Efecto del PH y de la temperatura sobre la actividad de la Transaminasa

Bioquímica. Enzimas. Actividad enzimática. Metodología laboratorio

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Efecto del PH y de la temperatura sobre la actividad de la Transaminasa

CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

BIOQUÍMICA II

EFECTO DEL pH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE

LA ACTIVIDAD DE LA TRANSAMINASA

GRUPO:

31-07-2002

INTRODUCCION

La actividad de las enzimas y sus características se estudian en las células integras o en el tubo de ensayo. Se han desarrollado técnicas histoquímicas que permiten localizar y valorar las enzimas intracelulares en cortes histológicos. Gran parte de los conocimientos sobre las enzimas proviene de su estudio en el tubo de ensayo.

Son varios los elementos capaces de influir en la acción de las enzimas, ya sea acelerándolas o retardándolas, según sus características.

  • Temperatura

La elevación de la temperatura incrementa la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. Al principio la velocidad de reacción aumenta cuando la temperatura se eleva debido al incremento de la energía cinética de la energía de las moléculas reactantes.

Sin embargo, al final, la energía cinética de la enzima excede a la barrera energética para romper los enlaces débiles de hidrogeno que conservan su estructura secundaria y terciaria.

A esta temperatura predomina la desnaturalización con pérdida precipitada de la actividad catalítica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura óptima de acción. Los limites de actividad para la mayor parte de las enzimas tiene lugar entre los 10°C y 50°C; la temperatura optima para las enzimas en el cuerpo se hall alrededor de 37°C.

El factor por el cual un proceso biológico aumenta para un incremento de temperatura de 10°C es el coeficiente de temperatura o Q10. El Q10 para la mayor parte de las enzimas varía entre 1.5 y 3.

  • pH

La intensidad máxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH óptimo, con rápida disminución de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad óptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9.

El pH óptimo de una enzima puede guardar relación con cierta carga eléctrica de la superficie, o con condiciones optimas para la fijación de la enzima a su sustrato. Cuando hay un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus moléculas y ante un déficit los ceden.

Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la molécula. Como todas las proteínas, las enzimas desempeñan su función por los residuos de aminoácidos; algunos confieren a su superficie una distribución de cargas eléctricas.

Cuando la concentración de iones hidrogeno es muy baja en comparación con la concentración optima, la molécula los cede desapareciendo cargas positivas o apareciendo cargas negativas en su superficie. Ante una concentración elevada de iones hidrogeno, algunos se fijan a la molécula desapareciendo cargas (-) o poniendo cargas (+) que no existían.

Así mismo al cambiar las cargas eléctricas en los residuos de aminoácidos se alteran los lazos de unión dentro de la molécula variando su acomodo tridimensional con recuperación de la actividad de la enzima.

  • Transaminasas o transferasas

Este tipo de enzimas se encargan de transferirle grupo amino del glutamato a muchos ð-cetoácidos. La mayor parte de los aminoácidos comunes se pueden formar por transaminación.

Durante la transaminación, el grupo amino del aminoácido donador pasa al ð-cetoácido aceptor, con lo cual se forma el ð-cetoácido del aminoácido donador y el aminoácido del ð-cetoácido aceptor original.

OBJETIVO

Ver como es afectada la actividad enzimática por los efectos producidos por los cambios de pH y los cambios de temperatura.

MATERIAL

20 tubos de ensayo 2 vasos de precipitado 250 ml

4 pipetas graduadas 1 ml 4 pipetas de 5 ml

2 pipetas de 10 ml 1 pipeta Pasteur

2 tubos de centrifuga tubo homogenizador

gradilla parrilla

termómetro piceta

espectrofotómetro y celdas hielo

embudo de vidrio gasa

Material Biológico

10 grs. De chicharos frescos

Reactivos

Sol. Amortiguadora de TRIS-HCl 40 mM, EDTA 0.25 mM, pH 7.5

Sol. Amortiguadora de TRIS-HCl 0.1 M, pH 7.5

Sol. Amortiguadora TRIS-HCl 0.1 M, pH 10

Sol. Amortiguadora de acético-acetato 0.1 mM, pH 5

Sol. NaOH 0.1 N

Sol. Patrón de Ácido Pirúvico 0.5 mM

Sol. Ácida de 2,4-dinitrofenilhidrazina 1.5 mM

Sustrato para la enzima: a. aspártico 0.1 mM, ð-cetoglutarato 0.1mM, TRIS-HCl 0.1 M, pH 7.5

METODOLOGIA

  • OBTENCION DE LA ENZIMA

      • Pesar 10 gramos de chicharos

      • Picarlos y homogenizar con TRIS-HCl 40mM, pH 7.5

      • Filtrar y centrifugar 3500 rpm, durante 5 minutos.

