Bioquímica

Aminoácidos. Cromatografía. Moléculas. Concentración de proteínas. Método de Lowry. Fosfatasa alcalina intestinal

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Prácticas de Bioquímica

1ª práctica: día 25 de febrero de 1999.

Cromatografía en papel de aminoácidos.

Objetivo:

La separación de sustancias constituye una de las técnicas más utilizada en un laboratorio bioquímico. Una de las más usadas, es la cromatografía, que será una aproximación metodológica. En esta práctica se pretende conocer y entender la base de la cromatografía en papel y de separarar e identificarar aminoácidos.

Introducción:

Existen varios factores importantes en la separación de sustancias, como pueden ser: el reparto, la adsorción, el intercambio iónico,...etc. El factor predominante en esta técnica es el reparto entre dos fases no miscibles. El papel actúa como soporte inerte del vapor de agua ambiental, aunque también puede llevar a cabo otras funciones tales como movimiento capilar de los solutos (adsorción) y atracción debida a las impurezas polares del papel (intercambio iónico). Esa fase acuosa es la fase estacionaria (líquido polar sostenido en papel). La fase móvil es el solvente apolar que se deposita en la cubeta de cromatografía y que ascenderá por capilaridad por el papel. El reparto ocurrirá entre la fase acuosa estacionaria y el solvente o fase móvil. El soluto se mueve en la dirección de flujo del solvente a una velocidad que es regulada por su afinidad hacia la fase acuosa estacionaria o la fase orgánica móvil no polar. La afinidad del soluto por la fase móvil es prueba de una mayor velocidad de migración en la dirección del flujo.

Otros factores a destacar en la determinación de la velocidad de migración del soluto son: peso molecular, tipo de papel empleado, tamaño de la cámara, temperatura,... etc. La velocidad de migración del soluto en la dirección del flujo del solvente, viene determinada por lo que se denomina Rf, que es la distancia recorrida por el soluto, desde un punto de partida, dividido por la distancia recorrida por el frente del solvente.

Distancia recorrida por el soluto .

Rf = Distancia recorrida por el solvente

El Rf de cualquier soluto de un sistema no puede ser mayor de la unidad.

Protocolo experimental:

Aminoácidos a separar:

Aspártico.

Leucina.

Lisina.

Mezcla problema.

Reactivos:

Disolvente: etanol/agua/amoniaco (80/10/10)

Revelador: ninhidrina (se disuelve 200 mg en 100 ml de acetona conservado a 4 ºC).

Se ponen 50 ml de disolvente en la cubeta y se tapa. Se prepara el papel, de un tamaño aproximado a 12 x 27 cm. A 2 cm de uno de los extremos se traza una línea con lápiz y se marcan 4 puntos separados a igual distancia en los que se aplicarán unos µl de los 3 aminoácidos y de la mezcla problema. Se coloca el papel en la cubeta de tal manera que quede sumergida aproximadamente 0.5 cm y se tapa la cubeta.

Transcurridas unas 2 o 3 horas, cuando el disolvente ya ha alcanzado una altura significativa, se retira el cromatograma de la cubeta, se marca con lápiz el frente alcanzado por el disolvente y se seca en una estufa a 105 ºC durante 10 minutos.

Una vez seco el cromatograma se pulveriza con el revelador en una campana y de nuevo se introduce en la estufa, ahora 5 minutos.

Los aminoácidos se distinguen por la aparición de unas manchas púrpuras en el cromatograma.

Para calcular los Rf de cada uno de los aminoácidos, hay que determinar la distancia recorrida por el aminoácido. Se harán dos mediciones: una de la distancia recorrida por el aminoácido, tomando el centro de la mancha. Otra para la distancia recorrida por el disolvente, considerando la señal practicada con lápiz antes de secar el cromatograma.

Resultados de la práctica:

Aminoácido

D. aminoácido (D1)

D. disolvente (D2)

Rf=D1/D2

Aspártico

Lisina

Leucina

2.3 cm

7.2 cm

14.2 cm

17.5 cm

17.5 cm

17.5 cm

0.1314

0.4114

0.8114

En la mezcla problema se obtuvieron los tres aminoácidos, como se observa en el cromatograma adjunto.

Podemos comparar la polaridad de los aminoácidos, observando la distancia recorrida por cada uno de ellos en el cromatograma. A mayor polaridad menos distancia recorrerá, a la inversa, una mayor distancia recorrida indicará menor polaridad, por tener afinidad por la fase móvil.

