Cultivo in vitro

Técnicas de reproducción in vitro. Plantas ornamentales. Árboles frutales. Antecedentes. Objetivos. Metodología. Cámara de cultivo. Condiciones. Problemas. Jardín Botánico

  • Enviado por: Castillo
  • Idioma: castellano
  • País: México México
  • 28 páginas
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PROPAGACIÓN COMERCIAL DE PLANTAS ORNAMENTALES POR CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES PARA BENEFICIO SOCIAL DE LA COMUNIDAD

INTRODUCCIÓN

El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.

A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción.

Es por esto que en el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz, A.C. con el apoyo de la Secretaría de Desarrollo Social (SEDESOL) y el Gobierno del Estado de Veracruz; se desarrolla un proyecto de producción de plantas de ornato utilizando la técnica antes mencionada con el propósito de aprovechar sus bondades, adecuándola a la problemática económica de algunas colonias populares de la Ciudad de Xalapa y municipios circunvecinos; para lo cual se empezó, a partir del primero de noviembre de 1994, la instalación de un Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales en donde se contempla la producción de especies ornamentales de interés económico. A la fecha, se tienen resultados satisfactorios en la producción de Gloxinia (Sinningia speciosa) cuyas características se mencionan a continuación:

Sinningia speciosa o Gloxinia speciosa; plantas perennes tuberosas de floración estival (estación más caliente del año). Sensible a las heladas; mínimo 15 ºC. Han de instalarse en lugares con abundante luz aunque no bajo la acción directa del sol. Prefieren una atmósfera húmeda y suelos también húmedos aunque no encharcados, turbosos con abundante materia orgánica. El riego no debe aplicarse directamente al follaje dado que este es muy pubescente y no seca rápidamente lo cual favorece la proliferación de organismos que causan enfermedades. Se multiplican mediante semillas en primavera y verano a través de esquejes caulinares; pueden también multiplicarse por división de los tubérculos en secciones provistas de un brote joven. Gloxinia speciosa tiene forma de roseta y de tallos cortos, las hojas ovales y aterciopeladas llegan a medir hasta 20 cm de longitud. Las péndulas y en forma de embudo, son carnosas y de color violeta, rojo o blanco, florece en verano. La regeneración de plantas de gloxinia por cultivo in vitro se logra utilizando secciones de tejido foliar sobre un medio nutritivo MS (1962) complementado con fitorreguladores de crecimiento; una vez enraizadas las plantulitas, deben pasar por un periodo de aclimatación en un invernadero con características (humedad, iluminación y temperatura) semejantes a las del laboratorio, después de 4-6 semanas se transfieren a un invernadero común donde terminan su ciclo.

ANTECEDENTES

En octubre de 1994, se inició la operación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz A.C. con la finalidad de desarrollar técnicas para la propagación de especies vegetales de interés ecológico y económico. En enero de 1995, se iniciaron las labores de siembra de tejidos en especies ornamentales de interés económico en la región. A la par de estas actividades, se ha hecho promoción del proyecto en los medios de comunicación locales con el fin de dar a conocer al público las ventajas de utilizar la técnica mencionada para la propagación de plantas ornamentarles difíciles de obtener por los métodos tradicionales. Así mismo, hemos participado en exposiciones de carácter cultural como la Feria de la Flores de Xalapa y la Feria del Café en Coatepec, Ver.; se han dado pláticas a estudiantes de la Facultad de Biología y Agronomía y se ha facilitado el laboratorio para que alumnos de biología se puedan capacitar en esta disciplina y en la Horticultura en general. Actualmente contamos con un inventario de 10,000 plantas ornamentales de las cuales 5,000 han sido donadas a un grupo social de 30 personas recientemente integrado en la población de Mazatepec, Mpio. de Acajete, Ver., para lo cual se dió capacitación integral para el manejo en invernaderos de las mismas; con este primer lote iniciarán su propio negocio. De esta manera, no sólo se incide en la generación de fuentes de empleo, sino se colabora en la conservación de los recursos forestales, pues esta zona padece de una elevada presión sobre estos. Por lo expuesto, se considera necesaria la continuidad de este proyecto para apoyar a otros grupos sociales y aprovechar la infraestructura existente.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad celular.

Schleiden y Schwan (1887) describen en su teoría celular, que la célula es capaz de subsistir por si sola si las condiciones externas le son favorables.

A Morgan (1901) se le atribuye el término de la totipotencialidad celular propiamente dicho, que dice que una célula es capaz de desarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y si se le aplican los estímulos adecuados.

Haberlandt (1902) con la idea de la totipotencialidad celular desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales. Desafortunadamente sus trabajos fueron inexitosos debido a que utilizó un medio de cultivo relativamente simple y por otra parte, tejidos vegetales demasiado diferenciados.

White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos ápices de raíces de jitomate. Los tejidos meristemáticos del ápice radical propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debió, como lo menciona White, a la mala elección del material vegetativo y a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le da un buen impulso al desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro; sin embargo en sus trabajos realizados hasta entonces no obtiene proliferación celular en forma, los ápices de raíz solo crecen en longitud como lo harían normalmente como parte de la raíz de la planta intacta.

