Universidad Autónoma Metropolitana.

Unidad Xochimilco.

Departamento de Producción Agrícola y Animal.

Medicina Veterinaria y Zootecnia.

Modulo: Reproducción de Mamíferos e Inseminación Artificial.

Seminario: Congelación de Semen en Conejo.

INDICE.

RESUMEN. ………………………………………………………………………..3

INTRODUCCIÓN. ………………………………………………………………..3

ANTECEDENTES. ...……………………………………………………………..4

1.- CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN DE CONEJO. ……………………….4

2.- FACTORES QUE DETERMINAN EL ÉXITO

EN LA CONGELACIÓN DEL SEMEN. …………………………………...6

2.1.- Recolección del semen. ……………………………………………………………...6

2.2.- Dosis de semen. ……………………………………………………………………….8

2.3.- Soluciones amortiguadoras comúnmente

utilizadas en la dilución de semen………………………………………………….8

2.3.1.-Solución de citrato. …………………………………………………………..8

2.3.2.-Solución Tris. …………………………………………………………………8

2.4.- Sustancias protectoras contra el desarrollo.

Microbiano. …………………………………………………………………………..9

2.5.- Crioprotectores. ……………………………………………………………………...9

2.5.1.- Glicerol. ……………………………………………………………………...10

2.5.2.- Yema de huevo. ……………………………………………………………...10

3.- FACTORES QUE DETERMINAN EL FRACASO

EN LA CONGELACIÓN DEL SEMEN. …………………………………...11

3.1.- Congelación. ………………………………………………………………………….11

3.2.- Crioprotectores. ……………………………………………………………………...12

3.3.- Cambios de temperatura. …………………………………………………………...12

3.4.- Daño acrosomal. ……………………………………………………………………..13

3.5.- Daño en la membrana espermática. ……..……………………………………….13

3.6.- Almacenamiento del semen. ………………………………………………………...13

4.- ALMACENAMIENTO. ………………………………………………………13

5.- USOS Y BENEFICIOS. ………………………………………………………14

6.- CONCLUSIONES. ……………………………………………………………15

7.- GLOSARIO. …………………………………………………………………...15

8.- BIBLIOGRAFIA. ……………………………………………………………...19

RESUMEN.

De todas las biotecnologías aplicadas a la reproducción animal asistida, crioconservación de semen es una de las que más impacto ha tenido sobre la producción animal: bovinos, porcinos y equinos principalmente, durante las últimas décadas, el uso de la crioconservación ha contribuido al mejoramiento genético notoriamente. El objetivo de este trabajo es saber cuales son los factores que ayudan al éxito y al fracaso en la congelación del semen en conejo así como los usos y beneficios de utilizar esta técnica en esta especie. Valorar las características seminales, la recolección del semen, dosis del semen, el uso de crioprotectores, diluyentes, crioprotectores, temperaturas de congelación, soluciones amortiguadoras y almacenamiento, antes de realizar la congelación del semen, es de fundamental importancia para tener éxito en el desempeño reproductivo de este semen, sin embargo los malos procesos de congelación, toxicidad de los crioprotectores utilizados, variaciones de temperatura, daño acrosomal, los cambios asociados a la membrana de los espermatozoides y al almacenamiento del semen post - descongelado afectan notoriamente la calidad del semen. La congelación aun no es una práctica común en el semen del conejo ya que la viabilidad de los espermatozoides es baja en la producción cunícola mundial especialmente en Europa se utiliza la monta directa o la inseminación en fresco ya que es mas viable. Pero el uso del conejo como modelo de investigación reproductiva es ampliamente difundido.

INTRODUCCIÓN.

La crioconservación del semen es una técnica que se debe de realizar rutinariamente, consiste en preservar a los espermatozoides bajo condiciones estables y adecuadas en las cuales puedan sobrevivir. De todas las biotecnologías aplicadas a la reproducción animal asistida, crioconservación de semen es una de las que más impacto ha tenido sobre la producción animal: bovinos, porcinos y equinos principalmente, durante las últimas décadas, el uso de la crioconservación ha contribuido al mejoramiento genético notoriamente. El objetivo de este trabajo es saber cuales son los factores que ayudan al éxito y al fracaso en la congelación del semen en conejo así como los usos y beneficios de utilizar esta técnica en esta especie. Inmediatamente después de realizar la colecta, la cual se realiza con una vagina artificial se debe de valorar el estado físico del eyaculado microscópico y macroscópico así como tener en cuenta las características del eyaculado según la especie por ejemplo: la cantidad de catalasa, el volumen eyaculado (0.1 - 1.5 ml.) etc., es importante mantenerlo a una temperatura correcta para evitar la muerte de los espermatozoides por shock térmico. Cuando un eyaculado nos aporta datos dentro de los rangos establecidos para la congelación se procede a realizarla teniendo en cuenta que los protocolos de congelación varían según la especie y los diluyentes (medio Stranzinger, Ácido cítrico y Tris-buffer con DMSO), crioprotectores (glicerol, DMSO y yema de huevo) a utilizar. Es muy importante que después de haber congelado el semen tenemos que observar su calidad post - descongelado (integridad espermática, acrosoma normal, vivos y muertos), para ver si es viable en la IA ya que se ha visto que el 50 % de estos mueren principalmente en los periodos de congelación y descongelación, en este procedimiento intervienen factores que dañan al eyaculado ya sea la toxicidad de los crioprotectores provocados por la permeabilidad de la membrana espermática, cambios de temperatura provocados por el traslado de la pajillas, el daño acrosomal debido a la capacitación prematura provocada por la descongelación del semen y el almacenamiento del semen el cual se realiza a 197 °C. Es muy importante tener en cuenta todos estos pasos si se quiere utilizar el semen para un programa de criocongelación. el uso del conejo como modelo para la aplicación del mejoramiento de esta técnica y otras ha sido excepcional, partiendo de este animal para realizarlo con otras especies incluso el hombre.