      • El SN se debe mantener a una temperatura de 4°C.

  • EFECTO DEL pH

      • Se preparara la siguiente serie de tubos:

      • la serie se junta con los incisos c y d, y se incuban a 37°C durante 30 min.

    tubo a (pH 5)

    tubo b (pH 10)

    sustrato

    0.2

    0.2

    amortiguador pH 5

    0.8

    ----

    amortiguador pH 10

    ----

    0.8

    enzima

    0.2

    0.2

  • EFECTO DE LA TEMPERATURA

      • Se preparara la siguiente serie de tubos:

      • la serie se junta con los incisos b y d, y se incuban a 37°C durante 30 min.

    4 °C

    25 °C

    50 °C

    sustrato

    0.2

    0.2

    0.2

    amortiguador pH 7.5

    0.8

    0.8

    0.8

    enzima

    0.2

    0.2

    0.2

  • CURVA PATRON DE ACIDO PIRUVICO

      • Se prepara la siguiente serie de tubos:

      • la serie se junta con los incisos b y c, y se incuban a 37°C durante 30 min.

      • 1

        2

        3

        4

        5

        6

        agua

        0.2

        0.2

        0.2

        0.2

        0.2

        0.2

        patron

        ----

        0.1

        0.2

        0.4

        0.8

        1.0

        sustrato

        1

        0.9

        0.8

        0.6

        0.2

        ----

          • Agregar a todos los tubos 1 ml de 2,4-dinitrofenilhidrazina

          • Agitar y dejar 20 minutos a temperatura ambiente

          • Agregar 5 ml de NaOH y agitar

          • Esperar 5 minutos y leer absorbancia a 505 nm.

        RESULTADOS

      • Los cálculos que se presentan enseguida se utilizan para encontrar las concentraciones por tubo, esto se realiza con la siguiente formula: CiVi=CfVf

      • Los datos que se presentan en la tabla 1 se utilizaran para la construcción de la curva patrón, también se ajustara la curva.

        tabla 1.

        tubo

        absorbancia

        [patron] mM

        1

        0

        0

        2

        0.039

        0.0416

        3

        0.060

        0.0833

        4

        0.068

        0.1666

        5

        0.090

        0.333

        6

        0.106

        0.4166

      • Se construirá una grafica de pH vs. Vo. Para esto se tiene que hacer los siguientes cálculos, de concentración utilizando la ecuación: y=0.0197x-0.0086. Se sustituirán las absorbancias en la Y, y se convertirán los resultados en mM a ðM.

      • Ahora tenemos que calcular la velocidad inicial. Esta se calculara con la formula: .

        En la tabla 2, se muestran los datos para hacer la grafica de pH vs. Vo.

        tabla 2.

        tubo

        absorbancia

        [conc] ðM

        Vo ðM/min.

        pH 5

        0.504

        0.0251

        0.0008366

        pH 10

        0.858

        0.0431

        0.001436

      • En este punto se construirá una grafica de temperatura vs. Vo. Con los siguientes cálculos se obtendrán los datos para hacer la grafica. También se utiliza la ecuación de la curva patrón para hallar las concentraciones. Se sustituirán las absorbancias en la Y, y se convertirán los resultados en mM a ðM.

      • A continuación se calculara la velocidad inicial, con la formula: Efecto del PH y de la temperatura sobre la actividad de la Transaminasa

        Efecto del PH y de la temperatura sobre la actividad de la Transaminasa
        Efecto del PH y de la temperatura sobre la actividad de la Transaminasa

        Efecto del PH y de la temperatura sobre la actividad de la Transaminasa

        La tabla 3 muestra los datos que utilizaremos para la grafica de temperatura.

        tabla 3.

        tubo

        absorbancia

        [conc] ðM

        Vo ðððmin.

        4 °C

        0.508

        0.0253

        0.0008433

        25 °C

        0.536

        0.0267

        0.0008923

        50 °C

        0.595

        0.0297

        0.000992

        DISCUCION

        Al realizar la práctica se tuvo mucho cuidado especialmente en la parte donde se extrae la enzima, ya que de lo contrario los resultados no hubieran sido satisfactorios. Al no haber tenido fallas en los procedimientos y al haber comprobado los objetivos, entonces no parece haber mucho que discutir.