No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro.

Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenia un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).

Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque, desnaturalizado por calor, tenía un efecto muy marcado en la formación de brotes a partir de tejidos de tabaco. De este ácido desoxirribonucleico (ADN) desnaturalizado Miller y colaboradores (1955) aislaron un compuesto de naturaleza purínica enominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina.

En 1926 dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudrición en plántulas de arroz. El efecto que producía dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raíz. Actualmente se le atribuyen otros efectos como la inducción de germinación en semillas, brotación en algunos tubérculos como la papa etc.

OBJETIVO GENERAL

Implementar un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales para el incremento de la producción de plantas ornamentales que genere un beneficio social a los habitantes de las colonias marginadas de Xalapa y municipios circunvecinos.

En este proyecto se verán beneficiados un grupo de pobladores de la congregación de Mazatepec, municipio de Acajete, Ver.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 

    • Investigar en el mercado local el tipo de plantas ornamentales de mayor consumo.

    • Investigar sus características botánicas y biogeográficas.

    • Desarrollar las técnicas de cultivo in vitro de las especies propuestas por los grupos sociales formados, en base a sus características biológicas y a su demanda en el mercado.

    • Producir 5,000 plántulas para beneficio social de la comunidad antes mencionada.

METODOLOGÍA

Fase I: Establecimiento de los cultivos in vitro

Para la realización de este proyecto se implementó un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales con el equipo y materiales básicos para estos fines.

El material biológico inicial consistió en plantas de gloxinia (Gloxinia speciosa) las cuales se adquirieron en viveros de la localidad.

Predesinfestación: los explantes iniciales se obtuvieron de tejido foliar para lo cual se separaron las hojas jóvenes más vigorosas y se lavaron con agua y detergente.

Desinfestación: dentro de una campana de flujo laminar las hojas de gloxinia se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 1% en constante agitación durante 10 minutos, se aplicaron tres enjuagues de tres minutos cada uno con agua destilada estéril. Después se cortaron y se sembraron secciones de tejido de aproximadamente 1 cm 2.

Paralelamente se adquirieron semillas de gloxinia híbrida F1 doble, mezcla de colores y se desinfestaron de la misma manera que las hojas. Tanto la siembra de tejidos como de semillas se realizó en un medio nutritivo de acuerdo a la formulación de Murashige & Skoog (1962) complementado con 100 mg/l de myo-inositol glysina 2 mg/l, ácido nicotínico 0.5 mg/l, pyridoxina 0.5 mg/l, tiamina 0.1 mg/l, sacarosa 30 gr/l, agar 7 gr/l, el pH se ajustó a 5.8. La esterilización de los medios de cultivo fue a 20 libras de presión durante 20 minutos en todos los casos. El medio para germinación de semillas fue el mismo pero a la mitad de la concentración original y adicionado con 1.5 gr/l de carbón activado, el medio para las secciones de tejido se complementó con 1 mg/l de benzilaminopurina (BAP) y 0.3 mg/l de alfa ácido naftalenacetico (µ ANA).

Los tejidos se trasladaron a una cámara de incubación a una temperatura de 25 ± 2º C, y bajo una intensidad luminosa de 2000 lux (lámparas slime line marca Phillips). Las semillas fueron incubadas a la misma temperatura pero en ausencia de luz.

Fase II: Multiplicación

Debido a que las secciones de tejido foliar de gloxinia sufrieron oxidación muy severa, no fue posible lograr la diferenciación de plántulas, esto motivó a que la multiplicación de propágulos se hiciera a partir de las plántulas obtenidas por germinación aséptica. El medio de cultivo utilizado en esta fase fue el mismo MS (1962) aumentando la concentración de BA a 2 mg/l y (µ ANA) 0.3 mg/l mg/l. Para alcanzar el número acordado de plántulas, se realizaron dos resiembras. Las condiciones de incubación fueron las mismas que se describieron con anterioridad.

Fase III: Enraizamiento de plántulas

Para esta fase, se utilizaron las mismas sales MS en el medio de cultivo, omitiéndose las citocininas (BA). Complementado con 1.5 gr/l de carbón activado y 20 gr/l de sacarosa. Las condiciones de incubación fueron las mismas que para las etapas anteriores.

RESULTADOS

Fase I: Establecimiento de los cultivos

No fue posible la obtención de plántulas a partir de tejidos por problemas de oxidación debido a esto, las primeras plantas se obtuvieron por germinación aséptica, en las etapas posteriores se siguió la metodología normal de cultivo in vitro.

Fase II: Proliferación

En esta fase se lograron tazas de multiplicación de 1x3 en un periodo de 6 a 8 semanas para la primera resiembra y de 1x5 en el mismo periodo de tiempo en la segunda resiembra bajo las condiciones anteriormente descritas. Con estos resultados la cantidad acordada de producción se rebasó en tan sólo 9 meses de trabajo.

