IV. CENTRIFUGACION

Técnicas de separación de partículas. Base : distinta velocidad de desplazamiento de las partículas en un medio líquido al ser sometidas a un campo centrífugo.

COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN: velocidad a la que se desplaza una partícula en el campo centrífugo unidad (1.g) 

d2 (p - m)

s = . g

18.

d2: volumen de la partícula p: densidad de la partícula

m : densidad del medio g: fuerza centrifuga relativa : la viscosidad s: velocidad sedimentación

Dimensiones: de tiempo a pesar de ser una vel, porque varia en f(x)del medio, el caso de macromoléculas :valores del orden de 10-13 segundos ! el Svedberg, símbolo S, 1S = 10-13 segundos.

• Coeficiente de sedimentación : variable según condiciones experimentales ! s de la partícula en un medio estándar ! agua pura a 20ºC ! s 20,w

Información obtenida con s :

Caracterizar a la partícula y obtener información sobre su tamaño, densidad y forma. Conocer su comportamiento en centrifugación ! facilita el diseño de métodos para su aislamiento.

INSTRUMENTACIÓN: centrifuga ,tipos en f(x) velocidad:

1.- De baja velocidad, de sobremesa o clínicas: pequeñas, sin refrigeración, máxima velocidad : 5.000 rpm. Útil : partículas grandes (células, precipitados de sales insolubles, etc.)

Micrófugas : variante de las anteriores. Velocidades altas : > de 10.000 rpm y tubos muy cortos->volúmenes muy peq.(eppendorf ->+ velocidad) Motor crea la fuerza centrífuga, está acoplado al rotor q tiene celdillas donde se coloca la muestra en tubos.

2.- De alta velocidad: velocidad máxima : 18.000 - 25.000 rpm, refrigeradas para evitar el calentamiento del rotor por rozamiento con el aire , algunas con sistemas de vacío, para controlar mejor la tº, porque evita el rozamiento. Útil : fracciones celulares.

Insuficientes : ribosomas, virus, macromoléculas, pequeño tamaño.

3.- Ultracentrífugas: velocidad máxima : 50.000 - 80.000 rpm , sistemas auxiliares : sistema de refrigeración, sistema de alto vacío (obligatorio), los tubos tienen q estar perfectamente balanceados.

Tipos :

Rotores: la pieza q sufre el giro y sobre la cual colocamos la muestra. Tienen que ser materiales ligeros y resistentes a las altas velocidades. La mayoría son aleaciones de Al, problema q tiene una vida media corta, se corroe. Alternativa Titanio, problema es caro, o fibra de carbón, son ligeros, duraderos y caros. tipos:

1.-oscilantes, flotantes o basculantes: las celdillas no están ancladas de

2.-de ángulo fijo: celdillas con una inclinación.

3.-verticales: rotores macizos con celdillas esculpidas paralelas al eje.

Tubos: condiciones : inertes, q no interaccionen con la muestra y resistentes para q no se deforme a altas velocidades.

Elección depende : tipo de rotor, tipo de muestra, volumen y tipo de fraccionamiento.

Materiales :

Vidrio: ventaja es transparente.

S: sensible R: resistente

TIPOS DE CENTRIFUGACION:

1.-C. DIFERENCIAL:

La muestra se distribuye homogénea- por todo el tubo. Separación de las partículas en función de su s. Capacidad de separación pobre, ya q como se distribuyen por todo el tubo en el pellet habrá de todas las partículas, abundaran las de mayor s ->no hay pureza.

Útil : aislamiento de células y orgánulos subcelulares

Para evitar la baja resolución podemos colocar la muestra en una banda estrecha, así todas las partículas parten de un mismo pto-> fraccionamiento. Se pueden producir corrientes de convección , reorganización del líquido -> evita usando gradientes de densidad.

2.- C. EN GRADIENTE DE DENSIDAD:

Muestra : parte superior como una fina banda. Función del gradiente : estabilizar el medio, va de la parte superior con la d min hasta el fondo con la d max ->variación gradual de la densidad en el medio. Separación de los componentes de la muestra en bandas o zonas

3.- C. ZONAL EN GRADIENTE DE DENSIDAD:

El valor de densidad de las partículas, no está incluido en el gradiente de densidad empleado, la dmax es menor q la dmedia de las partículas. Separación en función del coeficiente de sedimentación (s). Tiempo parámetro a controlar, porque influye en la distancia q recorre. Útil : separación partículas con " s por " tamaño y forma, pero con densidades similares

4.- C. ISOPICNICA:

Gradiente de densidad, max. y min. en el rango de las densidades de las partículas a separar. Método de equilibrio-> la partícula se detiene cuando p = m . No dependencia del tiempo .Velocidad de centrifugación mucho más alta que en la centrifugación zonal.