ANTECEDENTES.

En la medicina veterinaria, la preservación del semen esta ligada con el desarrollo de la inseminación artificial. El primer reporte de un intento de crioperservación data del sacerdote Spallanzani en 1776 quien intento congelar semen con la ayuda de nieve además el fue quien realizó la primer inseminación exitosa en perros en 1785. Después de 100 años Repiquet publicó sus estudio “A cerca de posibilidades teóricas acerca del uso practico de la inseminación artificial” en la Academia Veterinaria en Francia y postulando el éxito de la aplicación de la inseminación artificial como una herramienta en la reproducción (Pesch, 2007; Royere, 1996).

Desde el descubrimiento de métodos para la congelación del semen en 1940 por Polge, se han tenido espectaculares resultados; a pesar de esto, aún existen algunos obstáculos que no han sido superados (Córdova, 2005).

El desarrollo de la preservación del semen se puso en práctica en el siglo veinte, en Moscú por Ivanov, seguido posteriormente por Milanov (Pesch, 2007).

Varios investigadores lograron recuperar espermatozoides de varias especies después de congelarlos en solución con agentes crioprotectores como el glicerol. A partir de entonces, se han desarrollado diversas técnicas para congelar gran cantidad de material biológico (espermatozoide, células sanguíneas, tejidos, óvulos, embriones, etc.) con buenos resultados en algunos casos, aunque en otros no han sido satisfactorios (Córdova, 2001).

Los bancos genómicos han tomado popularidad entre los zoológicos para preservar la viabilidad genética. Estos bancos genómicos contienen gametos congelados y embriones los cuales pueden permanecer por décadas. Estos se guardan para investigaciones o recursos para futuras inseminaciones (Kouba, 2001).

Cuando se vende semen congelado, el primer paso antes de comercializarlo es considerar: sus diluyentes, rangos de congelación del semen, concentración de crioprotectores, empaquetamiento para la refrigeración y condiciones de congelación (Foote, 2002).

1.- CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN DE CONEJO.

La calidad del semen debe de evaluarse antes de usar a los machos como sementales. Una ves que se ha colectado el semen, pueden emplearse varios criterios para evaluar la calidad del semen. No debe de confundirse la evaluación del semen con la prueba de fertilidad, ya que la última se cuantifica mediante las tasas de concepción y la producción de descendencia viable (Noguez, 2004).

El semen es el producto de la mezcla de materia seminal, fluido producido por los conductos excretores, las glándulas accesorias del aparato genital masculino (Noguez, 2004). La eyaculación del conejo es bifásica, primero eyacula el contenido de las ampollas de Henle y casi al mismo tiempo el líquido prostático que al reunirse con la secreción de las glándulas vesiculares, determinandose la gelificación del semen, y a su vez formándose una especie de tapón mucoso que actúa mecánicamente impidiendo el reflujo del semen a través de la vagina (Wall, 1999).

Las características seminales varían según los eyaculados dentro de un mismo individuo, el volumen del semen del conejo va desde 0.1 hasta 1.5 ml. y con un concentración de un millón hasta cien millones (Badú, 2000).

Otra característica del semen del conejo es la cantidad de catalasa, fructosa acido cítrica clicerolfosforicolina (GPC) las cuales son protectores del semen para evitar una reacción por parte del peróxido de hidrógeno, esto lo tienen pocas especies, gracias a la catalasa se mejora la supervivencia de los espermatozoides (Echegaray, 1999; Holtz, 1978). Al igualmente, es sensible a las soluciones hipertónicas y a la adición de agentes crioprotectores como grupos hidroxilo y al glicerol (Liu, 2004).

El estudio bioquímico y biofísico de la membrana plasmática ha probado variaciones ínter especies, en la cual el grado de sensibilidad por congelamiento se cree va ligado a la función de la membrana y ha sido correlacionado con los fosfolípidos y el colesterol contenidos en esta. Evidencias indican de esta variación en el esperma de ratón crioperservado el cual es atribuido a las diferencias en la sensibilidad de la membrana plasmática y al shock osmótico (Thurston, 2001).

El semen del conejo a diferencia de otras especies resiste más el shock térmico. Esto es atribuido a su alto contenido de colesterol y fosfolípidos. Estos componentes seminales son esenciales para mantener la estructura celular de la membrana espermática (Abdel-Ghaffar, 1995; Castellini, 2003).

Composición del semen en conejo.