Fase III: Enraizamiento

Muchas especies de la familia de las herbáceas, producen raíces aún en medios conteniendo citocininas; sin embargo, estas raicillas no son funcionales ya que son demasiado delgadas y por lo tanto frágiles; entonces, es necesario transferirlas a un medio con hormonas promotoras de raíces (auxinas) con lo cual además se evita que las plántulas continúen proliferando, el fortalecimiento de tallos y hojas se obtiene también de este modo. En gloxinia el enraizamiento de propágulos se logró en un medio conteniendo las sales MS a la concentración normal complementado con 1.5 gr/l de carbón activado, las plántulas enraizaron exitosamente en 4 semanas y adquirieron mayor vigor en tallos y hojas.

VINCULACIÓN SOCIAL DEL PROYECTO "Floricultores de Mazatepec" Acajete, Ver.

A través del Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz A.C., estamos desarrollando, con el apoyo económico de la Secretaría de Desarrollo Social (SEDESOL), proyectos productivos cuya finalidad es la de provocar un impacto positivo en las comunidades con problemas de marginalidad, uno de los cuales es el de "Producción de Plantas Ornamentales por Cultivo in vitro". Elegimos esta Biotecnología debido a que ofrece una serie de ventajas, algunas de las cuales se mencionan a continuación:

    • Uniformidad genética

    • Manejo de grandes volúmenes de plantas en áreas pequeñas

    • Florecimiento temprano

    • Las plantas producidas in vitro están exentas del control sanitario

    • Facilita el movimiento de grandes cantidades de plantas entre distintas zonas geográficas etc.

Aprovechando las bondades de ésta técnica para su aplicación en problemas específicos de comunidades con problemas de desempleo, se están produciendo masivamente plantas de ornato de interés económico en la región, las cuales son donadas a grupos sociales legalmente constituidos y capacitados en forma integral, para que ellos mismos lleven a cabo las actividades emanadas del proyecto desde que reciben las plántulas, hasta la fase adulta cuando son comercializadas.

En la realización de este proyecto se ha contado con la destacada colaboración del Patronato de Apoyo Voluntario a la Sierra de Perote de la Secretaría de Finanzas y Planeación (SEFIPLAN), la Secretaría de Desarrollo Agropecuario y Pesquero (SEDAP), del Servicio Estatal de Empleo, el H. Ayuntamiento de Acajete, Ver., y el CBTIS 13 de Xalapa, Ver., entre otros.

Bajo este esquema, se ha formado y capacitado un grupo social de 30 personas en la población de Mazatepec, Municipio de Acajete, Ver., el cual ha concluido la construcción de un invernadero en donde se encuentra en la fase de adaptación una cantidad de 5000 plántulas de la especie Sinningia speciosa (gloxinia), mismas que fueron producidas y donadas por el Colegio de Biólogos.

Con este modelo de trabajo se crearon 30 empleos directos y se estima que con el efecto multiplicador se rebase la cifra de 100 empleos en aproximadamente un año, ya que en el laboratorio se producen las flores que deberán sembrarse en cada parcela factible, pasando a la integración de sistemas unifamiliares de producción; otro de los beneficios del proyecto consiste en que se disminuirá en adelante la presión ejercida por los pobladores de esta región sobre los recursos naturales particularmente sobre los bosques ya que al ofrecerles alternativas de empleo no tienen que talar árboles para cubrir sus necesidades más urgentes. Cabe agregar que Mazatepec es una localidad situada en el Municipio de Acajete, que cuenta con una población de 706 habitantes; de éstos 421 son personas de más de quince años de edad de los cuales el 48.2% son analfabetas. La principal ocupación laboral es la agricultura (jornaleros que laboran en otras regiones y/o trabajan su parcela para el autoconsumo) y la venta clandestina de madera; de manera secundaria existe un grupo de personas que se dedican a la comercialización de flores en la Ciudad. de Xalapa.

Esta primera donación se considera útil para enfrentar al grupo en los principales procesos de producción en invernadero, bajo un programa de capacitación técnico-administrativa, así como para generar la capacitación inicial del mismo, que al momento ha invertido en base a un crédito sin interés y condicionado a la producción, promovido por el Patronato de Apoyo Voluntario a la Sierra de Perote. Para el año 1996, se tiene previsto el proceso intensivo de capacitación, entrenamiento y organización, así como la producción en laboratorio de 5000 plántulas de "Crisantemo", que el grupo ha decidido sea su producto definitivo a desarrollar, toda vez que de el dominan el mercado.

CONCLUSIONES

De este trabajo se deben destacar los siguientes aspectos fundamentales:

    • Que el desarrollo sustentable del estado de Veracruz, requiere de la aplicación de estrategias agresivas, siendo una de ellas la transferencia de biotecnologías a procesos productivos, de base social, en el medio rural.

    • Que la vinculación entre las instancias productoras de biotecnologías y los sectores marginados, puede lograrse en la medida en que se establezcan los canales adecuados en cuanto a localización y adquisición de apoyos de todo tipo: de investigación, de inversión social, administrativos, financieros y de capacitación.

    • Que en base a la integración de grupos de autogestión productiva, es posible constituir empresas sociales generadoras de empleos como alternativa a los fenómenos de marginalidad y depredación de los recursos naturales.

    • Que los proyectos de autogestión productiva y de aplicación interinstitucional, son capaces de integrar recursos y apoyos con un elevado efecto sinérgico, propiciando la sustentabilidad del grupo y del proyecto mismo.

