Cultivos starter

Industria alimentaria. Cultivos inóculos. Fermentaciones con levaduras. Cinética de fermentación láctica. Determinación de Biomasa, Proteínas, Azúcares totales y Ácido láctico. Método Lowry Modificado. Antrona. HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). Cámara Neubauer

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CULTIVOS STARTER O INOCULOS Y CINETICA DE FERMENTACION LACTICA

CULTIVOS STARTER O INOCULOS

= ((16 + 15 + 25 + 15 + 19)/5) x 16 = 288

288 x 104 x 1/10-1 = 28800000 células / mililitro

1. Que es un cultivo starter

R/ Los cultivos starter se utilizan actualmente en el procesado de alimentos para inducir diversos cambios en sus propiedades, tales como la modificación de la textura, la conservación, el desarrollo de aromas o la mejora nutricional.

La utilización de estos cultivos debe tener en cuenta estos efectos, cumpliendo a su vez con la exigencia de la automatización del proceso, calidad del producto y reproducibilidad. Lo que lleva consigo la producción de cultivos con una actividad definida en términos de viabilidad, eficacia y vida útil.

Las principales aplicaciones de los cultivos Starter se encuentran en las industrias de panadería y lechería, aunque también existen levaduras starter destinadas a la fermentación de bebidas alcohólicas y a la producción de alcohol industrial.

El proceso de producción de estas últimas es el similar al efectuado en la manufactura de levaduras de panadería, que además se utilizan con frecuencia en las fermentaciones alcohólicas.

Las levaduras Saccharomyce crevisiae, utilizadas en la elaboración del pan degradan los azucares a una mezcla de alcohol y de dióxido de carbono gaseoso que queda retenido en la masa. Con la excreción de compuestos como cisteina y glutation que rompen los puentes disulfuro intramoleculares y con la producción de gas, las levaduras actúa modificando química y mecánicamente el gluten, que es la proteína mayoritaria del trigo.

FERMENTACIONES CON LEVADURAS

Aproximadamente el 96% de la fermentación del etanol se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyce crevisiae o especies relacionadas entre estas S. Uvarum el etanol se produce en la ruta Embden Meyerhof Parnas en la que el piruvato producido durante la glicosilizacion se convierte en Acetaldehído y etanol la reacción global es la siguiente:

Glucosa + 2 ADP 2 Etanol + 2 CO2 + 2ATP

El rendimiento teórico de un gramo de glucosa es de 0.51 gr. de etanol y 0.49 gr. de CO2 sin embargo en la practica aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento de etanol y CO2 alcanzan el 90% del valor teórico.

El ATP formado se utiliza para las necesidades energéticas de la célula.

La envoltura de la célula de levadura incluye una membrana plástica un espacio periplasmico y una pared celular constituida principalmente por polisacáridos y una pequeña cantidad de péptidos

La pared tiene una estructura semirrigida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tencil. Los grupos carboxilos de los péptidos de la pared celular confieren alas levaduras utilizadas en la elaboración de cerveza una capacidad de floculación importante lo que permite la separación sólido liquido después de la fermentación se cree que la floculación se debe a la formación de puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos carboxilos de la pared celular.

2. Que importancia tiene cuantificar la densidad celular en el inóculo

R/ La importación de la densidad celular es que nos ayuda a lograr óptimos resultados en al fermentación ya que nos ayuda a predecir la cinética de crecimiento y por medio de esto podemos determinar en cuanto tiempo podremos obtener los metabolitos deseados.

3. Describa la metodología que permite contar bacterias en cámara de Neubauer.

R/ Recuento en cámara de Neubauer Es una cámara que se utiliza para contar glóbulos y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos está, a su vez, dividido en 16 cuadrados.

Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3.
 
 
 

Ventajas del método:

Desventajas del método: 

Es rápido

La cantidad de muestra analizada es poca

Los frotis se pueden guardar

Provoca cansancio del operador

Las exigencias de equipo son mínimas

Sólo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL.