Parámetros	Primer eyaculado	Segundo eyaculado
Volumen (sin gel) ml	0.1-1.1	0.2-0.4
Volumen de la fracción de gel (ml)	0.32-0.50	0.1-0.18
Eyaculados con gel (%)	54	15
Espermatozoides/ml semen (x106)	280-1,050	420-800
Motilidad (%)	58-90	57-87
Ph	7.7 - 8.4	7.7 - 8.4

(Zárate, 2002).

Composición del plasma seminal en conejo.

Plasma Seminal
Fructuosa (ml/100 ml)	40-150
Sorbitol (ml/100 ml)	80
Ácido cítrico (ml/100 ml)	70-200
Proteína (ml/100 ml)	4-15
Glyserolfosforicolina (ml/100 ml)	215-370
Sodio (moles/l)	80-140
Potasio (mmoles/l)	23-120
Fósforo (mmoles/l)	1-3
Magnesio (mmoles/l)	2-4
Calcio (moles/l)	2-8

(Zárate, 2002).

2.- FACTORES QUE DETERMINAN EL ÉXITO EN LA CONGELACIÓN DEL SEMEN.

La criópreservación del semen has sido ampliada exitosamente en otras especies, sin embargo existen variaciones en la cualidad del semen descongelado entre individuos (Thurston, 2001). Para esto el propósito de la criobiología el cuál es encontrar el optimo proceso para congelar (usando nitrógeno liquido), y prevenir la cristalización del agua dentro de los tejidos (Kieselev, 2000).

Entre los diferentes factores que influyen en la fertilidad de la congelación - descongelación del semen en diferentes especies se encuentran: la naturaleza de los crioprotectores, la temperatura en la descongelación, concentración espermática y variaciones en la metodología (Buhr, 2001).

El semen puede ser conservado mediante refrigeración o congelación. La congelación disminuye la tasa metabólica y prolonga la sobré vivencia espermática. Los diluyentes del semen utilizados para la congelación protegen las membranas espermáticas de los daños causados por los cambios de temperatura, proveen energía, estabilizan el pH y la presión osmótica (Stornelli, 2006).

2.1.- Recolección del semen.

La capacidad de fuentes fidedignas para recoger muestras de semen eyaculadas de modelos artificiales para estudios andrológicos es crítica. Los conejos con regularidad han sido usados en estudios andrológicos debido a la facilidad relativa de obtener el semen eyaculado con la ayuda de una vagina artificial (Moriya, 1996; Oliveira 2004; Bustamante, 1980). Aunque en ciertos casos se da la perdida del 10 % del eyaculado dependiendo del tipo de vagina artificial que se llegara a utilizar, ello depende del modelo, dimensiones y tipo de lubricante (Amann, 2004).

La carencia de preparación sexual probablemente puede contribuir a tener valores bajos, en el eyaculado total. La evaluación apropiada de un macho requiere múltiples colecciones cada 2 o 3 días, usando montajes falsos, por el período de semanas o meses (Amann, 2004).

El pronto procesamiento de semen después de la recolección es importante para evitar la acumulación de productos del metabolismo, mantener la motilidad espermática, y prevenir los efectos peligrosos de la exposición a la luz (Foote, 1982).

Para la recolección del semen se utilizan conejos en jaulas individuales con el fin de presentar a la hembra, el macho intentara montarla, se tendrá ya una vagina artificial (Naughton, 2003) con temperatura de 45 a 50º C al momento de la colecta la cual se considera como un receptáculo que trata de proporcionar al órgano copulador los estímulos térmicos, mecánicos y de la elasticidad necesarios para que la eyaculación se produzca (Wall, 1999; Naughton, 2003).

La recolección de semen se tendrá que mantener a 35ºC para poder evaluar el volumen, color, motilidad progresiva, vivos/muertos y morfología (Devireddy, 1999.). El dispositivo es puesto abajo de la hembra con una dirección caudal. Cuando el macho comienza a montar, el dispositivo es colocado más posteriormente e inferiormente permitir la penetración del conejo en la vagina artificial. El tiempo de eyaculado ocurre rápidamente y el dispositivo es retirado (Moriya, 1996.). El tiempo de preservación del semen afecta a la motilidad, viabilidad y morfología (Devireddy, 1999).

En programas de reproducción, para acortar los intervalos de generación, el semen debe ser colectado de machos lo mas jóvenes posible. Para hacer la recolección de semen un proceso más eficiente, es importante obtener el máximo número de las mejores cualidades de dosis seminales de cada macho en el periodo más corto posible (Silvestre, 2004).

Algunas veces la libido, la producción de espermas y otras características sexuales pueden limitar el uso de ese macho (Silvestre, 2004).

Factores que ayudan a la criopreservación exitosa de semen.

Factor importante en criopreservación	Substancias o condiciones usualmente utilizadas
Procesamiento de semen	Inmediatamente después de la recolección
Macromoléculas para proteger al esperma contra el shock-frio de la precongelación	Yema de huevo buferizada Leche caliente
Tasa de enfriamiento y tiempo de precongelación	Enfriar en 1-2 hrs El tiempo de precongelación varia con el diluyente y la especie
Crioprotector especial	Usualmente glicerol
Tasa de congelación	Varia: de + 5 ºC a - 100 ºC en 10 minutos
Temperatura de almacenamiento	-196 ºC en nitrógeno liquido
Tasa o temperatura de descongelamiento	Usualmentese descongela de 30-37 ºC

(Foote, 1982).