Aplicación de la muestra : no es relevante.

Utilidad : partícula de " densidades, aún con tamaños similares.

5.- C. COLCHON:

busca diferencias en las d de el componente a separar y el contaminante. Centrífuga sobre una disolución homogénea más densa q la d de las cel a aislar, ahí se coloca la muestra.

Útil para la separación de cél sanguíneas.

GRADIENTES DE DENSIDAD:

• Características necesarias :

1.No provocar modificaciones biológicas en la muestra

2.No interacción con el método de detección (visible -UV)

3.Valores mínimos de viscosidad

4.Fácilmente separable de la muestra

5.No difusible

6.Bajo coste.

Sacarosa y glicerol

Ventajas: coste, pureza, inerte, carácter no iónico

Desventajas: activos osmóticamente, alta viscosidad

Util : fraccionamiento orgánulos celulares y virus

Ficoll

Sacarosa polimerizada (PM 400.000), densidad max. > densidad con sacarosa. Más estable

Inconveniente : ! viscosidad, afecta al movimiento de la particula

Útil : partículas grandes (células y orgánulos celulares)

*Derivados iodados del ácido benzoico

Derivados ácido triodobenzoico (sustituciones para ! solubilidad)

Biológicamente inertes, iónicos : metrizoato, neutros : metrizamida y Nycodenz

Densidad máxima : 1,4 g/cm3, gran estabilidad, fácil formación.

Útil para estructuras sensibles a la fuerza iónica, mem ,cel, virus, ..

Inconvenietes : coste, interferencia con UV afecta a la absorvancia

Percoll

suspensiones de partículas (5.15 nm) de ácido silícico con Revestimiento de polivinilpirrolidona (PVP)

Útil : partículas grandes (tamaño de las partículas coloidales y sensibles osmóticamente)

*Sales de metales alcalinos pesados : cesio y rubidio

Altas concentraciones : 6 - 8 M, elevada fuerza iónica.

Útil para macromoléculas resistentes a la fuerza iónica ! ácidos nucleicos, las otras precipitan. Muy corrosivas->ojo rotores

Sulfato de cesio (más usadas)

densidad max. 2,01 g/cm3, Capaz de bandear RNA

Cloruro de cesio (más usadas)

densidad max : 1,91 g/cm3 , variación de densidad del ADN por % G+C.

Útil : separación de ADN ! distamicina, bromuro de etidio

*Otras sales :

Trifluoracetato de cesio ! separar topoisómeros de ADN

Rubidio : similar al cesio, < densidad max.

Inconvenientes : coste, corrosión.

TIPO Y FORMACION DE GRADIENTES

En f(x) de la variación de la densidad:

• Comenzando por la disolución más densa (“overlaying”)

• Comenzando por la disolución menos densa (“underlaying”)

B) Continuos

• Por difusión

• Utilizando formadores de gradientes

• Por centrifugación : gradientes autogenerados

FRACCIONAMIENTO Y ANALISIS DE LOS GRADIENTES.

Condiciones :

• Evitar turbulencias y distorsiones del gradiente

• Recomendable mantener la temperatura del tubo = temp. de centrifugación

• Evitar la inversión del gradiente

Métodos :

Detección de la muestra :

Manera fija al eje de la centrífuga-> móvil

Inconveniente si la centrífuga no esta bien balanceadaa oscilación del tubo es incontrolada se puede perder la muestra.

Obs. 2 casos:

*centrifugación diferencial (verde): muestra distribuida homogénea-,tras cent. Hay sobrenadante y pellet.

*gradiente de densidad (rojo):muestra no homogénea, cambio de posición del, tubo provoca mov de las particulas x gradiente d, el contenido del tubo no sufre reorganización tubo vuelve su posición.

El contenido es impulsado por la fuerza de la centrífuga y se dispone perpendicular a la dirección del eje de giro. Cuando la fuerza acaba el contenido recupera su posición.

El pellet se coloca en el ext inferior del tubo + alejado del eje de giro, en el caso de centrifugación diferencial (1ºdibujo)

En gradiente de densidad la muestra queda paralela al eje de giro (2º y 3º dibujo)

Malos para sedimentar , lo q sufre un cambio de posición es el contenido del tubo.

*C. diferencial: reorientación del líquido, el pellet se dispone en la superficie del tubo más alejada al eje de giro (1º dibujo)

*C. gradiente de densidad: cuando comienza y acaba la fuerza centrífuga se reorganiza el líquido -> mecanismo para iniciar y acabar la centrifugación.