Los resultados obtenidos permitirán en el futuro aplicar esta metodología a otras comunidades con problemas de marginación con lo cual se contribuirá por una parte a la creación de empleos y por otra a impulsar fuertemente la actividad de la floricultura en el estado de Veracruz , produciendo plantas ornamentales de calidad para ser más competitivos en esta área.

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    Cultivo in vitro de árboles frutales
    Multiplicación o reproducción de frutal in vitro
    'Cultivo in vitro'

    'Cultivo in vitro'
    Cultivo in vitro 'Cultivo in vitro'

    El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales.

    Un dato para dar una idea comercial es que en España había en 1.990 28 laboratorios dedicados a la producción de plantas por cultivo in vitro como negocio.

    El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo.

    Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave.

    El cultivo in vitro es muy caro, entre otras cosas porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos laboratorios muy grandes y con mucho mercado.

    La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.

    'Cultivo in vitro'

    Fase de aclimatación en invernadero


    Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro:

    • Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:

      - Micropropagación de estaquillas
      - Organogénesis de callos

    • Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:

      - Cultivo de meristemos
      - Microinjerto in vitro

    • Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.

    • Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.

    • Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

    • Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.

    • Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.

    • Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:

      - Obtención rápida de homocigotos.
      - Producción de híbridos (frutos puros).

    Equipo necesario para el cultivo in vitro

    - Autoclave
    - Cámara de flujo laminar
    - Medio de cultivo
    - Planta
    - Cámara de cultivo

    - Autoclave

    'Cultivo in vitro'

    Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presión, pero de mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º).

    - Cámara de flujo laminar

    'Cultivo in vitro'

    Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

    - Medio de cultivo

    'Cultivo in vitro'

    Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.

    - Planta

    'Cultivo in vitro'

    El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones.

    - Cámara de cultivo

    'Cultivo in vitro'

    La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc..

    Condiciones del cultivo in vitro

    • En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.

    • En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.

    • El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.

    • Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.

    • El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5.

    • Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.

    • El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

    • El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo.

    • En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.

    • Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta.

    • En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.

    Subcultivos o replicado

    Cuando sembramos microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan raíces ni hojas, sino que se produzca una proliferación (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos.

    No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan sólo se hace 8-10 veces.

    Ocurre entonces lo siguiente:

    - El medio nutritivo se agota y se seca.
    - El material vegetal ocupa todo el tubo.
    - Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).
    - El medio se hace líquido.

    Fases del cultivo de meristemos

    1. Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).

    2. Siembra en el medio del tubo.

    3. Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos.

    4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio).

    5. Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc..

    6. Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero.

    7. Plantación en el campo.

    Fases del cultivo de embriones

    Se utiliza mucho en manzano.

    1. Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea.

    2. Se coge el embrión de la semilla.

    3. Se inocula en el tubo.

    4. A las 1-2 semanas, la planta está más o menos reconocible.

    5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatación.

    Micropropagación

    'Cultivo in vitro'

    Se parte de una yema, de bráctea o axilar.

    Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo.

    Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener más plantas).

    El número de subcultivos depende del material vegetal.

    Ejemplo de micropropagación de Kiwi:

    - Se parte de un trozo de tallo.

    - Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote.

    - En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes.

    - Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio.

    - Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas.

    - Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.

    Cultivo de callo in vitro

    Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro.

    El medio puede ser sólido o líquido.

    Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión.

    A partir de entonces se desarrolla normalmente.

    Obtención de plantas haploides

    Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular.

    De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis u organogénesis.

    • Embriogénesis: se forman células (poliembriones).

    • Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).

    No se riega nunca por aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera.

    Problemas en el cultivo in vitro

    'Cultivo in vitro'

    * Contaminación: es grave.

    * Vitrificación: es una reacción de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La única solución es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estén bien.

     

    'Cultivo in vitro'

    TÉCNICAS DE CULTIVO IN VITRO

    Cuando se habla del cultivo de plantas, generalmente nos referimos a cultivarlas en macetas, arriates o cultivarlas en el campo. En 1904 Hanning desarrolló un nuevo método de cultivo de plantas al que se llamó cultivo de embriones. Aisló in vitro embriones inmaduros de algunos miembros de la familia Crucíferas, obteniendo plántulas viables.
    El cultivo in vitro se define como el cultivo en un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, órganos, explantos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores. Estas técnicas se caracterizan porque:

    • " Ocurren a microescala, sobre todo en una superficie pequeña;

    • " Se optimizan las condiciones ambientales, en lo que se refiere a factores físicos, nutricionales y hormonales;

    • " Se excluyen todos los microorganismos (hongos, bacterias y virus), así como también las plagas de las plantas superiores (insectos y nematodos).

