Clonación

Investigación genética. Genoma. Concepto. Tejidos embrionarios. Células madre. Aplicaciones médicas. Legislación

  • Enviado por: Lucero
  • Idioma: castellano
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Clonación

Se estudió la presencia de unión de transferrina en 60 cepas de distintas especies comensales de Neisseria y se seleccionó la cepa Neisseria sicca P183 para la clonación del gen tbpB. Entre las cepas de Neisseria meningitidis disponibles se seleccionó la cepa V14. En ambas cepas, se estudiaron las características de la unión de transferrina y se calcularon los pesos moleculares de sus proteínas Tbp2. Una vez caracterizadas se procedió a la construcción de una genoteca del ADN de Neisseria meningitidis V14 en el plásmido pUC8 utilizando el método de la "perdigonada". La genoteca se examinó mediante tres métodos: la detección de la proteína activa utilizando un conjugado de transferrina peroxidasa, la detección de una fracción inmunogénica de la proteína utilizando un suero policlonal y la detección de un fragmento de ADN, correspondiente al extremo amino-terminal de la proteína, utilizando un oligonucleótido marcado con digoxigenina. No se detectó ningún recombinante positivo utilizando estas tres técnicas. Para la clonación del gen tbpB de Neisseria sicca se utilizaron dos estrategias: la clonación directa de ADN específico de N. sicca P183, utilizando como sonda un oligonucleótido diseñado a partir de la secuencia amino-terminal de la proteína Tbp2 de Neisseria meningitidis V14 y la clonación previa amplificación del gen mediante PCR. Mediante la primera estrategia se detectó un recombinante que hibridaba con el oligonucleótido pero no portaba el gen tbpB. Con la segunda estrategia se logró la clonación del gen. Se confirmó la identidad del fragmento clonado y su secuencia se comparó con la de los genes tbpB de otras cepas de Neisseria previamente estudiados por otros autores cuyos genes habían sido previamente clonados y sus secuencias publicadas.

El término clonar en biología se refiere a la obtención de copias idénticas de genes, células u organismos. En cada caso los niveles de organización son diferentes por lo que los mecanismos correspondientes van de menor a mayor complejidad. En vertebrados la clonación requiere de la combinación del citoplasma de un ovocito con el núcleo de alguna célula de tejido embrionario o adulto. La adecuada sincronización del genoma del núcleo transplantado con el citoplasma del ovocito depende de la rapidez con la que requiere su expresión. El hecho de que sea tardía en las ovejas, explica en parte el éxito obtenido en la clonación de esta especie. Los experimentos también demostraron que el genoma de algunas células conserva la capacidad para ser reprogramado y dirigir el desarrollo de un nuevo organismo, pero las consecuencias biológicas amplias de esta manipulación son todavía desconocidas. A raíz de estos experimentos la inquietud mundial es evitar que se llegue a la clonación humana, aunque ésta no es posible en un sentido estricto ya que un individuo clonado desarrollaría una conciencia individual ajena al individuo del cual se tomó el núcleo. Sin embargo, la investigación de clonación en especies domésticas y de laboratorio representa enormes posibilidades económicas y para dilucidar procesos biológicos aún desconocidos.

Clonación: Aspectos Científicos

El 27 de febrero de 1997 la revista científica Nature publicaba el informe sobre la primera clonación de un mamífero a partir del núcleo de una célula adulta de otro individuo. La “presentación en sociedad” de la oveja Dolly es uno de esos momentos en los que la ciencia espolea una plétora de reacciones emocionales de todo tipo, despertando sueños (o pesadillas) y reavivando mitos y viejos fantasmas.

1. Que es la clonación?

Hay que diferenciar el uso de la palabra clonación en distintos contextos de la biología:

Si nos referimos al ámbito de la Ingeniería Genética, clonar es aislar y multiplicar en tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN. Sin embargo, Dolly no es producto de Ingeniería Genética.

En el contexto a que nos referimos, clonar significa obtener uno o varios individuos a partir de una célula somática o de un núcleo de otro individuo, de modo que los individuos clonados son idénticos o casi idénticos al original.

En los animales superiores, la única forma de reproducción es la sexual, por la que dos células germinales o gametos (óvulo y espermatozoide) se unen, formando un zigoto (o huevo), que se desarrollará hasta dar el individuo adulto. La reproducción sexual fue un invento evolutivo (del que quedaron excluidas las bacterias y muchos organismos unicelulares), que garantiza que en cada generación de una especie van a aparecer nuevas combinaciones de genes en la descendencia, que posteriormente será sometida a la dura prueba de la selección y otros mecanismos evolutivos. Las células de un animal proceden en última instancia de la división repetida y diferenciación del zigoto.

Las células somáticas, que constituyen los tejidos del animal adulto, han recorrido un largo camino "sin retorno", de modo que, a diferencia de las células de las primeras fases del embrión, han perdido la capacidad de generar nuevos individuos y cada tipo se ha especializado en una función distinta (a pesar de que, salvo excepciones, contienen el mismo material genético).

El primer experimento de clonación en vertebrados fue el de Briggs y King (1952), en ranas. En los años 70, Gurdon logró colecciones de sapos de espuelas (Xenopus laevis) idénticos a base de insertar núcleos de células de fases larvarias tempranas en ovocitos (óvulos) a los que se había despojado de sus correspondientes núcleos. Pero el experimento fracasa si se usan como donadoras células de ranas adultas.