Se pueden observar las diferentes morfologías de los microorganismos.

Es difícil distinguir los microorganismos de las partículas de muestra

Se observan tanto los microorganismos viables como los no viables 

Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores.

Reglas para contar en la cámara.

Cuente usando el cuadro del centro.

Los cuadros de menor tamaño 0.2 * 0.2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a contar desde la parte superior de los cuadros menores que están dentro del cuadro grande central 1 * 1 mm y se continúa hasta la base.

Si las células tocan los limites de los cuadros menores 0.2 * 0.2, deberán contarse únicamente las que toquen la parte superior y lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior o la parte izquierda, no se cuentan. Este método reduce las posibilidades de contar la misma célula dos veces. Cuente hasta cerca de 200 - 250 células antes de determinar el numero de células por volumen. El proceso e conteo puede presentar cuatro situaciones diferentes: Puede haber de 200 - 250 células antes de determinar el numero de células por volumen. Puede haber de 20 - 250 células por cuadro grande 0.1 mm3. En este caso multipliquese el número de células por centímetro cúbico. Puede haber menos de 200 células por cuadro grande. Será necesario contar algunos de los cuadros de las esquinas para obtener un total de cerca de 200 células en la cuenta. Después de haber contado suficientes células divida el numero total entre el numero e cuadros grandes usados en al cuenta para encontrar el promedio de células por cuadro grande. Multipliquese ahora el numero promedio de células por 104 para encontrar el numero de células por centímetro cúbico. Puede haber más de 200 células por cuadro grande. En este caso las células en los cuadros pequeños que están en el cuadro grande el cual esta dividido en 25 cuadros pequeños de 0.2 mm * 0.2 mm, hasta encontrar cerca de 200 células. Determine el número promedio de células de uno de los 25 cuadros pequeños dividiendo el número el número de cuadros que contó. Multipliquese este promedio por 25 para obtener el numero aproximado de de células en cuadro grande. Para encontrar las células por centímetro cúbico multiplique el número obtenido por 104 para encontrar el número de células por centímetro cúbico.

Si las células son demasiadas para contarse, la suspensión debe diluirse. No olvide multiplicar el dato final por porción en la cual fue diluida.

CINETICA DE FERMENTACION LACTICA

A continuación relacionamos los datos obtenidos a través de las 8 horas de observación al medio de cultivo.

Tiempo(horas)

Ln D.O.

pH

1

-1,33941078

5,42

2

-1,30195321

5,36

3

-1,28013417

5,36

5

-1,25878104

5,5

7

-1,24827306

5,43

9

-1,24132859

5,4

Con esta tabla de datos realizaremos los gráficos:

  • Ln D.O. vs. Tiempo

  • pH vs. Tiempo

GRAFICA DE Ln D.O vs. TIEMPO

GRAFICA DE pH vs. TIEMPO

Recuento en placa

En la realización de este recuento tuvimos un problema ya que no se presento crecimiento en ninguna de las tres diluciones, por lo tanto se tomo los datos del grupo de Lorena Zambrano para realizar el conteo, los datos se relacionan a continuación:

Dilución 10-6

= ((4 + 4 + 8)/3) = 5.33

5.33 x (1/ 1x10-6) x 10 = 53'333.333 UFC/ml

Dilución 10-7

= ((2 + 4 + 3)/3) = 3

3 x (1/ 1x10-7) x 10 = 300'000.000 UFC/ml

Dilución 10-8

= ((1 + 1 + 2)/3) = 1.33

3 x (1/ 1x10-8) x 10 = 1.333'333.333 UFC/ml

PROTOCOLO PARA DETERMINACION DE LA BIOMASA POR PESO SECO MEDIANTE FILTRACION.

PRINCIPIO: estimación de la biomasa por peso seco, aplicable a todo tipo de microorganismo en medio liquido claro.

MATERIALES.

