Determinación de nitrógeno y proteina totales

Proceso. Muestra. Equipos de laboratorio. Materiales. Reactivos. Procedimiento. Destilación del amoniaco. Titulación

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DETERMINACION DE NITROGENO  Y PROTEINA TOTALES

  1. OBJETIVOS:

  • Describir el proceso  de determinación   de nitrógeno   y proteínas totales.

  • Determinar la cantidad de nitrógeno  de la muestra en estudio.

  • Calcular la proteína total, en base a la formula correspondiente.

  1. MARCO TEORICO

Las proteínas  son compuestos orgánicos  que contienen nitrógeno; son importantes  para el mantenimiento  del cuerpo animal, crecimiento, desarrollo, producción y reproducción. Un ser vivo, necesita reparar tejidos desgastados  y reemplazar proteína perdida  durante el proceso metabólico.

 Entre todos los compuestos químicos, las proteínas deben considerarse ciertamente como los más importantes, puesto que son las sustancias de la vida.

Las proteínas constituyen gran parte del cuerpo animal; lo mantienen como unidad y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda célula viva. Ellas son el material principal de la piel, los músculos, tendones, nervios y la sangre; de enzimas, anticuerpos y muchas hormonas.

Desde un punto de vista químico, las proteínas son polímeros grandes. Son poliamidas y los monómeros de los cuales derivan son los ácidos -amino carboxílicos. Una sola molécula proteínica contiene cientos, e incluso miles, de unidades de aminoácidos, las que pueden ser de unos 20 tipos diferentes. El número de combinaciones diferentes, es decir, el número de moléculas proteínicas distintas que pueden existir, es casi infinito. Es probable que se necesiten decenas de miles de proteínas diferentes para formar y hacer funcionar un organismo animal; este conjunto de proteínas no es idéntico al que constituye un animal de tipo distinto.

Las proteínas son necesarias para la formación y renovación de los tejidos. Los organismos que están en período de crecimiento necesitan un adecuado suministro de proteínas para su aumento de peso. Los organismos adultos que tienen su peso estabilizado están en equilibrio dinámico, en el que sus proteínas se degradan y se regeneran continuamente, aunque su composición permanece constante. Para ello debe existir en la dieta un suministro regular y continuo de proteínas.

La técnica consiste en transformar el nitrógeno de la muestra en amoniaco. Ese amoniaco lo hacemos reaccionar con una cantidad conocida de acido sulfúrico en exceso. La parte que queda sin reaccionar de AC sulfúrico la valoramos con hidróxido sódico (volumetría ácido-base) y así podemos saber la parte que ha reaccionado, lo que nos informa de la cantidad de amoniaco (y por tanto la de nitrógeno)  
Lo último que debes hacer es multiplicar la cantidad de nitrógeno por un factor de conversión (creo que 6.25, no estoy seguro) para saber la cantidad de proteína.  

Este método es el más utilizado en la determinación de N orgánico. Consiste en la descomposición con ácido sulfúrico concentrado para convertir el N combinado en ión amonio. La solución resultante se alcaliniza y el amoniaco así generado se destila y se recoge en solución ácida que se cuantifica por titulación. La etapa crucial del método es la descomposición de la muestra con ác. Sulfúrico el cual oxida el C a dióxido de carbono y el H a agua. Sin embargo el N depende del estado de combinación que se encuentre. El N amidico o aminico se transforma cuantitativamente en amonio. Así se averigua el % de N en la muestra. Luego se multiplica por un factor adecuado para averiguar el contenido en proteína según se trate de cereales 5,70. Carnes 6,25. Y productolácteos6,38.  
El problema se resuelve así:

En primer lugar has de averiguar el contenido de N en la muestra, es decir, es el cociente entre el contenido de proteína y su factor o sea 4.25/6.38 = 0.66 %N. Luego aplicas los equivalentes de N son iguales a los HCl gastados con lo que:  
0.66= ((v-0.7)x0.1x14x100)/(1000x5.0231) y despejando "v" queda 
23.84=v-0.7; v=24.55ml.  

El nitrógeno total Kjeldahl es un indicador utilizado en ingeniería ambiental. Refleja la cantidad total de nitrógeno en el agua analizada, suma del nitrógeno orgánico en sus diversas formas (proteínas y ácidos nucleicos en diversos estados de degradación, urea, aminas, etc.) y el Ion amonio NH4+.

Es un parámetro importante en estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) ya que mide el nitrógeno total capaz de ser nitrificado a nitritos y nitratos y, posteriormente y en su caso, desnitrificado a nitrógeno gaseoso. No incluye, por tanto, los nitratos ni los nitritos.

El nombre procede del método de análisis que, en esencia, digiere el agua en condiciones ácidas enérgicas con peroxidisulfato hasta pasar todas las especies a amonio, el cual se mide por fotometría.