Desde hace unos años se vienen obteniendo mamíferos clónicos, pero sólo a partir de células embrionarias muy tempranas, debido a que aún no han entrado en diferenciación (y por lo tanto poseen la propiedad de pluripotencia). No es extraño pues el revuelo científico cuando el equipo de Ian Wilmut, del Instituto Roslin de Edimburgo comunicó que habían logrado una oveja por clonación a partir de una célula diferenciada de un adulto.[2] Esencialmente el método (que aún presenta una alta tasa de fracasos) consiste en obtener un óvulo de oveja, eliminarle su núcleo, sustituirlo por un núcleo de célula de oveja adulta (en este caso, de las mamas), e implantarlo en una tercera oveja que sirve como “madre de alquiler” para llevar el embarazo. Así pues, Dolly carece de padre y es el producto de tres "madres": la donadora del óvulo contribuye con el citoplasma (que contiene, además mitocondrias que llevan un poco de material genético), la donadora del núcleo (que es la que aporta la inmensa mayoría del ADN), y la que parió, que genéticamente no aporta nada.[3]

Científicamente se trata de un logro muy interesante, ya que demuestra que, al menos bajo determinadas circunstancias es posible "reprogramar" el material genético nuclear de una célula diferenciada (algo así como volver a poner a cero su reloj, de modo que se comporta como el de un zigoto). De este modo, este núcleo comienza a "dialogar" adecuadamente con el citoplasma del óvulo y desencadena todo el complejo proceso del desarrollo intrauterino.

2. Fecundación y Desarrollo Embrionario

Desarrollo de las células germinales femeninas: es un proceso muy prolongado, que arranca de la fase fetal, y que concluye en la adulta.

  • Células primordiales germinales: se originan en la cresta germinal. Al recibir ciertas señales de las células del plexo dorsal de la cresta germinal, las células germinales primordiales entran en meiois, y pasan de diploides a haploides. Se detienen en diplotene hasta la fase adulta (hasta 50 años). En el ovario fetal los ovocitos primarios están rodeados y nutridos por una capa de células foliculares. Antes de la pubertad hay muerte programada de ovocitos, y desde la pubertad, algunos de estos ovocitos seguirán su desarrollo.

  • Fase de crecimiento: No hay cambios en el ciclo celular, pero existe una gran actividad transcripcional, con aumento de 200 veces del tamaño del ovocito. Parte del ARN queda “silente”, acomplejado con proteínas. Estos dos tipos de macromoléculas serán las esenciales para asegurar las primeras fases del zigoto y del embrión. Formación de la zona pelúcida (ZP), que separa al ovocito de las células foliculares.

  • Fase de diferenciación: Durante las 48 horas previas a la fecundación las gonadotrofinas actúan sobre el folículo, cuyas células somáticas responden produciendo señales que reprograman al ovocito. Se usa el ARN almacenado en la fase previa

    • Las señales intrafoliculares iniciales para la maduración del ovocito provocan el paso desde G2 hasta M de la meioisis

    • Reaparece el ARNm enmascarado, y se traduce. Movimientos de orgánulos citoplásmicos

    En la fecundación se unen los gametos femeninos (óvulo) y masculino (espermatozoide). Al entrar el espermatozoide, se activa el óvulo, que termina su diferenciación: final de la meiosis

    Zigoto (célula huevo): finaliza la meiosis del óvulo, con eliminación del segundo cuerpo polar. Los procesos que ocurren durante las primeras horas son:

    • Se duplica el ADN de los genomas haploides de cada gameto

    • Singamia: aproximación de los pronúcleos de cada gameto, pero sin fusión nuclear

    • Primera división mitótica: los cromosomas quedan engarzados en el huso mitótico, y las cromátidas hermanas se separan

    El embrión se va dividiendo, originando duplicación de las células (blastómeros):

    • 2 células (a las 26 horas)

    • 4 células (38 h)

    • 8 células (46 h)

    • 16 células (68 h)

    Implantación: comienza al final de la 1ª semana, y termina al final de la 2ª.

    Fase embrionaria dura hasta la 8ª-9ª semana, cuando quedan establecidos los rudimentos de todos los órganos [5].

    • Gástrula (15º-18º día): tres capas germinales (ecto, meso y endodermo). La actuación de ciertos productos génicos (de tipo Noggin) provoca la inducción neural, que genera la placa neural (primordio de la cuerda espinal y del cerebro)

    • Durante el 2º mes de embarazo, tras adquirir el “diseño general” el desarrollo conduce a la diferenciación general del sistema. Organogénesis hasta el 3º mes

    • El resto del embarazo: sigue la diferenciación-maduración. Desarrollo fetal (3º mes hasta el nacimiento)

    Aspectos relevantes para el trasplante de núcleos:

    El trasplante de núcleos somáticos a óvulos enucleados tiene la intención de lograr lo que hacen de modo natural los dos pronúcleos del ovocito recién fertilizado.

    Cuando entra el espermatozoide, éste se encuentra en fase Go, mientras que el ovocito está en la segunda metafase meiótica (MII). Luego se descondensa el núcleo del espermatozoide y se sincronizan ambos ciclos celulares, ingresando al mismo tiempo en la fase S (síntesis de ADN).

    • Fase de diferenciación: Durante las 48 horas previas a la fecundación las gonadotrofinas actúan sobre el folículo, cuyas células somáticas responden produciendo señales que reprograman al ovocito. Se usa el ARN almacenado en la fase previa.