La polaridad de los tres aminoácidos queda esquematizada de la siguiente manera:

Asp>Lis>Leu

El carácter ácido del ác. aspártico, se lo da su radical libre: CH2-COO¯

La lisina es una minoácido básico, cuyo radical libre es: CH2-CH2-CH2 -CH2 -H2N

La leucina es un aminoácido apolar, y su radical libre es: CH2 -CH-(CH3)2

Existen también cromatogramas descendente donde el eluyente se pone encima y va hacia abajo.

También hay cromatograma bidimensional: ascendente y descendente. El papel es cuadrado y se utiliza cuando queremos cuantificar y cualificar muchos aminoácidos. Se utilizan dos eluyentes de distinta polaridad.

2ª práctica: día 25 de febrero de 1999.

Cromatografía de filtración en gel.

Objetivo:

En esta prática se pretende conocer y entender la base de la cromatografía de filtración en gel, que separan moléculas en función de su tamaño.

Introducción:

La cromatografía de filtración en gel, también llamada de tamiz molecular, permite separar moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía se emplean geles que se componen de bolitas aproximadamente esféricas de un tamaño comprendido entre las 50 y las 200 µm de diámetro, formadas por una red tridimensional polimérica interconectada que da lugar a la formación de poros de un tamaño regular. La matriz polimérica es insoluble en agua, pero por su carácter hidrofílico se encuentra embebida por el disolvente.

Lo que sucede cuando se hace pasar por el gel en el tampón de elución una mezcla de moléculas de distintas tamaños es:

a)Las moléculas muy grandes, por tener un diámetro superior al de las microesferas, no puede difundir hacia su interior.

b)Las moléculas muy pequeñas difunden hacia el interior de los poros de las microesferas, quedando momentáneamente detenidas, hasta que difunden nuevamente hacia fuera de la matriz del gel. Las moléculas pequeñas se ven retrasadas en su elución con respecto a las moléculas de mayor tamaño.

c)Las moléculas de un tamaño intermedios pueden penetrar en unos poros pero no en otros, en función de su tamaño, por lo que se ven mas o menos retenidos y poseerán un volumen de elución intermedio entre los anteriores.

Esta cromatografía se lleva a cabo en una columna. Para cuantificar el proceso cromatográfico es necesario definir varios volúmenes a considerar en la columna:

a)Volumen vacío(vo): es el volumen de eluyente que rodea a las bolitas de gel y que será el único accesible a las moléculas más grandes.

b)Volumen de líquido retenido en las microesferas o bolitas de gel (Vx). Este es el volumen de eluyente accesible a las moléculas pequeñas, y parcialmente a las moléculas de tamaños intermedios.

c)Volumen total (Vt): es la suma de los dos anteriores volúmenes: Vt=Vo+Vx.

d)Volumen de elución (Ve): se llama volumen de elución de una molécula parcialmente retenida a la cantidad de eluyente que debe salir de la columna desde que dicha molécula penetró en el gel hasta que empieza a salir del mismo. Este volumen deberá ser igual a la suma de volumen vacio más un volumen que será proporcional al grado de penetración o accesibilidad de dicha molécula en las bolitas del gel.

Este grado de accesibilidad se puede medir con una constante, Kav, que se puede definir como un coeficiente de distribución cuyo valor puede relacionarse con el peso molecular y con el radio de Stoke de la sustancia. Así, Kav , depende no solo del peso molecular, sino también del tamaño molecular o forma de la molécula.

Protocolo experimental:

El gel que se empleará en la práctica se llama Sephadex G50-150. El gel está constituido por largas cadenas de dextrato entrecruzadas con epiclohidrina. El gel resulta estable ante numerosos disolventes y permite el uso de elevados flujos de eluyente.

Se van a emplear dos compuestos de color para visualizar mejor el proceso de separación:

a)azul dextrato, polisacárido de aproximadamente 2,000,000 daltons, que tiene unido covalentemente un cromóforo azul.

b)dicromato potásico, molécula orgánica de 294 daltons, de color amarillo.

El gel está empaquetada en una columna cromatográfica de vidrio de 1.6 cm de diámetro interno.

Como eluyente un tampón fosfato 0.05M, Ph 7.0, que se usará también para quedar empaquetada la columna.

Para aplicar la muestra se abre el paso de eluyente de la columna hasta que queda enrasado por la parte superior del gel. Se aplica la muestra con la pipeta dejando que resbale por la pared, evitando así la formación de turbulencias en la superficie del gel. Una vez aplicada la muestra, se abre de nuevo el paso de eluyente y se empieza a recoger a la salida de la columna ( 20 gotas por tubo). A la vez hay que añadir nuevo tampón sobre el gel para evitar que se seque la columna.

La cromatografía finaliza cuando han salido completamente los dos compuestos añadidos.