Dado que el análisis de proteína cruda no suministra información alguna en cuanto a la digestibilidad de una fuente de proteína, un procedimiento de laboratorio para determinar la digestibilidad sería extremadamente útil.

Este es precisamente el objetivo de la prueba de determinación de la digestibilidad por pepsina.

La pepsina es una enzima digestiva que en la presencia de un medio ácido desdobla las proteínas del alimento.

Colocando una muestra de la materia prima que se desea analizar en una solución que contenga pepsina y midiendo qué cantidad de proteína es digestible, podemos estimar el valor nutritivo relativo de dicha materia prima. Es muy importante tener presente la palabra “relativo”.

Es muy importante tener en cuenta que en el tracto digestivo existen otras enzimas que también ayudan a desdoblar las proteínas y que las condiciones son mucho más complejas que las que pueden simularse en un laboratorio. Por lo tanto, los resultados de porcentaje de digestibilidad en pepsina que obtengamos mediante este método nunca deberán confundirse con la digestibilidad verdadera de la materia prima. Por ejemplo, supongamos que analizamos dos muestras de harina de pescado de dos proveedores diferentes. La muestra del proveedor “A” tiene un valor de pepsina de 80% y la del proveedor “B” sólo 70%. Esto no quiere decir que el animal solamente será capaz de digerir 80 o 70% de estas harinas respectivamente. Simplemente, podemos concluir que el proveedor “A” procesa mejor sus harinas de pescado. Si el contenido de proteína cruda de las dos harinas es similar, haremos bien en comprar el producto “A” y dejar el producto “B” para alguien en cuyo laboratorio se realice solamente el análisis de proteína cruda (Dale, 1984).

La leche es una fuente   rica de  proteínas   de alta calidad ; una deficiencia de proteínas  en el alimento, da como resultado  una menor producción  de leche  por animal día, asimismo animales con severas deficiencias de proteínas pierden  peso con rapidez  a comienzos de la lactación  y no lo vuelven a recuperar  hasta el fin de la misma.

Por lo tanto, para cubrir la demanda  de proteínas,  el animal  necesita consumir alimentos  ricos en proteína. Las proteínas  de un alimento  pueden calcularse químicamente  a partir de su contenido de nitrógeno, mediante la clásica técnica  de KJELDAHL, descubierto hace más de cien años.

No todo el nitrógeno  de los alimentos esta en forma de proteína, sino algunos alimentos sobre todo los forrajes verdes contienen  un tercio o mas de  su nitrógeno  esta en la forma  de Compuestos nitrogenados  no proteicos (NNP), como las amidas, sales de amonio, aminoácidos, etc. Debido a esta forma de nitrógeno, la multiplicación por el factor 6.25  no proporciona el valor útil  para la proteína verdadera. El método de kejldahl  no distingue ambas formas  de nitrógeno, por lo tanto los valores obtenidos  se expresan en términos  de proteína total  o proteína cruda, que representa una  combinación  de nitrógeno  no proteico (NNP)  y el nitrógeno no proteico (NP)

Felizmente  en la dieta para cerdos  y aves de corral  predominan los cereales  y las oleaginosas,  los cuales tienen muy poco de NNP. Afortunadamente los rumiantes  tienen millones de microorganismos   en el rumen que utilizan eficientemente  el NNP, por consiguiente, la calidad  de las proteínas no tienen  tanta importancia   para los rumiantes que  para los monogastricos, en los que si es necesario  un balanceo de aminoácidos  esenciales  en las proteínas.

  1. EQUIPOS , MATERIALES Y REACTIVOS:

  1. EQUIPOS  DE LABORATORIO:

    1. Aparato  de digestión kjeldahl.

    2. Aparato  de destilación  tekator.

    3. Balanza analítica o de precisión.

    4. Bureta (microbureta) semiautomatica de 10 o 50ml.

  1. MATERIALES:

    1. Balon de kjeldahl  de 100ml (digestión).

    2. Balon kjeldahl de 250ml (destilación).

    3. Frascos erlemmeyer de 250ml (150).

    4. Pipeta cilíndrica.

    5. Probeta graduada  de 25, 50,100ml.

    6. Piceta de agua destilada.

    7. Papel filtro.

  2. REACTIVOS:

    1. Acido sulfúrico concentrado.

    2. Selenio de sodio (selenio en polvo).

    3. Catalizador (sulfato de potasio y sulfato de cobre).

    4. Acido bórico al 4%.

    5. Indicador  de Ph (rojo azul de metilo).

    6. Acido clorhidrico en solución  de 0.05N.

    7. Solución de hidróxido  de sodio al 40%.

  1. PROCEDIMIENTO:

Se realiza en tres fases:

  1. Digestión o ataque a la materia orgánica.

  2. Destilación del amoniaco.

  3. Titilación  del borato de amonio.

  1. FASE DE DIGESTION.

    1. Pesar 0.2gr.  de muestra seca en estudio   en la balanza analítica.

    2. Envolver en un papel  filtro de análisis  previamente tarado, asegurando del exterior  con hilo.

    3. Introducir en forma de un paquete  dentro de un balón de digestión  kejldahl  de 100ml

  1. Agregar 01gr.  De mezcla catalizadora (0.05gr. de sulfato de cobre  y 0.95gr. de sulfato  de potasio)

  1. Se añade una  pizquita de  selenio en polvo (0.3 a 1gr.aprox.).

  2. Adicionar por las paredes d el valón  2.5ml  de acido sulfúrico concentrado.



  1. Mezclar con cuidado, imprimiendo el valón  un moviendo rotatorio

  2. Colocar el valón en posición inclinada   sobre una de las hornillas de la cámara digestor multi-kjeldahl, de manera que la boca del valón   quede dentro de la correspondiente  abertura del tubo de plomo, por donde  serán removidos los gases producidos durante la ebullición.

  3. Dar paso a la corriente eléctrica   y regular a la temperatura de forma que la ebullición sea moderada. Esta ebullición  se mantendrá durante 30 minutos o mas  si fuera necesario. Generalmente hasta  media hora  después de que el liquido  tome un color verde claro  o azul verdoso

  1. Luego se deja enfriar  hasta que empiece  a formar cristales.



  1. En las mismas condiciones  se realiza una digestión “en blanco” , o digiera a parte el papel filtro , pero sin muestra ;  esta representa también una muestra en blanco.

  1. FASE DE DESTILACION DEL AMONIACO:

Estos métodos incluyen la destilación del producto alimenticio con un disolvente inmiscible que tiene un elevado punto de ebullición y una densidad menor que la del agua, por ejemplo, tolueno, heptano y xileno. El agua que se destila cae debajo del disolvente condensado en un recipiente graduado, en el cual se puede medir el volumen de la fase acuosa. Se debe empujar dentro del condensador un largo alambre o "gendarme", hasta cerca del tubo de salida que facilite el escurrimiento de cualquier cantidad de agua que pueda destilar hasta el tubo graduado. Aunque los resultados bajos son comunes en el método de destilación, éste tiene la ventaja que una vez que se ha montado el aparato necesita poca atención y que cualesquier aceites volátiles que destilen, no son medidos, dado que quedan atrapados en el disolvente inmiscible.

  1. Termina  la digestión  y enfriarla el valón, añadir con cuidado 25ml.  De agua destilada y enfriar nuevamente.

  1. Adicionar en un matraz de erlenmeyer  de 250ml  de capacidad, 5ml de acido bórico  al 4%   y cuatro gotas de indicador  y colocarlo en la parte inferior  del tubo condensador d e tal manera  que el extremo del tubo  de unión quede sumergido  en acido bórico.

  1. Mezclar continuamente, haciendo un lavado   de todos los  residuos   de la muestra contenida en el valón.

  2. Agregar lentamente  por las paredes del balón  25ml.  De agua destilada.

  1. Transferir  la muestra a otro balón  de destilación de 250ml.

  1. Colocar  el balón en el aparato de tecator   y conectarlo al tubo condensador, donde se añade 25ml.  De solución de hidróxido de sodio  al 40%  con la manivela del alcali  del aparato en posición correcta. 



  1. Se alimenta  vapor con la  manivela presionando hacia abajo

  1. A los pocos minutos comenzara la ebullición  y destilación.

  1. Destilar  por  tres minutos   desde el cambio de color rojo  a verde (controlar con el cronometro  del destilador  tekator)

  2. Después de tres minutos  subir la manivela  hacia arriba  para cortar el vapor

  3. Retirar el balón  con cuidado aun lugar seguro.

  4. Retirar el erlenmeyer  con cuidado lavando  el extremo del tubo  con un poco de agua  destilada.

  5. Destilar  también el balón  que contiene la digestión (en blanco).

  1. FASE DE TITULACION:

  1. Enjuagar la bureta  con al solución a utilizar   para titular (HCL), antes de ser aforada  a cero,  para evitar la contaminación.

  2. Cargar la bureta  milimetrada  con acido clorhídrico  al 0.05N  valorado.

  3. Titular  el contenido del matraz   de erlenmeyer  con la solución de HCL 0.05N, agitando suavemente  hasta que el color  vire aun color  violeta (cada ml. De hasta solución que se  gasta en la titulación, equivale a  1.4mg. de nitrógeno).

  1. Una ves  cambiada  el color  de la muestra contenida  en el erlenmeyer,  se hace la lectura correspondiente  en al bureta, cuyo dato se considera como gasto

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNO-PERU

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

E.P.: ING. AGRONOMICA