    • En la activación del ovocito por el espermatozoide intervienen aumentos cíclicos de Ca++ intracelular

    • Ello provoca el descenso de actividad de la MPF[6]-quinasa (por degradación de la ciclina B y fosforilación de cdc2).

    • Ello inhibe las moléculas bloqueadoras de la metafase II, lo que hace que el óvulo termine la mitosis

    • Se desenmascaran más ARNm, que se traducen

    Al introducir un núcleo somático, tenemos que lograr sincronizarlo con la fase del ovocito y “remedar” los cambios fisiológicos arriba citados. Algunos de los protocolos artificiales estimulan la entrada de Ca al ovocito.

    • La electroestimulación provoca un aumento de Ca++ único, pero no las oleadas de Ca++

    • Se mejora con pulsos de corriente o por ionomicina

    • Pero aún necesitamos mejorar para simular las condiciones naturales

    Requisitos de ciclo celular:

    • Sincronización núcleo-citoplasma

    • Periodo de reprogramación nuclear, para su adaptación al entorno citoplásmico.

    • Si se usan núcleos de células diferenciadas, deben “desdiferenciarse” para lograr la totipotencia. Ello solo puede conseguirse con el citoplasma meiótico en fase M. El grupo de Wilmut (1996) concluyó que el éxito aumenta con núcleos somáticos en fase G0 y citoplasmas en fase MII

    En el reciente trabajo sobre la clonación de ratones[7], las condiciones mejores fueron:

    • La activación se realiza dejando un cierto tiempo (6 horas) tras la inyección del núcleo donante en G0

    • La activación se induce con estroncio y citocatalasina B (con supresión de citoquinesis). Aunque esto parece paradójico en relación con otros informes, la exposición prolongada de los núcleos entrantes a un ambiente rico en MPF causa una duradera condensación de cromosomas (en ausencia de síntesis de ADN), y puede facilitar los cambios nucleares que son esenciales para el desarrollo e implantación del blastocisto.

    • Puede que influya también el uso de una unidad de micropipeta de piezo-impacto, que permite que las manipulaciones del oocito y del embrión sean rápidas y eficaces, reduciendo así el trauma de otros métodos (electrofusión, Virus Sendai o PEG)

    Pero incluso el “dogma” de la necesidad de usar células quiescentes como donantes parece que se tambalea: la reciente clonación de ratones usando células madre en fase G1 o en post-fase S (fases G2 y M) así lo indica.[8] Recientemente, el grupo de PPL-Roslin, ha logrado cinco cerdos clónicos mediante un nuevo procedimiento de doble transferencia nuclear, a partir de células no quiescentes (I.A. Polejaeva et al. [2000]: “Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells”, Nature 407: 86-90).

    Por ahora, parece que no todas las células somáticas son susceptibles de poder usarse como donantes de núcleos para la clonación. Se desconoce si se trata de un problema biológico o meramente técnico. Si es biológico, habrá que investigar qué es lo que hace que algunas células sean reprogramables y otras no, y cuál es la naturaleza de la reprogramación (obviamente debe haber activación y represión de genes). ¿Tiene algo que ver en la tasa de fracasos algo relacionado con la impronta genética?

    3. Gemelos y Mellizos

    • Gemelos dizigóticos (no idénticos): se originan por la fecundación de dos o más óvulos por distintos espermatozoides. Tasa de 0.6-1-1%nacimientos. Gran heredabilidad e incidencia de factores ambientales (nutrición, edad, etc.)

    • Gemelos monozigóticos (idénticos): por fisión de un embrión temprano. 0.3-0.4% de nacimimientos.

    4. Tipos de Clonación

    Tipos de clonación según el método

  • Partición (fisión) de embriones tempranos: analogía con la gemelación natural. Los individuos son muy semejantes entre sí, pero diferentes a sus padres. Es preferible emplear la expresión gemelación artificial, y no debe considerarse como clonación en sentido estricto.

  • Paraclonación: transferencia de núcleos procedentes de blastómeros embrionarios o de células fetales en cultivo a óvulos no fecundados enucleados y a veces, a zigotos enucleados. El “progenitor” de los clones es el embrión o feto.

  • Clonación verdadera: transferencia de núcleos de células de individuos ya nacidos a óvulos o zigotos enucleados. Se originan individuos casi idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas) y muy parecidos al donante (del que se diferencian en mutaciones somáticas y en el genoma mitocondrial, que procede del óvulo receptor).

  • 4.1 Gemelación artificial

    Partición de un embrión, o separación de blastómeros en embriones preimplantatorios (de 2-32 células). Cada mitad o trozo desgajado del embrión se introduce en una zona pelúcida de otro óvulo, o en una cubierta artificial (ZPA), y se implanta.

    • Embriones se mojan en 1% de alginato y se transfieren a medio con Cl2Ca, que induce la polimerización

    • En ratones, tiene éxito con blastómeros separados en fase de 2 células. Pero los blastómeros de embriones de 4-8 células pueden suministrar células para la masa celular interna y para el trofectodermo si se incorporan junto con blastómeros de otros embriones.

    Se viene aplicando desde hace años en ganadería. Estudios de Willadsen (1979 y 1981) sobre ovejas: algunos blastómeros de embriones de 4-8 células pueden originar individuos completos.