    Generalmente no se reproduce el patrón normal de desarrollo de una planta, resultando que un tejido aislado puede dar origen a un callo o puede desarrollarse de otras formas poco usuales (por ejemplo, formación de órganos, embriogenesis somática). La capacidad de cultivar protoplastos o células individuales permite manipulaciones que antes era imposibles. El nombre de cultivo in vitro (que generalmente quiere decir en vidrio), se utilizó porque, al menos inicialmente, se usaron recipientes de vidrio para el cultivo

    'Cultivo in vitro'

    'Cultivo in vitro'
     CULTIVO IN VITRO EN EL JARDÍN BOTÁNICO

    En 1988, en el Jardín Botánico se montó un laboratorio de cultivo in vitro con el fin de recuperar plantas en peligro de extinción, multiplicándolas lo más rápidamente y en un corto periodo de tiempo. Así se realizó con varias especies:

    • " Artemisia granatensis se multiplicó a partir de yema, obteniéndose muchas plantitas en poco tiempo que se adaptaron bien en maceta, más tarde en el campo, en un hábitat semejante al suyo.

    • " Betula pendula subsp. fontqueri, se multiplicó a partir de la base de la hoja joven, y se ha conseguido recuperar, de tal forma que en el conservatorio hay ejemplares grandes totalmente adaptados.

    • " Narcissus spp. a partir de la base del catáfilo del bulbo.

    • " Rosmarinus tomentosus, utilizándose como explanto la base de la hoja, obteniéndose por embriogénesis nuevas plantas.

    • " Euonymus latifolius, que aunque es una planta difícil de multiplicar, se han obtenido nuevas plántulas.

    UNIDAD V


    Técnicas de manejo del material volumétrico y preparación de soluciones.

    Objetivo de la unidad.
    Dar a conocer el correcto manejo y precisión del material volumétrico, así como la metodología y técnica adecuada para preparar soluciones valoradas requeridas en los diferentes análisis clínicos.



    MATERIAL VOLUMÉTRICO.

    5.1 Importancia de las mediciones correctas con el material volumétrico.

    Es de gran importancia el manejo correcto del material volumétrico, ya que este material es utilizado en cualquier tipo de análisis clínicos, es decir, se utiliza muy seguido en la elaboración de análisis, y el buen manejo del material es de vital importancia para obtener resultados correctos.

    Existen materiales de mayor precisión que otros, como es el caso de los materiales volumétricos (probeta de 10 ml y matraces aforados de 100 y 250 ml)T que presentan marcas de aforo establecidas a una temperatura determinada, generalmente todo el material de medición, viene con una descripción del proveedor dando marca, temperatura a la qué es calibrado, (si el material esta calibrado ) y el rango de error , # de catálogo y en que país ha sido hecho , algunos instrumentos de medición marcan con una línea roja la clase de vidrio de la que está hecho. También algunos traen escala.

    El uso correcto del material volumétrico es esencial para las mediciones analíticas y dichos equipos deben ser adecuadamente mantenidos, y cuando sea necesario, calibrados. En general, deberán verificarse las especificaciones de calidad del material volumétrico a su recepción. Para que la verificación no sea necesaria, el material volumétrico debe haber sido certificado para una tolerancia específica por unidad o por lotes, según sea necesario.

    Se debe prevenir cualquier contaminación del material volumétrico. Son factores esenciales para la realización de los ensayos, entre otros, el tipo de material (vidrio, teflón -PTFE- etc.), su limpieza, almacenamiento y separación.
    Esto es especialmente importante en el caso de análisis de trazas, en los que la lixiviación y absorción puedan tener un efecto significativo.

    Los aparatos de medición tienen que elegirse según la aplicación y la precisión exigida. Incluso el aparato de análisis automático más caro ofrece resultados fiables sólo cuando el material volumétrico empleado en la preparación de las muestras es adecuadamente precioso. Las pipetas Serológicas o graduadas nos sirven para medir volúmenes cuando el soluto por adicionar es líquido.

    Las buretas se utilizan para agregar volúmenes cuando el soluto no se puede pipetear.

    Las probetas nos sirven para medir volúmenes aproximados que se van a adicionar a la preparación de soluciones como solvente.

    El matraz aforado se utiliza en la preparación de soluciones valoradas.

    Se le mostrará lo que es el aforo, la acción de aforar y su lectura correcta.

     

    A continuación se presentan algunas definiciones acerca de el uso del material volumétrico:


    5.2 Definiciones de:

    AFORO: Es la manera o señal que delimita la capacidad o volumen de un recipiente.


    AFORAR: Es la acción de agregar a un liquido o un utensilio volumétrico hasta que su menisco coincida con el aforo. En líquidos transparentes las línea o marca del aforo debe quedar tangente al menisco en la parte inferior, en los líquidos obscuros se toma en la medida en la parte superior del menisco. Al aforar la vista del operador debe estar perpendicular y en la misma altura del aforo para evitar error de paralaje.


    EXACTITUD: Puntualidad y fidelidad en la ejecución de una cosa.


    PRESICION: Obligación o necesidad indispensable a ejecutar una cosa.


    MEDIR: Es comparar una magnitud con otra de la misma especie que convencionalmente se a tomado como patrón.


    MENISCO: Curvatura que presenta los líquidos un su superficie y pueden ser cóncavos o convexos.


    5.3 Técnicas de manejo del material volumétrico.


    El material volumétrico tal y como su nombre lo dice; nos sirve para medir algún volumen determinado.


    El material se constituye de:
    1. Probeta.
    2. Pipeta.
    3. Bureta.
    4. Matraz aforado.