Resultados de la práctica:

Cada tubito contiene un volumen de 1.8 ml.

La columna que contiene el gel tiene un volumen de 50.8 ml.

El azul dextrano ocupó 15 tubitos por lo tanto un volumen total de 15*1.4=21 ml.

El dicromato potásico ( amarillo) ocupó un total de 30 tubitos y un volumen de

30*1.4=42 ml.

Ahora calculamos la Kav de los distintos compuestos:

Ve-Vo

Kav = ----------

Vt-Vo

Y los resultados son :

Kav de azul dextrano = (21-21)/(50.8-21) = 0

Kav de dicromato potásico = (42-21)/(50.8-21) = 0.70

Los resultados obtenidos nos indican que el compuesto azul dextrano tiene un tamaño de molécula mayor que el dicromato potásico, ya que tarda menos en atravesar la columna.

3ª práctica:26 de febrero de 1999.

Determinación de la concentración de proteínas por el método de Lowry

Objetivo:

El objetivo principal de esta práctica es el aprendizaje de uno de los métodos más ampliamente usado para la determinación de la concentración de proteínas: método de Lowry.

Introducción:

Las proteínas son las macromoléculas más abundantes de las células. Juegan un papel esencial en todos los procesos biológicos ( catálisis enzimática, transporte y almacenamiento de ciertas sustancias, movilidad celular, diferenciación celular,...).

No existe un método ideal para la determinación cuantitativa de proteínas. La elección de uno u otro método se basa en qué componentes acompañan a las proteínas, en la rapidez y precisión deseada y en la sensibilidad del método utilizado.

Una de las maneras para determinar concentración de proteína es usando la absorción a 280nm. Este método de medida requiere conocer el coeficiente de extinción en unas condiciones determinadas.

Otro de los métodos es el Biuret, que se basa en el hecho de que las sustancias que contienen 2 o más enlaces peptídicos dan en solución alcalina de sulfato cúprico diluido un color violeta característico, debido a la formación de un complejo de coordinación del átomo de cobre y cuatro átomos de nitrógeno.

La reacción de Biuret da valores bastantes fidedignos para una misma proteína, pero precisa cantidades relativamente altas de muestra (1-20 mg).

El método de Lowry emplea el reactivo de Folin-ciocalteau. Se basa en la determinación de los grupos hidroxifenólico e indol que forman parte de los aminoácidos tirosina y triptófano. Estos aminoácidos se encuentran en proporciones relativamente constantes en muchas proteínas. La reacción de una proteína en solución con el reactivo Folin-ciocalteau se produce en dos fases, que llevan a la aparición final de color.

1ª) Cu² + proteínas ! Cu² - proteína.

2ª) Reducción del reactivo fosfomolíbdico-fosfotúngstico por la proteína tratada

con el Cu².

La primera fase se asemeja a la reacción de Biuret. La segunda fase, la reducción del reactivo de Folin, presenta el máximo color cuando se lleva a cabo pH 10. A este pH el reactivo es eficaz durante poco tiempo.

Conclusión: Cuanto mayor sea la concentración de proteína de la muestra más intenso será el color formado porque existirán más enlaces peptídicos para formar el complejo de coordinación y habrá más tirosinas y triptófanos que reduzcan el reactivo de Folin.

Mediante una recta patrón elaborada enfrentando la absorción a la concentración de proteína y conociendo la absorción de la muestra problema, se puede determinar la concentración de proteína.

Algunas de las características del método de Lowry para la determinación de proteínas en solución son: es de 10 a 20 veces mas sensible que la estimación por absorción a 280 nm, es varias veces más sensible que la reacción con Ninhidrina y también es 100 veces más sensible que la reacción de Biuret. Presenta pocas interferencias, aunque hay que tener en cuenta que el triptófano, la tirosina, la mayor parte de los fenoles, el ácido úrico, la guanina y la xantina reaccionan con el reactivo de Folin para producir color.

Una desventaja que presenta es que la intensidad del color varía con las diferentes proteínas. En este sentido es menos constante que la reacción de Biuret pero más que la absorción a 280nm.

Protocolo experimental:

Soluciones:

  • NA2CO3 al 4% en NaOH 0.1 N.

  • CuSO4 x 5H2O al 2%

  • Tartrato-NaK al 4.9%

  • Reactivo de Folin-Ciocalteau.

  • Reactivo I: 50 ml solución 1 + 0.5 ml soluición 2 + 0.5 ml solución 3.

    Reactivo II: Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido (1 volumen de Folin + 2

    volúmenes de agua destilada).