    Recientemente se ha hecho en monos (macacos Rhesus)[11]

    4.2 Paraclonación: por transferencia de núcleos de células embrionarias o fetales

    En humanos hubo un experimento polémico (Hall y Stillman, 1993) con un zigoto poliploide inviable (no se pretendía implantarlo). Más estudios del equipo de Paul Gindoff de la Universidad G. Washington con embriones anómalos: los embriones más tempranos son mejores para la separación de blastómeros. La ZP natural se disgrega con pronasa y se colocan los embriones en Ca para separar los blastómeros. Inclusión de blastómeros en ZPA de alginato. La capacidad de división de los blastómeros de fases de 2 células era de 3 divisiones, y disminuía con blastómeros más tardíos.

    El resultado son individuos prácticamente idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas), pero diferentes a sus padres. Serían equivalentes a gemelos monozigóticos.

    No se debe considerar como clonación en sentido estricto.

    Los núcleos pueden proceder de:

    • Blastómeros de embrión preimplantatorio: las células de la masa celular interna como las del trofectodermo son totipotentes

    • Células embrionarias o fetales de un cultivo primario o de un cultivo celular

    Estos núcleos se transfieren a un óvulo enucleado o a un zigoto al que se le hayan eliminado los pronúcleos. Este óvulo receptor aporta mitocondrias, y en el caso del zigoto, algo del espermatozoide.

    El resultado: individuos casi idénticos entre sí, pero diferentes de los progenitores del embrión que aportó el núcleo transferido. Se pierde una generación, ya que el embrión donante del núcleo se destruye. Los individuos nacidos así se parecerían (desde el punto de vista del genoma nuclear) al individuo que hubiera surgido del embrión destruido.

    A mitad de los 80 se venían produciendo paraclonaciones en diversos animales de granja: ovejas y vacas.[12] Willadsen logró terneros por transferencia de núcleos de embriones en fase de hasta 128 células. En 1996 el equipo de Wilmut y Campbell logró dos ovejas (Megan y Morag) por transferencia de núcleos de embriones. PPL siguió con experimentos de paraclonación con células embrionarias y fibroblastos fetales.[13]

    Se ha descrito igualmente la producción de monos Rhesus por transferencia de núcleos de blastómeros[14].En un caso se dividieron 107 embriones en 368 unidades, lográndose 4 embarazos, de uno de los cuales nació Tetra. [15] Alguno de los intentos condujo a embarazos “ciegos”, consistentes en un saco placentario desprovisto de tejido fetal. En una postdata los autores anuncian que acaban de lograr 4 embarazos, cada uno con un feto viable, a partir de los últimos 7 embriones originados por separación de blastómeros. Dos de los fetos son gemelos idénticos por fisión de un embrión original. Nacieron vivos y se llaman Neti y Ditto.

    Se ha empleado en animales transgénicos clónicos. Polly (julio 1997), de PPL, es una oveja paraclónica (núcleo donante: fibroblastos fetales) transgénica productora de factor IX de coagulación humano[16]. Intentos de cerdos modificados para xenotrasplantes.

    Un avance reciente significativo es la clonación de decenas de ratones empleando núcleos de células madre no quiescentes, realizado por un equipo de la Universidad de Hawai y la Universidad Rockefeller[17]. Una de las mayores incidencias de este trabajo es que demuestra que se puede clonar con núcleos de células en cultivo bien caracterizadas, y no solamente con células frescas o cultivos primarios. Como las células madre de ratón se manejan bien desde el punto de vista genético, esto abre la vía a la fácil creación de ratones clónicos y transgénicos.

    4.3 Clonación (en sentido estricto): por transferencia de núcleos de células de individuos nacidos

    El núcleo procede de individuo nacido. Se transfiere a óvulo o zigoto enucleados, y el embrión se implanta en útero. El resultado: individuos casi idénticos entre sí y casi idénticos a su progenitor (donante del núcleo).

    Se ha logrado en varias especies[18]:

    • Oveja (Dolly). Núcleo donante de célula sin identificar de ubre de oveja de 6 años de la raza Finn Dorset. Embrión implantado en hembra Scottish Blackface. Baja tasa de éxitos: 430 óvulos, de los que se obtuvieron 277 óvulos reconstituidos, que se cultivaron por separado durante 6 días. 29 blastocistos “normales” se transfirieron a hembras receptoras. El único éxito fue Dolly. Algunos fueron fetos o neonatos muertos, o con alteraciones del desarrollo

    • Ratones, con núcleos del cúmulo oóforo[19]. (El primer ratón clónico nació el 3 de octubre de 1997, y fue llamado Cumulina; ya ha tenido progenie aparentemente normal, que a su vez se ha reproducido). El haber obtenido clones en esta especie de laboratorio, con ciclo de vida corto y de la que se tienen amplios conocimientos de su genética, abre perspectivas insospechadas para los estudios básicos sobre la clonación: mecanismos de la reprogramación celular, impronta (imprinting) genómica, activación del genoma del embrión, diferenciación celular, etc. Poco después, este mismo equipo japonés informó de la clonación de ratones a partir de células del rabo de ratones adultos.[20]

    • Ganado bovino: núcleos de células epiteliales del oviducto, del cúmulo oóforo, [21] epiteliales, musculares.

    • Ganado caprino

    • Recientemente se ha logrado en ganado porcino: el grupo de Roslin-PPL lo ha conseguido con un nuevo método de doble transferencia nuclear, con el nacimiento de cinco lechones, con dos subgrupos de tres y dos que eran clones entre sí y con respecto al correspondiente donante. Sus nombres: Millie, Christa, Alexis, Carrel y Dotcom. (I.A. Polejaeva et al. [2000]: “Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells”, Nature 407: 86-90).