Embudo de filtración Buchner.

Filtros Whatman N°2.

Pinzas metálicas.

Balanza de precisión.

Horno a 105 °C y desecador.

Sistema de vació.

A fin de estimar la pérdida en agua de los filtros, se realizara en paralelo un ensayo con un filtro sobre el cual se hará un depósito de agua.

METODOLOGIA.

No tocar los filtros con los dedos, usar pinzas metálicas. Realizar duplicados.

Lavar los filtros previamente marcados, a un horno a 105 °C durante aproximadamente 4 horas. Sacar del horno. Reposar en desecador.

Pesar exactamente cada uno de los filtros.

Llevar el filtro al embudo Buchner.

Prender el sistema de vació.

Depositar cuidadosamente en l centro del filtro, 10 ml de suspensión microbiana homogénea.

Lavar la pipeta de muestra con agua para recuperar toda la biomasa.

Eliminar el vació.

Retirar el filtro y llevar al horno a 105 °C durante 12 horas.

Enfriar en desecador.

Pesar precisamente.

CALCULO.

Peso filtro con la muestra - peso del filtro vació * 100 = X g/lt.

Se determina en espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm.

Si es necesario se realizan diluciones de la suspensión celular a fin de ubicar la lectura en un rango entre 0.1 y 0.5.

PROTOCOLO PARA DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY MODIFICADO.

FUNDAMENTO: las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin - Cicolteu para dar un complejo de color azul, debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína. La intensidad del color depende del numero de aminoácidos aromáticos presentes y enlaces peptídicos y varia según la clase de de proteína. La solución azul muestra una absorbancia máxima a 750nm. Rango de linealidad entre 0 - 300 gr/lt.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS.

Las variaciones de este método pueden ser debidas al pH, el tiempote la reacción, la concentración de los reactivos o las interferencias de las sustancias como azucares o productos celulósicos. En este método la concentración no es estrictamente proporcional a las concentraciones más altas de proteína.

Este método es aconsejable cuando:

Las muestras presentan un alto contenido de ligno celulosa.

Las muestras contienen fenoles.

Las razones para la aplicación del reactivo de Folin son:

Que se pude medir el contenido de proteína en fracciones enzimáticas.

Medición en mezclas de tejidos en proteínas o de soluciones muy diluidas.

MATERIAL Y EQUIPO.

Tubos de ensayo.

Gradilla.

Pipetas de 1 ml.

Pipetas de 5 ml.

Matraces aforados de 100 a 500 ml.

Frascos de color ámbar.

Espectrofotómetro.

Balanza analítica.

Agitador vortex.

Baño Maria.

REACTIVOS.

Solución A: diluir 0.5 gr de tartrato de sodio potasio, 25 gr de carbonato de sodio, 125 ml de hidróxido de sodio 1 N en 125 ml de agua destilada.

Solución B: diluir 2 gr de tartrato de sodio potasio, 1 gr de sulfato de cobre en 10 ml de hidróxido de sodio 1 N.

Solución C: preparar una solución de agua destilada y reactivo de Folin Cicolteu en proporciona 14:1. Preparar al momento de usar.

Solución estándar de seroalbumina bovina disolver en 15 mg en 50 ml de agua destilada el resto almacenarlo en congelador. Concentración final 300 mg/lt.

Curva estándar 0 - 300 gr/ml. Dentro de una serie de tubos de ensayo 0 - 0.1 - 0.2 -0.4 - 0.6 - 0.8 - 1.0 ml de solución de seroalbumina y completar a 1 ml con agua destilada.

METODOLOGIA.

La dosificación de las proteínas es efectuado sobre 1 ml de muestras convenientemente diluida. La curva estándar y las muestras sufren el siguiente tratamiento.

Muestra de fermentación liquida.