        Se pudiera pensar que el objetivo que se trazo para la realización de esta practica se logro casi satisfactoriamente. Ya que se observaron los cambios que se llevan a cabo con el cambio del pH y el cambio de temperatura.

        La teoría nos indica que a temperaturas bajas la enzima pudiera llegar a perder la actividad, esto seria momentáneamente; entonces a temperaturas altas, la enzima se desnaturalizaría, pero, a una temperatura media (entre unos 30°C y 40°C) la enzima funciona casi perfecta.

        El pH es otro factor que influye en la manera de accionar de la enzima, pues, como se menciona en la teoría, cuando el pH es demasiado ácido la enzima trabajaría menos, pero, a comparación de un pH demasiado alcalino, la enzima muestra actividad mayor que en la actividad mostrada a pH alcalino.

        Los datos mostrados no dicen que de un pH 5 hacia abajo la enzima empieza a perder actividad, y de pH 10 hacia arriba hace lo mismo, empieza a dejar de trabajar. Esto nos lleva a pensar que al haber variaciones de aunque sean décimas, se puede afectar la manera de trabajar de la enzima. Por tanto, se piensa que la practica estuvo bien realizada, al haber comprobado los objetivos propuestos.

        CONCLUSION

        Con la realización de esta práctica pudimos darnos cuenta de los cambios que puede sufrir la actividad enzimática a causa de la variación de pH y los cambios de temperatura.

        Podemos decir que el aumento de la actividad enzimática, observado a 50°C o por encima de esta temperatura, es de corta duración, ya que la enzima a temperaturas muy altas como esta, tiende a perder sus propiedades y desnaturalizarse, posteriormente se coagula la parte de la proteína enzimática. Todo esto hace que desaparezca la actividad enzimática.

        Quizá a temperatura de 4°C no tiene actividad la enzima, ya que a esta temperatura la enzima se inhibe, al igual que las proteasas. Se puede pensar que si las proteasas no trabajan a esta temperatura, entonces las Transaminasas tampoco debieran trabajar, pues, también son enzimas.

        Creemos que la mejor actividad enzimática que se pudo haber obtenido hubiera sido a una temperatura de 37°C, ya que a esta temperatura la enzima tiene una actividad optima. Ya que teóricamente esta temperatura es la adecuada para el funcionamiento de la enzima, nos hubiera dado un punto más de comparación con las otras temperaturas. Así, se podría ver en cual de las temperaturas se llevo a cabo una mejor actividad enzimática.

        Al igual que los efectos causados por la temperatura, el pH tiene los suyos que pueden alterar o favorecer la actividad de la enzima.

        Esto se debe a que cuando el pH tiene tendencias alcalinas, la enzima muestra una disminución de la actividad. Caso contrario se observa a pH ácido, pues, la enzima se vio favorecida en su actividad, esto gracias al medio ácido en que se encontraba.

        Podemos decir que nuestras observaciones nos llevan a decir que la actividad enzimática se vio disminuida en medios muy alcalinos, pero quizá hubiera dejado de trabajar a un pH mucho mas alcalino; en cambio los resultados obtenidos a un pH ácido fueron de una mejor actividad, aunque quizá, si hubiera sido un pH todavía mas ácido, la enzima hubiera dejado de funcionar.

        CUESTIONARIO

      • según los resultados, que sucede a pH acido y a pH alcalino. Dar una breve explicacion.

      • Conforme el pH alcalino (de 10) va aumentando, la velocidad de reacción de la enzima disminuye, por lo tanto a pH ácido (de 5) la velocidad de reacción de la enzima es ligeramente mayor en comparación con la de pH 10.

      • asi mismo, ¿Qué efecto tuvo la temperatura?.

      • A medida que la temperatura va aumentando, la velocidad enzimática es mayor, sin embargo, existe un límite, el que si se sobrepasa, puede tener consecuencias que afecten a la enzima, como, desnaturalización y por lo tanto puede perder su actividad.

        BIBLIOGRAFÍA

        MATHEWS, C. K. Y VAN HOLDE, K. E.

        Bioquímica, McGraw Hill Interamericana, 2ª. Ed., España, 1998.

        WHITE, A., HANDLER, P., SMITH, E., HILL, R., LEHMAN, R.

        Principios de Bioquímica, McGraw Hill, 1989.

        MICROSOFT® EXCEL 2002 (10.2614.2625)