    ¿Un protocolo universal para clonación reproductiva?

    El grupo de Wakayama, en el artículo reciente que informa sobre clonación de ratones a partir de núcleos de células madre, propone un posible esquema que permitiría la clonación ilimitada a partir de casi cualquier célula del organismo (al menos en esta especie)[22]:

  • Transferencia por microinyección de un núcleo de célula somática a un óvulo enucleado.

  • Se dejaría desarrollar el embrión in vitro hasta una fase previa a la de implantación.

  • A partir de las células de la masa interna del blastocisto se pueden establecer cultivos estables (inmortales) de células madre (ES). Todas esas células contendrían el mismo genoma nuclear que el individuo donante, genoma que quedaría de esta forma “inmortalizado”.

  • Las células madre pueden servir a su vez para:

  • Terapias celulares

  • Clonación reproductiva

  • Manipulación genética: se podrían generar ratones mutantes, incluso en homozigosis, en una sola generación, sin pasar por la generación intermedia de quimeras. Ello permitiría analizar las funciones complejas que dependen de varios genes.

  • Combinación de b) y c) para producir individuos clónicos transgénicos.

  • 5. Fines (teóricamente posibles) de los distintos tipos de clonación

    5.1 De la gemelación artificial

    En animales:

    • Investigación básica

    • Mejora de FIV

    • Mejora de fertilidad de las especies empleadas

    En humanos:

    • En FIV, para mejorar resultados en mujeres con pobre estimulación ovárica

    • Gemelos idénticos separados en el tiempo

    5.2 De la paraclonación

    En animales:

    • Individuos idénticos para investigación

    • Producción ganadera

    • Junto con clonación, para biotecnología: tejidos “humanizados”, granjas farmacéuticas

    • Fuentes de tejidos, para xenotrasplantes

    En humanos:

    • ¿investigación básica y aplicada?

    • ¿Terapia? Para enfermedades mitocondriales que producen ceguera o epilepsia: transferencia del núcleo del embrión hasta un óvulo-zigoto recepetor

    5.3 De la clonación verdadera

    En animales:

    • mejora de conocimientos en biomedicina

    • modelos de enfermedades

    • con transgénesis: producción de medicamentos

    • órganos para xenotrasplantes: cerdos transgénicos con factor inhibidor de complemento humano. Este es el objetivo del grupo de PPL, cuyo artículo reciente ya hemos citado: I.A. Polejaeva et al. (2000): “Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells”, Nature 407: 86-90. De hecho, en dicho trabajo adelantan ya que han logrado cultivos celulares en los que el gen de la alfa-1,3-galactosil transferasa está interrumpido, por lo que no es funcional. En principio, si lograsen cerdos transgénicos a partir de estas células, podrían servir como fuentes de tejidos para xenotrasplantes a humanos, evitándose el rechazo hiperagudo del injerto. Sin embargo, la cuestión de los xenotrasplantes a partir de tejidos porcinos está en entredicho, por el riesgo de que se puedan liberar virus endógenos a la población humana. Ello se complicaría aún más con las propuestas de obtener cerdos transgénicos dotados de proteínas humanas del complemento: si bien con ello se evitaría otra de las causas de rechazo, hay que tener en cuenta que algunas de esas proteínas sirven como puertas de entrada a algunos virus humanos

    Ganadería:

    • Obtención de animales transgénicos. Recombinación homóloga para generar animales noqueados con genes inactivados y sustituidos. Producción de proteínas terapéuticas. Algunas empresas:

    • PPL Therapeuthics: factor IX, a-1-antitripsina. Esta empresa ha logrado ovejas simultáneamente clónicas y transgénicas que segregan en su leche esa proteína de la que carecen los enfermos del enfisema pulmonar congénito. Hace poco han logrado expresar ese gen de forma controlada, insertándolo en un lugar predeterminado del genoma receptor, lo que si se confirma y amplía supone un gran paso para conseguir factorías vivas de sustancias útiles (K.J. McCreath, J. Howcroft, K.H.S. Campbell, A. Colman, A.E. Schnieke, A.J. Kind [2000]: “Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells”, Nature 405: 1066-1069)

    • Genzyme Transgenics: estudios con cabras

    Idealmente se necesita método de transferencia no quirúrgica de embriones. Rápida propagación de fenotipos probados en el sector ganadero. ¿Venta y distribución cómoda de embriones? Evitar la falta de diversidad genética, limitando el número de individuos de un mismo clon en cada rebaño
    Ver: http://www.ir.bbsrc.ac.uk/

    Intentos de salvar in extremis a especies de la extinción (p. ej, el panda gigante, un bóvido salvaje asiático llamado gaur, etc.). Incluso alguien está intentando "resucitar" especies extinguidas de las que hay material biológico conservado (alguna especie de marsupial australiano como el tigre de Tasmania, el bucardo -una subespecie de cabra montés recientemente desaparecida del Pirineo español).

    • En enero de 2001 nació en los EE.UU. un gaur clónico, pero murió a los dos días a causa de una disentería

    • En octubre de 2001, se comunicó el nacimiento en Italia de un muflón clónico, a partir de células de hembras muertas de la isla de Cerdeña

    En humanos, la clonación verdadera podría tener dos usos diferentes:

    Clonación reproductiva: tal como se describe arriba, para crear un individuo clónico. Posibles situaciones:

    Como técnica de reproducción asistida excepcional, no convencional.