2.2.- Dosis de semen.

La dosis normal oscila entre 15 a 20 millones de espermatozoides. De esta manera las conejas no receptivas requieren de un cantidad de 13 millones en comparación de conejas receptivas con 11 millones aproximadamente (Srisombut, 1998), haciendo de esto una dosis de semen por cada pajilla de 20 millones en 0.5 ml (Devireddy, 1999).

En explotaciones cunícolas comerciales, los eyaculados generalmente no están muy diluidos (1:4 a 1:10) una cantidad espermática mayor a los 16 millones (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

2.3.- Soluciones amortiguadoras comúnmente utilizadas en la dilución de semen.

Puede evitar cambios o alteraciones mínimas en el pH al neutralizar los ácidos producidos por la actividad metabólica de los espermatozoides, así como un ambiente isotónico para los mismos. Una característica de los buffer, es que debe ser atóxica para los espermatozoides (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

2.3.1.-Solución de citrato.

El común es el citrato de sodio deshidratado, el inconveniente se da cuando se mezcla con la yema de huevo, dejando sumamente transparente la muestra y de difícil observación en forma individual (Vargas, 2002; Zárate, 2002; Royere, 1996).

La adición de yema de huevo-citrato después de la recolección, protege al esperma contra el shock frio (Foote, 1982).

Solución: Citrato de sodio al 2.9% (medio de Strazinger), disuelto en 100 ml. de agua destilada y se añade un 20% de yema de huevo (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

Tris (hidroximetilaminometano) / gr.	3.028
Glucosa / gr.	1.25
Ácido cítrico / gr.	1.675

(Vargas, 2002; Zárate, 2002).

2.3.2.-Solución Tris.

Conocida como Hidroximetilaminometano, como un medio amortiguador. Este parece prolongar la vida de los espermatozoides a temperaturas de 5º y a 196 º C (Vargas, 2002; Zárate, 2002; Royere, 1996).

Se han realizado diversas combinaciones de diluyentes basados en amortiguadores como: Tris adicionado con ácido cítrico, utilizados en combinación de la yema de huevo (20%), obteniendo una capacidad amortiguadora suficiente para mantener un pH neutro (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

El buffer Tris y la yema de huevo-glicerol también proveen de una excelente protección para el esperma congelado en dosis de 1 g/100 mL y descongelado (Foote 2002; (López-Gatiusa, 2005).

La sustancia basada en TAM (tris-hidroximetilaminometano) ha sido la más específica por su eficiencia en la conservación de semen de conejo (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

Una fórmula más compleja utilizando Ácido citrico y Tris-buffer con dimetilsulfoxido (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

Tris-buffer.	3.029 g.
Acido cítrico monohidratado.	1.675 g.
D-glucosa monohidratada.	1.250 g.
Agua destilada.	85 ml.
Albúmina de huevo.	20 ml.
Penicilina G-sódica.	100000 U.I.
Estreptomicina, sulfato.	0.1 g.
DMSO.	20 ml.

(Vargas, 2002; Zárate, 2002).

2.4.- Sustancias protectoras contra el desarrollo microbiano.

La contaminación microbiana y de los agentes patógenos en el semen y la infertilidad de la hembra se pueden evitar con la adición de antibióticos en los diluyentes, más comúnmente utilizada la penicilina, la estreptomicina y la sulfonamidas (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

Estos agentes antimicrobianos controlan los microorganismos presentes en el semen diluido y almacenado a temperaturas superiores a 0º C. La cantidad de penicilina utilizada para causar un efecto antimicrobiana en el semen va de los 500 a 1000,000 de U. I./ml. y de 1000 ðg. de dehidroestreptomicina por ml. (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

2.5.- Crioprotectores.

Durante el proceso de congelación, las sustancias crioprotectoras son esenciales para disminuir el daño espermático ocasionado por el descenso de temperatura, ya que estos remplazan el agua intracelular durante la congelación, permitiendo que el fluido intracelular pueda ser superenfriado a temperaturas entre -5 y -15 °C sin que ocurra la formación de cristales de hielo, debido a que estas sustancias disminuyen el punto de congelación por medio de la reducción en la interacción entre las moléculas de agua. Por su parte, la velocidad del enfriamiento puede determinar un mayor o menor efecto de la congelación sobre la viabilidad espermática (Cruz, 2006).

Las células durante las fases de congelamiento se enfrentan a cambios osmóticos por la entrada y salida del agua en la membrana celular para evitar esto se ha creado los crioprotectores que ayudan a la célula a sobrevivir a este proceso (Srisombut, 1998).

Las optimización de técnicas para la críoconservación del esperma esta limitada por el conocimiento referente a la permeabilidad del agua, características durante el enfriamiento, la presencia de hielo extracelular y agentes crioprotectores (Curry, 2000).

Algunos de los crioprotectores utilizados son: dimetil sulfoxido (DMSO), glicerol, metanol, propanediol, etyl glicol, acetamida, tetralosa, metil celulosa, yema de huevo y leche descremada estos crioprotectores funcionan ya que son de bajo peso molecular y penetran la membrana del esperma (Castle, 1997; Lopez-Gatius, 2005; Mocé, 2002; Foote, 1993; Kiselev, 2000; Chenier, 1998; Royere, 1996).

