compuestos, especialmente los que presentan una estructura parecida al sustrato natural, como expresó en el caso del ácido malónico y el ácido succínico con respecto a la deshidrogenasa succínica.

    Esta inhibición se denomina metabolitos las sustancias presentes o producidas en el curso del metabolismo celular, y antimetabolitos las sustancias parecidas a aquéllos, y que impiden su aprovechamiento y utilización ; en general, se trata de sustancias que compiten, a nivel enzimático, en vista de su parecido estructural, con los metabolitos naturales.

    Numerosos hongos, actinomicetos, bacterias, etc., producen sustancias que muestran actividad contra otros microorganismos. Estas sustancias se han denominado antibióticos y, en principio, se deben considerar como antimetabolitos que impiden, por razones de competencia , el crecimiento de determinadas formas microbianas. En medicina ha resultado del mayor interés el aislamiento y la actividad de los antibióticos, ya que en ciertas condiciones se usan para reprimir el desarrollo de gérmenes patógenos para los seres humanos.

    El estudio de los antimetabolitos probablemente se inició al observar que numerosas bacterias podían crecer en un medio que tuviera sulfanilamida, que normalmente es un inhibidor de su crecimiento, siempre que se añadieran grandes cantidades de ácido p-aminobenzoico, una vitamina necesaria para la nutrición celular. En vista del parecido estructural entre las dos moléculas, la sulfanilamida y el ácido p-aminobenzoico, se aceptó que los fenómenos de inhibición tenían una base estructural.

    Entre los antibióticos, existen algunos de gran utilidad terapéutica, como la penicilina, aislada de diversos hongos Penicillium ; la estreptomicina, proveniente de cultivos de Streptomyces griseus, y las tetracilinas, sustancias que tienen amplio campo de acción de diversas infecciones producidas por bacterias grampositivas o gramnegativas. Químicamente, son sustancias complejas formadas por distintos grupos :por ejemplo, la estreptomicina contiene glucosamina, estreptosa y estreptidina. Algunos antibióticos son péptidos, de tipo básico, aislados de bacterias, tales como la gramicidina y las tirocidinas. Un ejemplo peculiar de antibiótico producido por el hongo Pemicillium notatum es la notatina, idéntica a la enzima glucosa oxidasa que ataca a la glucosa permitiendo su conversión a gluconolactona y ácido glucónico ; es posible que de esta manera ejerza su acción de antibiótico.

    Muchos antimetabolitos suelen intervenir de modo específico a nivel de las coenzimas o de los grupos prostéticos, cuando éstos son del tipo de las vitaminas. Se trata, por lo tanto, en estos casos, de antivitaminas , muy comunes en las del grupo B. Así, la tiamina modificada en su estructura química para formar piritiamina o oxitiamina, no participa en los procesos de descarboxilación.

    El ácido piridín - 3 sulfónico impide la acción de la vitamina natural parecida a él, o ácido nicotínico y perturba numerosas reacciones de deshidrogenación. La piridoxina es antiorganizada por la desoxipiridoxina y la biotina, de la misma manera, por la destiobiotina. Se han preparado numerosas sustancias parecidas a las bases púricas y pirimidínicas con la finalidad de bloquear los sistemas de formación de proteína, que dependen de la presencia de ácidos nucleicos que contienen dichas bases, en el interior de la células; estos trabajos se han planeado para deprimir la velocidad de desarrollo de células cancerosas. Entre las sustancias obtenidas en fechas recientes se puede señalar el grupo del 5 - fluorouracilo, que produce inhibición tumoral por el siguiente mecanismo, que puede ser común a un gran número de sustancias con estas propiedades : en el tumor falta la enzima que destruye el antimetabolito, en este caso el 5 - fluorouracilo, el cual se vuelve muy agresivo hacia el tumor ya que no es degradado por él; en cambio, dicha sustancia es menos tóxica para el tejido normal que sí está en posibilidad de destruirlo.

    23. Inhibicion alosterica

    De gran importancia en el fenómeno de la actividad enzimática es el hecho de que, en las proteínas, pueden existir dos (o cuando menos dos) sitios diferentes desde el punto de vista estereo- específico y que, además, estén en lugares distintos. Un de estos sitios es el centro activo, donde el sustrato es atacado para dar origen a los productos de la reacción y por lo tanto donde reside el aspecto funcional de la proteína. El otro sitio denomina sitio alostérico y en él puede acomodarse de manera complementaria - pero reversible - alguna sustancia llamada efector alostérico ; al efectuarse esta unión se produce una alteración discreta de la estructura de la proteína, la transición alostérica, que modifica la actividad biológica de la proteína, porque altera la distancia, las propiedades del sitio activo.

    Es muy importante que el efector alostérico normal no tiene relación química o metabólica alguna con el sustrato de dicha enzima y que su acción tan específica se debe a que altera de tal modo la conformación de la proteína que modifica su centro activo.