    Qué riesgos podría tener?

    Datos sobre la “edad celular”

    Otros efectos (cáncer?).

    ¿Solucionar cuestiones de seguridad?

    Cuestiones de eficiencia:

    si se tuviera la eficiencia del caso Dolly, necesitaríamos 200 mujeres.

    Pero recientemente se ha visto que con el líquido de aspiración del folículo ovárico se pueden obtener muchos folículos preantrales que se pueden madurar en laboratorio hasta ovocitos maduros

    Desarrollo de folículos ováricos humanos en ratones scid e hipogonádicos. ¿Ratones produciendo óvulos humanos?

    Cuestiones de seguridad:

    Incidencia de nacimientos muertos y abortos[23] Según Wilmut, hay un patrón continuo de muertes durante el desarrollo embrionario y fetal, llegando a término sólo 1-2% de los embriones.

    ¿Qué edad genética tiene el clon? ¿Corresponde a la edad de la célula donante? Los datos actuales parecen indicar que la transferencia nuclear no revierte la edad genética

    ¿Supone esto mayor peligro de acumulación de mutaciones y de envejecimiento celular? (Hay informes sobre anomalías en este sentido, por ejemplo, un acortamiento significativo de los telómeros, lo que parece un indicio de la edad celular[24]. Hay que recordar que los telómeros restauran su longitud normal en la línea germinal, que por definición no intervino en la producción de los animales clónicos. Es posible que los efectos fisiológicos en el acortamiento de la edad de los animales clonados se reflejen tras varias generaciones). Sin embargo, otros informes sobre las terneras clónicas parecen indicar que ocurre lo contrario, un rejuvenecimiento según ciertos parámetros moleculares.

    Clonación no reproductiva: se realiza la manipulación celular como en la anterior, pero el embrión no se implanta en útero, sino que puede servir a distintos objetivos, principalmente de investigación:

    • Sobre fertilidad, anticoncepción, etc.

    • Desarrollo embrionario

    • Obtención de células madre e inducción de diferenciación a diferentes tejidos

    6. Clonación no reproductiva y células madre embrionarias

    6.1 Obtención de células madre humanas

    Los informes originales de los equipos de Thomson[25] y de Gearhart[26] sobre el cultivo de células madre humanas. Se trata de células dotadas de inmortalidad y de pluripotencia. Posibilidad de diferenciación en distintos tipos de células y tejidos.

    El trabajo de Thomson y colegas en la Universidad de Wisconsin, financiado por Geron: aislamiento y cultivo de células madre embrionarias (ES) a partir de blastocistos procedentes de programas de FIV.

    Gearhart, en la U. John Hopkins obtuvo células madre germinales embrionarias (EG) a partir de fetos abortados. (Informes posteriores arrojan dudas sobre la conveniencia de usar estas células, ya que parece que la clonación con ellas, da origen a frecuentes anomalías del desarrollo de los animales[27]).

    Advanced Cell Technologies (ACT) usaron una técnica similar a la de transferencia nuclear, para fusionar un óvulo enucleado de vaca con una célula somática humana: se obtuvo un embrión híbrido.

    Obtención de células madre (ES), cultivo in vitro para lograr su diferenciación en distintos tipos de células y tejidos, con fines terapéuticos: autotrasplantes, terapias celulares, etc.[28]

    Las células ES de ratón (y quizá las humanas) son tumorigénicas: si se inyectan a un animal adulto originan teratomas y teratocarcinomas. Por lo tanto, un tema de seguridad será asegurarse que en un cultivo diferenciado a partir de ES no quedan estas células troncales, o bien disponer de métodos fiables de separación y purificación de las células diferenciadas de interés respecto de las ES.

    Queda mucho por hacer en aspectos básicos:

    • ¿podemos forzar a las células madre a diferenciarse en líneas celulares concretas?

    • ¿podemos lograr que todas las células de un cultivo de ES se diferencien simultáneamente en una ruta determinada?

    • Estudios de marcadores (al estilo de los CD de las células inmunes) para caracterizar todas las fases intermedias de cada ruta de diferenciación

    • Métodos de separar y purificar tipos celulares concretos

    Otros orígenes posibles de células madre:

    Células pluripotentes del cordón umbilical

    Células de abortos espontáneos

    ¿Hay células madre en tejidos del adulto? Hay indicios de que existen células pluripotentes en varios órganos, incluyendo el cerebro.[29]. Véase a este respecto un reciente artículo en la revista The Scientist (noviembre 2000).

    ¿Se pueden desprogramar y reprogramar células somáticas?. Una posibilidad sería mediante la introducción de citoplasma de célula ES en una célula somática adulta. Se trataría de “cíbridos” por fusión de citoplastos de células madre con carioplastos de células somáticas.

    Las ES y EG, por sí mismas no pueden producir placenta, por lo que no son viables al ser transferidas al útero. Pero si se mezclan con otras células embrionarias y se encapsulan en zona pelúcida, podrían generar embriones viables que conducirían a quimeras somáticas. Incluso, en ratones se ha visto que al transferir ES a un blastocisto huésped tetraploide, las células de este mueren, sobreviviendo las ES, responsables de originar un ratón completo. Así pues, aunque las ES no pueden dar origen por sí mismas a un nuevo individuo, pueden hacerlo al ser colocadas en un ambiente celular adecuado, a saber, el que pueda generar el trofectodermo que produce la placenta.