    El reactivo I se prepara cada día mezclando las tres soluciones que son estables individualmente. El reactivo II viene preparado comercialmente y sólo hay que diluirlo. Es muy tóxico.

    Para medir la concentración de proteína de una muestra problema se prepara una batería de tubos por duplicado como se indica en la tabla adjunta. Se procederá como se indica: Los tubos B (blanco) al 5 son la recta patrón y los tubos P1 y P2 son para la proteína problema.

    Tubo

    B

    1

    2

    3

    4

    5

    P1

    P2

    H2O destilada

    Albúmina 0.25 mg/ml

    Proteína problema

    Reactivo I

    (Incubar 30 min a Tª ambiente)

    Reactivo II

    (Incubar 30 min a Tª ambiente)

    1.0 ml

    0.0 ml

    -

    5.0 ml

    0.5 ml

    0.8 ml

    0.2 ml

    -

    5.0 ml

    0.5 ml

    0.6 ml

    0.4 ml

    -

    5.0 ml

    0.5 ml

    0.4 ml

    0.6 ml

    -

    5.0 ml

    0.5 ml

    0.2 ml

    0.8 ml

    -

    .0 ml

    0.5 ml

    0.0 ml

    1.0 ml

    -

    5.0 ml

    0.5 ml

    0.8 ml

    -

    0.2 ml

    5.0 ml

    0.5 ml

    0.6 ml

    -

    0.4 ml

    5.0 ml

    0.5 ml

    Pasados los últimos treinta minutos se midió la absorción de todos los tubos a 650 nm y los resultados obtenidos son:

    B

    1

    2

    3

    4

    5

    P1

    P2

    Absorvancias

    0.0

    0.110

    0.195

    0.300

    0.393

    0.400

    0.107

    0.187

    P1´

    P2´

    Absorvancias

    -0.002

    0.108

    0.223

    0.339

    0.424

    0.432

    0.106

    0.199

    La tabla siguiente representa la absorción frente a la cantidad de proteína con los valores de los tubos que forman la recta patrón.

    A partir de los valores de absorción de los tubos problema, calculamos la concentración de proteína de la solución problema:

    4ª práctica: día 10 y 11 de febrero de 1999.

    Caracterización funcional de la fosfatasa alcalina intestinal de rata.

    Objetivo:

    Es el conocimiento de la cinética enzimática a través del estudio de los parámetros cinéticos de la enzima fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) presente en el extrato de mucosa intestinal de rata.

    Introducción:

    Estas enzimas catalizan la hidrólisis de ésteres del ácido fosfórico. Se distinguen dos tipos principales:

    -Fosfomonoesterasas, que hidrolizan monoésteres del ácido fosfórico.

    -Fosfodiesterasas, que hidrolizan diésteres del ácido fosfórico.

    La fosfatasa alcalina es una fosfomonoesterasa que hidroliza monoésteres fosfóricos cualquiera que sea su radical R. Está presente en todos los materiales biológicos. Se le denomina alcalina porque presenta su máxima actividad a valores elevados de pH. Es particularmente abundante en tejidos óseo, mucosa intestinal e hígado.

    En nuestro experimento utilizaremos fosfatasa alcalina de mucosa intestinal de rata. Para determinar la actividad enzimática usaremos como sustrato un monoéster fosfórico sintético, el p-nitrofenilfosfato (pNØP), siendo los productos de la reacción

    El fosfato y el p-nitrofenol, compuesto de color amarillo a pH alcalino. La intensidad de color amarillo producida en un tiempo dado es proporcional a la actividad fosfatasa presente y se mide por su absorción a una longitus de onda de 405 nm en un espectrofotómetro o un colorímetro.

    Protocolo experimental:

    1º Preparación del extracto enzimático de mucosa intestinal.

    (en la práctica se nos daba la fosfatasa alcalina ya preparada)

    2º Medida de la linealidad con el tiempo de la actividad fosfatasa.

    Para medir la linealidad con el tiempo de esta actividad enzimática, se prepara una bateria de tubos por duplicado como se indica en la tabla siguiente y se procede como se indica:

    Tubo

    1

    2

    3

    4

    C

    Tris-HCl 0.5 M, pH 8.5

    PNØP 2mM

    H2O destilada

    Fosfatasa alcalina

    Mantener a Tª ambiente

    Para la reacción por adición

    De NaOh 0.2 N

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    100 µl

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    100 µl

    10´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    100 µl

    15´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    -

    10´

    3 ml

    Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha habido reacción enzimática. Al finalizar los tiempos correspondientes a cada tubo se miden las absorvancias de cada uno de ellos a 405 nm. La absorción del tubo C se tomará como 0. Las absorvancias obtenidas son:

    1

    2

    3

    4

    C

    0.10

    0.22

    0.30

    0.38

    0

    0.10

    0.22

    0.231

    0.48

    Ahora representamos los datos obtenidos en una gráfica donde enfrentamos el tiempo con las absorción.