Para determinar la concentración de proteína celular de un cultivo líquido se centrifuga la muestra a fin de descartar la proteína insoluble. El botón celular es resuspendido en le mismo volumen inicial. A esta muestra se le hacen la respectiva dilución y se procede a realizar la cuantificación.

Muestra e fermentación dolida.

A 500 mg de la muestra seca, se le agregan 10 ml de agua, se homogeniza la mezcla se diluye 4:100 y se toma 1 ml. La concentración final de 2000 mg de muestra seca/lt. Diluir convenientemente.

PROCEDIMIENTO.

Ajustar 1 ml de patrones de la curva estándar y muestras.

Adicionar 0.5 ml de NaOH 2 N a todos los tubos.

Calentar a baño Maria por 10 min.

Reposar en agua fría.

Accionar 0.5 ml de ácido sulfúrico 2.6 N.

Adicionar 0.9 ml de solución A.

Llevar 10 min. A baño Maria a 50 °C.

Reposar en baño de agua fría.

Adicionar 0.1 ml de solución B.

Llevar 10 nm a oscuridad y preparar solución C.

Adiciona 3 ml de solución C. levar 10 nm a baño Maria a 50 °C.

Reposar en baño de agua fría.

Leer al absorbancia a 750 nm comparando contra un blanco.

CALCULOS.

Los datos de absorbancia y concentración de la curva estándar, son graficados para obtener una regresión lineal donde el coeficiente de correlación no debe ser menor a 0.99.

Reordenar la ecuación en términos de concentración y sustituir las lecturas de DO obtenidas de las muestras del problema, teniendo en cuenta que hay que multiplicar por el factor de dilución.

PROTOCOLO PARA DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES MÉTODO DE ANTRONA.

FUNDAMENTO: la reacción de antrona constituye la base de un método conveniente para la determinación de hexosas, aldopentosas y ácidos hexouronicos, bien sea que estén libres o formando parte de un polisacárido. La solución azul verdosa muestra una absorción máxima a 625 nm.

MATERIAL.

La vidrieria para dosificaciones de las diluciones deben estar previamente lavadas con ácido sulfúrico al 10 %, se deja en remojo en esta solución por una noche, luego son enjuagados y secados para su uso.

Tubos de ensayo con tapas.

Pipetas de 1 ml.

Pipetas de 5 ml.

Gradilla.

Pipeta o distribuidor automático.

Matraz aforado de 100 ml.

Frasco ámbar o recubierto con papel aluminio.

Espectrofotómetro.

Balanza analítica.

Agitador vortex.

Baño Maria.

Baño de hielo.

REACTIVOS.

Antrona.

Ácido sulfúrico 96 %.

Glucosa grado reactivo.

Curva estándar.

Preparación del reactivo de Antrona: disolver 200 ml de Antrona en 100 ml de ácido sulfúrico al 96% conservar en frasco ámbar.

Solución madre: disolver 1 ml de glucosa en 200 ml de agua destilada. (5 g/lt.)

Diluciones patrón: establecer una curva estándar de 0 - 50 mg/lt. Después de efectuar una dilución de 1/10 de la solución madre (50 gr/ml.) depositar en una serie de tubos 0 - 0.25 - 0.5 - 0.75 - 1 - 1.25 - 1.5 - 2 - 2.5 ml de solución madre y completar a 2.5 ml con agua destilada.

METODOLOGIA.

Tanto en la curva madre como en las muestras a dosificar sufren el mismo tratamiento.

La dosificación de azucares totales realizadas sobre 2.5 ml de muestra convenientemente diluida. Conservación a baño de hielo.

Preparar blanco con agua destilada. 2.5 ml.

Adicionar 5 ml de reactivo e Antrona.

Agitar con vortex hasta homogenizar la dilución.

Llevar a ebullición durante 10 min.

Enfriar en baño de hielo.

Agitar y esperar 15 min para eliminar las burbujas de aire.

Leer a 625 nm, contra blanco.

ECUACION CURVA ESTÁNDAR.