    PROBETA:


    Las probetas graduadas y las probetas con tapón ofrecen un máximo nivel de exactitud. El estricto control estadístico asegura el elevado nivel de calidad.


    Es un cilindro de vidrio de un diámetro grande, sostenida por una base cilíndrica o hexagonal que puede ser de vidrio o de plástico, tiene graduaciones a lo largo de su cuerpo, comenzando cerca de la base y terminando en la parte superior, su capacidad esta dada por la ultima graduación, puede ser desde 5ml hasta 2000ml a 20°C, su exactitud no es muy grande debido al diámetro del menisco que se forma, nos sirve para hacer mediciones rápidas con mas o menos exactitud, sirve para trasvasar líquidos rápidamente.


    PIPETA:


    EXISTEN DE 2 TIPOS: PIPETAS AFORADAS Y PIPETAS GRADUADAS.


    Son cilindros de vidrio de pequeño diámetro y con abertura en sus dos extremos; existen dos tipos, uno llamado pipeta graduada que puede ser terminal o subterminales, tienen graduación a lo largo de todo su cuerpo, pueden tener la ultima graduación en la punta y la llamaremos terminal, o antes de la punta llamándose subterminal; el otro tipo de pipetas tiene un ensanchamiento o ampolla en su parte media, en la cual viene indicado el volumen que pueden emitir no para contener, sirven para transvasar pequeñas cantidades de líquidos.


    La forma correcta de tomar una pipeta es con los dedos pulgar y cordial y obturar con el índice, introducir dentro del líquido que se va a pipetear, hasta cerca del fondo del recipiente que lo contienen, absorber lentamente observando como sube la columna permitiendo que le líquido llegue arriba del aforo deseado, obturar con el dedo índice sacar la punta del líquido y aforar la presión, teniendo los ojos a la altura del aforo deseado, aforar, limpiando el exterior de la pipeta con un papel absorbente y llevarlo al recipiente donde se va a trabajar, iniciar el recipiente de tal manera que el liquido escurra por las paredes, lenta o rápidamente de acuerdo con las necesidades y características e los líquidos, quedara una pequeña porción en la punta, esta no debe introducirse por ningún motivo o caer dentro del recipiente (no soplar o escurrir).

     

    BURETA.


    Material que se encuentra diseñado para medir el volumen de una sustancia con muy buena precisión. Es un instrumento que cuenta con una llave que controla la salida del líquido cuando ésta se abre. La escala se encuentra distribuida a lo largo del cuerpo de la bureta. Normalmente se utiliza para llevar a cabo valoraciones o titulaciones. Para trabajar con ella primero verificar que este perfectamente limpia y seca, colocarla en un soporte universal con unas pinzas para bureta con la punta hacia abajo y verificar que la llave está cerrada.


    Por medio de un embudo y un vaso de precipitados, llenar hasta arriba del ultimo aforo, sacar el embudo y aforar permitiendo que se llene la punta inferior de la bureta por medio de las llave de paso es de vidrio hay necesidad de lubricarla con vaselina neutra (una pequeñísima cantidad); Se toma la llave de paso con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda abrazando con estos dedos con objeto de no aflojar la clave y provocar la salida del líquido por los bordes de esta, con la mano derecha se toma el recipiente y se agita cuando se recibe el líquido emitiendo por la bureta, para tomar la lectura en la bureta una vez terminada la relación, se espera un minuto con objeto de permitir que resbale el líquido adherido a las paredes y no cometer errores, para hacer la lectura colocar la bureta a la altura de la bureta. (Si la bureta no esta seca y urge trabajar con ella, se conjuga dos o tres veces con la solución que va a contener).


    MATRAZ AFORADO:


    Los matraces aforados son indispensables para preparar disoluciones y soluciones medidas. Si no se expresa otro deseo, los matraces aforados se suministran con tapón de PP, parte superior cuadrada, con punta de goteo. Este tapón reduce notablemente el peligro de rotura en caso de vuelco y evita que el matraz aforado se caiga al rodar por la mesa del laboratorio.


    Es un recipiente de vidrio pyrex, forma de pera en su parte inferior y un cuello largo, en el cual se encuentra la marca o aforo, de su capacidad a diferencia de los otros utensilios volumétricos, no emite sino que contiene el volumen indicado, consta de un tapón esmerilado que permite taparlo y evitar en esta forma que se evapore el liquido de su interior, así como mantenerlo limpio de polvo.


    Se usa para preparar sustancias valoradas, por ello; verificar que esté limpio, la sustancia a aforar, si es liquido se diluye primeramente en un vaso de precipitados y se vierte por medio de un embudo y un agitador dentro del matraz aforado, enjuagar dos o tres veces con agua destilada y vertirlo dentro del matraz, proceder a aforar con agua, teniendo la precaución de que las ultimas gotas no sobre pasen el aforo, para esto usar una pipeta y permitir que la gota escurra a lo largo del cuello, no añadir la siguiente hasta verificar el aforo.