    3ª Medida de la linealidad con la cantidad de enzima de la actividad fosfatasa.

    Para medir la linealidad con la cantidad de enzima de esta actividad fosfatasa se prepara una batería de tubos por duplicado como se indica en la tabla siguiente y se procede como se indica:

    Tubo

    1

    2

    3

    4

    C

    Tris-HCl 0.5 M, pH 805

    PNØP 0.2 mM

    H2O destilada

    Fosfatasa alcalina

    Mantener a Tª ambiente

    Parar la reacción por adición de NaOH 0.2 N

    100 µl

    500 µl

    350 µl

    50 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    250 µl

    150 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    200 µl

    200 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha habido reacción enzimática. Una vez finalizados los 20 minutos y se ha parado la reacción con el NaOH, se miden las absorvancias y los resultados obtenidos son:

    1

    2

    3

    4

    C

    0.04

    0.11

    0.20

    0.28

    0

    0.03

    0.12

    0.21

    0.20

    Representamos una gráfica con los datos obtenidos enfrentando la cantidad de fosfatasa alcalina con las absorvancias de cada tubo.

    4ª Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.

    Determinación de la Km

    Para medir el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad fosfatasa se prepara una batería de 8 tubos como se observa a continuación y se procede como se indica:

    Tubo

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    C

    Tris-HCl 0.5 M pH 8.5

    PNØP 0.2 mM

    H2O destilada

    Fosfatasa alcalina

    Mantener a Tª ambiente

    Parar la reacción por adición de NaOH 0.2 N

    100 µl

    20 µl

    780 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    40 µl

    760 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    70 µl

    730 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    120 µl

    680 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    180 µl

    620 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    300 µl

    500 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    300 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    120 µl

    680 µl

    -

    20´

    3 ml

    Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha habido reacción enzimática. Se mide la absorción de todos los tubos a 405 nm y los resultados obtenidos son:

    C

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    0

    0.12

    0.20

    0.25

    0.28

    0.32

    0.33

    0.32

    (La representación gráfica la haremos después del punto 5º)

    5º Efecto inhibidor del ión fosfato sobre la actividad enzimática.

    Determinación de la ki.

    Para medir el efecto inhibidor del ión fosfato sobre la actividad fosfatasa se prepara una batería de 8 tubos como se indica a continuación y se procede como sigue:

    Tubo

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    C

    Tris-HCl 0.5 M pH 8.5

    PNØP 0.2 mM

    Po4Hna2 10 mM

    H2O destilada

    Fosfatasa alcalina

    Mantener a Tª ambiente

    Parar la reacción por adición de NaOH 0.2 N

    100 µl

    20 µl

    50 µl

    730 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    40 µl

    50 µl

    710 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    70 µl

    50 µl

    680 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    120 µl

    50 µl

    630 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    180 µl

    50 µl

    570 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    300 µl

    50 µl

    450 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    500 µl

    50 µl

    250 µl

    100 µl

    20´

    3 ml

    100 µl

    120 µl

    50 µl

    630 µl

    20´

    3 ml

    Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha habido reacción enzimática.

    Una vez finalizado el tiempo correspondiente, se mide la absorción:

    C

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    0

    0.03

    0.13

    0.06

    0.07

    0.13

    0.17

    0.23

    Para representar la gráfica, donde enfrentaremos el inverso de la concentración frente al inverso de las absorvancias, primero hay que calcular las concentraciones:

    /S1/: 2nm*20 µl = 1000 µl * /S1/; /S1/= 0.04 nM

    /S2/: 2nm*40 µl = 1000 µl * /S2/ ; /S2/=0.08 nM

    /S3/: 2nm*70 µl = 1000 µl * /S3/; /S3/=0.14 nM

    /S4/: 2nm*120µl = 1000 µl * /S4/; /S4/=0.24 mM

    /S5/: 2nm*180 µl = 1000 µl * /S5/; /S5/=0.36mM

    /S6/: 2nm*300 µl = 1000 µl * /S6/; /S6/=0.60 mM

    /S7/: 2nm*500 µl = 1000 µl * /S7/; /S7/=1.0 mM

    /Sc/: 2nm*120 µl = 1000 µl * /Sc/; /Sc/= 0.24 mM

    En la gráfica están expresados los inversos de las concentraciones y los inversos de las absorvancias. El cálculo de Km, Vmax y de Ki, vienen expresados en le gráfica siguiente:

    1