Durante el congelamiento de las células en suspensión: el hielo se encuentra en el espacio extracelular causando un gradiente osmótico (Castle, 1997; Lopez-Gatius, 2005).

2.5.1.- Glicerol.

Bernstein y Petropavlovsky fueron los primeros en describir el uso del Glicerol al 9.2% como solución crioprotectora en semen de conejo (Pesch, 2007). El descubrimiento esta acción crioprotectora del glicerol, permite congelar los espermatozoides con ayuda de agentes potenciales crioprotectores, el glicerol ha permanecido sin excepción como el mejor crioprotector en todas las especies (Crabo, 2001; Castle, 1997).

La adición de glicerol al medio de preservación causa que el esperma se mantenga fértil después de la congelación y el descongelamiento (Foote, 1995).

El glicerol es un esencial crioprotector en todos los diluyentes convencionales para esperma de equino. Muchos otros crioprotectores han sido recientemente probados en esperma de sementales. Entre estos el dimetil formamide el cual provee un efecto similar en el semen de sementales como el glicerol (Vidament, 2002).

La utilización de 1.0 M de glicerol ha demostrado un alta grado de preservación en el semen de conejo (Kashiwazaki, 2006).

2.5.2.- Yema de huevo.

El descubrimiento de la yema de huevo para minimizar el shock térmico fue hecho en Selivanova (Pesch, 2007).

La yema de huevo es un componente habitual de los diluyentes para semen debido a que sus fosfolípidos y proteínas de baja densidad protegen al espermatozoide del shock de frío (Stornelli, 2006).

La membrana de los espermas de los conejos es más permeable a componentes lípidos, la emulsificación con la yema de huevo, podría disminuir el shock térmico en la congelación del esperma (Arriola, 2001).

La yema de huevo-tris, yema de huevo-citrato, yema de huevo-lactosa, y diluciones de leche que han sido utilizadas exitosamente en Ganado, han sido adaptadas para muchas otras especies. Muchas de estas diluciones protegen al esperma durante la congelación, se a juzgado por la motilidad post congelación y la integridad de los acrosomas (Foote, 1982) se ha visto que la adición de un 20% de yema de huevo en diluyantes para congelación de semen en conejo (Vargas, 2002; Zárate, 2002).

En las últimas décadas, varios procedimientos para la crioconservación de espermatozoides de diferentes especies han evaluado el uso de una amplia variedad de sustancias crioprotectoras, utilizadas en diferentes concentraciones y protocolos de congelación, con resultados variables, lo cual hace necesario la realización de más estudios para estandarizar un protocolo definitivo (Cruz, 2006).

Dosis de crioprotectores usadas para la congelación de semen.

Agente crioprotector.	Motilidad progresiva post - descongelado.	Integridad de la membrana espermática.
1.0 M glicerol.	17.0 ± 3.3 %	17.0 ± 2.6 %
1.0 M lactamida.	37.8 ± 3.0 %	35.9 ± 3.3 %
1.0 M acetamida.	28.3 ± 3.8 %	30.2 ± 3.0 %
1.0 M DMSO.	25.3 ± 3.5 %	27.0 ± 2.4 %

(Kashiwazaki, 2006).

3.- FACTORES QUE DETERMINAN EL FRACASO EN LA CONGELACIÓN DEL SEMEN.

La posibilidad de obtener buenos resultados de semen críopreservado puede cambiar según sea el caso en diferentes especies (Polgár, 2000), también se ha visto que en óptimos protocolos de criopreservación en espermatozoides de mamíferos solamente se conservan vivos el 50 % de los espermatozoides totales (Green, 2001; Rasul, 2001).

La criopreservación de semen a demostrado bajos rangos de concepción y pequeñas camadas después de la inseminación artificial en comparación con la inseminación con semen fresco (Buhr, 2001).

Existen variados tipos de daños asociados tanto al congelamiento propiamente, dicho como a los componentes de un diluyente (Stornelli, 2006).

Las anormalidades morfológicas de los espermas son utilizadas como un indicador de stress biológico causados por críodaños o intoxicaciones (Gravance, 1995).

Estos daños están relacionados con los cambios de temperatura (shock de frío), la toxicidad de los crioprotectores y la formación y disolución de hielo en el medio ambiente intracelular. Cada paso del protocolo de criopreservación podría afectar la estructura de la membrana así como el metabolismo y la función celular. Sin embargo los pasos están interrelacionados entre sí y un cambio en uno de ellos puede modificar el efecto de otras variables (Stornelli, 2006; Hassa, 1996).

Una limitante importante en el conejo es el bajo volumen del eyaculado y la baja concentración de los espermatozoides en proporción con su poca resistencia de las células durante largos periodos de almacenamiento hacen deficiente el uso de este para la inseminación artificial (Badú, 2000).

Varios protocolos para la crioconservación de espermatozoides han sido desarrollados durante los últimos 25 años. En general, los resultados son muy variables, indicando una alta sensibilidad de los protocolos propuestos, lo cual hace necesario, en la mayoría de los casos, ajustar el procedimiento para cada especie (Navarro, 2004).