    El efecto alostérico se ha estudiado de manera especial en bacterias, pero ocurre también en animales superiores. En un principio se reconoció como un efecto inhibidor que, por su características, fue denominado "por retro- alimentación" o "por producto final" . En rigor, en las bacterias, es la regla que el metabolito formado al final de un camino metabólico, resulte un poderoso inhibidor de su propia síntesis. Parte de la explicación de este efecto (pág. 535) se debe a que dicho metabolito inhibe específicamente a una sola enzima localizada en el camino metabólico que forma a dicha sustancia, y de manera curiosa, la enzima sensible al metabolito final es la primera de este camino metabólico.

    En un ejemplo de camino A B C D E, siendo E el metabolismo final, éste inhibiría a la primera enzima la que forma B a partir de A. En este capítulo en que se estudia la regulación metabólica se analizan con detalle algunos de estos ejemplos y las reacciones químicas individuales afectadas. La inhibición alostérica demuestra la alta especialización de las enzimas que reconocen tanto al sustrato como al inhibidor, siendo muy específicas para ambos. Como químicamente el sustrato y el efector alostérico son muy distintos, se acepta que la unión con la enzima debe efectuarse en sitios diferentes, lo que ha demostrado con mutantes bacterianas no sensibles al efector alostérico . Además, no hay interacción directa entre el sustrato y el inhibidor puesto que los sitios receptores están muy separados.

    Las proteínas alostéricas pueden corresponder a polímeros, es decir, a moléculas compuestas de sub- unidades idénticas, con ejes de simetría definidos. El hecho de que se agreguen las subunidades, por una parte, y el que al estar en forma polimérica adopten diversas situaciones conformaciones, hace susceptibles a la enzima a los inhibidores, o por el contrario, a recibir (fig. 3-10) al sustrato y llevar a efecto su acción característica. Más aún, para el caso de la transcarbamilasa aspártica se ha demostrado que una subunidad se combina con el sustrato y otra, distinta, con el inhibidor. Estos fenómenos adquieren una importancia de tipo general, al demostrarv que es factible modificar la acción de las enzimas por cambios en la estructura cuaternaria de las proteínas, basados en la asociación y disociación de subunidades. Algunos ejemplos particulares son los siguientes : la deshidrogenasa glutámica, con peso molecular de cerca de 1 millón puede partirse en subunidades de 250 000 por diversos agentes : DPN, ADP, estrógenos tiroxina y ciertos aminoácidos . Otro ejemplo es la carboxilasa de la acetil coenzima. A, que es activada por la adición de citrato, el cual cambia el coeficiente de sedimentación de la enzima de 18 S a 43 S, o sea la molécula pasa a forma de polímero activo a partir de monómeros inactivos. Un caso ya clásico es el de la fosforilasa inactiva que se convierte en activa cuando se fosforila; la estructura inactiva está formada por 2 unidades y la activa por 4.

    24. Enzimas: regulacion de actividades

    La regukacion del metabolismo logra la homeostacia

    La regulación de la actividad enzimática contribuye en gran parte a preservar la homeostasia que, mantiene un entorno intracelular e intraorgánico relativamente constante en presencia de fluctuaciones amplias en al medio ambiente externo, como cambios de temperatura, presencia o ausencia de agua o tipos específicos de alimentos.

    Como conservar la homeostasia

    Las concentraciones locales de sustrato , compartición de enzimas y secreción como proenzimas o cimogenos ( como por ejemplo la quimiotripsina ) sin actividad catalítica contribuyen a la regulación de los procesos metabólicos . Además , las alteraciones rápidas y mínimas en la actividad catalítica de enzimas reguladas clave tienen funciones importantes en la canalización selectiva de metabolitos hacia uno u otro proceso metabólico .

    Las enzimas reguladoras

    Tienden a ser aquellas que catalizan una reacción temprana única ( con frecuencia la primera ) de una secuencia determinada de reacciones metabólicas .

    La actividad catalítica de las enzimas reguladas puede modularse por ejemplo ,cambios repetidos entre estados bajo y alto de actividad catalítica ; cuando no hay síntesis proteínica nueva ni degradación proteínica .

    La modulación se logra cuando matabolitos específicos se unen en forma covalente y no covalente, a la enzima regulada en general a sitios ( alostéricos ) bastantes separados del sitio catalítico .

    Tres mecanismos generales regulan la actividad enzimatica

    Por ejemplo el flujo neto de carbono en una reacción catalizada en una reacción enzimática podría ser influido

  • Cambiando la cantidad absoluta de enzima presente .

  • Alterando el tamaño del conjunto de sustancias reaccionantes distintas de la enzima.

  • Alterando la eficacia catalítica de la enzima (estas tres opciones son utilizadas e casi todas las formas de vida).

  • La modulación de actividad enzimática por cambios en la conformación del sitio catalítico puede incluir la alteración de Km para un sustrato de Vmax para la reacción global o para efectos sobre los dos, Km y Vmax.

    A menudo las curvas de saturación de sustrato para la inhibición alostérica son sigmoideas, por ende la ecuación de Michaelis Menten no se aplica.