Graficar los valores obtenidos de la lectura de do a 625 nm contra la concentración en mg/lt. Obtener la ecuación de la recta y despejar de esta la concentración, aplicar esta ecuación para los datos obtenidos para las muestras problema.

Para hallar la concentración real de las muestras no olvidar multiplicar por el factor de dilución.

PROTOCOLO PARA DETERMINACION DE ACIDO LACTICO HPLC.

UTILIZACION DEL HPLC.

Preparación de 1 lt de solvente.

1 lt de agua destilada.

Ajustar a pH 1.5 con ácido sulfúrico 96%. Esto corresponde a una concentración 6 M.

Filtrar el solvente bajo vació con un filtro de 0.45 u.

Desgasificar el solvente mediante vació y/o ultrasonido durante 30 min.

Si no hay baño de ultrasonido dejar el solvente con agitación fuerte.

Después de este tiempo apagar la agitación y después el vació.

Antes de conectar el solvente con HPLC verificar el estado de limpieza del filtro de acero, si esta sucio poner por 5 min en baño de ultrasonido.

Durante esta conexión se debe tener cuidado con las burbujas de aire.

Arranque del HPLC.

Oprimir POWER de la bomba.

Abrir la llave de purga.

Poner el botón CONTROL MODE sobre PURGE.

Dejar 1 min.

Poner el botón CONTROL MODE sobre FLOW.

Cerrar la llave de purga.

Ajustar el flujo a 0.2 ml/min.

Observar si el solvente sale al final del circuito.

Encender el horno de la columna y ajustar la temperatura a 65°C.

Encender el refractómetro.

Esperar que la temperatura suba hasta 65 °C y aumentar el flujo de solvente de 0.2 a 0.6 ml/min. Entre cada aumento de flujo debe dejar que la presión se estabilice durante 10 min.

Cuando el flujo llegue hasta 0.6ml/min esperar 20 min hasta que la temperatura y presión se estabilicen.

Oprimir el botón PURGE del refractómetro y dejar la purga 15 min y apagarla.

Oprimir el botón TEST RUN del integrador para ver el nivel del ruido; un ruido de 5 permite empezar los análisis. Arriba de 5 seguir la purga. La presión debe quedar entre 44 - 48 bares.

CUIDADO: nunca dejar la columna caliente sin flujo de solventes.

Inyección.

Utilizar una jeringa de 10 ml.

Limpiar la jeringa con las muestra 3 veces. Evitar las burbujas.

Verificar que el inyector este en la posición LOAD.

No inyectar todo el contenido de la jeringa para evitar la inyección de micro burbujas.

Inyectar la muestra.

Poner rápidamente el inyector en la posición INJECT dejando la jeringa dentro del inyector hasta el final del análisis.

En el caso e una serie de muestras hay que inyectar todas las muestras de concentraciones bajas y después de las concentraciones altas. No es necesario limpiar la jeringa con agua destilada entre 2 muestras de similares.

Apagar el HPLC.

Apagar el horno de la columna.

Dejar pasar el solvente o mejor agua destilada durante 15 min.

Apagar el refractómetro.

Después de 15 min bajar el flujo hasta 0.2 ml/min.

Apagar la bomba.

Procedimiento para la regeneración de la columna.

Poner la columna al revés a la temperatura de 65 °C y el flujo a 0.1 ml/min durante:

4 hr con solvente 5% de acetonitrilo en ácido sulfúrico 6 mM.

4 hr con solvente 15% de acetonitrilo en ácido sulfúrico 6 mM.

4 hr con solvente 30% de acetonitrilo en ácido sulfúrico 6 mM.

La regeneración se realiza cuando la presión sube anormalmente por encima de 75 bar.

Integrador.

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Bibliografía

CARPENTER. Microbiología. Editorial Interamericana. 1969.

FRAZIER. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia. 1981

SCAGG. Biotecnología para Ingenieros. Editorial Limusa. 1997.