3.1.- Congelación.

En este sentido, la congelación intracelular es letal para la célula dependiendo particularmente del tamaño y de la cantidad de cristales de hielo formados en el citoplasma, ya que altas velocidades de enfriamiento producen cristales intracelulares pequeños que pueden llegar a ser inocuos, pero éstos pueden unirse y crecer durante la descongelación por medio de un proceso denominado recristalización. En la mayor parte de los casos, las células bajo formación de hielo intracelular (IIF) dejan inactivada osmóticamente a la célula (lisada), esto hace que pierdan la integridad de la membrana celular (Castle, 1997; Chen, 1989; Navarro, 2004; Cruz, 2006), alteración del metabolismo espermático y pérdida de la motilidad, factores que afectan la capacidad fecundante del semen (Stornelli, 2006; Green, 2001).

Generalmente el semen de conejo es diluido para su utilización inmediata, por lo que no ha sido necesario un método de congelamiento, además que posee características que hacen difícil su congelamiento (Lopez-Gatius, 2005; López 1998), ya que la problemática se basa en las características del centrosoma, el cual sirve como organización de los microtúbulos en el centro de los cigotos (Liu, 2004).

3.2.-Crioprotectores.

El grado de toxicidad del crioprotector y su velocidad de difusión a través de la membrana plasmática, dependen de la temperatura a la cual son incorporados a la solución de semen y del tiempo de exposición celular. Esta difusión puede verse afectada por el descenso de la temperatura, ya que durante este proceso la membrana celular aumenta la proporción de colesterol con el propósito de lograr mayor estabilidad mecánica; sin embargo, este aumento del colesterol también disminuye la permeabilidad de la membrana a pequeñas moléculas, pudiendo afectar la penetración del crioprotector en la célula de una manera efectiva (Cruz, 2006).

El uso del glicerol se ha restringido en su utilización para la congelación del semen, ya que en el caso del conejo se puede deber a una alteración en la permeabilidad de la membrana (Crabo, 2001; Castle, 1997; Lopez-Gatius, 2005; Badú, 2000), además de la posible toxicidad en los espermatozoides, mientras que con la adición de otros crioprotectores como la Acetamida, Lactamida y DMSO (Dimetil sulfoxido), no se han observado dichos resultados Kashiwazali, et. al, 2004).

El semen congelado luego de la descongelación posee una vida mucho más corta que el semen fresco, debido a que los protocolos de criopreservación producen un número potencial de factores de estrés que pueden producir variados cambios en el espermatozoide (Stornelli, 2006; Gravance, 1998).

3.3.-Cambios de temperatura.

Se considera que el principal sitio de daño asociado a los cambios de temperatura son las membranas espermáticas. La reducción de la fertilidad asociada al semen congelado es atribuida en gran parte a la alteración de la estructura y función de las membranas durante los procesos de refrigeración, congelación y descongelación. Para poder interactuar con el ovocito, los espermatozoides deben estar vivos, motiles y poseer las membranas plasmática y acrosomal intactas y funcionales (Stornelli, 2006).

Los procesos de congelación-descongelación resultan en reducción de la fertilidad del semen criopreservado si lo comparamos con el semen fresco. Este hecho es el resultado tanto de la pérdida de viabilidad espermática (población de espermatozoides muertos) como de las alteraciones funcionales instauradas en la población sobreviviente (Stornelli, 2006).

3.4.-Daño acrosomal.

Los procesos de criopreservación afectan la integridad acrosómica. El acrosoma debe estar intacto en el momento de la inseminación debido a que la reacción acrosómica debe ocurrir en el sitio donde ocurra la fertilización. La morfología acrosómica puede ser observada mediante microscopio de contraste de fase, microscopio electrónico de transmisión, lectinas marcadas con sustancias fluorescentes y anticuerpos monoclonales (Stornelli, 2006; Gravance, 1998; Royere, 1996; Zekariya, 2006).

3.5.- Daño en la membrana espermática.

Los espermatozoides criopreservados exhiben modificaciones de membrana similares a las ocurridas en espermatozoides capacitados, dichos eventos reducen la longevidad espermática. Estos cambios similares a la capacitación espermática están relacionados con eventos que desestabilizan las membranas. Un aumento de la tasa de concepción puede lograrse mejorando los métodos de criopreservación tratando de prevenir o minimizar la ocurrencia de los eventos que desestabilizan las membranas y aumentando así la cantidad de espermatozoides con capacidad fecundantes en la población de espermatozoides sobrevivientes luego del proceso de criopreservación (Stornelli, 2006; Tamer, 2005; Royere, 1996; Zekariya, 2006).

3.6.- Almacenamiento del semen.

Durante el almacenamiento el incremento de la temperatura con el manejo descuidado de las pajillas, la posibilidad de fallar en mantener los tanques de nitrógeno liquido recargados a tiempo, pueden contribuir a una pequeña baja en la fertilidad (Foote, 1982).

4.- ALMACENAMIENTO.

Empacar el semen congelado para su uso con dióxido de carbono sólido o nitrógeno líquido fue un problema, las ampolletas de vidrio se rompían durante el congelamiento y la descongelación. Se desarrollo un método de sellado en pajillas plásticas y una pistola para inseminación (Foote, 2002).