    Si la sustancia por disolver es sólida, colocarla en un vaso de precipitados, añadiendo agua una pequeña cantidad y agitar por medio de un agitador, dejar sedimentar y verter el liquido al anterior del matraz, repetir esta operación hasta verificar que dentro del vaso no queda ninguna partícula sin disolver, enjuagar dos o tres veces, verter dentro del matraz, llevar el aforo, tapar y agitar tomando del cuello y sosteniéndolo el tapón invirtiendo varias veces, no tomar l matraz aforado del cuerpo para no elevar la temperatura y variar su capacidad.


    SOLUCIONES.


    5.6 Definición de solución, solvente y de soluto.


    Solución: A la mezcla homogénea de un Soluto y un solvente se le da el nombre de solución.
    Soluto: puede ser sólido, liquido o gaseoso.
    Solvente: Se puede presentar en los tres estados.


    A la incorporación del soluto al solvente se le conoce como el poder de dispersión y a la facilidad con la que el soluto se dispersa en el solvente se le llama solubilidad, la que es característica particular de cada solvente.

    El solvente de mayor empleo en el análisis es el agua en la que muchos solutos son solubles por lo que las soluciones se clasifican como:


    5.7 Tipos de soluciones.

    Las soluciones empíricas son aquellas en las que no se considera la relación de las cantidades exactas que existen entre soluto y solvente.

     

    Soluciones empíricas


    ? Insaturadas: En las que la cantidad de soluto con relación al volumen de solvente, es menor a la cantidad que se puede disolverse a la temperatura ambiente. Se consideran a la diluida y la concentrada.


    ? Saturadas: Son las que el soluto ha logrado ocupar todos los espacios intermoleculares del solvente y no se puede diluir mas del mismo, o sea la cantidad máxima que se puede disolver a la temperatura ambiente.


    ? Sobresaturada: Es aquella en la que al aumentar la temperatura de la solución los espacios intermoleculares se abren y permiten que entre más soluto.

     

     


    Las soluciones valoradas son en las que la relación de soluto y solvente es definida y entre éstas tenemos las siguientes:

    Soluciones valoradas:


    ? Porcentual (%):Se define como la cantidad de soluto expresada en gramos disueltos y aforados en 100 mililitros de solución.

    %------------- soluto g---------------100ml. de solución

     

    ? Molar (M): Es la que tiene un mol o el peso molecular del soluto expresado en gramos disueltos y aforados en 1000 mililitros de solución.

    1 Molar------- peso molecular g ----------1000 ml de solución.

    ? Molal (m): Es la que tiene disuelto el peso molecular del soluto expresado en gramos en 1000 g de solvente.

    1 molal --------peso molecular g ------------1000 g de solvente.

     

    ? Normal (N): Es la que tiene el peso equivalente del soluto expresado en gramos disueltos y aforados en 1000 mililitros de solución.

    1 Normal------peso equivalente g----------1000 ml de solución


    ? Formal (F): Es la que contiene el peso fórmula del soluto expresada en gramos disuelto y aforada a 1000 de solución.

    1 Formal ----- peso fórmula g ----------------1000 ml de solución

    5.8 Soluciones valoradas.

    Porcentuales: Se define como la cantidad de soluto expresada en gramos disueltos y aforados en 100 mililitros de solución.

    Molares: Es la que tiene un mol o el peso molecular del soluto expresado en gramos disueltos y aforados en 1000 mililitros de solución.

    Normales: Es la que tiene el peso equivalente del soluto expresado en gramos disueltos y aforados en 1000 mililitros de solución.

    Soluto

    Ml de solución

    Concentración

    1 mol

    1000

    1 M

    1 mol

    1000g de solvente **

    1 m

    1 p eq

    1000

    1 N

    1 pf

    1000

    1 F


    Tabla de soluciones valoradas

    Un mol es igual al peso molecular del solvente, que es la suma de los pesos atómicos de los elementos que hay en la fórmula.

    Peso equivalente químico es el peso en gramos de un elemento o radical capaz de reaccionar o desplazar una molécula gramo de hidrogeno o el peso molecular de compuesto entre el número de hidrógenos sustituibles o la valencia neta positiva.

    Existen en la naturaleza compuestos que para cristalizar necesitan incluir en su formula moléculas de agua, en estos casos el peso molecular se designa como Peso Formula.

    5.9 Cálculo de la cantidad de soluto y solvente de soluciones valoradas de diferentes concentraciones.

    Soluciones porcentuales.

    Para calcular la cantidad de soluto:

    X g -------------- 100 ml
    ¿? -------------- y ml
    Ejemplo:
    Se requieren 3.2 ml de solución al 5%.

    5g -------------- 100 ml
    ¿? -------------- 3.2 ml

    ¿? = 0.16 grs

    Soluciones molares:

    1. Calcular el peso molecular gramo/mol de soluto.
    2. Sumar los pesos de la fórmula.
    3. Se mide el peso en gramos o volumen correspondiente.
    4. Se afora en el matraz volumétrico de 1000 ml.

    Para calcular la molaridad de una solución:

    X g -------------- 1M -------------- 1000 ml
    Y g -------------- ¿? M -------------- 1000 ml

    ¿? = Z m

    X g -------------- Z M -------------- 1000 ml
    X g -------------- ¿? M -------------- A ml

    ¿? = M Final


    Ejemplo:
    Calcular la molaridad de una solución de 316 grs. de MgBr2 en 859 ml.