    En resumen, de los estudios en ratón parecía deducirse que las ES no son totipotentes, pero colocadas como masa celular interna de un blastocisto huésped, pueden generar el feto, salvo la placenta.

    Ahora bien, el trabajo ya citado del grupo de Wakayama[30] logró clones de ratón inyectando núcleos de células madre en ovocitos. Esto significa que, aunque las ES por sí mismas no sean totipotentes, su núcleo transferido puede programar la diferenciación de individuos completos (es decir, posee totipotencia nuclear). Ello abre, además, la posibilidad de generar ratones transgénicos en un solo paso, sin necesidad de pasar por la fase de quimeras somáticas. La manipulación genética de estas células madre y su ulterior clonación facilitará sobremanera la creación de clones transgénicos.

    6.2 Usos posibles de células madre humanas

    6.2.1 Terapias celulares y autotrasplantes

    El potencial terapéutico de las ES se pondría de manifiesto sobre todo empleando ES derivadas del propio paciente, ya que no habría problemas de rechazo de injertos: estaríamos ante un autotrasplante. Una posibilidad sería tipificar muchas líneas diferentes de ES, con diferentes sistemas MHC (HLA), pero la diversidad de los haplotipos HLA es enorme, por lo que habría que eliminar o alterar algunos de los genes de histocompatibilidad.

    Pero la posibilidad teórica que ha llamado más la atención es la transferencia de núcleos somáticos del paciente a óvulos enucleados. Las desprogramación y reprogramación del núcleo seguiría en sus primeras fases la lógica a lo Dolly: se obtendría un zigoto y embrión artificial. Al llegar a la fase de blastocisto, se obtienen células de la masa celular interna (con lo que se destruye el embrión), y se cultivan en placa de Petri, obteniéndose ES con la información genética nuclear del donante. Finalmente, las ES serían tratadas para diferenciarse a distintos tipos celulares:

    • Neuronas dopaminérgicas en el tratamiento de Parkinson

    • Células beta del páncreas para diabéticos

    • Hepatocitos para pacientes con cirrosis hepática

    En resumen, esto es la idea de lo que se ha dado en llamar “clonación terapéutica”[31]. En el esquema anterior queda claro que estamos ante una técnica de “doble uso”, ya que el embrión artificial obtenido, transferido a un útero preparado, podría eventualmente originar un ser humano completo, en cuyo caso estaríamos ante una clonación reproductiva verdadera.

    Los científicos del Instituto Roslin han propuesto a las autoridades británicas un proyecto consistente en obtener “bancos de células madre clonadas” por transferencia de núcleos de células pluripotentes de cordón umbilical de los recién nacidos. Cada cultivo quedaría conservado en previsión de la necesidad ulterior de diferenciarlo hacia tipos celulares requeridos para autotrasplantes del individuo donante.

    6.2.2 Creación de quimeras y modificación genética de la línea germinal

    Las ES son en principio la célula ideal para intentar cambios en línea germinal (véase el caso de los ratones transgénicos).Quimeras de ES manipuladas y blastómeros se implantan en úteros. Progenie quimérica, alguna de la cual será transgénica en sus células germinales. La siguiente generación sería transgénica.

    Lecturas adicionales recomendadas (en Internet):

    Aspectos de seguridad no resueltos en la tecnología de clonación

    Aspectos éticos y sociales de la clonación, incluyendo el actual debate sobre clonación "terapéutica" y uso experimental de embriones humanos

    Se recomienda la consulta del resumen del Informe sobre Clonación del Instituto de Bioética de la Fundación Ciencias de la Salud.

    Referencias

    [1] Para un resumen histórico y conceptual, J.R. Lacadena (1998): “La clonación humana”, en Actas del 2º Congreso de bioética de América Latina y del Caribe, Santafé de Bogotá, pp. 138-165, y el cap. 1 de Comité de expertos sobre bioética y clonación (1999): Informe sobre la clonación: en las fronteras de la vida, Instituto de Bioética de la Fundación Ciencias de la Salud, Ediciones Doce Calles, Madrid. Véase igualmente National Bioethics Advisory Comisión (2000): “Ciencia y aplicación de la clonación” (parte del informe original de 1997 de la NBAC), en Clones y clones. Hechos y fantasías sobre la clonación humana (M.C. Nussbaun y C.R. Sunstein, eds.), Cátedra, Madrid, pp. 39-48.

    [2] I. Wilmut, A.E. Schnieke, J. McWhir, A.J. Kind, K.H.S. Campbell (1997): “Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells”, Nature 385: 810-813.

    [3] Un artículo de divulgación sobre algunas modalidades de clonación y sus posibilidades terapéuticas: I. Wilmut (1999): “Clonación con fines médicos”, Investigación y Ciencia 269: 24-29.

    [4] Véase el cap. 2 de Comité de expertos sobre bioética y clonación (1999): Informe sobre la clonación: en las fronteras de la vida, Instituto de Bioética de la Fundación Ciencias de la Salud, Ediciones Doce Calles, Madrid. Igualmente útil es R. Moor, C. Lee y J. Fulka (1998): “El contexto de la clonación: células germinales, fecundación y desarrollo embrionario”, en En las fronteras de la vida: ciencia y ética de la clonación, Fundación Ciencias de la Salud, Ediciones Doce Calles, Madrid, pp. 22-51.