Originalmente se utilizaron pajillas de 0.5 ml de capacidad, pero se usan más las de 0.25 ml de capacidad por que utilizan menos espacio de almacenamiento (Foote, 2002).

Otro cambio mayor en el almacenamiento ocurrió en 1950, con el cambio de almacenamiento en dióxido de carbono sólido a -79 ºC a nitrógeno liquido a -196 ºC. Se ha demostrado que la sobre vivencia del esperma a -196 ºC es virtualmente infinita, mientras que a -79 ºC ocurren cambios biológicos (Foote, 2002).

El almacenamiento de nitrógeno líquido fue también un problema por que el aislamiento de los tanques era ineficiente. La recarga frecuente era requerida para mantener una temperatura segura de -196 ºC.

Una práctica comúnmente usada para el almacenamiento en periodos cortos 48 horas, es a temperaturas de 5 a 25° C (Badú, 2000).

Los fabricantes no estaban interesados en mejorara los tanques, hasta que J. Rockefeller Prentice, dueño del Servicio Americano de Criadores, privadamente proporcionó una suma de dinero substanciosa, que convenció a la división Linde de la Compañía Americana Cyanamid, de que había mercado para contenedores de nitrógeno liquido con una aislamiento mejorada. La exitosa criopreservación del esperma y el desarrollo de contenedores de nitrogeno liquido, proporcionaron la fundación en la que toda la industria de la criopreservación ahora esta construida (Foote, 2002).

5.- USOS Y BENEFICIOS.

El conejo es un importante modelo de estudio en espermatozoide y la fertilización. Es usado ya por su facilidad en la recolección del semen, así como el simple proceso de inseminación artificial que facilita el estudio del mismo (Arriola, 2001; Chen, 1989; Farrell, 1993).

El semen de conejo no solo puede ser utilizado para estudios de fertilidad, si no también para la propia reproducción de la especie, sin embargo la motilidad en los espermatozoides puede diferir no solo en su utilización para su manejo ya sea fresco o congelado, sino también en la raza (Moriya, 1999).

El desarrollo de la tecnología en criopreservación ayuda a machos y a hembras en problemas de infertilidad. La criopreservación nos da la oportunidad de tener esperma para usar en el futuro siguiendo claro buenos protocolos de descongelación (Hassa, 1996).

Un programa de mejoramiento genético animal requiere de una utilización intensiva de los machos superiores, los cuáles deben ser avaluados, seleccionados y comparados en su valor genético en diferentes hatos por pruebas con machos de referencias (Gibbons, 2002).

Una técnica que reduce considerablemente estos inconvenientes para el mejoramiento genético es la inseminación artificial con semen congelado. Esta técnica reproductiva incrementa la utilización de los machos genéticamente superiores y amplia las posibilidades de su difusión a gran escala. La conformación de un banco de semen congelado permite disponer con tiempo del material genético y programar su distribución en los diferentes hatos (Gibbons, 2002).

La criopreservación de los espermatozoides puede ser usada en técnicas de asistencia reproductiva especialmente en casos cuando el macho ya no puede producir espermatozoides (Tamer, 2005).

La utilización de semen congelado para la inseminación artificial es una herramienta comúnmente usada en el ganado actual (Gravance, 1998).

La conservación del semen de diferentes especies en especial en peligro de extinción podrían veneficiar los programas de manejo genético, incluyendo la aplicación de tecnologías para la asistencia reproductiva (Thiangtum, 2006).

La congelación aun no es una práctica común en el semen del conejo ya que la viabilidad de los espermatozoides de conejo es baja (Badú, 2000).

6.- CONCLUSIONES.

El semen post - descongelado deteriora en gran medida la calidad de los eyaculado las técnicas de criopreservación del semen siguen mejorándose con el paso del tiempo tratando de desarrollar nuevos métodos, protocolos y diluyentes que ayuden a mantener el semen por mas tiempo impidiendo en mayor medida el daño producido por procesos de congelación y descongelación. El uso de la congelación del semen se ha utilizado bastamente en mamíferos y el ser humano como técnica de mejoramiento genético, preservación de semen de especies en peligro de extinción y en bancos genómicos.

En la producción cunícola la congelación del semen no se ha empleado como un método reproductivo en unidades de producción animal, ya que los resultados de estos no han sido muy satisfactorios. Pero el uso del conejo como modelo para la aplicación del mejoramiento de esta técnica y otras ha sido excepcional, partiendo de este animal para realizarlo con otras especies incluso el hombre.

7.- GLOSARIO.

• Álbúmina: Es una proteína que se encuentra en gran abundancia en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre. Es sintetizada en el hígado. La concentración normal de albúmina en la sangre humana oscila entre 3,5 y 5,0 gramos por decilitro, y supone alrededor del 50% de la proteína plasmática. El resto de proteínas presentes en el plasma se llaman en conjunto globulinas. La albúmina es fundamental para el mantenimiento de la presión oncótica, necesaria para la distribución correcta de los líquidos corporales entre el compartimento intravascular y el extravascular, localizado entre los tejidos. La albúmina tiene carga eléctrica negativa. La membrana basal del glomérulo renal, también está cargada negativamente, lo que impide la filtración glomerular de la albúmina a la orina. En el síndrome nefrótico, esta propiedad es menor, y se pierde gran cantidad de albúmina por la orina

• Acrosoma: Es un pequeño depósito situado en el extremo apical de la cabeza del espermatozoide y que contiene enzimas hidrolíticas. La misión de éstas es el debilitamiento y ruptura -por efecto colaborativo de varios espermatozoides- de las distintas paredes que envuelven al óvulo. Está limitado por la mebrana acrosomal externa (adosada a la membrana celular) y por la membrana acrosomal interna (adosada a la mebrana nuclerar).