    Mg = 240312 grs./mol. 24.312
    Br = 79.909 grs./mol. 159.818
    184.130 Peso molecular de MgBr2

    184.130 grs. MgBr2 -------------- 1 M -------------- 1000 ml
    316 grs. MgBr2 -------------- ¿? M -------------- 1000 ml

    ¿? = 1.716 M

    316 grs. MgBr2 -------------- 1.716 M -------------- 1000 ml
    316 grs. MgBr2 -------------- ¿? M -------------- 859 ml

    ¿? = 1.4741 M

    Resultado Final = 1.471 grs. MgBr2


    Para calcular la cantidad de soluto de una sustancia.

    X grs. -------------- 1 M -------------- 1000 ml
    ¿? grs. -------------- Y M -------------- 1000 ml

    ¿? = Z grs.

    Z grs. -------------- Y M -------------- 1000 ml
    ¿? grs. -------------- Y M -------------- A ml

    ¿? = grs. Final

    Ejemplo:
    Se requiere preparar una solución de NaOH 0.2 Molar en 250 ml.

    Na = 22.9898 grs. mol
    O = 15.994 grs. mol
    H = 1 grs. mol

    40 grs. NaOH -------------- 1 M -------------- 1000 ml
    ¿? NaOH -------------- 0.2 M ------------- 1000 ml

    ¿? = 8 grs. NaOH

    8 grs. NaOH -------------- 0.2 M -------------- 1000 ml
    ¿? NaOH -------------- 0.2 M -------------- 1000 ml

    ¿? = 2 grs. NaOH

     

    Resultado Final = 2 grs. NaOH
    Soluciones Normales.
    Para poder calcular la normalidad o la cantidad de soluto de una solución se requiere del equivalente químico.

    El Eq. Se calcula:


    'Cultivo in vitro'

     

    El Eq. De un ácido es igual al M gramo de la sustancia sobre el total de Hidrógenos positivos:

    'Cultivo in vitro'


    El Eq. De un Hidróxido es igual al peso molecular gr. del Hidróxido sobre el número de iones oxidrilos negativos:

     

    'Cultivo in vitro'


    Técnica de soluciones Normales.


    1. Calcular el peso molecular.
    2. Sacar el Eq.
    3. Calcular grs. o ml.
    4. Calcular pureza.

    Calcular grs.

    X grs. -------------- 1N -------------- 1000 ml
    ¿? grs. -------------- Y N -------------- 1000 ml

    ¿? = Z grs.

    Calcular pureza

    X grs. -------------- 1 N -------------- Y %
    ¿? Grs. -------------- 1 N -------------- 100 %

    ¿? = grs. Final.

    Ejemplo:
    Preparar una solución de NaOH 2 Normal AL 37%

    Na = 22.9898 grs. mol
    O = 15.994 grs. mol
    H = 1 grs. mol

    Eq.= 40 grs./1
    Eq. = 40 grs.
    40 grs. NaOH -------------- 1 N -------------- 1000 ml
    ¿? Grs. NaOH -------------- 2N -------------- 1000 ml

    ¿? = 316.2162 grs.


    5.10 Técnicas para preparar soluciones valoradas.

    1. Se calcula la cantidad de soluto de la sustancia requerida.
    2. En un matraz aforado se mezclan las sustancias.

    5.11 Preparación de una solución valorada.

    Se requiere preparar una solución .4 N de HCl con una pureza de 37.6% y una densidad de 1.1 85 g/ml.


    Calcular la cantidad de soluto:

    H = 1.0079
    Cl =35.453
    36.4609

    Eq.= 36.4609/1

    36.4609 grs. HCl -------------- 1 N -------------- 1000 ml.
    ¿? grs. HCl -------------- 0.4 N -------------- 1000 ml

    ¿? = 14.58436 grs.
    14.58436grs. HCl -------------- 1 N -------------- 1000 ML
    ¿? grs. HCl -------------- 1 N -------------- 100 ml

    ¿? = 1.458436 grs

    Calcular pureza:

    1.458436 grs. HCl -------------- 1 N ------------ 37.6%
    ¿? grs HCl -------------- 1 N -------------- 100%

    ¿? grs.= 3.87881914 grs.

    ? = 1.185 g7ml
    V = m/?
    V = 3.87881914/1.185
    V = 3.273265 ml


    BIBLIOGRAFIA:


    CLIFTON, E MELOAN. Problemas y Experimentos en Análisis Instrumental.
    Editorial Reverte Mexicana, S. A. 1973. México

    FLASCHKA, H. A. Química Analítica Cuantitativa Vol. II. Compañía Editorial Continental S.A. México. 1980.

    GARZON G. GUILLERMO “Fundamentos de Química General” serie Skgaum segunda edición 1989.

    HOMER, D. CHAPMAN. Métodos de Análisis para suelos, plantas y aguas. Editorial Trillas. México. 1979.

    OROZCO, D. FERNANDO. Análisis Químico Cuantitativo. Editorial Porrua. 1981

    SAUNDERS, L. Fisicoquímica para estudiantes de biología, farmacia y medicina