    [5] J.R. Lacadena (1995): “Consideraciones genético-biológicas sobre el desarrollo embrionario humano”, en Genética Humana: Fundamentos para el estudio de los efectos sociales de las investigaciones sobre el genoma humano (ed.: C.M. Romeo Casabona), Univerdidad de Deusto y Fundación BBV, Bilbao, pp. 77-103.

    [6] MPF es el factor promotor de la mitosis.

    [7] T. Wakayama, A.C.F. Perry, T. Zuccotti, K.R. Johnson, R. Yanagimachi (1998): “Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei”, Nature 394: 369-374.

    [8] T. Wakayama, I. Rodríguez, A.C.F. Perry, R. Yanagimachi, P. Mombaerts (1999): “Mice cloned from embryonic stem cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 96: 14984-14989.

    [9] Véase el cap. 3 de Comité de expertos sobre bioética y clonación (1999): Informe sobre la clonación: en las fronteras de la vida, Instituto de Bioética de la Fundación Ciencias de la Salud, Ediciones Doce Calles, Madrid.

    [10] P. R. Gindoff (1998): “Clonación por separación embrionaria”, En las fronteras de la vida: ciencia y ética de la clonación, Fundación Ciencias de la Salud, Ediciones Doce Calles, Madrid, pp. 52-61.

    [11] A.W. Chan, T. Dominko, C.M. Luetjens, E. Neuber, C. Martinovich, L. Hewitson, C.R. Simerly, G.P. Schatten (2000): “Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting”, Science 287: 317-319.

    [12] M.Sims, N.L. First (1994): “Production of calves by transfer of nuclei from cultured inner mass cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 91: 6143-6147; S.M. Willadsen (1986): “Nuclear transplantation in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte”, Biology of Reproduction 37: 859-866.

    [13] K.H.S. Campbell, J. McWhir, W.A. Ritchie, I. Wilmut (1996): “Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell”, Nature 380: 64-66.

    [14] L. Meng, J.J. Ely, R.L. Stouffer, D.P. Wolf (1997): “Rhesus monkeys produced by nuclear transfer”, Biology of Reproduction 57: 454-459.

    [15] D. P. Wolf, L. Meng, N. Ouhibi, M. Zelinski-Wooten (1999): Biology of Reproduction 60: 199.

    [16] A.E. Schieke, A.J. Kind, W.A. Richtie, K. Mycock, A.R. Scott, M Ritchie, I. Wilmut, A. Colman, K.H.S. Campbell (1997): “Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts”, Science 278: 2130-2133.

    [17] T. Wakayama, I. Rodríguez, A.C.F. Perry, R. Yanagimachi, P. Mombaerts (1999): “Mice cloned from embryonic stem cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 96: 14984-14989.

    [18] Véase comentario de D. Solter (1998): “Dolly is a clone-and no longer alone”, Nature 394: 315-316.

    [19] T. Wakayama, I. Rodríguez, A.C.F. Perry, R. Yanagimachi, P. Mombaerts (1999): “Mice cloned from embryonic stem cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 96: 14984-14989.

    [20] T. Wakayama, R. Yanagimachi (1999): Nature Genetics 22: 127-128.

    [21] K. Kato, T. Tani, Y. Sotomaru, K. Kurokawa, J.-Y. Kato, H. Doguchi, H. Yasue, Y. Tsunoda (1998): “Eight calves cloned from somatic cells of a single adult”, Science 282: 2095-2098. Otro caso es el comentado por D. Butler (1998): “French clone provides support to Dolly”, Nature 392: 113.

    [22] T. Wakayama, I. Rodríguez, A.C.F. Perry, R. Yanagimachi, P. Mombaerts (1999): “Mice cloned from embryonic stem cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 96: 14984-14989.

    [23] J.B. Cibelli et al (1998): “Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts” Science 280: 1256-1258.

    [24] P. G. Shields et al. (1999): “Analysis of telomere lengths in cloned sheep”, Nature 399: 316-317.

    [25] J.A. Thomson, J. Itskovitz-Eldor, S.S. Shapiro et al. (1998): “Embryonic stem cell lines derived from human blastocists”, Science 282: 1145-1147.

    [26] M.J. Shamblott, J. Axelman, S. Wang, E.M. Bugg, J.W. Littlefield, P.J. Donovan, P.M. Bulumenthal, G.R. Huggins, J.D. Gearhardt (1998): “Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95: 13726-13731.

    [27] S. Steghaus-Kovac (1999): “Ethical loophole closing up for stem cell researcher”, Science 286: 31.

    [28] D. Solter y J. Gearhart (1999): “Putting stem cell to work”, Science 283: 1468-1470.

    [29] G. Vogel (1999): “Harnessing the power of stem cells”, Science 283: 1432-1434.

    [30] T. Wakayama, I. Rodríguez, A.C.F. Perry, R. Yanagimachi, P. Mombaerts (1999): “Mice cloned from embryonic stem cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 96: 14984-14989.

    [31] R. P. Lanza, J.B. Cibelli, M. West (1999): “Prospects for the use of nuclear transfer in human transplantation”, Nature Biotechnology 17: 1171-1174.; J. Gearhardt (1998): “New potential for human embryonic stem cells”, Science 282: 1061-1062; J. Rossant, A. Nagy (1999): “In search of the tabula rasa of human cells”, Nature Biotechnology 17: 23-24.