• Antibiótico: Es un medicamento que se utiliza para tratar una infección bacteriana, y que por su efecto, mata o impide el crecimiento de ciertas clases de bacterias, pero que normalmente es inofensivo para el huésped (aunque ocasionalmente puede producirse una reacción adversa a medicamento o puede afectar a la flora bacteriana normal del organismo).

• Ácido cítrico: Es un ácido orgánico tricarboxílico que está presente en la mayoría de las frutas, sobre todo en cítricos como el limón y la naranja. Su fórmula química es C6H8O7.Es un buen conservante y antioxidante natural que se añade industrialmente como aditivo en el envasado de muchos alimentos como las conservas vegetales enlatadas. En bioquímica aparece como una molécula intermediaria en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, proceso realizado por la mayoría de los seres vivos.

• Biofísica: Es la ciencia que estudia la biología con los principios y métodos de la física. Se discute si la biofísica es una rama de la física o de la biología. Desde un punto de vista puede concebirse que los conocimientos y enfoques acumulados en la física "pura" pueden aplicarse al estudio de los sistemas biológicos. En ese caso la biofísica le aporta conocimientos a la biología, pero no a la física. Ejemplos en ese sentido son la física de la audición, la biomecánica, etc.

• Bioquímica: Es la rama de la Química que estudia los seres vivos, especialmente de la estructura y función de sus componentes químicos específicos, como son las proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos, además de otras pequeñas moléculas presentes en las células. La bioquímica se basa en el concepto de que todo ser vivo contiene carbono y en general están compuestos de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre.

• Buffer o Tampón químico: En términos químicos, también es un sistema constituido por un ácido débil y su base conjugada o por una base y su ácido conjugado que tiene capacidad "tamponante", es decir, que puede oponerse a grandes cambios de pH (en un margen concreto) en una disolución acuosa.

• Carbohidratos: Son una clase básica de compuestos químicos en bioquímica. Son la forma transgenaria primaria de almacén o consumo de energía; otras formas son las grasas y las proteínas. El término hidrato de carbono es poco apropiado, ya que estas moléculas no son átomos de carbono hidratados, es decir, enlazados a moléculas de agua, sino de átomos de carbono unidos a otros grupos funcionales químicos. Este nombre proviene de la nomenclatura química del siglo XIX, ya que las primeras sustancias aisladas respondían a la fórmula elemental Cn(H2O)n (donde "n" es un entero=1,2,3... según el número de átomos). De aquí el término "carbono-hidratado" se haya mantenido, si bien posteriormente se vio que otras moléculas con las mismas características químicas no se corresponden con esta fórmula.

• Cloranfenicol (o "cloramfenicol"): Es un antibiótico derivado de la bacteria Streptomyces venezuelae y en la actualidad se produce sintéticamente. El cloranfenicol es efectivo frente a un amplio espectro de microorganismos, pero debido a sus importantes efectos secundarios (daño a la médula ósea, incluyendo anemia aplásica) en humanos, su uso se limita a infecciones muy graves, como la fiebre tifoidea. Pese a sus efectos secundarios, los la OMS aboga por su uso en muchos países del tercer mundo en ausencia de tratamientos más baratos. Se usa en el tratamiento del cólera, al destruir los vibrios y disminuir la diarrea asociada. Es efectivo contra los vibrios resistentes a la tetraciclina. Se usa también en colirios y emulsiones para tratar la conjuntivitis bacteriana.

• Congelación: Es una forma de conservación que se basa en la solidificación del agua contenida en estos. Por ello uno de los factores a tener en cuenta en el proceso de congelación es el contenido de agua del producto. En función de la cantidad de agua se tiene el calor latente de congelación. El calor latente del agua es la cantidad de calor necesario para transformar 1 kg de líquido en hielo, sin cambio de temperatura, en este caso es de 80 kcal/kg. Otros factores son la temperatura inicial y final del producto pues son determinantes en la cantidad de calor que se debe extraer del producto.

• Criogenia: Es el conjunto de técnicas utilizadas para enfriar un material a la temperatura de ebullición del nitrógeno o a temperaturas aún más bajas. La temperatura de ebullición del nitrógeno, es decir 77,36 K (o lo que es lo mismo -195,79 °C) se alcanza sumergiendo a una muestra en nitrógeno líquido. El uso de helio líquido en lugar de nitrógeno permite alcanzar la temperatura de ebullición de éste, que es de 4,22 K (-268,93 °C).

• Célula: Unidad fundamental de los organismos vivos, generalmente de tamaño microscópico, capaz de reproducción independiente y formada por un citoplasma y un núcleo rodeados por una membrana.

• Contrastación: Comprobar la exactitud o autenticidad de algo.